JP3857075B2 - Reactive solid phase carrier and DNA fragment detection tool - Google Patents

Reactive solid phase carrier and DNA fragment detection tool Download PDF

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子物質の構造の解析に有用な検出用具に関し、特に遺伝子の発現、変異、多型等の効率的な解析に有用な、多数の生物起源の高分子物質もしくはその類縁体を凹凸を有する固相担体表面に整列固定させた検出用具に関する。本発明は特に、DNA断片試料の塩基配列の解析に有用な、多数のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を凹凸を有する固相担体表面に高密度に整列固定させた高密度アレイ型検出用具(DNA検出チップ)、そしてその高密度アレイ型検出用具の作製に有利に用いることのできる反応性固相担体に関する。
【0002】
【従来の技術】
多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が急速に進んでおり、それらのDNAもしくはDNA断片の塩基配列の解析のために、DNAチップとよばれる、多数のDNA断片あるいは合成オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固相基板の表面に固定した検出用具が用いられている。このような固相基板の表面に結合固定されたヌクレオチド誘導体などの、DNAもしくはその断片あるいは合成オリゴヌクレオチドのような検出用分子はプローブ分子とも呼ばれる。代表的なDNAチップは、スライドガラス等の固相担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロアレイである。このDNAチップの製造、そしてその使用に関するDNAチップ関連技術は、DNA以外の生体分子の検出にも利用可能であると考えられ、従って、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発等に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【0003】
DNAチップ関連技術が具体化してきたのは、DNAの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法が考案されたことに始まる。この方法は、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、当初は実用化には至らなかった。
【0004】
その後、上記のような構成のDNAチップと、その作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べることが可能となった。すなわち、作製されたDNAチップ上のDNA断片もしくはオリゴヌクレオチドに相補性を示すDNA断片試料(標的DNA断片ともいわれる)は、一般的には、DNAチップ上のDNA断片もしくはオリゴヌクレオチドと、標識したDNA断片試料とのハイブリダイゼーションを利用して検出される。
【0005】
DNAチップ作製技術を実用化するためには、多数のDNA断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に高密度に、かつ安定に整列させるための技術が必要とされる。
【0006】
DNAチップの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法(「オン・チップ法」という。)と、予め調製用意したDNA断片あるいはオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせ、所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行なう方法(「マスキング技術」という)が代表的である。
【0007】
予め調製用意したDNA断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法としては、DNA断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法が知られている。
(1)固定するDNA断片がcDNA(mRNAを鋳型にして合成した相補的DNA)やPCR産物(cDNAをPCR法によって増幅させたDNA断片)である場合には、cDNAあるいはPCR産物を、DNAチップ作製装置に備えられたスポッタ装置により、ポリ陽イオン化合物(ポリリシン、ポリエチレンイミン等)で表面処理した固相担体の表面に点着し、DNA断片の持つ電荷を利用して固相担体に静電結合させるのが一般的である。なお、固相担体表面の処理方法としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。このシランカップリング剤を用いた表面処理では、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に固定されるため、ポリ陽イオン化合物による表面処理の場合と比較して、安定に固相担体表面に固定される。
【0008】
上記のDNA断片の電荷を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したPCR産物をSSC(標準食塩−クエン酸緩衝液)に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行なう方法が報告されている。しかし、この固定方法では必ずしも充分なDNA断片の固定安定度が得られ難いという問題がある。DNAチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で(すなわち、高密度に)、かつ安定にDNA断片が結合固定することは、DNA断片プローブと標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に直接影響する。
【0009】
(2)固定するオリゴヌクレオチド(プローブ分子)が合成オリゴヌクレオチドである場合には、まず反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着して、該オリゴヌクレオチドを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法も知られている。例えば、表面にアミノ基を導入したスライドガラスに、PDC(p−フェニレンジイソチオシアネート)の存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記(1)のDNA断片の電荷を利用して静電結合により固定する方法と比べると、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に結合固定されるという利点がある。しかし、PDCを存在させる方法は、PDCとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法では、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い(従って、加水分解が起こり易い)という問題点がある。
【0010】
なお、近年、DNAチップのプローブ分子として、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド(合成されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド及びDNA分子やDNA断片、そしてRNA分子やRNA断片をも包含する)の代りに、PNA(ペプチド核酸)と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体を用いる技術も提唱されている。このPNAの固相基板へ共有結合により固定するための方法として、アビジンとビオチンとを組合わせて用いる方法も知られている(特開平11−332595号公報)。この公開公報には、固相基板として、表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサを利用することの技術も記載されている。表面プラズモン共鳴バイオセンサ上にプローブ分子が固定されたDNAチップを用いて、その表面にハイブリダイゼーションを介して結合固定されたDNA断片は、表面プラズモン共鳴現象を利用して検出することができる。
【0011】
また、DNAチップの基板として、電荷結合素子(CCD)を用いることも知られている(Nucleic Acids Research, 1994, Vol.22, No.11, 2124-2125)。
【0012】
特開平4−228076号公報(米国特許第5387505号明細書に対応)には、ビオチン分子を付けた標的DNAを、アビジン分子を表面に固定した基体に結合させて、標的DNAを分離する技術が記載されている。
【0013】
特公平7−43380号公報(米国特許第5094962号明細書に対応)には、リガンド−受容体アッセイに用いる検出用具であって、表面に反応活性基を有する微孔質ポリマー粒子の表面に受容体分子を結合させた分析用具が記載されている。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体表面に、予め調製した、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を高密度に安定に結合固定させるために特に有利に用いることができる反応性固相担体、そして、その反応性固相担体に、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が結合固定されてなる、特定の塩基配列部分を有するDNA、RNA、あるいはそれらの断片の検出用具を提供することを、その課題とする。
【0015】
【課題を解決するための手段】
本発明は、無機物質の微粒子の単層から成る凹凸を有するガラス担体の表面に、ビニルスルホニル基が連結基を介して共有結合により固定されてなる、生体高分子固定用の反応性固相担体にある。
上記の凹凸は無機物質により形成される粒子であり、さらには珪素、アルミナ又はチタンを含有する、平均粒子径が50μm以下の粒子であることが望ましい。
上記のビニルスルホニル基と連結基との連結体は下記の式(1)により表わされるものであることが望ましい。
【0016】
−L−SO2−X (1)
【0017】
[上記の式において、Xは、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、Lは連結基を表わす]。
【0018】
上記の式(1)において、Xは、−CH=CH2で表わされるビニル基であることが望ましく、
【0019】
Lは、炭素原子以外の二価以上の原子を含む連結基であることが望ましい。Lとしては、−NH−、−S−、もしくは−O−などの連結部位を有する連結基であることが望ましい。Lの例としては、−(L1n−NH−(CR122−または−(L1n−S−(CR122−[但し、R1及びR2は前記と同じ意味を表わし、L1は連結基を表わし、そしてnは0もしくは1である]で表わされる連結基を挙げることができる。特に、Lが、−(L1n−NHCH2CH2−[但し、L1は連結基を表わし、そしてnは0もしくは1である]で表わされる連結基あることが望ましい。上記のL1は、−OSi−で表わされる基を含む連結基であることが望ましい。
【0020】
本発明の反応性固相担体は、表面に反応性基が導入された凹凸を有する固相担体に、下記式(2):
【0021】
1−SO2−L2−SO2−X2
【0022】
[上記の式において、X1およびX2は互いに独立に、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、L2は連結基を表わす]
で表わされるジスルホン化合物を接触させることによって容易に製造することができる。
【0023】
上記の式(2)で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタンを挙げることができる。
【0024】
上記の固相担体表面に導入されている反応性基は、アミノ基、メルカプト基もしくはヒドロキシル基であることが望ましい。
【0025】
本発明はまた、ビニルスルホニル基が共有結合により固定されてなる反応性固相担体の表面に、該反応性基と反応して共有結合を形成する反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を接触させることを特徴とする、スルホニル基を有する連結基を介してヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された固相担体の製造方法にもある。
【0026】
凹凸を有する固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表的な例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その分子の一方の端部もしくは端部附近に、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基などの、ビニルスルホニル基と反応する共有結合を形成する反応性基を持つものが利用される。
【0027】
上記のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された凹凸を有する固相担体は、水性媒体の存在下、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド(DNAもしくはその断片、あるいはRNAもしくはその断片)を接触させて、ハイブリダイゼーションを発生させることにより、その相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固定することができる。固定すべき相補性のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、その固定を外部から検知することが可能なように、検知可能な標識(例、蛍光標識)が結合していることが望ましい。
本発明はまた、上記したヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された凹凸を有する固相担体、あるいは上記した相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが結合固定された固相担体を利用することを特徴とする、遺伝子の同定又はスクリーニング方法にも関する。
【0028】
【発明の実施の形態】
本発明の反応性固相担体は、凹凸を有する固相担体の表面に、ビニルスルホニル基が連結基を介して共有結合により結合固定された構成を有している。本発明の反応性固相担体は、予め表面に反応性基を導入した凹凸を有する固相担体を用意し、この固相担体と、この担体表面に備えられた反応性基と反応して共有結合を形成する反応性基を一方の端部もしくは端部附近に有し、かつ他方の端部もしくは端部附近にビニルスルホニル基を有する化合物とを接触させることにより製造することができる。
【0029】
固相担体は、特に疎水性、あるいは親水性の低い、表面が平滑な基板であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低い基板も用いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルターなどの各種の多孔質物質を挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、2乃至1000nmの範囲にあることが好ましく、2乃至500nmの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、100乃至2000μmの範囲にあることが好ましい。
【0030】
本発明の反応性固相担体の製造に用いる凹凸を有する固相担体としては、従来よりDNAチップの製造に用いられているか、あるいはDNAチップの製造用として提案されている各種の固相担体が好ましく利用することができる。そのような固相担体の例としては、ガラス基板、樹脂基板、シランカップリング剤で表面処理されたガラス基板もしくは樹脂基板、あるいは表面に被覆層を有するガラス基板もしくは樹脂基板などを挙げることができる。固相担体としては、特に、ケイ酸ガラス基板、シランカップリング剤で表面処理されたケイ酸ガラス基板、あるいは有機質被覆層で被覆されたケイ酸ガラス基板であることが好ましい。また、電気化学的な分析方法に用いるDNAチップの基板として用いられる電極基板であってもよい。また、前述の表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサ用基板、電荷結合素子(CCD)などの各種の機能性基板であってもよい。さらに、これらの基板以外にも、粒子状の固相担体なども用いることができる。
また凹凸性の物質としては、無機物質により形成される粒子であることが好ましく、例えば、コロイダルシリカ、アルミナゾル、酸化チタン、ZrO2等の金属酸化物、水酸基を持ったプラスチック、ラッテクス等が挙げられる。粒子径は50μm以下が好ましく、特に共焦点レ−ザ−蛍光検出する場合には、バックグランドの抑える為、100nm以下の微粒子を用いることが好ましい。固相担体に凹凸性物質をコ−トさせる方法としては、凹凸性物質をシランカップリング剤と混合して、固相担体に接触させ、反応させることで容易に固相担体に凹凸性を付与することができる。固相担体が特にガラスの場合には特に有効である。また凹凸性物質を接触させ、乾燥後、シランカップリング剤で処理しても、作成することができる。
粒子性物質で固相担体をコートすることで凹凸を生じさせると、表面積が平滑面に比べてかなり大きくなり、固定されるDNA断片の結合物量を大幅に増やせるという利点がある。さらに、以下の理由から重層の形態より単層の方が有利である。
1. 蛍光、発光、RI等で検出する場合、励起光や発光物質などによる散乱が減少し、バックグラウンドが低下する。
2. スポット時の液の浸透が少ないので、スポット径を小さくする事が可能で、高密度アレイを作成する事ができる。
