JP2010104239A - Method for producing 1,5-d-anhydroglucitol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は酵素を用いた１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法に関する。 The present invention relates to a method for producing 1,5-D-anhydroglucitol using an enzyme.
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール(以下１，５−ＡＧ)は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物により生合成されることから、食品中にも広く分布している物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり経口摂取された１，５−ＡＧで４８時間までに二酸化炭素として呼気中に排出される量は全体の１％以下であり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料としての利用も期待できる。また産業上では、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートから化学的に合成する方法（非特許文献２参照）が報告されている。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素により臭素化し、水素化アルミニウムリチウムにより脱アセチル化することにより行われる。
1,5-D-anhydroglucitol (hereinafter 1,5-AG) is a polyol having a structure in which the hydroxyl group at the 1-position of glucose is reduced and is biosynthesized by many animals and plants. It is a widely distributed substance. 1,5-AG is metabolically stable in the animal body, and the amount of 1,5-AG taken orally ingested as exhaled carbon dioxide by 48 hours is less than 1% of the whole (non-patented) Reference 1) can also be used as a low calorie or non-calorie sweetener. In industry, it is used as a research reagent and a clinical test reagent.
As a method for preparing 1,5-AG, a method of chemically synthesizing from β-D-glucopyranose pentaacetate (see Non-Patent Document 2) has been reported. The synthesis method is carried out by dissolving β-D-glucopyranose pentaacetate in ether, brominating with hydrogen bromide, and deacetylating with lithium aluminum hydride.
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で抽出後、精製、晶析して調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。これらの化学合成法や植物からの抽出法は、プロセスが多段的で煩雑であり、さらにエーテルやヘキサン等の有機溶媒を用いるため、得られた１，５−ＡＧを食品とするには、それらを分離、処理する必要がある。更には安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められる。
１，５−ＡＧは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）により生合成されること（非特許文献１参照）が報告されている。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）では、１，５−ＡＧはその大腸菌の培養時に培地中に分泌されるが、その生成量は培地１リットルあたりに数マイクログラム程度であり工業生産方法としては応用できるものではない。
As another preparation method, a method of extracting and purifying 1,5-AG from leaves of protea seeds with an organic solvent such as ethanol and hexane, followed by purification and crystallization has been reported (see Non-Patent Document 3). These chemical synthesis methods and extraction methods from plants are complicated and complicated processes, and since organic solvents such as ether and hexane are used, the obtained 1,5-AG can be used as food. Need to be separated and processed. Furthermore, questions remain from the viewpoint of safety.
As a means for solving these problems, a production method is required which has a simple production process and does not use an organic solvent such as ether.
It has been reported that 1,5-AG is biosynthesized by Escherichia coli (see Non-Patent Document 1). However, in Escherichia coli, 1,5-AG is secreted into the medium at the time of culturing the E. coli, but the amount produced is about several micrograms per liter of the medium. It is not possible.
その他パラディウム触媒存在下で１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース(以下１，５−ＡＦ)に水素を添加する１，５−ＡＧの調製法が報告されているが(非特許文献４参照)、１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧの生成量は反応生成物の２０％程度であり効率的に合成できない。
１，５−ＡＧの原料となり得る１，５−ＡＦは澱粉などのα−１、４−グルカンをα−１、４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、その生産技術が提案された（特許文献１参照）。１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに効率よく変換する方法の開発が望まれているが、近年、１，５−ＡＧの工業的な生産方法として１，５−ＡＦを微生物に接触させて製造する方法が提案されている(特許文献２参照)。この方法では外因性の１，５−ＡＦが微生物によって１，５−ＡＧに変換される。この変換をし得る微生物として酵母が挙げられている。
In addition, although a method for preparing 1,5-AG in which hydrogen is added to 1,5-D-anhydrofructose (hereinafter 1,5-AF) in the presence of a palladium catalyst has been reported (see Non-Patent Document 4), Not only 1,5-AG but other reaction products are produced, and the amount of 1,5-AG produced is about 20% of the reaction products, and cannot be synthesized efficiently.
1,5-AF, which can be a raw material for 1,5-AG, is a saccharide that can be prepared by degrading α-1,4-glucan such as starch with α-1,4-glucan lyase. A technique has been proposed (see Patent Document 1). Development of a method for efficiently converting 1,5-AF to 1,5-AG is desired, but in recent years, 1,5-AF has been brought into contact with microorganisms as an industrial production method for 1,5-AG. Has been proposed (see Patent Document 2). In this method, exogenous 1,5-AF is converted to 1,5-AG by microorganisms. Yeast is mentioned as a microorganism capable of this conversion.
