本発明は、添加することで、保存温度−１９６〜＋３７℃において、混入細菌の増殖速度を無菌状態に抑制することが可能となり、有効期間延長できる輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液に関する。更に、当該担体を用いた雑菌やマイコプラズマ、またはウイルスに汚染された細胞培養溶液からの汚染除去方法に関する。 By adding the present invention, it becomes possible to suppress the growth rate of mixed bacteria to a sterile state at a storage temperature of -196 to + 37 ° C, and blood for transfusion, platelets, umbilical cord blood, bone marrow, and hematopoiesis that can extend the effective period. The present invention relates to a preservation solution for stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS), or cells and tissues induced to differentiate from these stem cells. Further, the present invention relates to a method for removing contamination from a cell culture solution contaminated with various bacteria, mycoplasma, or virus using the carrier.
２１世紀は再生医療の時代といわれている。この再生医療とは、病気や事故により機能不全に陥った組織や臓器の機能を再生する新しい医療である。その方法としては、自己や他人の細胞を患者に投与したり、それらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し組織を構築した後、患者に移植する治療法である。これまでの医療では、薬で治らない疾病には生体組織の移植や人工臓器の置換術などで治療されてきたが、移植医療と人工臓器の限界が見えてきたため、今世紀に入り再生医療への期待が大きく高まって来ている。近年、この再生医療の研究開発が急速に熱を帯びてきているが、これはあらゆる生体組織のもとになるＥＳ細胞（胚性幹細胞）やＥＧ細胞（胚性生殖細胞）等の「万能細胞」をヒトや動物の受精卵から取り出して育てることが可能になってきたためである。また最近、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の転写因子（遺伝子）を導入することにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に似た分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持たせた細胞である人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ）が開発された。これらの幹細胞を用いたこの再生医療が実現することになれば、不治の病や事故により臓器移植しか蘇生できる手立てがない重篤な患者を救うことができるため、遺伝子を手掛かりにした新薬開発と並び、大きな市場を開く可能性を秘めている。
さて、この再生医療には高度な知識と技術および時間を要するが、その初期段階として細胞工学や組織工学が再生医療の発展にとって極めて重要である。
採血などで提供された輸血用血液、臍帯血、骨髄、あるいは細胞等は約３０％もマイコプラズマ等の細菌が混入していることが報告されている。これらの混入細菌のため移植には不適合で廃棄されるか、もしくは検出限界の細菌数でも保存後に増殖し移植後重篤な危険性を伴うことになる。従って、増殖を抑制することが可能になれば、血液製剤や幹細胞製剤の有効期間延長に繋がることが期待できる。
そこで本特許では、輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの−１９６〜＋３７℃保存において、抗菌性ペプチドであるポリリジン（ε結合を有する）、あるいはそれらポリリジンと緑茶ポリフェノールの一種である（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）を添加した保存液が有用であることを明らかにした。The 21st century is said to be an era of regenerative medicine. This regenerative medicine is a new medicine that regenerates the function of tissues and organs that have become dysfunctional due to illness or accident. As a method, self or other cells are administered to a patient, or these cells are cultured in vitro to form a tissue, and then transplanted to the patient. Until now, medical treatment has been treated for diseases that cannot be cured by drugs, such as transplantation of living tissue and replacement of artificial organs. Expectations have increased greatly. In recent years, research and development of this regenerative medicine has been rapidly heated, and this is a “universal cell” such as ES cells (embryonic stem cells) and EG cells (embryonic germ cells) that are the basis of all living tissues. This is because it has become possible to take out and raise them from fertilized eggs of humans and animals. Recently, by introducing several kinds of transcription factors (gene) into somatic cells (primarily fibroblasts), ES cells artificial is a cell which gave (embryonic stem cells) similar pluripotent the (pluripotency) Pluripotent stem cells (iPS) have been developed. If this regenerative medicine using these stem cells is realized, it will be possible to save serious patients who have no means of resuscitating only organ transplantation due to incurable diseases and accidents, so along with the development of new drugs based on genes, It has the potential to open a large market.
Now, this regenerative medicine requires advanced knowledge, technology and time, but as its initial stage, cell engineering and tissue engineering are extremely important for the development of regenerative medicine.
