JP2010112872A - Sensing chip and manufacturing method and using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、センシングチップに関するものであり、より詳しくは、分子インプリント微粒子が基板に固定化されたセンシングチップに関するものである。また、本発明は、当該センシングチップの製造方法、当該センシングチップを用いる標的分子の検出または定量方法、当該センシングチップ製造用キットに関するものである。 The present invention relates to a sensing chip, and more particularly to a sensing chip in which molecularly imprinted fine particles are immobilized on a substrate. The present invention also relates to a method for manufacturing the sensing chip, a method for detecting or quantifying a target molecule using the sensing chip, and a kit for manufacturing the sensing chip.
標的分子を特異的に認識できる人工レセプター合成法の１つとして、分子インプリント法（ＭＩ法）が知られている。分子インプリント法とは、認識対象である分子（標的分子）を鋳型として、その標的分子に選択性のある結合部位（標的分子認識部位）を人工的に材料中に構築する方法である。分子インプリント法を用いて合成されるポリマーは分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）と呼ばれる。ＭＩＰによって認識される標的分子としては、除草剤、薬物、殺虫剤、タンパク質やペプチド、コレステロール、染料、炭水化物などが報告されており、ＭＩＰは標的分子認識技術として有用であることが示されている。また、基板上にＭＩＰを備えるセンシングチップを用いて、種々の検出手段で標的分子を検出する試みがなされている。 A molecular imprint method (MI method) is known as one of artificial receptor synthesis methods capable of specifically recognizing a target molecule. The molecular imprint method is a method of artificially constructing a binding site (target molecule recognition site) selective to a target molecule in a material using a molecule to be recognized (target molecule) as a template. A polymer synthesized using the molecular imprint method is called a molecular imprint polymer (MIP). As target molecules recognized by MIP, herbicides, drugs, insecticides, proteins and peptides, cholesterol, dyes, carbohydrates and the like have been reported, and MIP has been shown to be useful as a target molecule recognition technique. . Attempts have also been made to detect target molecules with various detection means using a sensing chip having a MIP on a substrate.
基板上にＭＩＰを備えるセンシングチップとしては、例えば非特許文献１に記載のものが知られている。このセンシングチップは、シアル酸をインプリントした薄膜のポリマーを有し、ビニル化した金蒸着基板上にプレポリマー溶液を垂らしてインプリントポリマーを合成するという方法で作製され、ＳＰＲスペクトル測定に用いることができる。
ＭＩＰを用いるセンシング技術は未だ発展途上の分野であり、基板上にＭＩＰを備えるセンシングチップを用いてより高感度、高精度に標的分子を測定するためには、基板上のＭＩＰ薄膜の均一性を高める工夫や比表面積を増加させる工夫など、更なる改良が必要である。また、このようなセンシングチップを、より簡便に低コストで製造する方法の開発も望まれている。 Sensing technology using MIP is still a developing field, and in order to measure target molecules with higher sensitivity and accuracy using a sensing chip equipped with MIP on the substrate, the uniformity of the MIP thin film on the substrate is required. Further improvements are necessary, such as a device to increase or a device to increase the specific surface area. In addition, development of a method for manufacturing such a sensing chip more easily and at low cost is also desired.
そこで、本発明は、従来の製造方法と比較して非常に簡単に製造することができ、しかも、ＭＩＰ薄膜の厚みが均一で比表面積が大きく、低分子量の標的分子を高感度に測定可能な、基板上にＭＩＰを備えるセンシングチップを提供することを目的とする。 Therefore, the present invention can be manufactured very easily compared with the conventional manufacturing method, and the MIP thin film has a uniform thickness, a large specific surface area, and can measure a low molecular weight target molecule with high sensitivity. An object of the present invention is to provide a sensing chip having a MIP on a substrate.
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］基板と、標的分子またはその誘導体の単分子層と、分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子とを備える標的分子のセンシングチップであって、前記単分子層は前記基板上に形成され、前記分子インプリント微粒子は前記単分子層に固定化されていることを特徴とするセンシングチップ。
［２］前記基板は表面に金属領域を有し、前記単分子層は該金属領域に形成されていることを特徴とする前記［１］に記載のセンシングチップ。
［３］前記分子インプリント微粒子は、動的光散乱法により測定される平均粒子径が２００ｎｍ以下であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のセンシングチップ。
［４］ＳＰＲスペクトル測定用である前記［１］〜［３］のいずれかに記載のセンシングチップ。
［５］前記基板は、複数の金属領域を有することを特徴とする前記［４］に記載のセンシングチップ。
［６］複数の金属領域が、それぞれ異なる種類の金属からなることを特徴とする前記［５］に記載のセンシングチップ。
［７］前記金属領域が、複数種類の金属からなることを特徴とする前記［４］に記載のセンシングチップ。
［８］基板上に標的分子またはその誘導体の単分子層を形成する単分子層形成工程と、前記単分子層と分子インプリント微粒子懸濁液とを接触させる微粒子接触工程とを包含することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載のセンシングチップの製造方法。
［９］前記微粒子接触工程において、前記単分子層を形成した基板をＳＰＲ測定装置にセットし、分子インプリント微粒子懸濁液をＳＰＲ測定装置の試料送液用流路に送液することを特徴とする前記［８］に記載の製造方法。
［１０］標的分子を含む試料を調製する試料調製工程と、前記［１］〜［７］のいずれかに記載のセンシングチップと試料中の標的分子との相互作用を測定する測定工程とを包含することを特徴とする標的分子の検出または定量方法。
［１１］前記試料調製工程において、標的分子を修飾することを特徴とする前記［１０］に記載の標的分子の検出または定量方法。
［１２］標的分子またはその誘導体の単分子層形成用試薬、および、標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子を含むことを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載のセンシングチップの製造用キット。
The present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
[1] A target molecule sensing chip comprising a substrate, a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof, and molecularly imprinted fine particles having a target molecule recognition site constructed by a molecular imprint method, A sensing chip, wherein a layer is formed on the substrate, and the molecularly imprinted fine particles are immobilized on the monomolecular layer.
[2] The sensing chip according to [1], wherein the substrate has a metal region on a surface, and the monomolecular layer is formed in the metal region.
[3] The sensing chip according to [1] or [2], wherein the molecularly imprinted fine particles have an average particle diameter measured by a dynamic light scattering method of 200 nm or less.
[4] The sensing chip according to any one of [1] to [3], which is used for measuring an SPR spectrum.
[5] The sensing chip according to [4], wherein the substrate has a plurality of metal regions.
[6] The sensing chip according to [5], wherein the plurality of metal regions are made of different types of metals.
[7] The sensing chip according to [4], wherein the metal region is made of a plurality of types of metals.
[8] including a monomolecular layer forming step of forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof on a substrate, and a fine particle contact step of bringing the monomolecular layer into contact with a molecularly imprinted fine particle suspension. The method of manufacturing a sensing chip according to any one of [1] to [7], which is characterized in that
[9] In the fine particle contact step, the substrate on which the monomolecular layer is formed is set in an SPR measurement device, and the molecularly imprinted fine particle suspension is sent to the sample solution flow path of the SPR measurement device. The production method according to [8].
[10] A sample preparation step for preparing a sample containing a target molecule, and a measurement step for measuring an interaction between the sensing chip according to any one of [1] to [7] and a target molecule in the sample. A method for detecting or quantifying a target molecule.
[11] The target molecule detection or quantification method of [10], wherein the target molecule is modified in the sample preparation step.
[12] The sensing according to any one of [1] to [7], including a reagent for forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof, and a molecularly imprinted fine particle having a target molecule recognition site. Chip manufacturing kit.
本発明によれば、基板表面の金属薄膜にインプリント微粒子を用いて薄膜を形成するので、インプリント微粒子薄膜の膜厚サイズのコントロールが容易であり、インプリント微粒子薄膜の均一性が高く、インプリント微粒子薄膜の比表面積が大きいセンシングチップを提供することができる。そのため、高感度かつ高精度に標的分子を測定することが可能となる。また、本発明のセンシングチップは、標的分子またはその誘導体の単分子層を形成させた基板を、分子インプリント微粒子懸濁液と接触させることにより、非常に簡便かつ低コストで製造することができる。 According to the present invention, since the thin film is formed using imprinted fine particles on the metal thin film on the surface of the substrate, it is easy to control the film thickness size of the imprinted fine particle thin film, the imprint fine particle thin film has high uniformity, A sensing chip having a large specific surface area of a printed fine particle thin film can be provided. Therefore, it becomes possible to measure the target molecule with high sensitivity and high accuracy. In addition, the sensing chip of the present invention can be manufactured very simply and at low cost by contacting a substrate on which a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof is formed with a molecularly imprinted fine particle suspension. .
〔センシングチップ〕
本発明のセンシングチップは、基板と、標的分子またはその誘導体の単分子層と、分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子とを備え、単分子層が基板上に形成され、分子インプリント微粒子が当該単分子層に固定化されているものであればよい。
[Sensing chip]
The sensing chip of the present invention includes a substrate, a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof, and molecular imprinted fine particles having a target molecule recognition site constructed by a molecular imprint method, and the monomolecular layer is on the substrate. What is necessary is just to be formed and the molecularly imprinted fine particles are fixed to the monomolecular layer.
本発明のセンシングチップを用いて、分子インプリント微粒子が有する標的分子認識部位と標的分子との相互作用を検出することにより、試料中の標的分子を検出または定量することができる。「相互作用」とは、分子インプリント微粒子が有する標的分子認識部位が試料中の標的分子を特異的に認識し、分子インプリント微粒子と標的分子とが物理的化学的に相互作用可能なほど近接する状態になることを意味する。 By detecting the interaction between the target molecule recognition site of the molecularly imprinted fine particles and the target molecule using the sensing chip of the present invention, the target molecule in the sample can be detected or quantified. “Interaction” means that the target molecule recognition site of the molecularly imprinted microparticle specifically recognizes the target molecule in the sample, and the molecularly imprinted microparticle and the target molecule are close enough to allow physical and chemical interaction. It means to become a state to do.