3. ハイブリダイゼ−ション後の操作において、未反応の標識検体を除く後処理洗浄工程が容易になる。重層の場合には、標識検体が粒子間の空隙に入り込む。このため洗浄工程を十分に行う事が必要で、不十分な場合にはバックグラウンドが高く事が良くある。
【0031】
凹凸を有する固相担体の表面には、ジビニルスルホン化合物などの二官能反応性化合物を共有結合により結合固定するために、ポリ陽イオン化合物(例えば、ポリ−L−リシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等であることが好ましく、ポリ−L−リシンであることがさらに好ましい)などのアミノ基を側鎖に有するポリマーによって被覆処理(この場合、固相担体表面へ導入される反応性基は、アミノ基である)することが望ましい。あるいは、固相担体表面は、シランカップリング剤などの固相担体表面と反応する反応性基と、そして別にアミノ基などの反応性基を有する表面処理剤によって接触処理することができる。
【0032】
凹凸を有する固相担体表面は、ポリ陽イオン化合物による被覆処理の場合には、アミノ基もしくはメルカプト基がポリマー化合物と固体担体表面との静電結合によって固相担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング剤による表面処理の場合には、固相担体表面に共有結合によって結合固定されるため、アミノ基もしくはメルカプト基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基およびメルカプト基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、あるいは水酸基も好ましく導入することができる。
【0033】
アミノ基を有するシランカップリング剤としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、N−β(アミノエチル)−γ−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはN−β(アミノエチル)−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランを用いることが好ましく、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【0034】
ポリ陽イオン化合物を用いる処理に、シランカップリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。この方法により、疎水性、あるいは親水性の低い固相担体とDNA断片との静電的相互作用を促進することができる。ポリ陽イオン化合物による処理がされた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって、ポリ陽イオン化合物による処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施した固相担体も好ましく用いることができる。
【0035】
通常のDNAチップ用の固相担体の表面には、予め区画あるいは想定された多数の領域が設定されており、各領域毎に上記のように、ジビニルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と反応することができる反応性基が予め導入されている。用いる固相担体の各領域の表面のそれぞれには、上記のアミノ基、メルカプト基、あるいはヒドロキシル基などの反応性基が備えられているが、そのような反応性基を持たない固相担体には、前述のように、シランカップリング剤による表面処理、あるいはアミノ基などの反応性基を側鎖に有するポリマーなどを固相担体の表面に塗布被覆する方法を利用して、反応性基の導入が行なわれる。
【0036】
反応性基を備えた固相担体は、ジビニルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と接触することによって、その反応性基と二官能性反応性化合物とが反応し、共有結合が形成され、固相担体の反応性基部分が延長され、その先端もしくは先端附近にビニルスルホニル基を持つ反応性鎖が形成され、これにより本発明の反応性固相担体が生成する。
【0037】
本発明の反応性固相担体において、固相担体表面に導入されるビニルスルホニル基と連結基との連結体は、下記の式(1)により表わされるものであることが望ましい。
【0038】
−L−SO2−X (1)
【0039】
上記の式(1)において、Xは、−CR1=CR23を表わす。R1、R2およびR3は、それぞれ互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、あるいは炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基を表わす。炭素原子数が1乃至6のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、及びn−ヘキシル基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ましい。アリール基としては、フェニル基及びナフチル基を挙げることができる。R1、R2及びR3は共に水素原子であることが好ましい。
【0040】
Lは、固相担体もしくは固相担体に結合している連結基と、上記−SO2−X基とを連結している二価もしくはそれ以上の連結基を表わす。ただし、Lは単結合であってもよい。二価の連結基としては、炭素原子数が1乃至6のアルキレン基、炭素原子数が3乃至16の脂肪族環基、炭素原子数が6乃至20のアリーレン基、N、SおよびPからなる群より選ばれるヘテロ原子を1乃至3個含む炭素原子数が2乃至20の複素環基、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、−SO3−、−NR11−、−CO−およびこれらの組み合わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み合わせてなる基であることが好ましい。R11は、水素原子、炭素原子数が1乃至15のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、あるいは炭素原子数が1乃至6のアルキル基を有する炭素原子数が7乃至21のアラルキル基であることが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が1乃至6のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好ましい。
Lが−NR11−、−SONR11−、−CONR11−、−NR11COO−、および−NR11CONR11−からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる基である場合には、それらのR11同士が結合して環を形成していてもよい。
【0041】
11のアルキル基、R11のアリール基、およびR11のアラルキル基は、置換基を持っていてもよい。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が1乃至6のアルコキシ基、炭素原子数が1乃至6のアルケニル基、炭素原子数が2乃至7のカルバモイル基、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が7乃至16のアラルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、スルファモイル基(もしくはそのNa塩、K塩等)、スルホ基(もしくはそのNa塩、K塩等)、カルボン酸基(もしくはそのNa塩、K塩等)、ハロゲン原子、炭素原子数が1乃至6のアルケニレン基、炭素原子数が6乃至20のアリーレン基、スルホニル基、およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。
【0042】
上記「−X」基の好ましい具体例を以下に示す。
【0043】
【化1】

Figure 0003857075
【0044】
Lの好ましい具体例を以下に示す。但し、aは、1乃至6の整数であり、1もしくは2であることが好ましく、1であることが特に好ましい。bは、0乃至6の整数であり、2もしくは3であることが好ましい。
【0045】
【化2】
Figure 0003857075
【0046】
Lとしては、上記記載の二価の連結基の他に、上記式のアルキレン基の水素原子が−SO2CH=CH2基によって置換されてなる基も好ましい。
【0047】
前記の式(1)で表わされるビニルスルホニル基が共有結合により固定された固相担体を得るために利用される二官能反応性化合物としては、下記の式(2)で表わされるジスルホン化合物が有利に利用できる。
【0048】
1−SO2−L2−SO2−X2 (2)
【0049】
[上記の式において、X1およびX2は互いに独立に、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、L2は連結基を表わす]。
【0050】
すなわち、上記の式(2)で表わされるジスルホン化合物を、前記の固相担体と、例えば水性雰囲気にて、接触させることによって、本発明の反応性固相担体を容易に製造することができる。
【0051】
本発明で好ましく用いるジスルホン化合物の代表例を下記に示す。なお、ジスルホン化合物は、二種類以上を混合して用いてもよい。
【0052】
【化3】
Figure 0003857075
【0053】
【化4】
Figure 0003857075
【0054】
上記の式(2)で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン[上記のS1に相当する]を挙げることができる。
【0055】
本発明で用いるジスルホン化合物の合成法については、たとえば、特公昭47−2429号、同50−35807号、特開昭49−24435号、同53−41551号、同59−18944号等の各種公報に詳細が記載されている。
【0056】
上記のようにして得られた反応性固相担体を利用して、DNA、RNA、DNA断片、あるいはRNA断片などの天然起源のポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの検出固定のための検出具(一般にDNAチップと呼ばれているもの)を作製するためには、上記の反応性固相担体を、その担体表面上のビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成するアミノ基などの反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と接触させる方法が利用される。すなわち、このようにして所望のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子を備えた検出具(いわゆるDNAチップ)を作製することができる。
【0057】
本発明の固相基板表面に共有結合を介して結合されたビニルスルホニル基は、加水分解に対して高い抵抗性を有しているため、容易に安定に保存することができ、また、アミノ基を予め備えているか、あるいはアミノ基などの反応性基が導入されているかヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の反応性基と迅速に反応して、安定な共有結合を形成することができる。
【0058】
プローブ分子として用いるヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、そしてペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、天然起源のもの(DNA、DNA断片、RNA、あるいはRNA断片など)であってもよく、あるいは合成化合物であってもよい。また、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その糖単位部分に架橋基を有するLNAと呼ばれる化合物(J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 13252-13253に記載)などの各種の類縁化合物が含まれる。
【0059】
プローブ分子としてDNA断片を用いる場合は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、cDNA、cDNAの一部、EST等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてcDNAのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてPCR法によって増幅して調製する(以下、「PCR産物」という)。PCR法によって増幅しないものも、好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列の分析を目的とする場合、4n(nは、塩基の長さ)種のオリゴヌクレオチドを合成して、それらを使用することが好ましい。DNA断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。DNA断片は、2乃至50量体であることが好ましく、10乃至25量体であることが特に好ましい。
【0060】
オリゴヌクレオチドやDNA断片などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の一方の末端には、前記のビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成する反応性基を導入する。このような反応性基は、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。オリゴヌクレオチドやDNA断片には、通常、クロスリンカーを介してこれらの反応性基が結合される。クロスリンカーとしては、たとえば、アルキレン基あるいはN−アルキルアミノ−アルキレン基が利用されるが、ヘキシレン基あるいはN−メチルアミノ−ヘキシレン基であることが好ましく、ヘキシレン基であることが特に好ましい。なお、ペプチド核酸(PNA)はアミノ基を有しているため、通常は、改めて別に反応性基を導入する必要はない。
【0061】
反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と反応性固相担体との接触は、通常、該ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水溶液を反応性固相担体の表面に点着することにより実施される。具体的には、反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を水性媒体に溶解あるいは分散して水性液としたのち、その水性液を、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。
【0062】
点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の乾燥を防ぐために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、検出対象の核酸断片試料(標的核酸断片)などの試料とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性があまり大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、そしてポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。このポリマーの分子量は、103乃至106の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液中、0.1乃至2容量%の範囲にあることが好ましく、0.5乃至1容量%の範囲にあることが特に好ましい。
【0063】
また、同じ目的のために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を点着した後の固相担体を、90%以上の湿度および25乃至50℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【0064】
反応性基を有するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、特に加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが好ましい。これらの後処理は、ポリ陽イオン化合物のみによって固相担体表面を処理した場合には特に有効である。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後は、未反応のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を洗浄して除去することが好ましい。
【0065】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の固定量(数)は、固相担体表面に対して、102乃至105種類/cm2の範囲にあることが好ましい。ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、1乃至10-15モルの範囲にあり、重量としては数ng以下であることが好ましい。点着によって、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。それぞれのドット間の距離は、0乃至1.5mmの範囲にあることが好ましく、100乃至300μmの範囲にあることが特に好ましい。1つのドットの大きさは、直径が50乃至300μmの範囲にあることが好ましい。固相担体表面に点着するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、100pL乃至1μLの範囲にあることが好ましく、1乃至100nLの範囲にあることが特に好ましい。
【0066】