It has been reported that about 30% of bacteria such as mycoplasma are mixed in blood for blood transfusion, umbilical cord blood, bone marrow, or cells provided by blood collection. These contaminated bacteria are incompatible with transplantation and discarded, or even the number of bacteria at the limit of detection grows after storage and poses a serious risk after transplantation. Therefore, if it becomes possible to suppress proliferation, it can be expected to lead to an extension of the effective period of blood products and stem cell products.
Therefore, in this patent, blood for blood transfusion, platelets, umbilical cord blood, bone marrow, hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS), cells or tissues induced to differentiate from these stem cells, etc. In storage at −196 to + 37 ° C., antibacterial peptide polylysine (having ε bond), or (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (EGCg) which is a kind of polylysine and green tea polyphenol was added. It was clarified that the preservation solution was useful.
本発明の解決しようとする課題は、混入細菌やウイルスの増殖を抑制し、輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織など保存液の機能の低下を防ぐことにより保存期間の延長を計ることである。 The problem to be solved by the present invention is to suppress the growth of contaminating bacteria and viruses, blood for blood transfusion, platelets, umbilical cord blood, bone marrow, hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells ( iPS), or the extension of the preservation period by preventing the function of preservation solutions such as cells and tissues induced to differentiate from the stem cells.
本発明の保存剤は、ポリリジンあるいはポリフェノールの混合成分からなり、これを保存輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、あるいは造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液に添加させることで、混入細菌やウイルスの増殖を抑制する。 The preservative of the present invention comprises a mixed component of polylysine or polyphenol, which is stored as blood for transfusion, platelets, cord blood, bone marrow, or hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells ( iPS), or by adding to a preservation solution such as cells or tissues induced to differentiate from these stem cells, the growth of contaminating bacteria and viruses is suppressed.
本発明では、ポリリジンあるいは、それらポリリジンとポリフェノールを添加したの混合成分により、混入細菌やウイルスの増殖抑制と保存効果を高めることができる。つまり、保存時に混入細菌やウイルスの増殖抑制を阻害することができる。 In the present invention, polylysine or a mixed component to which these polylysine and polyphenol are added can enhance the growth inhibition and preservation effect of mixed bacteria and viruses. That is, it is possible to inhibit the growth of mixed bacteria and viruses during storage.
本発明で用いるポリリジンは、塩基性アミノ酸であるリジンのポリマーである。そのポリマー分子構造中のアミノ基の位置によりα−ポリリジンとε−ポリリジンの二つの構造を取り得るが、ε−ポリリジンは、既存の食品添加物であり、安全性と価格の観点からε−ポリリジンを用いる方が好ましい。
本発明におけるε−ポリ−Ｌ−リジンは、具体的には、例えば、次のようにして得られらるものを用いることができる。日本特許第３５２５１９０号または日本特許第３６５３７６６号に記載の菌株であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを用いる。そして、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取する。
本発明においては、ポリリジンは遊離、又は塩の形態で用いることができる。塩の形態には、塩酸塩や硫酸塩等の無機酸塩の他、琥珀酸塩、クエン酸塩やリンゴ酸塩等の有機酸塩が用いることが出来る。
また、本発明におけるポリフェノールについては、限定されない。カテキン類、タンニン類、プロアントシアニジン又はリスベラトロールが使用され得る。特に好ましいのは、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣｇ）である。エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレートの純度は９０重量％以上が望ましく、９８重量％以上がより望ましい。