本発明のセンシングチップは、種々の検出手段に好適に適用することができる。具体的には、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）法、水晶振動子センサー、電気化学的方法、発光法、発色法、光導波路分光法などが挙げられる。 The sensing chip of the present invention can be suitably applied to various detection means. Specifically, for example, a surface plasmon resonance (SPR) method, a localized plasmon resonance (LSPR) method, a quartz oscillator sensor, an electrochemical method, a light emission method, a color development method, an optical waveguide spectroscopy, and the like can be given.
基板は、その表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成できるものであればよい。好適な基板としては、例えば、金属基板、ガラス基板、シリコン基板、光導波路基板などが挙げられる。また、用いる検出手段に応じて、適宜基板の材質を選択することが好ましい。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法に適用する場合はＳＰＲ用の金基板を用いることが好ましく、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）法に適用する場合は光導波路基板を用いることが好ましく、水晶振動子センサーに適用する場合は水晶振動子をセンシングチップとすることが好ましく、電気化学的方法による検出に適用する場合は電極となる金属基板（例えば、金基板）を用いることが好ましい。また、発光や発色による検出に適用する場合はガラスや石英基板、光ファイバー、光導波路基板を用いることが好ましい。 The substrate may be any substrate as long as a monomolecular layer of the target molecule or derivative thereof can be formed on the surface. Examples of suitable substrates include metal substrates, glass substrates, silicon substrates, optical waveguide substrates, and the like. Moreover, it is preferable to select the material of the substrate as appropriate according to the detection means used. For example, when applied to the surface plasmon resonance (SPR) method, a gold substrate for SPR is preferably used, and when applied to the localized plasmon resonance (LSPR) method, an optical waveguide substrate is preferably used. When applied to a sensor, it is preferable to use a quartz crystal as a sensing chip, and when applied to detection by an electrochemical method, it is preferable to use a metal substrate (for example, a gold substrate) serving as an electrode. When applied to detection by light emission or color development, it is preferable to use a glass, quartz substrate, optical fiber, or optical waveguide substrate.
本発明のセンシングチップの基板上には、標的分子またはその誘導体の単分子層が形成されている。「標的分子またはその誘導体の単分子層」とは、標的分子またはその誘導体が基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）やラングミュアーブロジェット膜のように単分子の層を作って固定化されていることを意味する。 A monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof is formed on the substrate of the sensing chip of the present invention. “Monolayer of target molecule or derivative thereof” refers to a monomolecular layer such as a self-assembled monolayer (SAM) or Langmuir Blodgett film on a substrate. Means that it is fixed.
基板は、その表面に金属領域を有し、当該金属領域に標的分子またはその誘導体の単分子層（以下、「標的分子の単分子層」という）が形成されていることが好ましい。基板が金属領域を有することにより、当該金属領域の表面に標的分子の単分子層を自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）として容易に形成することができる。また、本発明のセンシングチップをＳＰＲスペクトル測定に好適に用いることができる。金属領域を有する基板の構成は限定されない。例えば、基板自体が金属製であってもよく、基板表面の一部領域に金属領域を有する構成でもよい。簡便には、基板表面に、公知の方法で金属薄膜を蒸着させることにより金属領域を形成させることができる。金属薄膜を蒸着させる方法を採用すれば、金属領域のパターニングを容易に行うことができ、金属領域の表面に形成される標的分子の単分子層に固定化される分子インプリント微粒子層のパターニングも容易に行うことができる。金属領域に使用可能な金属は特に限定されず、例えば、金、銀、白金、銅、ニッケル、アルミ、鉄などが挙げられる。中でも、金、銀が好適である。 The substrate preferably has a metal region on its surface, and a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof (hereinafter referred to as a “target molecule monolayer”) is formed on the metal region. When the substrate has a metal region, a monomolecular layer of a target molecule can be easily formed as a self-assembled monolayer (SAM) on the surface of the metal region. In addition, the sensing chip of the present invention can be suitably used for SPR spectrum measurement. The structure of the substrate having a metal region is not limited. For example, the substrate itself may be made of metal or may have a metal region in a partial region of the substrate surface. Conveniently, a metal region can be formed on the substrate surface by depositing a metal thin film by a known method. If a method of depositing a metal thin film is adopted, the patterning of the metal region can be easily performed, and the patterning of the molecularly imprinted fine particle layer immobilized on the monomolecular layer of the target molecule formed on the surface of the metal region is also possible. It can be done easily. The metal that can be used for the metal region is not particularly limited, and examples thereof include gold, silver, platinum, copper, nickel, aluminum, and iron. Among these, gold and silver are preferable.
本発明のセンシングチップに用いられる分子インプリント微粒子は、分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、基板上に形成された標的分子の単分子層に固定化されるものであればよい。「固定化」とは、個々の分子インプリント微粒子が標的分子の単分子層から移動しない状態で配置されていること意味する。標的分子の単分子層に最密配置され、分子インプリント微粒子層が形成されていることが好ましい。分子インプリント微粒子の素材は、分子インプリント法を適用して標的分子認識部位が構築できるものであればよく、具体的には、例えば、有機ポリマー、無機ポリマー、金属酸化物などが挙げられる。なお、「分子インプリント法」は、認識対象である分子（標的分子）を鋳型として、その標的分子に選択性のある結合部位（標的分子認識部位）を人工的に材料中に構築する方法を意味する。 The molecularly imprinted fine particle used in the sensing chip of the present invention has a target molecule recognition site constructed by a molecular imprint method, and is immobilized on a monolayer of target molecules formed on a substrate. That's fine. “Immobilization” means that the individual molecularly imprinted fine particles are arranged in a state where they do not move from the monomolecular layer of the target molecule. It is preferable that the molecularly imprinted fine particle layer is formed in a close-packed arrangement in the monomolecular layer of the target molecule. The material of the molecularly imprinted fine particles is not particularly limited as long as the target molecular recognition site can be constructed by applying the molecular imprinting method. Specific examples include organic polymers, inorganic polymers, and metal oxides. The “molecular imprint method” is a method of artificially constructing a binding site (target molecule recognition site) that is selective for the target molecule in a material using the molecule to be recognized (target molecule) as a template. means.
有機ポリマーを素材としたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子としてラジカル重合反応時に共存させることにより得ることができる。無機ポリマーを素材にしたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子としてゾル-ゲル反応時に共存させることにより得ることができる。（Lee, S.W., Ichinose, I., Kunitake, T., Enantioselective binding of amino acid derivatives onto imprinted TiO2 ultrathin films. Chem. Lett. 2002, 678-679.）金属酸化物を素材としたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子として、金属酸化物膜の製膜法の１種である液相析出法を用いることで得ることができる（Feng, L., Liu, Y., Hu, J., Langmuir 2004, 20, 1786.）。 An organic polymer material can be obtained by using a target molecule or its derivative or similar compound as a template molecule in the radical polymerization reaction. A material made of an inorganic polymer can be obtained by using a target molecule or its derivative or similar compound as a template molecule in the sol-gel reaction. (Lee, SW, Ichinose, I., Kunitake, T., Enantioselective binding of amino acid derivatives onto imprinted TiO2 ultrathin films. Chem. Lett. 2002, 678-679.) Alternatively, it can be obtained by using the derivative or similar compound as a template molecule and the liquid phase deposition method which is one of the metal oxide film deposition methods (Feng, L., Liu, Y., Hu, J , Langmuir 2004, 20, 1786.).
分子インプリントポリマーは、重合反応時に鋳型分子に対して相補的に相互作用する分子認識部位を、ポリマー合成と同時に構築することにより合成することができる。より詳細には、まず、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物と結合可能な官能基および重合可能な官能基を併せ持つ機能性モノマーを標的分子と結合させて、標的分子／機能性モノマー複合体を形成させる。なお、この複合体を形成するための結合は、切断可能であれば共有結合でも非共有結合でもかまわない。次に、この標的分子／機能性モノマー複合体に架橋剤および重合開始剤を加え、重合反応を行なう。これにより鋳型分子の形状ならびに相互作用点の配置を記憶した有機高分子が得られる。最後に、得られた高分子より鋳型分子を切断除去することにより、鋳型分子と基質特異的に相互作用する分子認識部位を有する高分子（分子インプリントポリマー）が得られる。なお、分子インプリントポリマーの合成方法については、例えば、参考文献「Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H. "Molecular Imprinting", WILEY-VCH, Weinheim, 2002.」の記載を参照すればよい。 The molecularly imprinted polymer can be synthesized by constructing a molecular recognition site that interacts complementarily with the template molecule during the polymerization reaction simultaneously with the polymer synthesis. More specifically, first, a functional monomer having both a functional group capable of binding to the target molecule or its derivative or similar compound and a polymerizable functional group is bound to the target molecule to form a target molecule / functional monomer complex. Let The bond for forming this complex may be a covalent bond or a non-covalent bond as long as it can be cleaved. Next, a crosslinking agent and a polymerization initiator are added to the target molecule / functional monomer complex, and a polymerization reaction is performed. Thereby, an organic polymer in which the shape of the template molecule and the arrangement of the interaction points are stored is obtained. Finally, a template molecule is cleaved and removed from the obtained polymer to obtain a polymer (molecular imprint polymer) having a molecular recognition site that interacts with the template molecule in a substrate-specific manner. For the method of synthesizing the molecularly imprinted polymer, for example, the reference “Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H.“ Molecular Imprinting ”, WILEY-VCH, Weinheim, 2002.” Please refer to the description.
分子インプリント微粒子を得る方法としては、機械的に粉砕して微粒子を得る方法と、核を成長させて微粒子を得る方法の２つに大別される。機械的に粉砕する場合、ハンマー式粉砕機、衝撃式粉砕機、ロール式粉砕機、ジェット気流式粉砕機などの公知の粉砕機が使用できる。得られた粉砕物（微粒子）は、必要により篩別して粒度調製することができる。 The method for obtaining molecularly imprinted fine particles is roughly classified into two methods: a method for obtaining fine particles by mechanical pulverization and a method for obtaining fine particles by growing nuclei. When mechanically pulverizing, a known pulverizer such as a hammer pulverizer, an impact pulverizer, a roll pulverizer, or a jet airflow pulverizer can be used. The obtained pulverized product (fine particles) can be sieved as necessary to prepare a particle size.