一方で１，５−ＡＦを酵素反応により還元し１，５−ＡＧを製造する方法も考えられる。
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する酵素としては豚の肝臓(非特許文献５参照)やマウス（非特許文献６参照）由来の１，５−アンヒドロフルクトースデヒドロゲナーゼが報告されている。しかしながらこの酵素については大量調製などの検討はなされておらず、工業的に該酵素を使用することは困難である。
また１，５−ＡＦを還元する酵素としては微生物由来の還元酵素が報告されているが、反応生成物は１，５−アンヒドロマンニトールであり、１，５−ＡＧ生産には用いることができない(非特許文献７参照)。
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、Ｄ−アラビノースに作用してＤ−アラビノ−１，５−ラクトンに酸化すると共に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下ＮＡＤＰ+)を還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸(以下ＮＡＤＰＨ)に還元する。この酵素については全アミノ酸配列がすでに報告されている(非特許文献８参照)。
As an enzyme that reduces 1,5-AF to 1,5-AG, 1,5-anhydrofructose dehydrogenase derived from pig liver (see Non-Patent Document 5) and mouse (see Non-Patent Document 6) has been reported. Yes. However, this enzyme has not been studied for mass preparation, and it is difficult to use the enzyme industrially.
In addition, a microorganism-derived reductase has been reported as an enzyme that reduces 1,5-AF, but the reaction product is 1,5-anhydromannitol and cannot be used for 1,5-AG production. (Refer nonpatent literature 7).
D-arabinose dehydrogenase acts on D-arabinose to oxidize it to D-arabino-1,5-lactone, and converts oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter NADP + ) to reduced nicotinamide adenine nucleotide phosphate. (Hereinafter referred to as NADPH). The entire amino acid sequence of this enzyme has already been reported (see Non-Patent Document 8).
本発明は１，５−ＡＦを出発物質とし酵素を用いて１，５−ＡＧを製造する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing 1,5-AG using 1,5-AF as a starting material and an enzyme.
本発明者らは１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する各種微生物の酵素を探索した結果、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨの存在下で１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換することを見出し本発明を完成した。 As a result of searching for enzymes of various microorganisms that convert 1,5-AF to 1,5-AG, the present inventors found that D-arabinose dehydrogenase was converted from 1,5-AF to 1,5-AG in the presence of NADPH. The present invention has been completed.
本発明によれば、１，５−ＡＦを原料としてＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを作用させることにより、酵素法で、簡便に、効率的に１，５−ＡＧを大量に生産することができる。 According to the present invention, a large amount of 1,5-AG can be easily and efficiently produced by an enzymatic method by allowing D-arabinose dehydrogenase to act using 1,5-AF as a raw material.
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼはこれまでにカンディダ属（非特許文献９参照）、シュードモナス属(非特許文献１０参照)と酵母由来の酵素が報告されており、酵母由来の酵素のアミノ酸配列は図１の配列１に示すとおりである。
ここで示すアミノ酸は一文字略式を使用しており、略式は表１のとおりである。本発明に用いるＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは配列１とのアミノ酸配列の相同性が６０％以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するものであれば良いが、好ましくは配列１との相同性が７０%以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するもの、より好ましくは配列１と相同性が８０％以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するものが良い。
As for D-arabinose dehydrogenase, enzymes derived from Candida (see Non-Patent Document 9), Pseudomonas (see Non-Patent Document 10) and yeast have been reported so far. The amino acid sequence of the enzyme derived from yeast is the sequence shown in FIG. As shown in FIG.
The amino acids shown here use one-letter abbreviations, and the abbreviations are as shown in Table 1. The D-arabinose dehydrogenase used in the present invention may be any one as long as it has an amino acid sequence homology of 60% or more with sequence 1 and has an action of reducing 1,5-AF to 1,5-AG. Those having a homology with sequence 1 of 70% or more and the action of reducing 1,5-AF to 1,5-AG, more preferably 80% or more with sequence 1 and 1,5-AF It is preferable to have an action of reducing the amount to 1,5-AG.
以下に酵母由来のアラビノースデヒドロゲナーゼについて述べる。
酵母由来のＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次のような還元反応を行う。
The arabinose dehydrogenase derived from yeast will be described below.
D-arabinose dehydrogenase derived from yeast performs the following reduction reaction.