本発明の方法によって製造されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体の寿命は、cDNAが固定されてなるcDNA固定固相担体では通常、数週間であり、合成オリゴヌクレオチドが固定されてなる固相担体ではさらに長期間である。本発明のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【0067】
標識方法としては、RI法と非RI法(蛍光法、ビオチン法、化学発光法等)とが知られているが、本発明では蛍光法を用いることが好ましい。蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素(例えば、市販のCy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、N−アセトキシ−N2−アセチルアミノフルオレン(AAF)あるいはAAIF(AAFのヨウ素誘導体)を使用することができる。
【0068】
試料核酸断片としては、通常、その配列や機能が未知であるDNA断片試料あるいはRNA断片試料などの核酸断片試料が用いられる。
【0069】
核酸断片試料は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がmRNAならば、mRNAが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。mRNAは、逆転写反応により標識dNTP(「dNTP」は、塩基がアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)もしくはチミン(T)であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。)を取り込ませて標識cDNAとすることが好ましい。dNTPとしては、化学的な安定性のため、dCTPを用いることが好ましい。一回のハイブリダイゼーションに必要なmRNA量は、点着する液量や標識方法によって異なるが、数μg以下である。なお、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体固定固相担体上のDNA断片がオリゴDNAである場合には、核酸断片試料は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、mRNAの選択的な抽出が困難なため、全RNAを標識することが好ましい。
【0070】
核酸断片試料は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識dNTPを含む反応系において標的領域のPCRを行なって得ることが好ましい。
【0071】
ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した核酸断片試料が溶解あるいは分散してなる水性液を、本発明のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、1乃至100nLの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温乃至70℃の温度範囲で、そして6乃至20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【0072】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体を用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸断片試料の使用量を非常に少なくできることである。そのため、固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の鎖長や標識した核酸断片試料の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した核酸断片試料を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のDNA断片固定固相担体上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【0073】
【実施例】
実施例1:DNA断片固定スライドの作製、およびDNA断片の固定量の測定
凹凸性の反応性固相担体の作成とその性能、比較対照として凹凸性の無い反応性固相担体との比較を下記に示す。
【0074】
(1)ビニルスルホニル基が導入された凹凸性固相担体(A)の作成
コロイダルシリカ(スノーテックスPS−S[日産化学工業]/平均粒子径約10nm)の5質量%の懸濁液を200ml作り、その中に洗浄済みのガラススライド20枚を市販のバスケットに入れ30秒間浸漬させる。引き上げ後、水切りを行い45℃の乾燥機で10分間乾燥させる。次に、このガラススライドを信越シリコーンKBE903(信越化学工業)の2質量%溶液200mlに市販のスライドウオッシャーを使い3分間反応させる。反応終了後200mlの超純水で1分間(スライドウオッシャー使用)水洗する。超純水を交換しながら、さらに前述水洗条件で2回繰り返す。水洗終了後、45℃の乾燥機で10分間乾燥させた後に、110℃にセットしたオーブンに入れ10分間熱処理する。冷却後、3質量%1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン/pH8.0ホウ酸緩衝溶液にスライドウオッシャーを使い、120分間反応させる。反応終了後、超純水で20秒間×3回水洗する。乾燥は25℃にセットした乾燥機で30分間行い、凹凸性固相担体(A)が得られた。原子間力顕微鏡(AFM)で(A)の表面を観察したところ、厚さが約10nmであることが分かり、単層でコートされたことを確認した。
【0075】
(2)DNA断片の点着と蛍光強度の測定
3'末端および5'末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識試薬(FluoroLink Cy5−dCTP、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製)で修飾されたDNA断片(3'−TCCTCCATGTCCGGGGAGGATCTGACACTTCAAGGTCTAG−5')を0.1M炭酸緩衝液(pH9.3)に分散してなる水性液(1×10-6M、1μL)を、上記(1)で得たスライド(A)に点着した。直ちに、点着後の固相担体を25℃、湿度90%にて1時間放置した後、この固相担体を0.1重量%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)と2×SSC(2×SSC:SSCの原液を2倍に希釈した溶液、SSC:標準食塩−クエン酸緩衝液)との混合溶液で2回、0.2×SSC水溶液で1回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを0.1Mグリシン水溶液(pH10)中に1時間30分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、DNA断片が固定された固相担体(B)を得た。この固相担体(B)表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、15250であった。
【0076】
(3)比較対照スライドの作成と性能
ガラススライドを信越シリコーンKBE903(信越化学工業)の2重量%溶液200mlに市販のスライドウオッシャーを使い3分間反応させる。反応終了後200mlの超純水で1分間(スライドウオッシャー使用)水洗する。超純水を交換しながら、さらに前述水洗条件で2回繰り返す。水洗終了後、45℃の乾燥機で10分間乾燥させた後に、110℃にセットしたオーブンに入れ10分間熱処理する。冷却後、3重量%の1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン/p H 8.0ホウ酸緩衝溶液にスライドウオッシャーを使い、120分間反応させる。反応終了後、超純水で20秒間×3回水洗する。乾燥は25℃にセットした乾燥機で30分間乾燥する。上記(2)と同様の評価を行い蛍光強度2300を得た。
【0077】
上記結果を以下の表にまとめる。
【0078】
【表1】
Figure 0003857075
【0079】
表1の結果より、本発明の固定化方法により、DNA断片が高密度に効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【0080】
実施例2:試料DNA断片の検出
(1)凹凸性DNA断片固定固相担体の作製
3'末端がアミノ基で修飾された40merのDNA断片(3'−TCCTCCATGTCCGGGGAGGATCTGACACTTCAAGGTCTAG−5')を0.1M炭酸緩衝液(pH9.3)に分散してなる水性液(1×10-6M、1μL)を、実施例1の(1)で得た凹凸性固相担体(A)に点着した。直ちに、点着後の固相担体を25℃、湿度90%にて1時間放置した後、この固相担体を0.1重量%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)と2×SSC(2×SSC:SSCの原液を2倍に希釈した溶液、SSC:標準食塩−クエン酸緩衝液)との混合溶液で2回、0.2×SSC水溶液で1回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを0.1Mグリシン水溶液(pH10)中に1時間30分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、DNA断片が固定された固相担体(C)を得た。
【0081】
(2)試料DNA断片の検出
5'末端にCy5が結合した22merの試料オリゴヌクレオチド(CTAGTCTGTGAAGTTCCAGATC−5')をハイブリダイゼーション用溶液(4×SSCおよび10重量%のSDSの混合溶液)(20μL)に分散させたものを、上記(1)で得た固相担体(C)に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて60℃で20時間インキュベートした。次いで、このものを0.1重量%SDSと2×SSCとの混合溶液、0.1重量%SDSと0.2×SSCとの混合溶液、および0.2×SSC水溶液で順次洗浄した後、600rpmで20秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、10350であった。
【0082】
また比較対照スライドを用いて、試料DNA断片の検出を行ったところ、蛍光強度は1500であった。
本発明の固定化方法によって作製された凹凸性DNA断片固定固相担体を用いることによって、固定されているDNA断片と相補性を有する試料DNA断片を高感度に検出できることが分かる。
【0083】
参考例1:DNA断片固定スライドの作製、およびDNA断片の固定量の測定
(1)ビニルスルホニル基が導入された凹凸性固相担体の作成
DNAマイクロアレイ用コートスライドグラス(Type2高密度化アミノ基導入タイプ[松浪硝子工業])を、3重量%1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン/pH8.0ほう酸緩衝溶液にスライドウォッシャーを使い、120分間反応させる。反応終了後、超純水で20秒間×3回水洗する。乾燥は25℃にセットした乾燥機で30分間乾燥する。実施例1の(2)と同様の評価を行い蛍光強度3600を得た。
【0084】
参考例2:試料DNA断片の検出
(1)松浪ガラス製DNA断片固定化担体の作製
3'末端がアミノ基で修飾された40merのDNA断片(3'−TCCTCCATGTCCGGGGAGGATCTGACACTTCAAGGTCTAG−5')を0.1M炭酸緩衝液(pH9.3)に分散してなる水性液(1×10-6M、1μL)を、参考例1の(1)で得た凹凸性固相担体に点着した。直ちに、点着後の固相担体を25℃、湿度90%にて1時間放置した後、この固相担体を0.1重量%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)と2×SSC(2×SSC:SSCの原液を2倍に希釈した溶液、SSC:標準食塩−クエン酸緩衝液)との混合溶液で2回、0.2×SSC水溶液で1回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを0.1Mグリシン水溶液(pH10)中に1時間30分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、DNA断片が固定された固相担体(D)を得た。
【0085】
(2)試料DNA断片の検出
5'末端にCy5が結合した22merの試料オリゴヌクレオチド(CTAGTCTGTGAAGTTCCAGATC−5')をハイブリダイゼーション用溶液(4×SSCおよび10重量%のSDSの混合溶液)(20μL)に分散させたものを、上記(1)で得た固相担体(D)に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて60℃で20時間インキュベートした。次いで、このものを0.1重量%SDSと2×SSCとの混合溶液、0.1重量%SDSと0.2×SSCとの混合溶液、および0.2×SSC水溶液で順次洗浄した後、600rpmで20秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、15360であった。
【0086】
【発明の効果】
本発明の固定方法を利用することによって、凹凸を有する固相担体の表面に、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、あるいはペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体あるいはその類縁体ヌクレオチドのプローブを高密度かつ安定に固定することができる。従って、本発明の固定方法によって作製されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、加水分解によるプローブの離脱が起こりにくい非常に安定な固相担体となる。特に、固相担体として、その表面にアミノ基等をシランカップリング剤を用いて導入した場合には、アミノ基等の固相担体表面への結合も、プローブの結合も共に共有結合であるため、固相担体上に強固にプローブを固定することができる。プローブの安定な固定により、遺伝子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を有する検出用具を得ることができる。
【0087】
その一つの例として、本発明によって作製されたオリゴヌクレオチド固定固相担体を用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行なうことにより、オリゴヌクレオチド固定固相担体に固定されているプローブに相補性を有する核酸断片試料を感度よく検出することができる。また、オリゴヌクレオチドなどのプローブ試料を反応性固相担体の表面に点着後、グリシン等のアニオン性化合物で固相担体表面を処理することによって、試料核酸断片の非特的吸着を防ぐことができ、このことは相補性を有する核酸断片試料の高感度の検出に大きな効果を発揮する。
【0088】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.Ltd.,
<120> A reactive solid support and an apparatus for detection of DNA fragment
<130> A11242MA
<160> 2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial DNA
<400> 1
ctagtctgtg aagtgtctga tc 22
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial DNA
<400> 2
tcctccatgt ccggggagga tctgacactt caaggtctag 40
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、実施例1の固定方法を示す模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to a detection tool useful for analyzing the structure of a biopolymer substance, and particularly useful for efficient analysis of gene expression, mutation, polymorphism, etc., and many biogenic polymer substances or analogs thereof. The present invention relates to a detection tool in which the is aligned and fixed on the surface of a solid support having irregularities. In particular, the present invention is a high-density array-type detection tool (DNA detection) in which a large number of nucleotide derivatives or analogs thereof are aligned and fixed on a solid support surface having irregularities at a high density, which is useful for analyzing the base sequence of a DNA fragment sample. Chip), and a reactive solid phase carrier that can be advantageously used for the production of a high-density array-type detection tool.