分子インプリントポリマーの微粒子を得る方法としては、例えば、沈殿重合法、分散重合法、乳化重合法、シード乳化重合法などを挙げることができる（参考文献：蒲池幹治、遠藤剛監修者、『ラジカル重合ハンドブック』（1999）エヌティーエス、G. Schmid Ed. Nanoparticles, Wiley-VCH (2004) ）。本発明者は、ポリスチレン粒子をシード（種）とするシード乳化重合法により、ＢＰＡ認識分子インプリントポリマー微粒子を合成している（実施例１参照）。 Examples of the method for obtaining fine particles of molecularly imprinted polymer include precipitation polymerization method, dispersion polymerization method, emulsion polymerization method, seed emulsion polymerization method, etc. (reference: Mikiharu Tsunoike, Takeshi Endo, “Radical” Polymerization Handbook (1999) NTS, G. Schmid Ed. Nanoparticles, Wiley-VCH (2004)). The inventor has synthesized BPA-recognized molecularly imprinted polymer fine particles by a seed emulsion polymerization method using polystyrene particles as seeds (see Example 1).
本発明のセンシングチップに用いられる分子インプリント微粒子は、動的光散乱法により測定される平均粒子径が２００ｎｍ以下であることが好ましい。平均粒子径が２００ｎｍ以下であれば分子インプリント微粒子の比表面積が大きく、基板上の標的分子単分子層と分子インプリント微粒子の標的分子結合部位がとの結合箇所が増加するため、両者が強固に結合でき、分子インプリント微粒子が標的分子の単分子層に確実に固定化されるからである。逆に、平均粒子径が２００ｎｍを超えると、一旦標的分子の単分子層に結合した分子インプリント微粒子が、標的分子の単分子層から離れてしまう場合がある。また、平均粒子径が２００ｎｍを超えると、ＳＰＲスペクトル測定が困難になる場合がある。 The molecularly imprinted fine particles used in the sensing chip of the present invention preferably have an average particle size measured by a dynamic light scattering method of 200 nm or less. If the average particle size is 200 nm or less, the specific surface area of the molecularly imprinted fine particles is large, and the number of binding sites between the target molecule monomolecular layer on the substrate and the target molecular binding sites of the molecularly imprinted fine particles increases. This is because the molecularly imprinted fine particles are surely immobilized on the monomolecular layer of the target molecule. Conversely, when the average particle diameter exceeds 200 nm, the molecularly imprinted fine particles once bonded to the target molecule monomolecular layer may be separated from the target molecule monomolecular layer. Moreover, when the average particle diameter exceeds 200 nm, SPR spectrum measurement may be difficult.
「動的光散乱法」とは、粒子が分散している溶液にレーザー光を当て、その散乱光変化を測定したときに検出される粒子のブラウン運動に依存した散乱光度の揺らぎに基づいて、粒子の大きさ（粒子径）を導き出す方法である。動的光散乱法に基づく粒子径測定装置は各社から市販されており（大塚電子、シスメックス、ベックマン・コールターなど）、本発明に係る検出方法に用いられる分子インプリント微粒子の平均粒子径測定に好適に用いることができる。 "Dynamic light scattering method" is based on the fluctuation of the scattered light intensity depending on the Brownian motion of the particles detected when laser light is applied to the solution in which the particles are dispersed and the change in the scattered light is measured. This is a method of deriving the size (particle diameter) of particles. Particle size measuring devices based on the dynamic light scattering method are commercially available from various companies (Otsuka Electronics, Sysmex, Beckman Coulter, etc.) and suitable for measuring the average particle size of molecularly imprinted fine particles used in the detection method according to the present invention. Can be used.
本発明のセンシングチップは、上述のように種々の検出手段に好適に適用することができるが、なかでもＳＰＲスペクトル測定用に用いることが好ましい。本発明のセンシングチップをＳＰＲスペクトル測定用に用いる場合、複数の金属領域を有する基板を用いることが好ましい。複数の金属領域は、同じ種類の金属で構成されていてもよく、それぞれ異なる金属で構成されていてもよく、一部が異なる金属で構成されていてもよい。異なる種類の金属を使用する場合、その組み合わせは特に限定されないが、同一試料に対し複数のＳＰＲシグナルを同時に測定できる利点があるため、同一の標的分子に対して異なるＳＰＲスペクトルが得られる組み合わせが好ましい。好ましい組み合わせとしては、例えば、金と銀などが挙げられる。金属領域と分子インプリント微粒子の組み合わせは限定されず、例えば、複数の金属領域のすべてに同一の分子インプリント微粒子が固定化されていてもよく、複数の金属領域のそれぞれに異なる種類の（標的分子が異なる）分子インプリント微粒子が固定化されていてもよい。また、分子インプリント微粒子が固定化されていない金属領域を設けてもよい。金属領域は隣接していてもよく、離れていてもよい。 The sensing chip of the present invention can be suitably applied to various detection means as described above, and among them, it is preferably used for SPR spectrum measurement. When the sensing chip of the present invention is used for SPR spectrum measurement, it is preferable to use a substrate having a plurality of metal regions. The plurality of metal regions may be made of the same type of metal, may be made of different metals, or may be made of different metals. When different types of metals are used, the combination is not particularly limited. However, since there is an advantage that a plurality of SPR signals can be simultaneously measured for the same sample, a combination that can obtain different SPR spectra for the same target molecule is preferable. . Examples of preferable combinations include gold and silver. The combination of the metal region and the molecularly imprinted fine particle is not limited. For example, the same molecularly imprinted fine particle may be fixed to all of the plurality of metal regions. Molecularly imprinted fine particles having different molecules may be immobilized. Further, a metal region where the molecularly imprinted fine particles are not immobilized may be provided. The metal regions may be adjacent or separated.
基板が複数の金属領域を有することにより、ＳＰＲスペクトル測定において、高感度かつ高精度の定量を行うことができる。例えば２箇所の金属領域を設けた場合、以下(i)〜（iii）のような測定が可能となる。
(i) ２箇所の金属領域のうち、一方には標的分子の単分子層を形成せず、分子インプリント微粒子が固定化されていない金属領域とし、他方には標的分子の単分子層を形成し標的分子の分子インプリント微粒子を固定化したセンシングチップとした場合、ＳＰＲスペクトルの変化量とその他のファクター（例えば、温度など）を同時に測定することができる。また、複数チャンネルの流路を使用すれば複数サンプルの同時測定が可能になる。なお、２箇所の金属領域は同じ金属でも異なる金属でもよい。
(ii) ２箇所の金属領域は同じ金属からなり、両方の金属領域に標的分子の単分子層を形成し、一方には標的分子Ａの認識部位を有する分子インプリント微粒子を固定化し、他方には標的分子Ｂの認識部位を有する分子インプリント微粒子を固定化したセンシングチップとした場合、選択性などの測定を同時に行うことが可能になる。
(iii) ２箇所の金属領域は異なる金属からなり、両方に標的分子の単分子層を形成し標的分子の分子インプリント微粒子を固定化したセンシングチップとした場合、金属の特性の差により一方の金属領域の反応（ＳＰＲスペクトル変化量）を基準とし他方の金属領域のＳＰＲスペクトル変化量を測定すると定量的な測定が可能となる。
なお、金属領域は２箇所に限定されるものではなく、３箇所以上の場合も同様に標的分子を高感度かつ高精度に定量することができる。
Since the substrate has a plurality of metal regions, high-sensitivity and high-precision quantification can be performed in SPR spectrum measurement. For example, when two metal regions are provided, the following measurements (i) to (iii) are possible.
(i) Of the two metal regions, one does not form a target molecule monolayer, a metal region where molecular imprinted fine particles are not immobilized, and the other forms a target molecule monolayer. In the case of a sensing chip in which molecularly imprinted fine particles of target molecules are immobilized, the amount of change in SPR spectrum and other factors (for example, temperature) can be measured simultaneously. In addition, if a plurality of channels are used, a plurality of samples can be measured simultaneously. The two metal regions may be the same metal or different metals.
(ii) The two metal regions are made of the same metal, form a monomolecular layer of the target molecule in both metal regions, immobilize the molecularly imprinted fine particles having the recognition site of the target molecule A on one side, When a sensing chip having immobilized molecularly imprinted fine particles having a recognition site for the target molecule B is used, it is possible to simultaneously measure selectivity and the like.
(iii) When a sensing chip has two metal regions made of different metals, each of which forms a monolayer of target molecules and immobilizes target molecule molecular imprinted microparticles, Quantitative measurement is possible by measuring the SPR spectrum change amount of the other metal region on the basis of the reaction of the metal region (SPR spectrum change amount).
Note that the metal region is not limited to two places, and the target molecule can be quantified with high sensitivity and high accuracy in the case of three or more places.
上記(iii)に記載の効果は、２種類の金属からなる金属領域を１箇所設け、これに標的分子の単分子層を形成し、標的分子Ａの分子インプリント微粒子を固定化したセンシングチップによっても実現することが可能である。このような金属領域は、例えば、二層の金属薄膜を形成させることや、二種類の金属を混合してから金属薄膜を形成させることにより設けることができる。３種類上の金属を用いる場合も同様に設けることができる。 The effect described in the above (iii) is that a sensing region in which a metal region composed of two kinds of metals is provided, a monomolecular layer of a target molecule is formed thereon, and molecular imprinted fine particles of the target molecule A are immobilized. Can also be realized. Such a metal region can be provided, for example, by forming a two-layer metal thin film or by mixing two kinds of metals and then forming the metal thin film. When three kinds of metals are used, they can be similarly provided.
〔センシングチップの製造方法〕
本発明のセンシングチップの製造方法は、基板上に標的分子またはその誘導体の単分子層を形成する単分子層形成工程と、前記単分子層と分子インプリント微粒子懸濁液とを接触させる微粒子接触工程とを包含するものであればよい。これら以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。
[Sensing chip manufacturing method]
The method for producing a sensing chip of the present invention includes a monomolecular layer forming step of forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof on a substrate, and a fine particle contact in which the monomolecular layer and a molecularly imprinted fine particle suspension are brought into contact with each other. Any process that includes a process may be used. Steps other than these may be included, and the content is not limited.