またポリフェノールは、例えば、茶、ワイン、チョコレート、サボテン、海藻、野菜（たまねぎ（最外部の黄褐色の皮）、アロエ抽出物パセリの葉、白色野菜など）、柑橘類（温州みかん、だいたい、ポンカンの皮、夏みかんの皮、グレープフルーツ、レモンなど）、リンゴなどの果実類、穀物（こうりゃん、大豆、そば、小麦など）、ダリアの花などの種々の食品・植物に多く含まれているので、茶抽出物、海草抽出物、果実抽出物、サボテン抽出物又はワイン抽出物などの抽出物でも良い。例えば茶抽出物は、水、エタノール、酢酸エチルなどの溶剤を用いて茶の葉より抽出することで得られ、エピガロカテキンガレートを最も多く含むカテキン類を主成分とする。また、得られた茶抽出物あるいは市販の茶抽出物から、クロロフィルの除去、さらにカラムクロマトグラフ法による精製をすることによって、高純度のエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を得ることが可能である。
本発明において、ポリリジンとポリフェノールの濃度は、０．００１−１．０重量％（１０〜１００００ｐｐｍ）が好ましい。より好ましい濃度は０．００５〜０．１重量％（５０〜１０００ｐｐｍ）である。さらに好ましくは０．００５〜０．０３重量％（５０〜３００ｐｐｍ）である。また、ポリリジンとポリフェノールの混合割合は、ポリリジン／ポリフェノール＝０．１−９９．１／９９．１−０．１で任意に用いることができる。
本発明においてポリリジンとポリフェノールを安定化させるため、Ｌ−アスコルビン酸および二亜硫酸カリウムが添加されていても良い。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は０．０００１〜０．３重量％（１〜３００ｐｐｍ）である。二亜硫酸カリウムの濃度は０．０００１〜０．３重量％（１〜３００ｐｐｍ）である。
本発明の保存液には、用途に応じて抗酸化剤、安定化剤等の薬剤が適宜添加されても良い。そのような成分として、以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥまたはグルタチオン）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類、及び多糖類の化合物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（商標））、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ、商標））またはポリエチレングリコール）；血栓溶解剤；血管拡張剤；組織賦活化剤；カテコラミン；ＰＤＥＩＩ阻害剤；カルシウム拮抗剤；βブロッカー；ステロイド剤；脂肪酸エステル；抗炎症剤；抗アレルギー剤；抗ヒスタミン剤等。
本発明の輸血用血液、血小板、臍帯血、骨髄、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいはそれら幹細胞から分化誘導した細胞や組織などの保存液は、微生物に対して広範な増殖抑制効果や殺菌効果を有しており、また、それらの効果はｐＨに大きな影響を受けず、およそｐＨ４〜９の範囲で使用できる。その点眼液への添加量は、保存液に対して、０．００１〜１０重量％であることが好ましい。本発明の保存液は、抗菌性ポリリジンを含有することから、各種微生物感染の防御に有効であり、また、天然物由来の成分であることから、安全性も高い。本発明の保存液は、特に黄色ブドウ球菌及びその耐性菌（ＭＲＳＡ等）、並びに緑膿菌やマイコプラズマ等に対する抗菌性に優れる。本発明の保存液は、抗菌性ポリリジンやその塩、またはポリフェノールを含有することを特徴とする。The polylysine used in the present invention is a polymer of lysine, which is a basic amino acid. Depending on the position of the amino group in the polymer molecular structure, α-polylysine and ε-polylysine can take two structures, but ε-polylysine is an existing food additive, and from the viewpoint of safety and price, ε-polylysine Is preferred.
Specifically, as the ε-poly-L-lysine in the present invention, for example, those obtained as follows can be used. The strain described in Japanese Patent No. 3525190 or Japanese Patent No. 3653766 is Streptomyces albulus subspecies lysinopolymeras. And glucose 5 weight%, yeast extract 0.5 weight%, ammonium sulfate 1 weight%, dipotassium hydrogen phosphate 0.08 weight%, potassium dihydrogenphosphate 0.136 weight%, magnesium sulfate heptahydrate 0 .05% by weight, zinc sulfate / 7-hydrate 0.004%, iron sulfate / 7-hydrate 0.03% by weight, and adjusted to pH 6.8. -Isolate and collect polylysine.
In the present invention, polylysine can be used in free or salt form. In addition to inorganic acid salts such as hydrochloride and sulfate, organic acid salts such as oxalate, citrate and malate can be used as the salt form.
Moreover, it does not limit about the polyphenol in this invention. Catechins, tannins, proanthocyanidins or resveratrol can be used. Particularly preferred are (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (EGCg), (−)-gallocatechin gallate (GCg), and (−)-epicatechin gallate (ECg). The purity of epigallocatechin gallate (EGCg), gallocatechin gallate, and epicatechin gallate is desirably 90% by weight or more, and more desirably 98% by weight or more.