[0002]
[Prior art]
  Technological development for efficiently analyzing gene functions of various organisms is rapidly progressing, and many DNA fragments or synthesis called DNA chips are used to analyze the base sequences of those DNAs or DNA fragments. A detection tool in which a nucleotide derivative such as an oligonucleotide is immobilized on the surface of a solid phase substrate is used. Such detection molecules such as DNA or fragments thereof or synthetic oligonucleotides, such as nucleotide derivatives bound and fixed to the surface of a solid phase substrate, are also called probe molecules. A typical DNA chip is a microarray in which a large number of probe molecules are aligned and fixed on a solid phase carrier such as a slide glass. The DNA chip-related technology related to the manufacture and use of this DNA chip is considered to be applicable to the detection of biomolecules other than DNA, and is therefore new to drug discovery research, disease diagnosis and development of prevention methods, etc. It is expected to provide a means.
[0003]
  The technology related to the DNA chip has been realized when a method for determining a DNA base sequence by hybridization with an oligonucleotide has been devised. Although this method can overcome the limitations of the base sequencing method using gel electrophoresis, it has not been put into practical use at first.
[0004]
  Thereafter, a DNA chip having the above-described configuration and a production technique thereof were developed, and it became possible to efficiently investigate gene expression, mutation, polymorphism, and the like in a short time. That is, a DNA fragment sample (also referred to as a target DNA fragment) that is complementary to a DNA fragment or oligonucleotide on the prepared DNA chip is generally a DNA fragment or oligonucleotide on the DNA chip and labeled DNA. Detection is performed using hybridization with a fragment sample.
[0005]
  In order to put the DNA chip production technique into practical use, a technique for stably arranging a large number of DNA fragments and oligonucleotides on the surface of the solid support at high density is required.
[0006]
  As a method for producing a DNA chip, a method of directly synthesizing oligonucleotides on the surface of a solid phase carrier (referred to as “on-chip method”) and a DNA fragment or oligonucleotide prepared in advance are bound and fixed to the surface of the solid phase carrier. The method is known. As an on-chip method, a combination of the use of a protective group that is selectively removed by light irradiation, photolithography technology and solid phase synthesis technology used for semiconductor manufacturing, and oligonucleotides in a predetermined minute matrix region A method of selectively synthesizing (referred to as “masking technique”) is typical.
[0007]
  As a method for binding and fixing a DNA fragment or oligonucleotide prepared in advance to the surface of a solid phase carrier, the following methods are known depending on the type of DNA fragment and the type of solid phase carrier.
(1) When the DNA fragment to be immobilized is a cDNA (complementary DNA synthesized using mRNA as a template) or a PCR product (DNA fragment obtained by amplifying cDNA by the PCR method), the cDNA or PCR product is converted into a DNA chip. The spotter device provided in the production device is spotted on the surface of a solid carrier surface-treated with a polycation compound (polylysine, polyethyleneimine, etc.), and electrostatically is applied to the solid carrier using the charge of the DNA fragment. It is common to combine them. As a method for treating the surface of the solid support, a method using a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like is also used. In the surface treatment using this silane coupling agent, amino groups, aldehyde groups, etc. are immobilized on the surface of the solid support by covalent bonds, so that they are more stable and stable than in the case of surface treatment with a polycation compound. Fixed to the surface of the phase carrier.
[0008]
  As a modification of the above method using the charge of the DNA fragment, a PCR product modified with an amino group is suspended in SSC (standard saline-citrate buffer) and spotted on a silylated slide glass surface. It has been reported that after the incubation, a treatment with sodium borohydride and a heat treatment are sequentially performed. However, this immobilization method has a problem that it is difficult to obtain sufficient immobilization stability of DNA fragments. In DNA chip technology, the detection limit is important. Therefore, stable and stable binding of DNA fragments in a sufficient amount (that is, at a high density) on the surface of the solid phase carrier improves the detection limit of hybridization between the DNA fragment probe and the labeled sample nucleic acid fragment. Directly affects.
[0009]
(2) When the oligonucleotide (probe molecule) to be immobilized is a synthetic oligonucleotide, the surface of the solid phase carrier that has been surface-treated so as to first synthesize an oligonucleotide into which a reactive group has been introduced and to form a reactive group in advance. A method is also known in which the oligonucleotide is spotted and the oligonucleotide is covalently bonded to the surface of the solid support. For example, a method of reacting an amino group-introduced oligonucleotide in the presence of PDC (p-phenylenediisothiocyanate) on a slide glass having an amino group introduced on the surface, and reacting the slide glass with an aldehyde group-introduced oligonucleotide The method is known. These two methods have the advantage that the oligonucleotide is stably bound and immobilized on the surface of the solid phase carrier as compared with the method of immobilizing by electrostatic bonding utilizing the charge of the DNA fragment of (1). However, in the method in which PDC is present, the reaction between PDC and amino group-introduced oligonucleotide is slow, and in the method using aldehyde group-introduced oligonucleotide, the stability of the Schiff base which is a reaction product is low (thus, hydrolysis Is likely to occur).
[0010]
  In recent years, instead of oligonucleotides or polynucleotides (including synthesized oligonucleotides or polynucleotides and DNA molecules or DNA fragments, and RNA molecules or RNA fragments) as probe molecules for DNA chips, PNA (peptides A technique using an oligonucleotide analogue called “nucleic acid” has also been proposed. As a method for fixing this PNA to a solid phase substrate by covalent bond, a method using a combination of avidin and biotin is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 11-332595). This publication also describes a technique of using a surface plasmon resonance (SPR) biosensor as a solid phase substrate. Using a DNA chip on which a probe molecule is immobilized on a surface plasmon resonance biosensor, a DNA fragment bound and immobilized on the surface via hybridization can be detected using the surface plasmon resonance phenomenon.
[0011]
  It is also known to use a charge coupled device (CCD) as a substrate of a DNA chip (Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, No. 11, 2124-2125).
[0012]
  JP-A-4-222876 (corresponding to US Pat. No. 5,387,505) discloses a technique for separating a target DNA by binding a target DNA attached with a biotin molecule to a substrate having an avidin molecule immobilized on the surface. Are listed.
[0013]
  Japanese Examined Patent Publication No. 7-43380 (corresponding to US Pat. No. 5,094,962) discloses a detection tool for use in a ligand-receptor assay, which is received on the surface of a microporous polymer particle having a reactive group on the surface. Analytical tools with bound body molecules are described.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
  The present invention is a reactivity that can be used particularly advantageously to stably bind and immobilize nucleotide derivatives such as oligonucleotides, polynucleotides and peptide nucleic acids or their analogs prepared on the surface of a solid support at high density. To provide a detection tool for DNA, RNA, or a fragment thereof having a specific base sequence portion, in which a nucleotide derivative or an analog thereof is bound and fixed to the solid phase carrier and the reactive solid phase carrier. Let that be the issue.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
  The present invention relates to a reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer, wherein a vinylsulfonyl group is covalently immobilized via a linking group on the surface of an irregular glass carrier composed of a single layer of fine particles of an inorganic substance. It is in.
  The above irregularities are particles formed of an inorganic substance, and it is further desirable that the particles contain silicon, alumina, or titanium and have an average particle diameter of 50 μm or less.
  It is desirable that the linked body of the above-mentioned vinylsulfonyl group and linking group is represented by the following formula (1).
[0016]
-L-SO2-X (1)
[0017]
[In the above formula, X is -CR1= CR2RThreeR1, R2And RThreeAre independently of each other a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and a total number of carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. Represents an atom or group selected from the group consisting of 26 to aralkyl groups; and L represents a linking group.
[0018]
  In the above formula (1), X is —CH═CH2It is desirable that the vinyl group represented by
[0019]
  L is preferably a linking group containing a divalent or higher atom other than a carbon atom. L is preferably a linking group having a linking site such as —NH—, —S—, or —O—. An example of L is-(L1)n-NH- (CR1R2)2-Or-(L1)n-S- (CR1R2)2-[However, R1And R2Represents the same meaning as above, and L1Represents a linking group, and n is 0 or 1]. In particular, L is-(L1)n-NHCH2CH2-[However, L1Represents a linking group, and n is 0 or 1]. L above1Is preferably a linking group containing a group represented by -OSi-.
[0020]
  The reactive solid phase carrier of the present invention has the following formula (2) on a solid phase carrier having irregularities with a reactive group introduced on the surface:
[0021]
X1-SO2-L2-SO2-X2
[0022]
[In the above formula, X1And X2Are independent of each other, -CR1= CR2RThreeR1, R2And RThreeAre independently of each other a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and a total number of carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. Represents an atom or group selected from the group consisting of thirty-six aralkyl groups; and L2Represents a linking group]
It can manufacture easily by making the disulfone compound represented by these contact.