単分子層形成工程では、基板上に標的分子またはその誘導体の単分子層を形成する。基板は、上述のように、その表面に標的分子の単分子層を形成できる種々の材質のものが使用可能である。単分子層形成工程において、基板上に標的分子またはその誘導体の単分子層を形成する方法は特に限定されない。例えば、表面に金属領域を有する基板を用いる場合には、公知の方法により、チオール基を導入した標的分子の自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を当該金属領域の表面に形成させることができる。また、公知の方法により、ラングミュアーブロジェット膜を基板表面に形成させることができる。一例としてＳＰＲ用の金基板にＳＡＭを形成する場合について説明すると、標的分子のチオール誘導体のエタノール溶液を洗浄した金基板の表面に滴下し、溶液が蒸発しないようにカバーガラスをかぶせて２〜３時間程度、またはそれ以上静置することにより、標的分子の単分子層が形成できる。 In the monomolecular layer forming step, a monomolecular layer of the target molecule or its derivative is formed on the substrate. As described above, the substrate can be made of various materials capable of forming a monomolecular layer of target molecules on the surface thereof. In the monomolecular layer forming step, the method for forming the monomolecular layer of the target molecule or derivative thereof on the substrate is not particularly limited. For example, when a substrate having a metal region on the surface is used, a self-assembled monolayer (SAM) of a target molecule into which a thiol group is introduced can be formed on the surface of the metal region by a known method. Further, a Langmuir Blodget film can be formed on the substrate surface by a known method. As an example, the case where SAM is formed on a gold substrate for SPR will be described. An ethanol solution of a thiol derivative of a target molecule is dropped on the surface of a washed gold substrate, and a cover glass is put on the surface to prevent the solution from evaporating. A monomolecular layer of the target molecule can be formed by allowing to stand for about an hour or more.
微粒子接触工程では、単分子層形成工程で形成された標的分子の単分子層と分子インプリント微粒子懸濁液とを接触させる。これにより、分子インプリント微粒子が標的分子の単分子層に固定化される。接触させる方法は限定されず、分子インプリント微粒子懸濁液中に基板を浸漬する方法や、基板表面に分子インプリント微粒子懸濁液をマウントする方法などを適宜選択すればよい。微粒子接触工程の後に、固定化されていない分子インプリント微粒子を除去するための洗浄工程を設けてもよい。本発明の製造方法を用いれば、基板上に分子インプリントを備えるセンシングチップを非常に簡便に製造することができ、センシングチップの製造に必要なコストを大幅に低減することができる。 In the fine particle contact step, the monomolecular layer of the target molecule formed in the monomolecular layer forming step is brought into contact with the molecular imprinted fine particle suspension. As a result, the molecularly imprinted fine particles are immobilized on the monomolecular layer of the target molecule. The method of contacting is not limited, and a method of immersing the substrate in the molecularly imprinted fine particle suspension, a method of mounting the molecularly imprinted fine particle suspension on the substrate surface, or the like may be selected as appropriate. After the fine particle contact step, a cleaning step for removing molecular imprinted fine particles that are not immobilized may be provided. If the manufacturing method of this invention is used, the sensing chip provided with a molecular imprint on a board | substrate can be manufactured very simply, and the cost required for manufacture of a sensing chip can be reduced significantly.
微粒子接触工程において、単分子層形成工程で標的分子の単分子層を形成した基板をＳＰＲ測定装置にセットし、分子インプリント微粒子懸濁液をＳＰＲ測定装置の試料送液用流路に送液すれば、流路の範囲の標的分子の単分子層に分子インプリント微粒子懸濁液を接触させることができる。これによって、流路の範囲に分子インプリント微粒子を固定化することができる。この方法は、本発明のセンシングチップをＳＰＲスペクトル測定用に使用する場合には特に有利であり、例えば、上述のように表面に標的分子のＳＡＭを形成した金基板を、試料を測定する場合と同様にＳＰＲ測定装置にセットし、まず分子インプリント微粒子懸濁液を流路に送液して、分子インプリント微粒子を固定化、洗浄した後、そのまま流路に試料を送液すれば、直ちにＳＰＲスペクトルの測定を行うことができる。さらに、ターゲットが異なる分子インプリント微粒子を送液すれば一枚のチップで複数のターゲットを同時に測定することができる。 In the fine particle contact process, the substrate on which the monomolecular layer of the target molecule was formed in the monomolecular layer forming process is set in the SPR measurement device, and the molecular imprinted fine particle suspension is sent to the sample flow channel of the SPR measurement device. Then, the molecularly imprinted fine particle suspension can be brought into contact with the monomolecular layer of the target molecule in the range of the flow path. As a result, the molecularly imprinted fine particles can be immobilized in the range of the flow path. This method is particularly advantageous when the sensing chip of the present invention is used for SPR spectrum measurement. For example, when a sample is measured on a gold substrate on which a SAM of a target molecule is formed on the surface as described above, Similarly, after setting in the SPR measurement device, first sending the molecularly imprinted fine particle suspension to the flow path, immobilizing and washing the molecularly imprinted fine particles, and then directly feeding the sample to the flow path, An SPR spectrum can be measured. Furthermore, if molecular imprinted fine particles with different targets are fed, a plurality of targets can be simultaneously measured with a single chip.
〔標的分子の検出または定量方法〕
本発明の標的分子の検出または定量方法は、標的分子を含む試料を調製する試料調製工程と、本発明のセンシングチップと試料中の標的分子との相互作用を測定する測定工程と
を包含するものであればよい。これら以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。
[Target molecule detection or quantification method]
The target molecule detection or quantification method of the present invention includes a sample preparation step of preparing a sample containing the target molecule, and a measurement step of measuring the interaction between the sensing chip of the present invention and the target molecule in the sample. If it is. Steps other than these may be included, and the content is not limited.
本発明の標的分子の検出または定量方法の検出対象である標的分子は特に限定されず、薬剤等の低分子化合物からタンパク質などの高分子化合物まで広範囲の分子を標的分子とすることができる。好ましい標的分子としては、生体分子が挙げられる。生体分子は生物中に存在する分子であればよい。生体分子を標的とすることにより、病気の診断、臨床検査、生物学の基礎研究などに利用可能な標的分子の検出方法を提供することができる。 The target molecule to be detected by the target molecule detection or quantification method of the present invention is not particularly limited, and a wide range of molecules from low molecular compounds such as drugs to high molecular compounds such as proteins can be used as target molecules. Preferable target molecules include biomolecules. The biomolecule may be a molecule that exists in an organism. By targeting a biomolecule, it is possible to provide a method for detecting a target molecule that can be used for diagnosis of disease, clinical examination, basic research of biology, and the like.
試料調製工程では、標的分子を含む試料を測定手段に適した形態や濃度に調製する。試料の形態としては、液体、個体、粒状体、粉状体、流動体、組織切片などの形態を挙げることができる。試料は、例えば生体や天然物から採取することができる。生体分子を標的とする場合は、動物および植物の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、透析排液などを挙げることができる。なお、試料は標的分子を含み得るものであればよい。 In the sample preparation step, a sample containing the target molecule is prepared in a form and concentration suitable for the measurement means. Examples of the form of the sample include liquids, solids, granules, powders, fluids, tissue sections, and the like. The sample can be collected from a living body or a natural product, for example. When targeting biomolecules, animal and plant biological components can be suitably used. Examples of samples derived from animals including humans include body fluids such as blood, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, nasal discharge, sputum, urine, feces, ascites, skin, lung, kidney, mucous membrane, various organs, Examples thereof include a washing solution after washing tissue such as bone, nasal cavity, bronchi, skin, various organs, bone, and the like, and dialysis drainage. In addition, the sample should just contain a target molecule.
また、試料調製工程において、標的分子を修飾することにより測定感度を向上させることができる。修飾する物質としては、エネルギーを吸収する物質が好ましく、例えば、蛍光物質や金属微粒子などが挙げられる。金属微粒子としては金微粒子が好ましい。金微粒子がＳＰＲ信号を増感することが報告されており（例えば、L. Andrew Lyon, David J. Pena, Michael J. Natan "Surface Plasmon Resonance of Au Colloid-Modified Au Films: Particle Size Dependence" J. Phys. Chem. B, 1999, 103: 5826. や、Lin He, Michael D. Musick, Sheila R. Nicewarner, Frank G. Salinas, Stephen J. Benkovic, Michael J. Natan, Christine D. Keating "Colloidal Au-Enhanced Surface Plasmon Resonance for Ultrasensitive Detection of DNA Hybridization" JACS,2000,122:9071）、本発明のセンシングチップにおいても、銀薄膜と金微粒子との組み合わせにおいて感度の向上が確認されたからである（実施例参照）。標的分子の修飾は、共有結合、非共有結合、配位結合などにより修飾する物質を標的分子に結合させることで行うことができる。 In the sample preparation step, the measurement sensitivity can be improved by modifying the target molecule. The substance to be modified is preferably a substance that absorbs energy, and examples thereof include fluorescent substances and metal fine particles. Gold fine particles are preferred as the metal fine particles. Gold fine particles have been reported to sensitize SPR signals (for example, L. Andrew Lyon, David J. Pena, Michael J. Natan "Surface Plasmon Resonance of Au Colloid-Modified Au Films: Particle Size Dependence" J. Phys. Chem. B, 1999, 103: 5826. and Lin He, Michael D. Musick, Sheila R. Nicewarner, Frank G. Salinas, Stephen J. Benkovic, Michael J. Natan, Christine D. Keating "Colloidal Au- Enhanced Surface Plasmon Resonance for Ultrasensitive Detection of DNA Hybridization "JACS, 2000, 122: 9071), even in the sensing chip of the present invention, it was confirmed that the sensitivity was improved in the combination of silver thin film and gold fine particles (see Examples). ). The modification of the target molecule can be performed by binding a substance to be modified by covalent bond, non-covalent bond, coordinate bond or the like to the target molecule.
測定工程では、本発明のセンシングチップと試料中の標的分子の相互作用を測定する。センシングチップと試料中の標的分子の相互作用とは、上述のように、センシングチップの基板上に固定化された分子インプリント微粒子の標的分子認識部位が試料中の標的分子を特異的に認識し、分子インプリント微粒子と標的分子とが物理的化学的に相互作用可能なほど近接する状態になることを意味する。また、上述のように、種々の検出手段を用いて標的分子を測定することができる。また、標的分子の標準液を用いて検量線を作成することにより、試料中の標的分子を定量することが可能となる。 In the measurement step, the interaction between the sensing chip of the present invention and the target molecule in the sample is measured. As described above, the interaction between the sensing chip and the target molecule in the sample means that the target molecule recognition site of the molecularly imprinted microparticle immobilized on the sensing chip substrate specifically recognizes the target molecule in the sample. This means that the molecularly imprinted fine particles and the target molecule are in close proximity so that they can interact physically and chemically. Further, as described above, the target molecule can be measured using various detection means. In addition, by creating a calibration curve using a standard solution of target molecules, it becomes possible to quantify the target molecules in the sample.