Polyphenols are, for example, tea, wine, chocolate, cactus, seaweed, vegetables (onion (outermost tan skin), aloe extract parsley leaves, white vegetables, etc.), citrus fruits (Unshu oranges, roughly Tea, summer orange peel, grapefruit, lemon, etc.) fruits such as apples, cereals (soybean, soba, wheat, etc.), dahlia flowers, etc. An extract such as an extract, seaweed extract, fruit extract, cactus extract or wine extract may be used. For example, a tea extract is obtained by extraction from tea leaves using a solvent such as water, ethanol, ethyl acetate, and the like, and contains catechins containing the largest amount of epigallocatechin gallate as a main component. Moreover, it is possible to obtain high purity epigallocatechin gallate (EGCg) by removing chlorophyll from the obtained tea extract or commercially available tea extract and further purifying by column chromatography.
In the present invention, the concentration of polylysine and polyphenol is preferably 0.001 to 1.0% by weight (10 to 10,000 ppm). A more preferable concentration is 0.005 to 0.1% by weight (50 to 1000 ppm). More preferably, it is 0.005-0.03 weight% (50-300 ppm). Moreover, the mixing ratio of polylysine and polyphenol can be arbitrarily used as polylysine / polyphenol = 0.1-99.1 / 99.1-0.1.
In the present invention, L-ascorbic acid and potassium disulfite may be added to stabilize polylysine and polyphenol. The concentration of L-ascorbic acid is 0.0001 to 0.3% by weight (1 to 300 ppm). The concentration of potassium disulfite is 0.0001 to 0.3% by weight (1 to 300 ppm).
Agents such as antioxidants and stabilizers may be appropriately added to the preservation solution of the present invention depending on the application. Such components include: phosphates, citrates, or other organic acids; antioxidants (eg, catalase, peroxidase, superoxide dismutase, vitamin E or glutathione); low molecular weight polypeptides; Proteins (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymers (eg, polyvinylpyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharide, disaccharide, and polysaccharide compounds ( Chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol); salt-forming counterions (eg, sodium); and / or non-ionic surfactants (eg, , Polyoxyethylene sorbitan ester (Tween (TM)), polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer (pluronic (TM)) or polyethylene glycol); thrombolytic agent; vasodilator; tissue activator Catecholamines; PDEII inhibitors; calcium antagonists; beta blockers; steroids; fatty acid esters; anti-inflammatory agents; antiallergic agents;
Preservation solution for blood for transfusion, platelets, umbilical cord blood, bone marrow, hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS), or cells or tissues induced to differentiate from these stem cells Has a broad growth inhibitory effect and bactericidal effect on microorganisms, and these effects are not greatly influenced by pH, and can be used in the range of about pH 4-9. The amount added to the ophthalmic solution is preferably 0.001 to 10% by weight with respect to the preservation solution. Since the preservation solution of the present invention contains an antibacterial polylysine, it is effective in protecting various microbial infections, and since it is a component derived from a natural product, it is highly safe. The preservation solution of the present invention is particularly excellent in antibacterial properties against Staphylococcus aureus and its resistant bacteria (MRSA and the like), Pseudomonas aeruginosa and mycoplasma. The preservation solution of the present invention is characterized by containing antibacterial polylysine, a salt thereof, or polyphenol.