・ 作用
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次式に示すように１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元すると共にＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に酸化する。
１，５−ＡＦ ＋ ＮＡＤＰＨ ＋ Ｈ＋ → １，５−ＡＧ ＋ ＮＡＤＰ＋
-Action D-arabinose dehydrogenase reduces 1,5-AF to 1,5-AG and oxidizes NADPH to NADP + as shown in the following formula.
1,5-AF + NADPH + H + → 1,5-AG + NADP +
（２）酵素還元活性
本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの還元活性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
０．５Ｍビス−トリス緩衝液(ｐＨ６．５)、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液および５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌずつ混合し、蒸留水で１．８ｍｌに定容して基質とする。この基質溶液を３０℃の湯浴中で５分間保温した後に０．２ｍｌの酵素溶液を添加して反応を開始する。３０℃で２０分間反応させた後、分光光度計を用いた光路長１ｃｍのセルにて３７５ｎｍの吸光度を測定する。１分間当たりに減少した吸光度の値（Ａ）から、消費されたＮＡＤＰＨ量を下記の換算式に基づいて求めた。酵素の活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する酵素量を１ユニットとした（図２）。
(2) Enzyme reducing activity The method for measuring the reducing activity of D-arabinose dehydrogenase used in the present invention and the method for displaying the enzyme activity value are as follows.
Mix 0.5 ml of 0.5 M Bis-Tris buffer (pH 6.5), 250 mM 1,5-AF solution and 5 mM NADPH solution, and make up to 1.8 ml with distilled water to make a substrate. This substrate solution is kept in a 30 ° C. water bath for 5 minutes, and then 0.2 ml of the enzyme solution is added to start the reaction. After reacting at 30 ° C. for 20 minutes, the absorbance at 375 nm is measured in a cell having an optical path length of 1 cm using a spectrophotometer. From the absorbance value (A) decreased per minute, the consumed NADPH amount was determined based on the following conversion formula. The amount of enzyme that consumes 1 μmol of NADPH per minute was defined as 1 unit (FIG. 2).
（３）基質特異性
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの基質特異性を調べるために、基質濃度２５ｍＭの単糖類に対するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの還元活性を求めた。その結果を、１，５−ＡＦに対する還元作用を１００とした相対活性として表２に示す。この結果からも明らかなように本酵素は１，５−ＡＦ以外の単糖類には、殆ど還元活性を示さなかった。
(3) Substrate specificity In order to examine the substrate specificity of D-arabinose dehydrogenase, the reducing activity of D-arabinose dehydrogenase against a monosaccharide having a substrate concentration of 25 mM was determined. The results are shown in Table 2 as relative activities with the reducing action on 1,5-AF as 100. As is clear from this result, this enzyme showed almost no reducing activity for monosaccharides other than 1,5-AF.
また、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは補酵素としてＮＡＤＰＨを要求し、ＮＡＤＨには殆ど作用を示さなかった。
（４）Ｋｍ値
ラインウイバー・バーク(ＬＩＮＥＷＥＡＶＥＲ・Ｂｕｒｋ)プロットにより、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの１，５−ＡＦに対する還元反応のＫｍ値を求めたところ１．１７ｍＭであった（図３）。
In addition, D-arabinose dehydrogenase used in the present invention required NADPH as a coenzyme, and showed almost no effect on NADH.
(4) Km value The Km value of the reduction reaction of 1,5-AF for D-arabinose dehydrogenase used in the present invention was determined to be 1.17 mM by means of a LINEWEBER Burk plot. FIG. 3).
（５）還元作用の至適ｐＨは、６．５〜７．５付近であった（図４）。 (5) The optimum pH for the reducing action was around 6.5 to 7.5 (FIG. 4).
（６）至適温度は、３５〜４０度付近であった（図５）。
次に本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次のような酸化反応を触媒する。
(6) The optimum temperature was around 35 to 40 degrees (FIG. 5).
Next, the D-arabinose dehydrogenase used in the present invention catalyzes the following oxidation reaction.
（１）作用
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次式に示すようにＤ−アラビノースをＤ−アラビノ−１，５−ラクトンに酸化すると共にＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元する。
(1) Action D-arabinose dehydrogenase oxidizes D-arabinose to D-arabino-1,5-lactone and reduces NADP + to NADPH as shown in the following formula.