本発明の標的分子の検出または定量方法は、上記本発明のセンシングチップを用いるので、高感度かつ高精度の検出または定量が可能であり、特にバックグラウンドが高くなる要因となる夾雑物を多く含む生体由来の試料や天然物由来の試料等における標的分子の検出または定量に好適である。 Since the detection or quantification method of the target molecule of the present invention uses the sensing chip of the present invention, it can be detected or quantified with high sensitivity and high accuracy, and contains a large amount of contaminants that cause a particularly high background. It is suitable for detection or quantification of a target molecule in a sample derived from a living body or a sample derived from a natural product.
〔センシングチップの製造用キット〕
本発明のセンシングチップの製造用キットは、標的分子またはその誘導体の単分子層形成用試薬、および、標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子を含むものであればよい。これら以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、他に必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、基板を含むキットとしてもよく、検量線作成用に標的分子の標準液を含むキットとしてもよい。標的分子またはその誘導体の単分子層形成用試薬としては、具体的には、例えば、ＳＡＭ形成用の標的分子のチオール誘導体が挙げられる。本発明のキットを用いることにより、上記本発明のセンシングチップを簡便に製造することができる。
[Sensing chip manufacturing kit]
The kit for manufacturing a sensing chip of the present invention only needs to include a reagent for forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof, and molecularly imprinted fine particles having a target molecule recognition site. The specific kit configuration other than these is not particularly limited, and other necessary reagents, instruments, etc. may be appropriately selected to form the kit configuration. For example, it may be a kit containing a substrate, or a kit containing a standard solution of a target molecule for preparing a calibration curve. Specific examples of the reagent for forming a monolayer of a target molecule or a derivative thereof include, for example, a thiol derivative of a target molecule for SAM formation. By using the kit of the present invention, the sensing chip of the present invention can be easily produced.
本明細書において「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。 As used herein, a “kit” is intended to be a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a specific material. Preferably, an instruction manual for using the material is provided. The instructions for use may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, and the like.
なお、キットに含まれる標的分子またはその誘導体の単分子層形成用試薬、および、標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子を、それぞれ単独の試薬として販売することも可能である。 In addition, it is also possible to sell the reagent for forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof included in the kit and the molecularly imprinted fine particle having a target molecule recognition site, respectively, as a single reagent.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these.
〔実施例１：分子インプリント微粒子固定化基板の作製〕
ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）認識分子インプリント微粒子を合成し、得られた分子インプリント微粒子をガラス基板上の金薄膜蒸着部位に固定化した基板を作製した。本実施例に使用した試薬は、いずれも市販品を購入した。また、分析機器としては、以下のものを使用した。すなわち、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、GILSON製のオートサンプルインジェクター（SAMPLING INJECTOR 321XL）、ポンプ（306PUMP）、検出器（UV/VIS DETECTOR 119）からなる計器にパソコンをつなぎ、計測プログラムにはUnipoint V.3.00を使用した。遠心分離機はトミー精工株式会社のSRX-201、ローターはTA-1またはTA-20を用いた。遠心エバポレーターはEYELA CVE-2000、ローターはR-2000Dを用いた。サーモミキサーはeppendorf製thermomixer comfort、シリカゲルクロマトグラフィーはWAKO Wakogel C-300HGを使用した。NMRスペクトルはJEOL JNM-LA300 FT NMR SYSTEM 300MHz、紫外・可視分光光度計はJASCO V-560 UV/VIS Spectrophotometer、動的光散乱解析装置は大塚電子DLS 7000を使用した。質量分析はApplierd Biosystems MALDI-TOF-MS Voyager-2000、走査型分析電子顕微鏡（SEM）はキーエンス VE-9800、透過型電子顕微鏡（TEM）は日立 H-7500を用いた。UV/VIS表面・界面分光測定装置はシステムインスツルメンツ SIS-5000、IRスペクトルはBIO RAD FT-IR Spectrometer FTS 135、ITCは日本シイベルヘグナー VP-ITC Micro Calorimeterを用いた。シリカゲルクロマトグラフィーにはWAKO Wakogel C-300HGを用いた。UV/オゾンクリーニングにはメイワフォーシスBIOFORCE NANOSCIENCESを用いた。蒸留水はMILLIPORE MilliQを用いた。メカニカルスターラーはEYELA MINI D.C STIRRER MDC-RT、撹拌羽根は75×22×3t mmを用いた。
[Example 1: Preparation of molecularly imprinted fine particle-immobilized substrate]
Bisphenol A (BPA) recognizing molecular imprinted fine particles were synthesized, and a substrate in which the obtained molecular imprinted fine particles were immobilized on a gold thin film deposition site on a glass substrate was produced. All reagents used in this example were purchased commercially. Moreover, the following was used as an analytical instrument. In other words, high performance liquid chromatography (HPLC) is a GILSON autosample injector (SAMPLING INJECTOR 321XL), pump (306PUMP), detector (UV / VIS DETECTOR 119) connected to a personal computer, and the measurement program is Unipoint. V.3.00 was used. The centrifuge was Tommy Seiko SRX-201, and the rotor was TA-1 or TA-20. The centrifugal evaporator was EEYLA CVE-2000, and the rotor was R-2000D. Thermomixer comfort manufactured by eppendorf was used as the thermomixer, and WAKO Wakogel C-300HG was used as the silica gel chromatography. The NMR spectrum was JEOL JNM-LA300 FT NMR SYSTEM 300 MHz, the ultraviolet / visible spectrophotometer was JASCO V-560 UV / VIS Spectrophotometer, and the dynamic light scattering analyzer was Otsuka Electronics DLS 7000. Mass spectrometry was performed using Applied Biosystems MALDI-TOF-MS Voyager-2000, scanning analytical electron microscope (SEM) using Keyence VE-9800, and transmission electron microscope (TEM) using Hitachi H-7500. The UV / VIS surface / interface spectrometer was System Instruments SIS-5000, the IR spectrum was BIO RAD FT-IR Spectrometer FTS 135, and the ITC was Nihon Siebel Hegner VP-ITC Micro Calorimeter. For silica gel chromatography, WAKO Wakogel C-300HG was used. Meiwa Forsys BIOFORCE NANOSCIENCES was used for UV / ozone cleaning. Distilled water was MILLIPORE MilliQ. The mechanical stirrer used was EEYLA MINI DC STIRRER MDC-RT, and the stirring blade was 75 × 22 × 3t mm.
（１）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
１−１．テンプレート（鋳型）の合成
以下のスキーム１に従って、テンプレートの合成を行った。すなわち、50mlナスフラスコに3-vinylbenzaldehyde 0.254ml（2mmol）を測り取り、DCM 12mlを加えた。4,4’-diaminodiphenylmethane(4,4’-DADPM) 99.13 mg（0.5mmol）（in DCM 4ml）を加えて室温で３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（TLC）（DCM）で確認したところ4,4’-DADPMのスポットが見られた（原料Rf＝0.9，生成物Rf=0.7）。そこで3-vinylbenzaldehydeをさらに63.5μl（0.5mmol）加えた。１時間撹拌したところでスポットが見られなくなった。エバポレーターで溶媒を留去した後、Hxを加えると沈殿物が生成した。吸引ろ過で溶液と分離し真空乾燥した。1H-NMR（CDCl3）およびMALDI-TOF-MSで目的物１を確認した（収量：131.93 mg、収率：61.9％）。
(1) Synthesis of BPA-recognizing molecule-imprinted fine particles 1-1. Synthesis of Template (Template) A template was synthesized according to the following scheme 1. Specifically, 0.254 ml (2 mmol) of 3-vinylbenzaldehyde was measured in a 50 ml eggplant flask, and 12 ml of DCM was added. 4,4'-diaminodiphenylmethane (4,4'-DADPM) 99.13 mg (0.5 mmol) (in DCM 4 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. When confirmed by thin layer chromatography (TLC) (DCM), 4,4′-DADPM spots were observed (raw material Rf = 0.9, product Rf = 0.7). Therefore, 63.5 μl (0.5 mmol) of 3-vinylbenzaldehyde was further added. No spots were seen after stirring for 1 hour. After evaporating the solvent with an evaporator, Hx was added to form a precipitate. The solution was separated by suction filtration and dried in vacuo. The target product 1 was confirmed by 1 H-NMR (CDCl 3 ) and MALDI-TOF-MS (yield: 131.93 mg, yield: 61.9%).
１−２．ポリスチレンシードの合成
シード（種粒子）として用いるためのポリスチレン粒子の合成を行った。スチレンモノマーはインヒビターリムーバーにより重合禁止剤を除去したものを使用した。表１に示したレシピにしたがって、バイアル瓶にスチレンモノマーおよびジビニルベンゼン（DVB）を測りとった後、溶媒（蒸留水／アセトン＝8/2 (v/v)）を加えた。１０分間窒素置換を行った後、ホットプレートスターラーを用いて200rpmで撹拌しながら８０℃に加熱した。１ｇの溶媒に溶解させた開始剤（V-50）溶液を加えて２４時間熱重合を行った。重合終了後、ロータリーエバポレーターによりアセトンを留去した。重量乾燥法により重合率を算出したところ（３回平均）、シード(I)：77％、シード(II)：76％であった。ＤＬＳ測定による平均粒子径（３回平均）は、シード(I)：121nm（分散度1.14）、シード(II)：150nm（分散度1.15）であった。
1-2. Synthesis of polystyrene seeds Polystyrene particles for use as seeds (seed particles) were synthesized. The styrene monomer was obtained by removing the polymerization inhibitor with an inhibitor remover. According to the recipe shown in Table 1, after measuring styrene monomer and divinylbenzene (DVB) in a vial, a solvent (distilled water / acetone = 8/2 (v / v)) was added. After carrying out nitrogen substitution for 10 minutes, it heated at 80 degreeC, stirring at 200 rpm using a hotplate stirrer. An initiator (V-50) solution dissolved in 1 g of a solvent was added, and thermal polymerization was performed for 24 hours. After completion of the polymerization, acetone was distilled off by a rotary evaporator. When the polymerization rate was calculated by the weight drying method (average of 3 times), they were 77% for seed (I) and 76% for seed (II). The average particle size (average of 3 times) by DLS measurement was seed (I): 121 nm (dispersion degree 1.14) and seed (II): 150 nm (dispersion degree 1.15).