[0023]
  A typical example of the disulfone compound represented by the above formula (2) is 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane.
[0024]
  The reactive group introduced on the surface of the solid phase carrier is preferably an amino group, a mercapto group or a hydroxyl group.
[0025]
  The present invention also provides a nucleotide derivative having a reactive group that forms a covalent bond by reacting with the reactive group on the surface of a reactive solid phase carrier having a vinylsulfonyl group immobilized by a covalent bond, or an analog thereof. There is also a method for producing a solid phase carrier in which a nucleotide derivative or an analog thereof is bound and fixed to the surface of a carrier through a linking group having a sulfonyl group.
[0026]
  Representative examples of nucleotide derivatives or their analogs immobilized on a solid phase carrier having irregularities include oligonucleotides, polynucleotides, and peptide nucleic acids. These nucleotide derivatives or analogs thereof include a vinylsulfonyl group such as an amino group, an imino group, a hydrazino group, a carbamoyl group, a hydrazinocarbonyl group, or a carboximide group at or near one end of the molecule. Those having a reactive group that forms a covalent bond that reacts with the group are utilized.
[0027]
  The solid phase carrier having irregularities to which the nucleotide derivative or its analog is fixed is an oligonucleotide or polynucleotide (DNA or its) that exhibits complementarity to the fixed nucleotide derivative or its analog in the presence of an aqueous medium. The complementary oligonucleotide or polynucleotide can be fixed by bringing a fragment or RNA or a fragment thereof into contact with each other to generate hybridization. The complementary oligonucleotide or polynucleotide to be immobilized preferably has a detectable label (for example, a fluorescent label) bound thereto so that the immobilization can be detected from the outside.
  The present invention also utilizes a solid phase carrier having irregularities in which the above-described nucleotide derivative or its analog is bound and fixed to the surface of the carrier, or a solid phase carrier in which the above-mentioned complementary oligonucleotide or polynucleotide is bound and fixed. The present invention also relates to a gene identification or screening method characterized by
[0028]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  The reactive solid phase carrier of the present invention has a configuration in which a vinylsulfonyl group is bonded and fixed to a surface of a solid phase carrier having irregularities through a covalent bond via a linking group. The reactive solid phase carrier of the present invention is prepared by preparing a solid phase carrier having irregularities in which a reactive group is introduced on the surface in advance, and reacting with the solid phase carrier and the reactive group provided on the surface of the carrier. It can be produced by contacting a compound having a reactive group that forms a bond at one end or near the end and a vinylsulfonyl group at the other end or near the end.
[0029]
  The solid phase carrier is preferably a substrate having a smooth surface, particularly hydrophobic or low hydrophilicity. Alternatively, a substrate with low planarity whose surface is uneven can be used. Solid phase carrier materials include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polymers such as polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymethyl methacrylate, silicon, activated carbon, porous glass, porous Various porous materials such as ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven and knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, membrane filter and the like can be exemplified. The pore size of the porous material is preferably in the range of 2 to 1000 nm, and particularly preferably in the range of 2 to 500 nm. The material of the solid support is particularly preferably glass or silicon. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the solid support is preferably in the range of 100 to 2000 μm.
[0030]
  As the solid phase carrier having irregularities used for the production of the reactive solid phase carrier of the present invention, various solid phase carriers that have been used for the production of DNA chips or have been proposed for the production of DNA chips are conventionally used. It can be preferably used. Examples of such a solid support include a glass substrate, a resin substrate, a glass substrate or a resin substrate surface-treated with a silane coupling agent, or a glass substrate or a resin substrate having a coating layer on the surface. . The solid phase carrier is particularly preferably a silicate glass substrate, a silicate glass substrate surface-treated with a silane coupling agent, or a silicate glass substrate coated with an organic coating layer. Further, it may be an electrode substrate used as a substrate of a DNA chip used in an electrochemical analysis method. Further, various functional substrates such as the aforementioned surface plasmon resonance (SPR) biosensor substrate and charge coupled device (CCD) may be used. Furthermore, in addition to these substrates, a particulate solid support can also be used.
  Further, the uneven material is preferably particles formed of an inorganic material, such as colloidal silica, alumina sol, titanium oxide, ZrO.2Metal oxides such as, plastics having hydroxyl groups, latexes, and the like. The particle diameter is preferably 50 μm or less, and in the case of confocal laser fluorescence detection, it is preferable to use fine particles of 100 nm or less in order to suppress the background. As a method of coating the unevenness material on the solid phase carrier, the unevenness material can be easily imparted with unevenness by mixing the uneven material with a silane coupling agent, contacting the solid phase carrier and reacting. can do. This is particularly effective when the solid support is particularly glass. Alternatively, it can also be produced by bringing an uneven material into contact with each other, drying, and treating with a silane coupling agent.
  When irregularities are generated by coating a solid phase carrier with a particulate substance, there is an advantage that the surface area becomes considerably larger than that of a smooth surface and the amount of bound DNA fragments can be greatly increased. Furthermore, the single layer is more advantageous than the multilayer form for the following reasons.
1. When detecting by fluorescence, luminescence, RI, etc., the scattering by excitation light or a luminescent substance decreases, and the background decreases.
2. Since the penetration of the liquid at the time of spotting is small, the spot diameter can be reduced, and a high-density array can be created.
3. In the post-hybridization operation, a post-treatment washing step for removing unreacted labeled specimen is facilitated. In the case of multiple layers, the labeled specimen enters the voids between the particles. For this reason, it is necessary to perform a washing | cleaning process fully, and when it is inadequate, a background is often high.
[0031]
  In order to bind and fix a bifunctional reactive compound such as a divinyl sulfone compound by covalent bonding on the surface of the solid support having irregularities, a polycation compound (for example, poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyalkylamine) is used. Are coated with a polymer having an amino group in the side chain, such as poly-L-lysine (in this case, the reactive group introduced to the surface of the solid support is amino Preferably). Alternatively, the surface of the solid phase carrier can be contact-treated with a surface treatment agent having a reactive group that reacts with the surface of the solid phase carrier such as a silane coupling agent and a reactive group such as an amino group.
[0032]
  In the case of a coating treatment with a polycation compound, the solid support surface having irregularities is introduced into the solid support surface by an electrostatic bond between the polymer compound and the solid support surface. In the case of surface treatment with a silane coupling agent, the amino group or mercapto group is stably present on the surface of the solid support because it is covalently bonded to the surface of the solid support. In addition to an amino group and a mercapto group, an aldehyde group, an epoxy group, a carboxyl group, or a hydroxyl group can also be preferably introduced.
[0033]
  Examples of the silane coupling agent having an amino group include γ-aminopropyltriethoxysilane, N-β (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane, and N-β (aminoethyl) -γ-aminopropylmethyldimethoxysilane. It is preferable to use γ-aminopropyltriethoxysilane.
[0034]
  A treatment using a polycation compound may be combined with a treatment using a silane coupling agent. By this method, electrostatic interaction between a solid phase carrier having hydrophobicity or low hydrophilicity and a DNA fragment can be promoted. A layer made of a hydrophilic polymer having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be further provided on the surface of the solid phase carrier treated with the polycation compound. By providing such a layer, the unevenness of the solid phase carrier treated with the polycation compound can be reduced. Depending on the type of the solid phase carrier, it is possible to contain a hydrophilic polymer or the like in the carrier, and a solid phase carrier subjected to such treatment can also be preferably used.
[0035]
  On the surface of a solid phase carrier for a normal DNA chip, a number of regions or presumed regions are set in advance, and for each region, a bifunctional reactive compound such as a divinyl sulfone compound and A reactive group capable of reacting is previously introduced. The surface of each region of the solid phase carrier to be used is provided with a reactive group such as the amino group, mercapto group, or hydroxyl group described above. As described above, the reactive group can be formed by using a surface treatment with a silane coupling agent or a method in which a polymer having a reactive group such as an amino group in its side chain is coated and coated on the surface of a solid phase carrier. Introduction is done.
[0036]
  When the solid phase carrier having a reactive group is brought into contact with a bifunctional reactive compound such as a divinyl sulfone compound, the reactive group and the bifunctional reactive compound react to form a covalent bond, The reactive group portion of the solid phase carrier is extended to form a reactive chain having a vinylsulfonyl group at or near the tip, thereby producing the reactive solid phase carrier of the present invention.
[0037]
  In the reactive solid phase carrier of the present invention, it is desirable that the conjugate of the vinylsulfonyl group and the linking group introduced on the surface of the solid phase carrier is represented by the following formula (1).
[0038]
    -L-SO2-X (1)
[0039]
  In the above formula (1), X is -CR1= CR2RThreeRepresents. R1, R2And RThreeAre independently of each other a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a total number of carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. 7 to 26 aralkyl groups are represented. Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, and an n-hexyl group, and a methyl group is particularly preferable. . Examples of the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group. R1, R2And RThreeAre preferably hydrogen atoms.
[0040]
  L is a solid phase carrier or a linking group bonded to the solid phase carrier, and -SO2-Represents a divalent or higher linking group linking the X group. However, L may be a single bond. The divalent linking group includes an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, an aliphatic ring group having 3 to 16 carbon atoms, an arylene group having 6 to 20 carbon atoms, N, S, and P. A heterocyclic group having 2 to 20 carbon atoms containing 1 to 3 heteroatoms selected from the group, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -SOThree-, -NR11It is preferably a group formed by combining one or more groups selected from the group consisting of —, —CO—, and combinations thereof. R11Is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 21 carbon atoms having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. It is preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group.
  L is -NR11-, -SONR11-, -CONR11-, -NR11COO- and -NR11CONR11When the group is a combination of two or more groups selected from the group consisting of:11They may be bonded to each other to form a ring.
[0041]
  R11An alkyl group of R11An aryl group of11The aralkyl group may have a substituent. Examples of such a substituent include a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 7 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms. Alkyl groups, aralkyl groups having 7 to 16 carbon atoms, aryl groups having 6 to 20 carbon atoms, sulfamoyl groups (or Na salts, K salts thereof, etc.), sulfo groups (or Na salts, K salts thereof, etc.) ), Carboxylic acid groups (or Na salts, K salts thereof, etc.), halogen atoms, alkenylene groups having 1 to 6 carbon atoms, arylene groups having 6 to 20 carbon atoms, sulfonyl groups, and combinations thereof An atom or group selected from the group can be mentioned.
[0042]
  Preferred specific examples of the “—X” group are shown below.