Ｄ−アラビノース＋ＮＡＤＰ＋→Ｄ−アラビノ−１，５−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
（２）本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化活性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
０．２ｍｌの０．５Ｍトリス緩衝液(ｐＨ９．０)、０．２ｍｌの１ＭのＤ−アラビノース溶液および０．２ｍｌの５ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液を混合し、蒸留水で１．８ｍｌに定容して基質とする。この基質溶液を３０℃の湯浴で５分間保温した後に、０．２ｍｌの酵素液を加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間反応させた後、分光光度計を用いた光路長１ｃｍのセルにて３４０ｎｍの吸光度を測定する。１分間当たりに増加した吸光度の値（Ａ）から、生成するＮＡＤＰＨ量を下記の換算式に基づいて求めた。酵素の活性は、１分間あたりに１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが生成する酵素量を１ユニットとした（図６）。
D-arabinose + NADP + → D-arabino-1,5-lactone + NADPH + H +
(2) The method for measuring the oxidation activity of D-arabinose dehydrogenase and the method for displaying the enzyme activity value used in the present invention are as follows.
Mix 0.2 ml of 0.5 M Tris buffer (pH 9.0), 0.2 ml of 1 M D-arabinose solution and 0.2 ml of 5 mM NADP + solution, and make up to 1.8 ml with distilled water. As a substrate. After this substrate solution is kept warm in a 30 ° C. hot water bath for 5 minutes, 0.2 ml of enzyme solution is added and mixed to start the reaction. After reacting at 30 ° C. for 20 minutes, absorbance at 340 nm is measured in a cell having an optical path length of 1 cm using a spectrophotometer. From the absorbance value (A) increased per minute, the amount of NADPH produced was determined based on the following conversion formula. The enzyme activity was defined as 1 unit of the amount of enzyme produced by 1 μmol of NADPH per minute (FIG. 6).
（３）基質特異性
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの基質特異性を調べるために、基質濃度１００ｍＭにおける各単糖類に対するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化作用を求めた。最も活性の高かったＬ−キシロースに対する酸化作用を１００とした相対活性で表すと表３になる。Ｄ−アラビノース以外にもＬ−キシロース、Ｌ−ガラクトースおよびＬ−フコースに高い活性を示めす。
また、該酵素のＫｍ値が先の報告で求められているが、(非特許文献８参照)Ｄ−アラビノース:１６１ｍＭ、Ｌ−キシロース:２４ｍＭ、Ｌ−フコース:９８ｍＭ、Ｌ−ガラクトース:１８０ｍＭと同様な結果である。
(3) Substrate specificity To examine the substrate specificity of D-arabinose dehydrogenase, the oxidizing action of D-arabinose dehydrogenase on each monosaccharide at a substrate concentration of 100 mM was determined. Table 3 shows the relative activity with the oxidation activity for L-xylose having the highest activity as 100. In addition to D-arabinose, L-xylose, L-galactose and L-fucose are highly active.
Further, the Km value of the enzyme has been determined in the previous report (see Non-Patent Document 8), as with D-arabinose: 161 mM, L-xylose: 24 mM, L-fucose: 98 mM, and L-galactose: 180 mM. Result.
（４）還元作用の至適ｐＨは８．０〜９．０付近にある（図７）。 (4) The optimum pH for the reducing action is around 8.0 to 9.0 (FIG. 7).
（５）１，５−ＡＧから１，５−ＡＦへの酸化反応
表３に示すように該酵素は１，５−ＡＧから１，５−ＡＦへの酸化反応を触媒しない。
(5) Oxidation reaction from 1,5-AG to 1,5-AF As shown in Table 3, the enzyme does not catalyze the oxidation reaction from 1,5-AG to 1,5-AF.
これまで報告されている１，５−アンヒドロフルクトースレダクターゼによる（非特許文献５参照）１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへの変換は、水素供与体であるＮＡＤＰＨから水素が受け渡され、ＮＡＤＰ＋となる。１，５−ＡＧ製造量は、ＮＡＤＰＨの供給量に依存することから、１，５−ＡＧと等モル量以上のＮＡＤＰＨを必要とした。ＮＡＤＰＨは非常に高価であるため、１，５−ＡＧ生産においてはこのＮＡＤＰＨの供給が問題となる。
この問題点を解消するひとつの手段として反応系内に蓄積したＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ再生することが考えられる。ＮＡＤＰＨの再生方法としては、ＮＡＤＰ＋要求性の他の酸化酵素を共役させた反応系で行うのが一般的である。
In the conversion of 1,5-AF to 1,5-AG by 1,5-anhydrofructose reductase reported so far (see Non-Patent Document 5), hydrogen is transferred from NADPH which is a hydrogen donor. , NADP + . Since the production amount of 1,5-AG depends on the supply amount of NADPH, NADPH in an equimolar amount or more with 1,5-AG was required. Since NADPH is very expensive, the supply of NADPH becomes a problem in 1,5-AG production.