１−３．ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
上記１−１で合成したテンプレートと、上記１−２で合成したシード(I)を用いて分子インプリント微粒子の合成を行った。表２に示したレシピに従ってテンプレート、スチレンモノマーおよびジビニルベンゼン（DVB）、または、テンプレートおよびトリエチレングリコールジメタクリラート（TEGDMA）を測りとった。そこにシード(I)を加え、ホットプレートスターラーを用いて450rpm、室温でそれぞれ撹拌した。モノマー滴の消失を確認した後、200rpmに回転数を変え、８０℃に加熱した。その後、表２に示した量の蒸留水で溶解させた開始剤（V-50）水溶液を滴下し24時間熱重合を行った。重合率（３回平均）はそれぞれ83.6％、95.3％であった。ＤＬＳ測定による平均粒子径（３回平均）は、IPS5(S)：130nm（分散度1.03）、IPS5(T)：143nm（分散度1.14）であった。
1-3. Synthesis of BPA recognition molecularly imprinted fine particles Molecular imprinted fine particles were synthesized using the template synthesized in 1-1 and the seed (I) synthesized in 1-2. The template, styrene monomer and divinylbenzene (DVB), or template and triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) were measured according to the recipe shown in Table 2. Seed (I) was added thereto and stirred at 450 rpm and room temperature using a hot plate stirrer. After confirming disappearance of the monomer droplets, the number of revolutions was changed to 200 rpm and the mixture was heated to 80 ° C. Thereafter, an initiator (V-50) aqueous solution dissolved in distilled water in the amount shown in Table 2 was dropped, and thermal polymerization was performed for 24 hours. The polymerization rates (average of 3 times) were 83.6% and 95.3%, respectively. The average particle size (average of 3 times) by DLS measurement was IPS5 (S): 130 nm (dispersion degree 1.03) and IPS5 (T): 143 nm (dispersion degree 1.14).
続いてイミン部位の切断を行った。500mlナスフラスコにポリマーエマルション5gを加え、蒸留水で希釈し200mlにした。1M HClを200μl加え、スターラーを用いて250rpm、室温で２４時間撹拌した。その後、遠心分離（19000rpm、1h、20℃）によりポリマーを洗浄した。次に、500mlナスフラスコにイミンを切断したポリマーエマルション10gを加え、蒸留水を加えて210mlにした。1M HCl 10mlと30％H2O2 30mlを滴下し、スターラーを用いて250rpm、室温で24時間撹拌した。その後、遠心分離（19000rpm、1h、20℃）と超音波照射30分を３回行い、溶媒を1M HCl、蒸留水、メタノールの順に置換することでポリマーを洗浄し２種類のＢＰＡ認識分子インプリント微粒子ＩＰＳ５（Ｓ）およびＩＰＳ５（Ｔ）を得た。 Subsequently, the imine site was cleaved. 5 g of polymer emulsion was added to a 500 ml eggplant flask and diluted to 200 ml with distilled water. 200 μl of 1M HCl was added, and the mixture was stirred using a stirrer at 250 rpm at room temperature for 24 hours. Thereafter, the polymer was washed by centrifugation (19000 rpm, 1 h, 20 ° C.). Next, 10 g of a polymer emulsion obtained by cutting imine was added to a 500 ml eggplant flask, and distilled water was added to make 210 ml. 10 ml of 1M HCl and 30 ml of 30% H 2 O 2 were added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours at 250 rpm using a stirrer. After that, centrifugation (19000rpm, 1h, 20 ° C) and ultrasonic irradiation for 30 minutes are performed three times, and the polymer is washed by substituting the solvent in the order of 1M HCl, distilled water, and methanol, and two types of BPA recognition molecule imprints. Fine particles IPS5 (S) and IPS5 (T) were obtained.
１０分間ＵＶ／オゾン処理したカバーガラスに、メタノールに分散させたＩＰＳ５（Ｓ）およびＩＰＳ５（Ｔ）をそれぞれ滴下して真空乾燥させ、ＳＥＭ観察を行った。図１（ａ）および（ｂ）に得られた分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像を示した。（ａ）がＩＰＳ５（Ｓ）であり、（ｂ）がＩＰＳ５（Ｔ）である。図１（ａ）および（ｂ）からわかるように、ＩＰＳ５（Ｓ）およびＩＰＳ５（Ｔ）はメタノール中において球状を維持していることが確認された。 IPS5 (S) and IPS5 (T) dispersed in methanol were each dropped onto a cover glass treated with UV / ozone for 10 minutes and vacuum-dried, and SEM observation was performed. The SEM images of the molecularly imprinted fine particles obtained are shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b). (A) is IPS5 (S) and (b) is IPS5 (T). As can be seen from FIGS. 1 (a) and (b), IPS5 (S) and IPS5 (T) were confirmed to maintain a spherical shape in methanol.
（２）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子固定化基板の作製
金薄膜を蒸着した高屈折ガラス基板上にＢＰＡ−ＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer、自己組織化単分子膜）を形成させ、このＢＰＡ−ＳＡＭにＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を固定化することにより分子インプリント微粒子固定化基板を作製した。
(2) Preparation of BPA-recognized molecularly imprinted fine particle-immobilized substrate BPA-SAM (Self-Assembled Monolayer) is formed on a highly refractive glass substrate on which a gold thin film is deposited. A molecularly imprinted fine particle-immobilized substrate was prepared by immobilizing BPA-recognized molecularly imprinted fine particles.
２−１．ＢＰＡ−チオール誘導体の合成
(i) ジフェノール酸のアセチル保護（下記スキーム2-1参照）
200mlの二口ナスフラスコにジフェノール酸（1.43g, 5mmol）、K2CO3（2.76g, 20mmol）、Ac2O（1.88ml, 20mmol）を測り入れ、窒素置換した。MeCN 40mlを加え、還流下60℃で６時間撹拌した。ＴＬＣ（DCM/MeOH＝100/2、原料Rf=0, 生成物Rf=0.3）で原料のスポットの消失を確認し、反応を止め溶媒を留去した。H2O/DCMで抽出を行いMgSO4で脱水させた。溶媒を留去し、白色粉末を得た。1H-NMRで目的化合物１を確認した（収量:1.03g（2.8mmol）、収率:56％）。
2-1. Synthesis of BPA-thiol derivatives
(i) Acetyl protection of diphenolic acid (see Scheme 2-1 below)
Diphenolic acid (1.43 g, 5 mmol), K 2 CO 3 (2.76 g, 20 mmol), and Ac 2 O (1.88 ml, 20 mmol) were weighed into a 200 ml two-necked eggplant flask and purged with nitrogen. 40 ml of MeCN was added and stirred at 60 ° C. for 6 hours under reflux. The disappearance of the spot of the starting material was confirmed by TLC (DCM / MeOH = 100/2, starting material Rf = 0, product Rf = 0.3), the reaction was stopped, and the solvent was distilled off. Extraction with H 2 O / DCM was followed by dehydration with MgSO 4 . The solvent was distilled off to obtain a white powder. The target compound 1 was confirmed by 1 H-NMR (yield: 1.03 g (2.8 mmol), yield: 56%).
(ii) スクシンイミド活性エステル２の合成（下記スキーム2-2参照）
100mlの二口ナスフラスコに上記化合物１（370mg, 1mmol）、WSC（575mg, 3mmol）、NHS（345.3mg, 3mmol）を測り入れ、窒素置換した。DCM 30mlを加え、室温で6.5時間撹拌したが、ＴＬＣ（DCM/MeOH＝100/2, 原料Rf=0.3, 生成物Rf=0.6）で原料のスポットが見られたのでWSCとNHSを1mmol再添加し2.5時間撹拌した。ＴＬＣに変化がなく、原料のスポットが見られたので反応を止め、DCM/H2O、DCM/NaHCO3 aqで抽出を行った後、シリカゲルクロマトグラフィー（DCM/MeOH＝100/2）で分離精製を行い、白色粉末を得た。1H-NMRで目的化合物２を確認した（収量:336.4mg（0.72mmol）、収率:72％）。
(ii) Synthesis of succinimide active ester 2 (see Scheme 2-2 below)
The above compound 1 (370 mg, 1 mmol), WSC (575 mg, 3 mmol) and NHS (345.3 mg, 3 mmol) were weighed into a 100 ml two-necked eggplant flask and purged with nitrogen. Added 30 ml of DCM and stirred at room temperature for 6.5 hours. However, TLC (DCM / MeOH = 100/2, raw material Rf = 0.3, product Rf = 0.6) showed raw material spots, so re-added 1 mmol of WSC and NHS. And stirred for 2.5 hours. There was no change in TLC and spot of raw material was seen, so the reaction was stopped, extracted with DCM / H 2 O, DCM / NaHCO 3 aq, and then separated by silica gel chromatography (DCM / MeOH = 100/2) Purification was performed to obtain a white powder. The target compound 2 was confirmed by 1 H-NMR (yield: 336.4 mg (0.72 mmol), yield: 72%).