[0043]
[Chemical 1]
Figure 0003857075
[0044]
  Preferred specific examples of L are shown below. However, a is an integer of 1 to 6, preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. b is an integer of 0 to 6, and is preferably 2 or 3.
[0045]
[Chemical 2]
Figure 0003857075
[0046]
  As L, in addition to the above-described divalent linking group, the hydrogen atom of the alkylene group of the above formula is —SO 2.2CH = CH2A group substituted by a group is also preferred.
[0047]
  As the bifunctional reactive compound used for obtaining a solid phase carrier in which the vinylsulfonyl group represented by the above formula (1) is fixed by a covalent bond, a disulfone compound represented by the following formula (2) is advantageous. Available to:
[0048]
  X1-SO2-L2-SO2-X2     (2)
[0049]
[In the above formula, X1And X2Are independent of each other, -CR1= CR2RThreeR1, R2And RThreeAre independently of each other a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and a total number of carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. Represents an atom or group selected from the group consisting of thirty-six aralkyl groups; and L2Represents a linking group.
[0050]
  That is, the reactive solid phase carrier of the present invention can be easily produced by bringing the disulfone compound represented by the above formula (2) into contact with the above solid phase carrier, for example, in an aqueous atmosphere.
[0051]
  Typical examples of disulfone compounds preferably used in the present invention are shown below. In addition, you may use a disulfone compound in mixture of 2 or more types.
[0052]
[Chemical Formula 3]
Figure 0003857075
[0053]
[Formula 4]
Figure 0003857075
[0054]
  A typical example of the disulfone compound represented by the above formula (2) is 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane [corresponding to the above S1].
[0055]
  With respect to the synthesis method of the disulfone compound used in the present invention, various publications such as JP-B Nos. 47-2429, 50-35807, JP-A-49-24435, 53-41551, and 59-18944 are known. Details.
[0056]
  A detection tool (generally a DNA chip) for detecting and fixing naturally occurring polynucleotides or oligonucleotides such as DNA, RNA, DNA fragments, or RNA fragments using the reactive solid phase carrier obtained as described above. The reactive solid phase carrier described above was provided with a reactive group such as an amino group that reacts with a vinylsulfonyl group on the surface of the carrier to form a covalent bond. A method of contacting with a nucleotide derivative or an analog thereof is used. That is, a detector (so-called DNA chip) including a probe molecule composed of a desired nucleotide derivative or its analog can be produced in this way.
[0057]
  The vinylsulfonyl group bonded to the surface of the solid phase substrate of the present invention via a covalent bond has high resistance to hydrolysis, and thus can be easily and stably stored. Or a reactive group such as an amino group or a reactive group of a nucleotide derivative or an analog thereof can be reacted rapidly to form a stable covalent bond.
[0058]
  Representative examples of nucleotide derivatives or their analogs used as probe molecules include oligonucleotides, polynucleotides, and peptide nucleic acids. These nucleotide derivatives or analogs thereof may be of natural origin (DNA, DNA fragments, RNA, RNA fragments, etc.) or synthetic compounds. Examples of nucleotide derivatives or analogs thereof include various analogs such as a compound called LNA (described in J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 13252-13253) having a crosslinking group in the sugar unit portion. included.
[0059]
  When a DNA fragment is used as a probe molecule, it can be divided into two types according to the purpose. In order to examine gene expression, it is preferable to use cDNA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The functions of these polynucleotides may be unknown, but they are generally amplified by PCR using a cDNA library, genomic library or whole genome as a template based on sequences registered in a database. (Hereinafter referred to as “PCR product”). Those not amplified by the PCR method can also be preferably used. In order to examine gene mutations and polymorphisms, it is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms based on known standard sequences and use them. Furthermore, when analyzing the nucleotide sequence, 4nIt is preferable to synthesize oligonucleotides (n is the length of the base) and use them. The base sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general base sequence determination method. The DNA fragment is preferably a 2 to 50-mer, particularly preferably a 10 to 25-mer.
[0060]
  A reactive group that reacts with the vinylsulfonyl group to form a covalent bond is introduced into one end of a nucleotide derivative such as an oligonucleotide or a DNA fragment or an analog thereof. Such a reactive group is preferably an amino group, an imino group, a hydrazino group, a carbamoyl group, a hydrazinocarbonyl group, or a carboxyimide group, and particularly preferably an amino group. These reactive groups are usually bonded to oligonucleotides and DNA fragments via a crosslinker. As the crosslinker, for example, an alkylene group or an N-alkylamino-alkylene group is used, but a hexylene group or an N-methylamino-hexylene group is preferable, and a hexylene group is particularly preferable. In addition, since peptide nucleic acid (PNA) has an amino group, it is usually unnecessary to introduce another reactive group.
[0061]
  Contact of a nucleotide derivative having a reactive group or an analog thereof with a reactive solid phase carrier is usually carried out by spotting an aqueous solution of the nucleotide derivative or an analog thereof onto the surface of the reactive solid phase carrier. The Specifically, a nucleotide derivative having a reactive group or an analog thereof is dissolved or dispersed in an aqueous medium to obtain an aqueous liquid, and then the aqueous liquid is dispensed into a 96-well or 384-hole plastic plate. The poured aqueous liquid is preferably dropped on the surface of the solid support using a spotter device or the like.
[0062]
  In order to prevent drying of the nucleotide derivative or its analog after spotting, a substance having a high boiling point may be added to an aqueous liquid in which the nucleotide derivative or its analog is dissolved or dispersed. High-boiling substances include those that can be dissolved in an aqueous solution in which a nucleotide derivative or its analog after spotting is dissolved or dispersed, such as a nucleic acid fragment sample (target nucleic acid fragment) to be detected; It is preferable to use a substance that does not hinder hybridization and does not have a very high viscosity. Examples of such substances include glycerin, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, and low molecular weight hydrophilic polymers. Examples of the hydrophilic polymer include polyacrylamide, polyethylene glycol, and sodium polyacrylate. The molecular weight of this polymer is 10ThreeThru 106It is preferable that it exists in the range. As the substance having a high boiling point, it is more preferable to use glycerin or ethylene glycol, and it is particularly preferable to use glycerin. The concentration of the substance having a high boiling point is preferably in the range of 0.1 to 2% by volume, particularly preferably in the range of 0.5 to 1% by volume in the aqueous solution of the nucleotide derivative or its analog.
[0063]
  For the same purpose, it is also preferable to place the solid support after spotting the nucleotide derivative or its analog in an environment having a humidity of 90% or more and a temperature range of 25 to 50 ° C.
[0064]
  After spotting a nucleotide derivative having a reactive group or an analog thereof, post-treatment with ultraviolet light, sodium borohydride or a Schiff reagent may be performed. These post-treatments may be performed by combining a plurality of types, and it is particularly preferable to perform a combination of heat treatment and ultraviolet treatment. These post-treatments are particularly effective when the solid support surface is treated only with the polycation compound. It is also preferable to perform incubation after spotting. After the incubation, it is preferable to remove the unreacted nucleotide derivative or its analog by washing.
[0065]
  The fixed amount (number) of nucleotide derivative or its analog is 10 with respect to the solid support surface.2Thru 10FiveType / cm2It is preferable that it exists in the range. The amount of the nucleotide derivative or its analog is 1 to 10-15It is in the range of moles, and the weight is preferably several ng or less. By spotting, the aqueous liquid of the nucleotide derivative or its analog is fixed in the form of dots on the surface of the solid phase carrier. The shape of the dots is almost circular. The absence of variation in shape is important for quantitative analysis of gene expression and single nucleotide mutation analysis. The distance between the dots is preferably in the range of 0 to 1.5 mm, and particularly preferably in the range of 100 to 300 μm. The size of one dot is preferably in the range of 50 to 300 μm in diameter. The amount of the nucleotide derivative or its analog spotted on the surface of the solid phase carrier is preferably in the range of 100 pL to 1 μL, and particularly preferably in the range of 1 to 100 nL.
[0066]
  The lifetime of the solid phase carrier to which the nucleotide derivative or its analog produced by the method of the present invention is immobilized is usually several weeks for the cDNA-immobilized solid phase carrier to which cDNA is immobilized, and the synthetic oligonucleotide is immobilized. The solid phase carrier thus formed has a longer period. The solid phase carrier on which the nucleotide derivative of the present invention or an analog thereof is immobilized is used for gene expression monitoring, nucleotide sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis, and the like. The detection principle is hybridization with a labeled sample nucleic acid fragment described later.
[0067]
  As labeling methods, RI methods and non-RI methods (fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method, etc.) are known, but in the present invention, it is preferable to use the fluorescence method. As the fluorescent substance used for the fluorescent label, any substance can be used as long as it can bind to the base portion of the nucleic acid.TMSeries Cy3, Cy5, etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N2-Acetylaminofluorene (AAF) or AAIF (iodine derivative of AAF) can be used.
[0068]
  As the sample nucleic acid fragment, a nucleic acid fragment sample such as a DNA fragment sample or an RNA fragment sample whose sequence or function is unknown is usually used.
[0069]
  The nucleic acid fragment sample is preferably isolated from a eukaryotic cell or tissue sample for the purpose of examining gene expression. If the sample is a genome, it is preferably isolated from any tissue sample except red blood cells. Arbitrary tissues other than red blood cells are preferably peripheral blood lymphocytes, skin, hair, semen and the like. If the sample is mRNA, it is preferably extracted from a tissue sample in which the mRNA is expressed. mRNA is labeled by incorporating a labeled dNTP ("dNTP" means deoxyribonucleotide whose base is adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or thymine (T)) by a reverse transcription reaction. It is preferable to use cDNA. As dNTP, it is preferable to use dCTP because of chemical stability. The amount of mRNA required for one hybridization is several μg or less, although it depends on the amount of liquid to be spotted and the labeling method. When the DNA fragment on the nucleotide derivative or its analog-immobilized solid phase carrier is an oligo DNA, it is desirable that the nucleic acid fragment sample has a low molecular weight. In prokaryotic cells, since selective extraction of mRNA is difficult, it is preferable to label total RNA.
[0070]
  The nucleic acid fragment sample is preferably obtained by PCR of the target region in a reaction system containing a labeled primer or labeled dNTP for the purpose of examining gene mutation or polymorphism.