As one means for solving this problem, it is conceivable to regenerate NADP + accumulated in the reaction system into NADPH. The NADPH regeneration method is generally carried out in a reaction system conjugated with NADP + another oxidase that is required.
しかし、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは１，５−ＡＦの還元と上記したＬ−キシロースなどの還元糖の酸化の二つの反応を同時に触媒する。したがって該酵素を用いて、酸化還元の両反応を組み合わせることで図８に示す反応を行うことができる。
また、Ｄ−アラビノースを用いた場合、Ｄ−アラビノ−１，５−ラクトンは、酸化酵素（Ｄ−アラビノラクトンオキシダーゼ）の作用により、エリスロアスコルビン酸に(非特許文献８参照)、Ｌ−ガラクトースを用いた場合には、酸化酵素(Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）の作用でアスコルビン酸に（非特許文献１１参照）変換することができる。
従って、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼのみを用いた共役反応系を用いて１，５−ＡＧの製造量を上げつつ、更にアスコルビン酸などの有用物質の製造を行うこともできる。
However, the D-arabinose dehydrogenase used in the present invention simultaneously catalyzes two reactions of 1,5-AF reduction and oxidation of reducing sugars such as L-xylose described above. Therefore, the reaction shown in FIG. 8 can be carried out by combining the oxidation-reduction reactions using the enzyme.
When D-arabinose is used, D-arabino-1,5-lactone is converted to erythroascorbic acid (see Non-Patent Document 8) and L-galactose by the action of oxidase (D-arabinolactone oxidase). Can be converted into ascorbic acid (see Non-Patent Document 11) by the action of oxidase (L-galactonolactone oxidase).
Therefore, a useful substance such as ascorbic acid can be further produced while increasing the production amount of 1,5-AG using a coupling reaction system using only D-arabinose dehydrogenase.
次に本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの製造法について説明する。
サッカロマイセス・セレビジエ（酵母） 培養のための１，５−ＡＦを含む培養液は、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物などが適宜使用される。無機イオンの供給には、マグネシウム塩、リン酸塩、カルシウム塩などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して培養液とした。
培養条件は特別な制限もないが、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で行い、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行う。
Next, a method for producing D-arabinose dehydrogenase used in the present invention will be described.
Saccharomyces cerevisiae (yeast) As a culture solution containing 1,5-AF for culturing, a medium containing a normal carbon source, nitrogen source, inorganic ions, and further, if necessary, an organic nutrient source can be used. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids, and the like are appropriately used. As organic nutrient sources, yeast extract, malt extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, casein degradation product containing vitamins, amino acids and the like are used as appropriate. For the supply of inorganic ions, magnesium salts, phosphates, calcium salts and the like are appropriately used. A 1,5-AF aqueous solution that was separately sterilized by filter was added to the medium to obtain a culture solution.
The culture conditions are not particularly limited. For example, the culture is performed under aerobic conditions at a pH of 3 to 7 and a temperature of 20 to 40 ° C., and the culture is performed for about 2 to 7 days while maintaining an appropriate pH and temperature.
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの分離精製は、次のようにして行うことができる。本酵素は菌体内に存在するので、培養液を遠心分離、あるいはろ過などの方法で菌体だけを回収することが好ましい。該酵素を菌体から抽出する方法としては、ザイモリエイス等の酵素による細胞壁破砕、界面活性剤を用いた菌体膜の化学的溶解、ガラスビーズや超音波を用いた物理的破砕などの方法があげられる。これらの中から適当な方法を選択、あるいは適宜組み合わせて菌体から酵素を抽出できる。
これらの方法で抽出された粗酵素液からＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを更に精製する必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、疎水結合クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによって精製を行うことができる。
Separation and purification of D-arabinose dehydrogenase can be performed as follows. Since the present enzyme is present in the microbial cells, it is preferable to recover only the microbial cells by a method such as centrifugation or filtration of the culture solution. Examples of the method for extracting the enzyme from the cells include cell wall crushing with an enzyme such as Zymolyce, chemical dissolution of the cell membrane using a surfactant, and physical crushing using glass beads or ultrasonic waves. It is done. An enzyme can be extracted from the cells by selecting an appropriate method from these or combining them appropriately.
When it is necessary to further purify D-arabinose dehydrogenase from the crude enzyme solution extracted by these methods, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel, which is a commonly used means for purifying enzymes, is used. Purification can be carried out by appropriately combining or repeating methods such as filtration and hydrophobic bond chromatography.