(iii) アルキルチオール誘導体３の合成（下記スキーム2-3参照）
50mlの二口ナスフラスコに上記化合物２（116.9mg, 0.25mmol）、11-amino-1-undecanethiol（72.0mg, 0.3mmol）を測り入れ、窒素置換した。DCM 25mlを加え溶解させた後、DIEA（83μl, 0.3mmol）を添加し室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（DCM/MeOH＝100/2, 原料Rf=0.6, 生成物Rf=0.5）で化合物２のスポットの消失を確認し、反応を止めた。DCM/H2O、DCM/10％クエン酸水溶液で抽出を行いMgSO4で脱水させた。溶媒を留去し、黄色の油状の液体を得た。1H-NMRで目的化合物３を確認した（収量:123mg（0.22mmol）、収率:86％）。
(iii) Synthesis of alkylthiol derivative 3 (see Scheme 2-3 below)
The compound 2 (116.9 mg, 0.25 mmol) and 11-amino-1-undecanethiol (72.0 mg, 0.3 mmol) were weighed into a 50 ml two-necked eggplant flask and purged with nitrogen. After 25 mL of DCM was added and dissolved, DIEA (83 μl, 0.3 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 hours. The disappearance of the spot of Compound 2 was confirmed by TLC (DCM / MeOH = 100/2, raw material Rf = 0.6, product Rf = 0.5), and the reaction was stopped. Extraction was performed with DCM / H 2 O and DCM / 10% citric acid aqueous solution, and dehydrated with MgSO 4 . The solvent was distilled off to obtain a yellow oily liquid. The target compound 3 was confirmed by 1 H-NMR (yield: 123 mg (0.22 mmol), yield: 86%).
(iv) ＢＰＡ−チオール誘導体４の合成（下記スキーム2-4参照）
50mlナスフラスコに上記化合物３（57.0mg, 0.1mmol）を測り入れ、THF 10mlを加え溶解させた。0.25M NaOH水溶液4mlを添加し室温で４．５時間撹拌した。ＴＬＣ（DCM/MeOH＝100/2原料Rf=0.5, 生成物Rf=0.1）で化合物３のスポットの消失を確認し、反応を止めた。AcOEt/10％クエン酸水溶液、AcOEt/H2Oで抽出を行いMgSO4で脱水させた。溶媒を留去し、白色粉末を得た。1H-NMRで目的化合物４を確認した（収量:26.2mg（0.06mmol）、収率:56％）。
(iv) Synthesis of BPA-thiol derivative 4 (see Scheme 2-4 below)
The above compound 3 (57.0 mg, 0.1 mmol) was weighed into a 50 ml eggplant flask, and 10 ml of THF was added and dissolved. 4 ml of 0.25M NaOH aqueous solution was added and stirred at room temperature for 4.5 hours. The disappearance of the spot of compound 3 was confirmed by TLC (DCM / MeOH = 100/2 raw material Rf = 0.5, product Rf = 0.1), and the reaction was stopped. Extraction was performed with AcOEt / 10% aqueous citric acid solution and AcOEt / H 2 O, and dehydrated with MgSO 4 . The solvent was distilled off to obtain a white powder. The target compound 4 was confirmed by 1 H-NMR (yield: 26.2 mg (0.06 mmol), yield: 56%).
２−２．ＢＰＡ−ＳＡＭの形成
１０分間ＵＶ／オゾンクリーニングした金蒸着高屈折ガラス基板に、上記化合物４の１ｍＭエタノール溶液を滴下し、カバーガラスをかぶせて一夜静置した。その後、カバーガラスをはずし、メタノールで洗浄して乾燥させた。ＩＲ−ＲＡＳスペクトルを測定した結果から、基板上の金薄膜の表面にＢＰＡ−ＳＡＭが形成されていることを確認した。
2-2. Formation of BPA-SAM A 1 mM ethanol solution of the above compound 4 was dropped onto a gold-deposited high refractive glass substrate that had been UV / ozone cleaned for 10 minutes, covered with a cover glass, and allowed to stand overnight. Thereafter, the cover glass was removed, washed with methanol and dried. From the result of measuring the IR-RAS spectrum, it was confirmed that BPA-SAM was formed on the surface of the gold thin film on the substrate.
２−３．ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の固定化
(i) ＩＰＳ５（Ｓ）の固定化
固形分濃度0（対照）、0.45、0.91、1.37、2.73 wt％（トルエン／メタノール＝20/1(v/v)）のIPS5(S)エマルションを調製した。ＢＰＡ−ＳＡＭを形成した上記基板にフローセルを取り付け、流速50μl/minで溶媒（トルエン／メタノール＝20/1(v/v)）を１０分間、ＩＰＳ５（Ｓ）エマルションを８分間流し、分子インプリント微粒子を基板に結合させた。余分な微粒子を除去するために溶媒（トルエン／メタノール＝20/1(v/v)）を１０分間流した後、ＳＰＲスペクトルを測定した。その後、メタノールを１５分間流し、再度ＳＰＲスペクトルを測定した。
2-3. Immobilization of BPA recognition molecular imprinted fine particles
(i) Immobilization of IPS5 (S) IPS5 (S) emulsion with solid content concentration 0 (control), 0.45, 0.91, 1.37, 2.73 wt% (toluene / methanol = 20/1 (v / v)) was prepared. . A flow cell is attached to the above substrate on which BPA-SAM has been formed, and a solvent (toluene / methanol = 20/1 (v / v)) is flowed at a flow rate of 50 μl / min for 10 minutes, and an IPS5 (S) emulsion is allowed to flow for 8 minutes, and molecular imprint Fine particles were bound to the substrate. In order to remove excess fine particles, a solvent (toluene / methanol = 20/1 (v / v)) was allowed to flow for 10 minutes, and then the SPR spectrum was measured. Thereafter, methanol was allowed to flow for 15 minutes, and the SPR spectrum was measured again.
図２（ａ）および（ｂ）にＩＰＳ５（Ｓ）エマルション送流後（メタノール送流前）のＳＰＲスペクトルの測定結果を示した。（ａ）はＳＰＲスペクトルチャートであり、（ｂ）は各濃度におけるピーク波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットしたグラフである。図２（ａ）および（ｂ）に示した結果から、分子インプリント微粒子濃度の増加に伴いＳＰＲスペクトルの長波長シフトが観察され、飽和に達することが確認された。これは、分子インプリント微粒子が基板に結合したことによる屈折率の変化を捉えたものである。さらに、メタノール送流後に測定したＳＰＲスペクトルはメタノール送流前のＳＰＲスペクトルと同様であり、変化が見られなかった。すなわち、極性溶媒であるメタノールを送流しても、その前後でＳＰＲスペクトルが変化しなかったことから、極性溶媒中でも分子インプリント微粒子は基板から解離せず、分子インプリント微粒子は多価相互作用によって強固に結合（固定化）したと考えられた。 The measurement result of the SPR spectrum after IPS5 (S) emulsion sending (before methanol sending) was shown in Drawing 2 (a) and (b). (A) is an SPR spectrum chart, and (b) is a graph in which the shift value (Δλnm) of the peak wavelength at each concentration is plotted. From the results shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b), it was confirmed that a long wavelength shift of the SPR spectrum was observed as the concentration of the molecularly imprinted fine particles increased, and saturation was reached. This captures the change in refractive index due to the binding of molecularly imprinted fine particles to the substrate. Furthermore, the SPR spectrum measured after the methanol flow was the same as the SPR spectrum before the methanol flow, and no change was observed. That is, even when methanol, which is a polar solvent, was sent, the SPR spectrum did not change before and after that, so even in the polar solvent, molecularly imprinted fine particles were not dissociated from the substrate, and molecularly imprinted fine particles were It was thought that they were firmly bonded (immobilized).
(ii) ＩＰＳ５（Ｔ）の固定化
固形分濃度0（対照）、0.22、0.55、1.10、2.81 wt％（トルエン／メタノール＝20/1(v/v)）のＩＰＳ５（Ｔ）エマルションを調製し、上記「(i) ＩＰＳ５（Ｓ）の固定化」と同様にしてＳＰＲスペクトルを測定した。図３に各濃度におけるピーク波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットしたグラフを示した。図３から明らかなように、ＩＰＳ５（Ｔ）の場合もＩＰＳ５（Ｓ）の結果と同様に、分子インプリント微粒子濃度の増加に伴いＳＰＲスペクトルの長波長シフトが観察され、飽和に達することが確認された。さらに、メタノール送流の前後でＳＰＲスペクトルは変化しなかったことから、分子インプリント微粒子が基板に強固に結合（固定化）したと考えられた。
(ii) Immobilization of IPS5 (T) Prepare IPS5 (T) emulsion with solid content of 0 (control), 0.22, 0.55, 1.10, 2.81 wt% (toluene / methanol = 20/1 (v / v)). The SPR spectrum was measured in the same manner as in “(i) Immobilization of IPS5 (S)”. FIG. 3 shows a graph plotting the peak wavelength shift value (Δλnm) at each concentration. As is clear from FIG. 3, in the case of IPS5 (T), as in the case of IPS5 (S), a long wavelength shift of the SPR spectrum is observed as the concentration of molecularly imprinted fine particles increases, and it is confirmed that saturation is reached. It was done. Furthermore, since the SPR spectrum did not change before and after the methanol feed, it was considered that the molecularly imprinted fine particles were firmly bonded (immobilized) to the substrate.
以上のように、基板上の金属薄膜に標的分子またはその誘導体の単分子層を形成し、当該標的分子を認識する分子インプリント微粒子のエマルションを単分子層上に送流することによって、分子インプリント微粒子固定化基板を作製できることが明らかとなった。 As described above, by forming a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof on a metal thin film on a substrate and sending an emulsion of molecularly imprinted fine particles recognizing the target molecule onto the monomolecular layer, It was revealed that a printed fine particle fixed substrate can be produced.
〔実施例２：分子インプリント微粒子固定化基板を用いたセンシング〕
本実施例では、金および銀薄膜蒸着高屈折ガラス基板上に、上記実施例１で作製した分子インプリント微粒子（ＩＰＳ５（Ｓ））を固定化した基板と、標的分子であるＢＰＡに金ナノ微粒子を結合させたＢＰＡ修飾金ナノ微粒子（以下、「ＢＰＡ−ＡｕＮＰ」と記す）を用いて、ＳＰＲシグナルの変化によるセンシングを試みた。ＢＰＡ−ＡｕＮＰを用いたのは、ＢＰＡは分子量が小さいため、分子インプリント微粒子に結合してもシグナルが弱く、検出が困難であることが予想されたこと、および、金微粒子をターゲットに修飾することで１０００倍の感度向上が達成できていることが知られていること（参考文献：山田淳「プラズモンナノ材料の設計と応用技術」シーエムシー、2006）に基づく。ＢＰＡ−ＡｕＮＰは、上記ＢＰＡ−チオール誘導体４を用いて合成した。
[Example 2: Sensing using molecularly imprinted fine particle-immobilized substrate]
In this example, a substrate in which the molecularly imprinted fine particles (IPS5 (S)) prepared in Example 1 above are immobilized on a gold and silver thin film-deposited high refractive glass substrate, and a gold nanoparticle on the target molecule BPA. Using a BPA-modified gold nanoparticle (hereinafter referred to as “BPA-AuNP”) to which is bonded, an attempt was made by sensing based on a change in SPR signal. BPA-AuNP was used because BPA has a low molecular weight, so it was expected that the signal was weak even when bound to molecularly imprinted microparticles and that it was difficult to detect, and gold microparticles were modified to target This is based on the fact that it is known that a sensitivity improvement of 1000 times can be achieved (reference: Satoshi Yamada, “Design and application technology of plasmon nanomaterials”, CMC, 2006). BPA-AuNP was synthesized using the BPA-thiol derivative 4 described above.