以下、本発明を具体的に明らかにするために実施例を示すが、本発明は該実施例の記載により何等の制約も受けるものではない。
実施例１：抗菌試験
ε−ポリ−Ｌ−リジン（チッソ社製、分子量４０００）は２５％水溶液をダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ製）に２、４、６、１０ｗ／ｗ％となるように添加し、ｐＨは７．０−８．０の範囲になるように１Ｎの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。。各サンプルに、滅菌生理食塩水に浮遊させたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１：）をそれぞれ混合し、最終菌濃度（理論値）が１０３、１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌ、最終サンプル濃度が１０００μｇ／ｍｌになるように、シリコン処理したマイクロチューブに取った。そして、３７℃で２時間反応させた後、各サンプルを最終菌濃度を１０３、１０４、ＣＦＵ／ｍｌとしたものはそのまま、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌとしたものは滅菌生理食塩水でそれぞれ１０倍、１００倍希釈してミューラー・ヒントン寒天培地（ミューラー・ヒントン・ブロス：ベクトン・ディッキンソン製、寒天：和光純薬製）に塗抹し、更に３５℃で２４時間培養した後の各サンプルの菌の発育状況を調べた。
本発明の保存液は１．１×１０２〜２．３×１０５ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ε−ポリ−Ｌ−リジン２％保存液は１．１×１０２〜２．８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ε−ポリ−Ｌ−リジン４％保存液は１．１×１０２〜１．９×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、１００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。同様に、１．２×１０３〜６．９×１０５ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌に対しても、本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン２、４、６、１０％保存液は、１００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。
実施例２：
マイコプラズマ（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）の感染したＫＧ１ａ（＋）細胞（抗ＣＤ３４抗体産生細胞）１０６個と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌとを分取し、これにε−ポリ−Ｌ−リジンとエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を添加した後、炭酸ガス培養器で３日間培養した。培地交換５回目にＫＧ１ａ（＋）細胞の培養後の培地について、マイコテクトキット（大日本製薬製）を用いてマイコプラズマの検査を行なった。その結果、当該培地には、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓは検出されなかった。
実施例３：
黄色ブドウ球菌の感染したＳ−１細胞１０６個と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌとを分取し、これにε−ポリ−Ｌ−リジンとエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を添加した後、炭酸ガス培養器で３日間培養した。培地交換３回目のＮＳ−１細胞の培養後の培地について、ブドウ球菌の検索を行なった。その結果、当該培地からブドウ球菌の検出は出来なかった。
実施例４：
臍帯血（２０ｍＬ）にポリリジンを各種濃度で添加した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓの各菌液を２０ｃｆｕ／ｍＬになるように添加し４℃で保存した。添加直後、２日、５日、８日に少量の臍帯血試料をサンプリングし、適宜希釈後にトリプトソイ寒天培地のプレートに塗布し、一晩３７℃にて培養し、コロニー数をカウントした。また、ＥＧＣｇをポリリジンとともに添加した菌液についても同様のスパイク実験を行った。通常の１００％血漿中に浮遊した臍帯血に上記いずれかの細菌を２０ｃｆｕ／ｍＬで２単位血小板に添加するスパイク実験を行い、その際事前にポリリジンを各種濃度で添加後に２２℃にて振盪保存し、１、２、５、８日目の生菌数を測定した。ポリリジン非添加群では、両細菌とも急速な増殖を認めた。一方、ポリリジン２００μｇ／ｍＬ、およびポリリジン５０μｇ／ｍＬ添加系にて、両細菌の生菌数は８日目まで０ｃｆｕ／ｍＬとなり、ポリリジンの有効性が認められた。
実施例５：ラットを用いる安全性試験
ラット（体重約３００ｇ）をエチルエーテル及びネンブタールにて麻酔した後、尾静脈よりポリリジンまたは生理食塩液を適宜投与した。投与量は、ヒト（体重５０ｋｇ）にポリリジン５０μｇ／ｍＬを含む血小板製剤２０単位（最大容量の３００ｍＬ）を投与する場合の体重ｋｇ当たりのポリリジン濃度を基準として、体重ｋｇ当たりその２〜１０倍量でラットにポリリジン単体を週に１〜３回静脈注射した。その後、餌摂取量、体重変化及び外観状態を調べた。その結果、餌摂取量及び体重変化においては、両群間に顕著な差異は認められず、外観状態においても特に異常は認められなかった。Hereinafter, examples will be shown in order to clarify the present invention, but the present invention is not limited by the description of the examples.