本発明で用いた酵素源となる微生物の代わりに、例えば紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等により創生した変異株、細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株など、または他の細菌を形質転換したもので１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換し得るＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物を利用することができる。また、遺伝子操作技術により配列１に示すアラビノースデヒドロゲナーゼのアミノ酸の１０％までを置換、欠損、付加した酵素も利用できる。さらにこれらの酵素を他のホスト生物、例えばカビ、酵母、大腸菌などで酵素を産生させた酵素も含む。 Created by, for example, ultraviolet irradiation, N-methyl-N-nitrosoguanidine (NTG) treatment, ethylmethanesulfonate (EMS) treatment, nitrous acid treatment, acridine treatment, etc., instead of the microorganism used as the enzyme source used in the present invention. D which can convert 1,5-AF to 1,5-AG with a mutant strain, a genetically modified strain derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic recombination, or the like, or a transformant of other bacteria -Microorganisms having arabinose dehydrogenase activity can be used. In addition, an enzyme in which up to 10% of the amino acid of arabinose dehydrogenase shown in Sequence 1 is substituted, deleted, or added by gene manipulation techniques can be used. Furthermore, these enzymes include enzymes produced by other host organisms such as mold, yeast, E. coli and the like.
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼを用いた１，５−ＡＧの製法について説明する。
試料中の１，５−ＡＦは、ＮＡＤＰＨ存在下、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの作用により、１，５−ＡＧとＮＡＤＰ＋が生成する。酵素添加量は、１，５−ＡＦ濃度にもよるが、好ましくは１ｍｌあたり０．０１〜０．５ユニットで反応を行う。反応のｐＨは、好ましくは４．０〜１０．０、より好ましくは５．０〜９．０、さらに好ましくは６．０〜８．０である。反応温度は、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃である。１，５−ＡＧ生成量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいは高性能陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスドアンペロメトリ検出器（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）で測定することができる。ＨＰＬＣ測定及びＨＰＡＥ−ＰＡＤ測定の詳細条件は以下に示す。
A method for producing 1,5-AG using D-arabinose dehydrogenase will be described.
1,5-AF and NADP + are produced from 1,5-AF in the sample by the action of D-arabinose dehydrogenase in the presence of NADPH. The amount of enzyme added depends on the 1,5-AF concentration, but the reaction is preferably carried out at 0.01 to 0.5 units per ml. The pH of the reaction is preferably 4.0 to 10.0, more preferably 5.0 to 9.0, and still more preferably 6.0 to 8.0. Reaction temperature becomes like this. Preferably it is 20-50 degreeC, More preferably, it is 25-45 degreeC, More preferably, it is 30-40 degreeC. The amount of 1,5-AG produced can be measured by high performance liquid chromatography (HPLC) or high performance anion exchange chromatography and a pulsed amperometry detector (HPAE-PAD). Detailed conditions for HPLC measurement and HPAE-PAD measurement are shown below.
ＨＰＬＣ測定:分離カラム:ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ連結 （昭和電工（株）製、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速:１．０ｍＬ／分、カラム温度:４０℃、検出器:示差屈折率検出器、サンプル供与量:２０μＬの条件で測定を実施した。
ＨＰＡＥ−ＰＡＤ測定:分離カラム:Ｃａｒｂｏｐａｃｋ ＭＡ１ （Ｄｉｏｎｅｘ社製）、移動相:０．５Ｍ ＮａＯＨ、流速:０．４ｍｌ／分、カラム温度:３５℃、検出器:パルスドアンペロメトリ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ社製）、サンプル供与量:２５μＬの条件で測定した。
生成した１，５−ＡＧを含む反応溶液を通常実施される手段で反応液より分離、精製する。具体的には、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、シロップ状とする。次いでイオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせて１，５−ＡＧを分離し、濃縮後、結晶化することもできる。
HPLC measurement: separation column: Shodex SP810-MCIGELCK08S connection (manufactured by Showa Denko KK, Mitsubishi Chemical), mobile phase: distilled water, flow rate: 1.0 mL / min, column temperature: 40 ° C., detector: differential The measurement was carried out under conditions of a refractive index detector and a sample supply amount: 20 μL.
HPAE-PAD measurement: Separation column: Carbopack MA1 (manufactured by Dionex), mobile phase: 0.5 M NaOH, flow rate: 0.4 ml / min, column temperature: 35 ° C., detector: pulsed amperometry detector (Dionex) Manufactured), sample donation amount: It measured on the conditions of 25 microliters.
The produced reaction solution containing 1,5-AG is separated and purified from the reaction solution by a usual method. Specifically, decolorization with activated carbon and desalination with ion exchange resin make syrup. Subsequently, 1,5-AG can be separated by appropriately combining operations such as ion exchange, adsorption, and separation by gel filtration chromatography, and can be crystallized after concentration.