（１）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子固定化基板の作製
１０分間ＵＶ／オゾンクリーニングした金および銀蒸着高屈折ガラス基板上に、実施例１で合成したＢＰＡ−チオール誘導体の１ｍＭエタノール溶液を滴下し、カバーガラスをかぶせて一夜静置してＢＰＡ−ＳＡＭを形成させた。その後、カバーガラスをはずし、メタノールで洗浄して乾燥させた。この基板にフローセルを取り付け、流速50μl/minでトルエンを１０分間送流した。次に、2wt％に調製したIPS5(S)（トルエン）を１０分間送流して基板に結合させ、その後トルエンを１０分間送流して余分なＩＰＳ５（Ｓ）を除去した。以上の操作により、ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子固定化基板を作製した。
(1) Preparation of BPA recognition molecule imprinted fine particle fixed substrate A 1 mM ethanol solution of the BPA-thiol derivative synthesized in Example 1 was dropped on a gold / silver-deposited high refractive glass substrate that had been UV / ozone cleaned for 10 minutes, Covered with a cover glass and allowed to stand overnight to form BPA-SAM. Thereafter, the cover glass was removed, washed with methanol and dried. A flow cell was attached to this substrate, and toluene was fed for 10 minutes at a flow rate of 50 μl / min. Next, IPS5 (S) (toluene) prepared to 2 wt% was sent for 10 minutes to bond to the substrate, and then toluene was sent for 10 minutes to remove excess IPS5 (S). By the above operation, a BPA recognition molecule imprinted fine particle fixed substrate was produced.
（２）標的分子のセンシング
２−１．ＢＰＡ−ＡｕＮＰ溶液の送流
ＢＰＡ−ＡｕＮＰのＴＨＦ溶液（0.05, 0.1, 0.2, 0.5 mg/ml）を調製した。上記（１）により作製したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子固定化基板にフローセルを取り付け、ＢＰＡ−ＡｕＮＰのＴＨＦ溶液を１０分間送流（流速50μl/min）した後、溶媒をトルエンに置換した。各濃度におけるＳＰＲスペクトルを測定しＢＰＡ−ＡｕＮＰの結合特性を評価した。
(2) Target molecule sensing 2-1. Flow of BPA-AuNP solution A THF solution (0.05, 0.1, 0.2, 0.5 mg / ml) of BPA-AuNP was prepared. A flow cell was attached to the BPA recognition molecule imprinted fine particle fixed substrate prepared in (1) above, and a THF solution of BPA-AuNP was sent for 10 minutes (flow rate 50 μl / min), and then the solvent was replaced with toluene. The SPR spectrum at each concentration was measured to evaluate the binding characteristics of BPA-AuNP.
図４に、各濃度におけるピーク波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットしたグラフを示した。図４から明らかなように、ＢＰＡ−ＡｕＮＰの濃度増加に伴い、長波長シフトが観測され飽和に達した。また、シフトの大きさを比較すると、銀（Ag）のほうが金（Au）よりも大きかった。 FIG. 4 shows a graph in which the shift value (Δλnm) of the peak wavelength at each concentration is plotted. As is clear from FIG. 4, a long wavelength shift was observed and reached saturation as the BPA-AuNP concentration increased. Moreover, when comparing the magnitude of the shift, silver (Ag) was larger than gold (Au).
２−２．ＢＰＡ溶液の送流
ＢＰＡ−ＡｕＮＰが分子インプリント微粒子に結合した状態で、ＢＰＡ溶液を送流した。予め、各濃度（0.1, 0.5, 1mM）のＢＰＡ溶液を、トルエン・メタノール混合溶媒（トルエン／メタノール＝20/1(v/v)）を用いて調製した。上記２−１におけるＢＰＡ−ＡｕＮＰの送流およびトルエンの送流に続いてＢＰＡ溶液を１０分間送流（流速50μl/min）した後、溶媒をトルエンに置換し、各濃度におけるＳＰＲスペクトルを測定した。
2-2. BPA solution feeding The BPA solution was fed with BPA-AuNP bound to the molecularly imprinted microparticles. BPA solutions having respective concentrations (0.1, 0.5, 1 mM) were prepared in advance using a toluene / methanol mixed solvent (toluene / methanol = 20/1 (v / v)). Following the BPA-AuNP flow and toluene flow in 2-1 above, the BPA solution was flown for 10 minutes (flow rate 50 μl / min), the solvent was replaced with toluene, and the SPR spectrum at each concentration was measured. .
図５に、各濃度におけるピーク波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットしたグラフを示した。図５から明らかなように、金（Au）では波長のシフトが観察されなかったが、銀（Ag）では長波長シフトが観察された。遊離のＢＰＡの存在によりＢＰＡ−ＡｕＮＰが解離することが予想されたたが、ＢＰＡ−ＡｕＮＰの解離による短波長シフトは観察されず、銀（Ag）では逆に長波長シフトが観察されたことから、ＢＰＡ−ＡｕＮＰの存在下でＢＰＡの結合によるシグナルが増強されて検出された可能性が示唆された。 FIG. 5 shows a graph plotting the peak wavelength shift value (Δλnm) at each concentration. As is clear from FIG. 5, no wavelength shift was observed with gold (Au), but a long wavelength shift was observed with silver (Ag). BPA-AuNP was expected to dissociate due to the presence of free BPA, but no short wavelength shift due to the dissociation of BPA-AuNP was observed, and silver (Ag) was observed to have a long wavelength shift. This suggests that the signal due to the binding of BPA was enhanced and detected in the presence of BPA-AuNP.
２−３．ＢＰＡ−ＡｕＮＰ非存在下でのＢＰＡ溶液の送流
上記（１）により作製したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子固定化基板に、上記２−２と同様に調製したＢＰＡ溶液（0.05，0.1, 0.5, 1mM）を１０分間送流（流速50μl/min）した後、溶媒をトルエンに置換し、各濃度におけるＳＰＲスペクトルを測定した。
2-3. Flow of BPA solution in the absence of BPA-AuNP A BPA solution (0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) prepared in the same manner as in the above 2-2 was applied to the BPA recognition molecule imprinted fine particle fixed substrate prepared in (1) above. ) For 10 minutes (flow rate 50 μl / min), the solvent was replaced with toluene, and the SPR spectrum at each concentration was measured.
図６に、各濃度におけるピーク波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットしたグラフを示した。図６から明らかなように、ＢＰＡ−ＡｕＮＰ非存在下では、金（Au）および銀（Ag）ともに、長波長シフトは観察されなかった。この結果より、ＢＰＡの結合によるシグナルがＢＰＡ−ＡｕＮＰの存在下で増強されることが裏付けられた。また、データを示していないが、高濃度のＢＰＡ溶液（5mM〜2M）を送流しても大きな短波長シフトが観察されなかったことから、基板上のＢＰＡ（ＢＰＡ−ＳＡＭ）と分子インプリント微粒子（ＩＰＳ５（Ｓ））との相互作用は強力であり、遊離のＢＰＡによる分子インプリント微粒子の剥離は起こらず、基板に安定に固定化されていることが示された。 FIG. 6 shows a graph plotting the peak wavelength shift value (Δλnm) at each concentration. As is clear from FIG. 6, no long wavelength shift was observed for both gold (Au) and silver (Ag) in the absence of BPA-AuNP. This result confirmed that the signal due to BPA binding was enhanced in the presence of BPA-AuNP. In addition, although no data is shown, since a large short wavelength shift was not observed even when a high-concentration BPA solution (5 mM to 2 M) was fed, BPA (BPA-SAM) and molecularly imprinted fine particles on the substrate were not observed. The interaction with (IPS5 (S)) was strong, and molecular imprinted fine particles were not peeled off by free BPA, indicating that it was stably immobilized on the substrate.
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and technical means disclosed in different embodiments are appropriately combined. The obtained embodiment is also included in the technical scope of the present invention. Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
本発明は、公衆衛生、環境衛生、医療などの分野に利用することができる。また、試薬産業に利用することができる。 The present invention can be used in fields such as public health, environmental health, and medical care. It can also be used in the reagent industry.
Claims (12)
前記単分子層は前記基板上に形成され、前記分子インプリント微粒子は前記単分子層に固定化されていることを特徴とするセンシングチップ。 A target molecule sensing chip comprising a substrate, a monomolecular layer of a target molecule or a derivative thereof, and molecular imprinted fine particles having a target molecule recognition site constructed by a molecular imprint method,
The sensing chip, wherein the monomolecular layer is formed on the substrate, and the molecular imprinted fine particles are fixed to the monomolecular layer.
前記単分子層と分子インプリント微粒子懸濁液とを接触させる微粒子接触工程と
を包含することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンシングチップの製造方法。 A monolayer forming step of forming a monolayer of a target molecule or a derivative thereof on a substrate;
The method for manufacturing a sensing chip according to any one of claims 1 to 7, further comprising a fine particle contact step of bringing the monomolecular layer into contact with the molecularly imprinted fine particle suspension.
請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンシングチップと試料中の標的分子との相互作用を測定する測定工程と
を包含することを特徴とする標的分子の検出または定量方法。 A sample preparation step of preparing a sample containing the target molecule;
A method for detecting or quantifying a target molecule, comprising a measurement step of measuring an interaction between the sensing chip according to any one of claims 1 to 7 and a target molecule in a sample.
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