Example 1: Antibacterial test ε-poly-L-lysine (manufactured by Chisso Corporation, molecular weight 4000) is 25% aqueous solution in Dulbecco's modified medium (DMEM, manufactured by Sigma-Aldrich) at 2, 4, 6, 10 w / w%. The solution was neutralized with 1N hydrochloric acid or aqueous sodium hydroxide so that the pH ranged from 7.0 to 8.0. . Each sample was mixed with methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P01) suspended in sterile physiological saline, and the final bacterial concentration (theoretical value) was 10 3 , 10 4 , 10 5 and 10 6 CFU / ml, taken to a siliconized microtube to a final sample concentration of 1000 μg / ml. And after making it react at 37 degreeC for 2 hours, what made the final bacteria density | concentration of 10 3 , 10 4 , CFU / ml as it is is what made 10 5 , 10 6 CFU / ml as sterilized physiological saline. Each sample was diluted 10-fold and 100-fold, and smeared on Mueller Hinton agar medium (Mueller Hinton broth: Becton Dickinson, agar: Wako Pure Chemicals) and further cultured at 35 ° C for 24 hours. The growth of the fungus was examined.
The stock solution of the present invention is 1.1 × 10 2 to 2.3 × 10 5 CFU / ml MRSA, while the ε-poly-L-lysine 2% stock solution is 1.1 × 10 2 to 2.8. respect × 10 3 CFU / ml of MRSA, .epsilon. poly -L- lysine 4% stock solution relative to 1.1 × 10 2 ~1.9 × 10 4 CFU / ml of MRSA, with 100 [mu] g / ml It showed antibacterial action. Similarly, ε-poly-L-lysine 2, 4, 6, 10% stock solution of the present invention is also used against 1.2 × 10 3 to 6.9 × 10 5 CFU / ml of Pseudomonas aeruginosa. Antibacterial action was shown at 100 μg / ml.
Example 2:
10 6 KG1a (+) cells (anti-CD34 antibody-producing cells) infected with mycoplasma ( M. hyorhinis ) and 10 ml of RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum were collected, and ε-poly-L- After adding lysine and epigallocatechin gallate (EGCg), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 3 days. On the fifth medium exchange, the mycoplasma was inspected for the medium after the culture of KG1a (+) cells using a Mycotect kit (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). As a result, the medium contains M. hyorhinis was not detected.
Example 3:
10 6 S-1 cells infected with Staphylococcus aureus and 5 ml of RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum were collected, and ε-poly-L-lysine and epigallocatechin gallate (EGCg) were added thereto. After that, the cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 3 days. A search for staphylococci was performed on the medium after the culture of NS-1 cells in the third medium exchange. As a result, staphylococci could not be detected from the medium.
Example 4:
After adding polylysine at various concentrations to cord blood (20 mL), aureus and B. et al. Each cell solution of cereus was added to 20 cfu / mL and stored at 4 ° C. Immediately after the addition, a small amount of umbilical cord blood sample was sampled on the 2nd, 5th, and 8th, and after appropriate dilution, it was applied to a plate of tryptic soy agar medium, cultured at 37 ° C. overnight, and the number of colonies was counted. A similar spike experiment was also performed on the bacterial solution in which EGCg was added together with polylysine. A spike experiment was performed in which one of the above bacteria was added to 2 unit platelets at 20 cfu / mL to umbilical cord blood suspended in normal 100% plasma. At that time, polylysine was added in various concentrations in advance and stored at 22 ° C. with shaking. The viable cell counts on days 1, 2, 5, and 8 were measured. In the polylysine non-added group, both bacteria showed rapid growth. On the other hand, in the polylysine 200 μg / mL and polylysine 50 μg / mL addition systems, the viable count of both bacteria was 0 cfu / mL until the 8th day, and the effectiveness of polylysine was confirmed.
Example 5: Safety test using rats After anesthetizing rats (body weight of about 300 g) with ethyl ether and Nembutal, polylysine or physiological saline was appropriately administered from the tail vein. The dose is 2 to 10 times the weight per kg body weight based on the polylysine concentration per kg body weight when administering 20 units (300 ml of maximum volume) of platelet preparation containing 50 μg / mL polylysine to human (weight 50 kg) In rats, polylysine alone was intravenously injected 1 to 3 times a week. Thereafter, food intake, weight change and appearance were examined. As a result, no significant difference was observed between the two groups in terms of food intake and body weight change, and no particular abnormality was observed in the appearance.