[0071]
  For hybridization, an aqueous solution prepared by dissolving or dispersing a labeled nucleic acid fragment sample dispensed in a 96-well or 384-well plastic plate is used as a solid phase carrier on which the nucleotide derivative of the present invention or an analog thereof is immobilized. It is preferably carried out by spotting on top. The amount of spotting is preferably in the range of 1 to 100 nL. Hybridization is preferably carried out in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 6 to 20 hours. After completion of the hybridization, it is preferable to remove the unreacted nucleic acid fragment sample by washing with a mixed solution of a surfactant and a buffer solution. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, and the like can be used, and it is particularly preferable to use a citrate buffer solution.
[0072]
  A feature of hybridization using a solid phase carrier on which a nucleotide derivative or its analog is immobilized is that the amount of labeled nucleic acid fragment sample used can be greatly reduced. Therefore, it is necessary to set the optimum hybridization conditions according to the chain length of the nucleotide derivative or its analog immobilized on the solid phase carrier and the type of the labeled nucleic acid fragment sample. For analysis of gene expression, it is preferable to perform hybridization for a long time so that low-expressing genes can be sufficiently detected. For detection of single base mutation, it is preferable to perform hybridization for a short time. In addition, two types of nucleic acid fragment samples labeled with different fluorescent substances are prepared and simultaneously used for hybridization, so that the expression level can be compared and quantified on the same DNA fragment-fixed solid phase carrier.
  The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0073]
【Example】
Example 1: Preparation of a DNA fragment-fixed slide and measurement of the amount of DNA fragment fixed
  The preparation and performance of a concavo-convex reactive solid support and its comparison with a reactive solid support without concavo-convex as a comparison are shown below.
[0074]
(1) Preparation of an uneven solid phase carrier (A) having a vinylsulfonyl group introduced
  200 ml of a 5% by mass suspension of colloidal silica (Snowtex PS-S [Nissan Chemical Industry] / average particle size of about 10 nm) is made, and 20 washed glass slides are placed in a commercially available basket for 30 seconds. Soak. After pulling up, it is drained and dried in a dryer at 45 ° C. for 10 minutes. Next, this glass slide is reacted with 200 ml of a 2% by weight solution of Shin-Etsu Silicone KBE903 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) for 3 minutes using a commercially available slide washer. After completion of the reaction, wash with 200 ml of ultrapure water for 1 minute (use slide washer). Repeated twice under the above-mentioned washing conditions while exchanging ultrapure water. After rinsing with water, it is dried for 10 minutes with a dryer at 45 ° C. and then heat-treated for 10 minutes in an oven set at 110 ° C. After cooling, the reaction is carried out for 120 minutes using a slide washer in a 3% by mass 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide) ethane / pH 8.0 borate buffer solution. After completion of the reaction, it is washed with ultrapure water for 20 seconds × 3 times. Drying was carried out for 30 minutes with a drier set at 25 ° C. to obtain an uneven solid phase carrier (A). When the surface of (A) was observed with an atomic force microscope (AFM), it was found that the thickness was about 10 nm, and it was confirmed that it was coated with a single layer.
[0075]
(2) Spotting of DNA fragments and measurement of fluorescence intensity
  The DNA fragment (3′-TCTCTCCATGTCCGGGGAGGATCTGCATACTACTCAAGGTCTAG-5 ′) modified with an amino group and a fluorescent labeling reagent (FluoroLink Cy5-dCTP, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), respectively, at the 3 ′ end and the 5 ′ end is 0.1 M carbonic acid. An aqueous liquid (1 × 10 6) dispersed in a buffer solution (pH 9.3)-6M, 1 μL) was spotted on the slide (A) obtained in (1) above. Immediately after the spotted solid phase carrier was allowed to stand at 25 ° C. and 90% humidity for 1 hour, this solid phase carrier was mixed with 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 × SSC (2 × SSC: SSC). The stock solution was diluted twice with a mixed solution of SSC (standard saline-citrate buffer solution) and washed once with a 0.2 × SSC aqueous solution. Next, the washed slide was immersed in a 0.1 M glycine aqueous solution (pH 10) for 1 hour 30 minutes, washed with distilled water, dried at room temperature, and a solid phase carrier (B ) The fluorescence intensity on the surface of the solid support (B) was measured with a fluorescence scanning apparatus, and was 15250.
[0076]
(3) Preparation and performance of comparative slides
  A glass slide is reacted with 200 ml of a 2% by weight solution of Shin-Etsu Silicone KBE903 (Shin-Etsu Chemical) for 3 minutes using a commercially available slide washer. After completion of the reaction, wash with 200 ml of ultrapure water for 1 minute (use slide washer). Repeated twice under the above-mentioned washing conditions while exchanging ultrapure water. After rinsing with water, it is dried for 10 minutes in a dryer at 45 ° C. and then heat-treated for 10 minutes in an oven set at 110 ° C. After cooling, the reaction is carried out for 120 minutes using a slide washer with 3% by weight of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane / pH 8.0 borate buffer solution. After completion of the reaction, wash with ultrapure water for 20 seconds x 3 times. Drying is performed for 30 minutes in a dryer set at 25 ° C. The same evaluation as in (2) above was performed to obtain a fluorescence intensity of 2300.
[0077]
  The results are summarized in the following table.
[0078]
[Table 1]
Figure 0003857075
[0079]
  From the results shown in Table 1, it can be seen that the DNA fragment was efficiently fixed to the slide glass with high density by the immobilization method of the present invention.
[0080]
Example 2: Detection of sample DNA fragments
(1) Production of solid phase carrier on which uneven DNA fragments are immobilized
  An aqueous solution (1 × 10 4) obtained by dispersing a 40-mer DNA fragment (3′-TCCTCCCATGTCCGGGGAGGATCTCGACACTTCAAGGTCTAG-5 ′) modified with an amino group at the 3 ′ end in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3).-6M, 1 μL) was spotted on the uneven solid phase carrier (A) obtained in (1) of Example 1. Immediately after the spotted solid phase carrier was allowed to stand at 25 ° C. and 90% humidity for 1 hour, this solid phase carrier was mixed with 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 × SSC (2 × SSC: SSC). The stock solution was diluted twice with a mixed solution of SSC (standard saline-citrate buffer solution) and washed once with a 0.2 × SSC aqueous solution. Next, the washed slide was immersed in a 0.1 M glycine aqueous solution (pH 10) for 1 hour 30 minutes, washed with distilled water, dried at room temperature, and a solid phase carrier (C )
[0081]
(2) Detection of sample DNA fragments
  A 22-mer sample oligonucleotide (CTAGTCTGGTGAAGTTCCAGATC-5 ′) having Cy5 bound to the 5 ′ end was dispersed in a hybridization solution (mixed solution of 4 × SSC and 10 wt% SDS) (20 μL). The sample was spotted on the solid support (C) obtained in 1), and the surface was protected with a microscope cover glass, followed by incubation at 60 ° C. for 20 hours in a moisture chamber. Next, this was sequentially washed with a mixed solution of 0.1 wt% SDS and 2 × SSC, a mixed solution of 0.1 wt% SDS and 0.2 × SSC, and an aqueous 0.2 × SSC solution, It centrifuged at 600 rpm for 20 seconds, and dried at room temperature. The fluorescence intensity on the surface of the slide glass was measured with a fluorescence scanning device and found to be 10350.
[0082]
  Further, when a sample DNA fragment was detected using a comparative slide, the fluorescence intensity was 1500.
  It can be seen that the sample DNA fragment complementary to the immobilized DNA fragment can be detected with high sensitivity by using the uneven DNA fragment-immobilized solid phase carrier prepared by the immobilization method of the present invention.
[0083]
Reference Example 1: Preparation of a DNA fragment-fixed slide and measurement of the amount of DNA fragment fixed
(1) Preparation of an uneven solid phase carrier having a vinylsulfonyl group introduced
  Coated slide glass for DNA microarray (Type 2 densified amino group-introduced type [Matsunami Glass Industry]) using a slide washer in 3 wt% 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide) ethane / pH 8.0 borate buffer solution, React for 120 minutes. After completion of the reaction, it is washed with ultrapure water for 20 seconds × 3 times. Drying is performed for 30 minutes in a dryer set at 25 ° C. Evaluation similar to (2) of Example 1 was performed to obtain fluorescence intensity 3600.
[0084]
Reference Example 2: Detection of sample DNA fragment
(1) Production of DNA fragment immobilization carrier made of Matsunami glass
  An aqueous solution (1 × 10 4) obtained by dispersing a 40-mer DNA fragment (3′-TCCTCCCATGTCCGGGGAGGATCTCGACACTTCAAGGTCTAG-5 ′) modified with an amino group at the 3 ′ end in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3).-6M, 1 μL)Reference example 1It was spotted on the uneven solid support obtained in (1). Immediately after the spotted solid phase carrier was allowed to stand at 25 ° C. and 90% humidity for 1 hour, this solid phase carrier was mixed with 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 × SSC (2 × SSC: SSC). The stock solution was diluted twice with a mixed solution of SSC (standard saline-citrate buffer solution) and washed once with a 0.2 × SSC aqueous solution. Next, the washed slide was immersed in a 0.1 M glycine aqueous solution (pH 10) for 1 hour 30 minutes, washed with distilled water, dried at room temperature, and a solid phase carrier (D )
[0085]
(2) Detection of sample DNA fragments
  A 22-mer sample oligonucleotide (CTAGTCTGGTGAAGTTCCAGATC-5 ′) having Cy5 bound to the 5 ′ end was dispersed in a hybridization solution (mixed solution of 4 × SSC and 10 wt% SDS) (20 μL). After spotting on the solid support (D) obtained in 1) and protecting the surface with a cover glass for a microscope, it was incubated at 60 ° C. for 20 hours in a moisture chamber. Next, this was sequentially washed with a mixed solution of 0.1 wt% SDS and 2 × SSC, a mixed solution of 0.1 wt% SDS and 0.2 × SSC, and an aqueous 0.2 × SSC solution, It centrifuged at 600 rpm for 20 seconds, and dried at room temperature. It was 15360 when the fluorescence intensity of the slide glass surface was measured with the fluorescence scanning apparatus.
[0086]
【The invention's effect】
  By using the immobilization method of the present invention, oligonucleotide derivatives such as oligonucleotides, polynucleotides, or peptide nucleic acids, or analog nucleotide probes thereof can be immobilized with high density and stability on the surface of a solid support having irregularities. Can do. Therefore, the solid phase carrier to which the nucleotide derivative or its analog produced by the immobilization method of the present invention is immobilized becomes a very stable solid phase carrier that is unlikely to cause the probe to be detached by hydrolysis. In particular, when an amino group or the like is introduced onto the surface of the solid phase carrier using a silane coupling agent, both the binding of the amino group and the like to the surface of the solid phase carrier and the probe are covalent bonds. The probe can be firmly fixed on the solid support. By the stable fixation of the probe, a detection tool having a high detection limit that can be effectively used for gene analysis or the like can be obtained.