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ/ｖ）％である。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples. The% used in the following description is capacity (w / v)% unless otherwise specified.
実施例１
＜酵母培養・菌体破砕＞
グルコース２．０％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス２．０％、ｐＨ６．０の培地を坂口フラスコに１００ｍＬずつ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
上記培地に、斜面培地（グルコース２．０％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス２．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養したサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、３０℃、３日間振とう培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する液体培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μＭのフィルターを通し除菌した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度１．０％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５０ｍＬを加え、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／分、３０℃で４８時間培養した。
培養液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）して菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水に懸濁して再度遠心分離後（４，０００×ｇ、１０分）洗浄し、湿重量１００ｇの菌体を得た。
Example 1
<Yeast culture and cell disruption>
A medium of 2.0% glucose, 1.0% polypeptone, 2.0% yeast extract, and pH 6.0 was dispensed in 100 mL portions into a Sakaguchi flask and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes.
In the above medium, Saccharomyces cerevisiae NBRC 0210 cultured in a slant medium (glucose 2.0%, polypeptone 1.0%, yeast extract 2.0%, agar powder 1.5%, pH 6.0). One platinum ear was collected and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. This was used as a seed culture solution. 5 L of liquid medium having the same composition as above was placed in a 10-liter mini jar fermenter, and 1,5-AF aqueous solution sterilized through a filter with a pore size of 0.45 μM was added to a final concentration of 1.0%. . The seed culture solution (50 mL) was added to the medium containing 1,5-AF, and the mixture was cultured at 30 ° C. for 48 hours at a stirring speed of 250 rpm, an aeration rate of 4 L / min.
The culture was centrifuged (4,000 × g, 10 minutes) to recover the cells. The collected cells were suspended in distilled water, centrifuged again (4,000 × g, 10 minutes), and washed to obtain cells with a wet weight of 100 g.
２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに先に得た菌体を懸濁し、最終濃度１０ｍＭになるようにジチオスレイトールを加えて３０℃、２０分間、振とう器（１５０ｒｐｍ）で振とうし還元処理した。その後、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）で集菌した。２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）２５０ｍｌに懸濁してＹ−ＰＥＲ−Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬２５０ｍｌ、最終濃度１０ｍＭになるようにフェニルメチルスルフォニルオライド（ＰＭＳＦ）を加えた。３０℃、２０分間、振とう器（１５０ｒｐｍ）で振とうして菌体から酵素を抽出した。遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）で分離した上澄み液を２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析しＹ−ＰＥＲ−Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬を除去した。この溶液を粗抽出液とした。この際、１，５−ＡＦ還元酵素の総活性は２９４．０ユニットであり、比活性は０．０８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。 Suspend the cells previously obtained in 1 L of 20 mM Bistris buffer (pH 7.0), add dithiothreitol to a final concentration of 10 mM, and shake with a shaker (150 rpm) at 30 ° C. for 20 minutes. Reduced. Thereafter, the cells were collected by centrifugation (4,000 × g, 10 minutes). Suspended in 250 ml of 20 mM Bistris buffer (pH 7.0), 250 ml of Y-PER-Plus (registered trademark) reagent was added, and phenylmethylsulfonyl chloride (PMSF) was added to a final concentration of 10 mM. The enzyme was extracted from the cells by shaking with a shaker (150 rpm) at 30 ° C. for 20 minutes. The supernatant separated by centrifugation (24,000 × g, 15 minutes) was dialyzed overnight against 20 mM Bis-Tris buffer (pH 7.0) to remove the Y-PER-Plus® reagent. This solution was used as a crude extract. At this time, the total activity of 1,5-AF reductase was 294.0 units, and the specific activity was 0.08 units / mg-protein.
＜硫安分画＞
粗抽出液に、硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して、４℃、１時間冷却し、遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）で分離した上澄み液を回収した。次にその上澄み液に硫酸アンモニウムを８０％となるように添加し４℃、１時間冷却し、遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）して沈殿物を回収した。その沈殿画分を２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁して透析膜に入れ、２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）中で透析し硫酸アンモニウムを除去した。遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）し、上澄み液を回収した。その時の１，５−ＡＦ還元酵素の総活性は２２４．０ユニットであり、比活性は０．１３ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
<Ammonium sulfate fraction>
Ammonium sulfate was added to the crude extract at 30%, cooled at 4 ° C. for 1 hour, and the supernatant separated by centrifugation (24,000 × g, 15 minutes) was recovered. Next, ammonium sulfate was added to the supernatant so as to be 80%, cooled at 4 ° C. for 1 hour, and centrifuged (24,000 × g, 15 minutes) to collect a precipitate. The precipitated fraction was suspended in 100 ml of 20 mM Bis-tris buffer (pH 7.0), placed in a dialysis membrane, and dialyzed in 20 mM bitris buffer (pH 7.0) to remove ammonium sulfate. Centrifugation (24,000 × g, 15 minutes) was performed, and the supernatant was recovered. The total activity of 1,5-AF reductase at that time was 224.0 units, and the specific activity was 0.13 units / mg protein.