[0087]
  As one example, the oligonucleotide fixed solid phase carrier prepared according to the present invention is used to perform hybridization with a sample nucleic acid fragment, thereby complementing the probe fixed on the oligonucleotide fixed solid phase carrier. The nucleic acid fragment sample can be detected with high sensitivity. In addition, after spotting a probe sample such as an oligonucleotide on the surface of a reactive solid phase carrier, non-specific adsorption of the sample nucleic acid fragment can be prevented by treating the solid phase carrier surface with an anionic compound such as glycine. This has a great effect on highly sensitive detection of nucleic acid fragment samples having complementarity.
[0088]
[Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co. Ltd.,
<120> A reactive solid support and an apparatus for detection of DNA fragment
<130> A11242MA
<160> 2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial DNA
<400> 1
ctagtctgtg aagtgtctga tc 22
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial DNA
<400> 2
tcctccatgt ccggggagga tctgacactt caaggtctag 40
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a fixing method according to a first embodiment.

Claims (23)

無機物質の微粒子の単層から成る凹凸を有するガラス担体の表面に、ビニルスルホニル基が連結基を介して共有結合により固定されてなる、生体高分子固定用の反応性固相担体。 A reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer , wherein a vinylsulfonyl group is covalently immobilized via a linking group on the surface of a glass substrate having irregularities composed of a single layer of fine particles of an inorganic substance. 凹凸が、珪素、アルミナ又はチタンを含有する、平均粒子径が50μm以下の粒子であることを特徴とする、請求項1に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。 The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 1, wherein the irregularities are particles containing silicon, alumina, or titanium and having an average particle diameter of 50 µm or less. ビニルスルホニル基と連結基との連結体が下記の式により表わされるものである請求項1又は2に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体:
−L−SO2−X
[上記の式において、Xは、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、Lは連結基を表わす]。
The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 1 or 2, wherein the conjugated product of a vinylsulfonyl group and a linking group is represented by the following formula:
-L-SO 2 -X
[In the above formula, X represents —CR 1 ═CR 2 R 3 ; R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon atom And represents an atom or group selected from the group consisting of an aryl group having 6 to 20 carbon atoms and an aralkyl group having 7 to 26 carbon atoms in total having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms; Represents a group].
Xが、−CH=CH2で表わされるビニル基であることを特徴とする請求項3に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。X is reactive solid carrier for biopolymer fixing according to claim 3, characterized in that the vinyl group represented by -CH = CH 2. Lが、炭素原子以外の二価以上の原子を含む連結基であることを特徴とする請求項3に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。 The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 3, wherein L is a linking group containing a divalent or higher valent atom other than a carbon atom. Lが、−NH−、−S−、および−O−からなる群から選ばれる連結部位を有する連結基であることを特徴とする請求項5に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。 The reactive solid phase for immobilizing a biopolymer according to claim 5, wherein L is a linking group having a linking site selected from the group consisting of -NH-, -S-, and -O-. Carrier. Lが、−(L1n−NH−(CR122−又は−(L1n−S−(CR122−[但し、R1及びR2は前記と同じ意味を表わし、L1は連結基を表わし、そしてnは0もしくは1である]で表わされる連結基であることを特徴とする請求項3に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。L is — (L 1 ) n —NH— (CR 1 R 2 ) 2 — or — (L 1 ) n —S— (CR 1 R 2 ) 2 — [wherein R 1 and R 2 are the same as above. 4. The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 3, wherein the reactive solid phase carrier represents a meaning, L 1 represents a linking group, and n is 0 or 1. . Lが、−(L1n−NHCH2CH2−[但し、L1は連結基を表わし、
そしてnは0もしくは1である]で表わされる連結基あることを特徴とする請求項3に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。
L is — (L 1 ) n —NHCH 2 CH 2 — [wherein L 1 represents a linking group;
The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 3, wherein n is 0 or 1.
1が、−OSi−で表わされる基を含む連結基であって、nが1であることを特徴とする請求項7もしくは8に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。 The reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 7 or 8, wherein L 1 is a linking group containing a group represented by -OSi-, and n is 1. 固相担体が、ガラス基板、シランカップリング剤で表面処理されたガラス基板、および表面に被覆層を有するガラス基板からなる群から選ばれるシート状の基板である請求項1に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。The biopolymer according to claim 1, wherein the solid phase carrier is a sheet-like substrate selected from the group consisting of a glass substrate, a glass substrate surface-treated with a silane coupling agent, and a glass substrate having a coating layer on the surface. reactive solid support fixing. 固相担体が、ケイ酸ガラス基板、シランカップリング剤で表面処理されたケイ酸ガラス基板、及び有機質被覆層で被覆されたケイ酸ガラス基板からなる群から選ばれるシート状の基板である請求項10に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体。The solid phase carrier is a sheet-like substrate selected from the group consisting of a silicate glass substrate, a silicate glass substrate surface-treated with a silane coupling agent, and a silicate glass substrate coated with an organic coating layer. 10. A reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to 10. 表面に反応性基が導入された固相担体に、下記式:
1−SO2−L2−SO2−X2
[上記の式において、X1およびX2は互いに独立に、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、L2は連結基を表わす]
で表わされるジスルホン化合物を接触させることを特徴とする、請求項3に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体の製造方法。
A solid phase carrier having a reactive group introduced on its surface has the following formula:
X 1 -SO 2 -L 2 -SO 2 -X 2
[In the above formula, X 1 and X 2 independently represent —CR 1 ═CR 2 R 3 ; R 1 , R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, 1 to An atom or group selected from the group consisting of 6 alkyl groups, aryl groups having 6 to 20 carbon atoms, and aralkyl groups having 7 to 26 carbon atoms in total having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms And L 2 represents a linking group]
The method for producing a reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 3, wherein the disulfone compound represented by the formula:
固相担体表面に導入されている反応性基が、アミノ基、メルカプト基もしくはヒドロキシル基である請求項12に記載の生体高分子固定用の反応性固相担体の製造方法。The method for producing a reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer according to claim 12, wherein the reactive group introduced on the surface of the solid phase carrier is an amino group, a mercapto group or a hydroxyl group. ビニルスルホニル基が共有結合により固定されてなる、無機物質の微 粒子の単層から成る凹凸を有する生体高分子固定用の反応性ガラス担体の表面に、該反応性基と反応して共有結合を形成する反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を接触させることを特徴とする、スルホニル基を有する連結基を介してヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された固相担体の製造方法。Vinylsulfonyl group is fixed by covalent bonding, to the surface of the reactive glass carrier for biopolymer fixed with irregularities composed of a single layer of fine particles of inorganic materials, a covalent bond by reacting with said reactive groups A solid-phase carrier having a nucleotide derivative or its analog bound and immobilized on a carrier surface via a sulfonyl group-linking group, wherein the nucleotide derivative or its analog having a reactive group to be formed is contacted Production method. ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項14に記載の製造方法。  The method according to claim 14, wherein the nucleotide derivative or an analog thereof is selected from the group consisting of oligonucleotides, polynucleotides, and peptide nucleic acids. 凹凸を有する生体高分子固定用の反応性固相担体として、下記の式により表わされるビニルスルホニル基と連結基との連結体が結合固定された反応性固相担体を用いることを特徴とする請求項14もしくは15に記載の製造方法:
−L−SO2−X
[上記の式において、Xは、−CR1=CR23を表わし;R1、R2及びR3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、及び炭素原子数が1乃至6のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が7乃至26のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし;そして、Lは連結基もしくは単結合を表わす]。
A reactive solid phase carrier in which a conjugate of a vinylsulfonyl group and a linking group represented by the following formula is bound and fixed is used as the reactive solid phase carrier for immobilizing a biopolymer having irregularities. Item 14 or 15: The production method:
-L-SO 2 -X
[In the above formula, X represents —CR 1 ═CR 2 R 3 ; R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon atom And represents an atom or group selected from the group consisting of an aryl group having 6 to 20 carbon atoms and an aralkyl group having 7 to 26 carbon atoms in total having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms; Represents a group or a single bond].
Xが、−CR1=CR23[R1、R2及びR3は、前記と同一の意味を表わす]で表わされる反応性基であること特徴とする請求項16に記載の製造方法。X is, -CR 1 = CR 2 R 3 [R 1, R 2 and R 3 are the the same meaning as' manufacturing method according to claim 16, wherein it is a reactive group represented by . 請求項14乃至17のうちのいずれかの項に記載の製造方法により得られたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された凹凸を有する固相担体。  A solid phase carrier having irregularities in which a nucleotide derivative obtained by the production method according to any one of claims 14 to 17 or an analog thereof is bonded and fixed to a carrier surface. 請求項18に記載のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された凹凸を有する固相担体に、水性媒体の存在下、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを接触させることを特徴とする相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの結合固定方法。  An oligonucleotide or polynucleotide that is complementary to the immobilized nucleotide derivative or analog thereof in the presence of an aqueous medium on a solid phase carrier having irregularities to which the nucleotide derivative or analog thereof according to claim 18 is immobilized A method for binding and fixing complementary oligonucleotides or polynucleotides, wherein 相補性のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに検知可能な標識が結合していることを特徴とする請求項19に記載の方法。  20. A method according to claim 19, wherein a detectable label is attached to the complementary oligonucleotide or polynucleotide. 請求項18に記載のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された凹凸を有する固相担体に、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが相補的に結合してなることを特徴とする相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが結合固定された固相担体。  An oligonucleotide or polynucleotide complementary to the fixed nucleotide derivative or its analog is complementarily bound to the solid phase carrier having irregularities to which the nucleotide derivative or its analog according to claim 18 is fixed. A solid phase carrier to which a complementary oligonucleotide or polynucleotide is bound and fixed. 相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに検知可能な標識が結合していることを特徴とする請求項21に記載の固相担体。  The solid phase carrier according to claim 21, wherein a detectable label is bound to an oligonucleotide or polynucleotide exhibiting complementarity. 請求項18に記載のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された凹凸を有する固相担体、あるいは請求項21に記載の相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが結合固定された固相担体を利用することを特徴とする、遺伝子の同定又はスクリーニング方法。  A solid phase carrier having irregularities in which the nucleotide derivative according to claim 18 or an analog thereof is bound and fixed to the surface of the carrier, or a solid phase carrier to which the complementary oligonucleotide or polynucleotide according to claim 21 is bound and fixed. A method for identifying or screening a gene, characterized by being used.
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