＜弱塩基性陰イオン交換−クロマトグラフィー＞
この上澄み液をあらかじめ２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社製）を充填したカラム（φ２．２×３０ｃｍ）に通した。同緩衝液で非吸着タンパク質を洗浄後、０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ、１，５−ＡＦ還元活性画分を回収した。活性画分の総活性は７９．９ユニットであり、比活性は０．８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
<Weak basic anion exchange-chromatography>
This supernatant was passed through a column (φ2.2 × 30 cm) packed with Toyopearl DEAE-650M (manufactured by TOSOH) equilibrated in advance with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0). After washing the non-adsorbed protein with the same buffer, the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient of 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) containing 0.5 M sodium chloride, and the 1,5-AF reducing activity fraction was recovered. . The total activity of the active fraction was 79.9 units and the specific activity was 0.8 units / mg protein.
＜アフィニティークロマトグラフィー＞
この活性画分を一晩２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し塩化ナトリウムを除去し、あらかじめ２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパール−ＡＦ−ｒｅｄ−６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社製）を充填したカラム（φ３．０×１０ｃｍ）に通した。同緩衝液で非吸着タンパク質を洗浄後１．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収した。活性画分の総活性は６９．７ユニットであり、比活性は１６．３ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
<Affinity chromatography>
This active fraction was dialyzed overnight with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) to remove sodium chloride, and equilibrated with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) in advance. Toyopearl-AF-red-650M (manufactured by TOSOH) ) Was passed through a column (φ3.0 × 10 cm) packed with. After washing the non-adsorbed protein with the same buffer, the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient of 20 mM Bis-tris buffer (pH 7.0) containing 1.5 M sodium chloride to collect the active fraction. The total activity of the active fraction was 69.7 units and the specific activity was 16.3 units / mg protein.
＜疎水性クロマトグラフィー＞
この活性画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加したサンプルをあらかじめ硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｓｋ−ＧＥＬ ＰＨＥＮＹＬ−５ＰＷ （ＴＯＳＯＨ社製 ７．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×７．５ｃｍ）に通した。硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着タンパク質を洗浄後、硫酸アンモニウム濃度が３０％から０％となるように直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収した。活性画分の総活性は７．８ユニットであり、比活性は１７．７ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
<Hydrophobic chromatography>
Tsk-GEL PHENYL-5PW (7.5 mm I, manufactured by Tosoh) was prepared by equilibrating a sample prepared by adding 30% ammonium sulfate to this active fraction in advance with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) containing 30% ammonium sulfate. D. × 7.5 cm). After washing the non-adsorbed protein with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) containing 30% ammonium sulfate, the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient so that the ammonium sulfate concentration was 30% to 0%, and the active fraction was collected. The total activity of the active fraction was 7.8 units and the specific activity was 17.7 units / mg protein.
＜強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー＞
この活性画分を限外ろ過膜で脱塩・濃縮後、２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（４．６ｍｍ×１０ｃｍ）に通した。硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着タンパク質を溶出後、硫酸アンモニウム濃度が３０％から０％となるように直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収し精製酵素を得た。精製酵素の総活性は３．８ユニットであり、比活性は２４．４ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
<Strong basic anion exchange chromatography>
This active fraction was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane, and then passed through Mono-Q (4.6 mm × 10 cm) equilibrated with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0). After elution of non-adsorbed protein with 20 mM Bistris buffer (pH 7.0) containing 30% ammonium sulfate, the adsorbed protein is eluted with a linear concentration gradient so that the ammonium sulfate concentration ranges from 30% to 0%, and the active fraction is collected and purified. The enzyme was obtained. The total activity of the purified enzyme was 3.8 units and the specific activity was 24.4 units / mg protein.
＜物性評価、ゲルろ過クロマトグラフィー＞
精製酵素を、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｓｋ−ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）に供試したところ、単一ピークとして検出され高純度に精製されたことがわかった。標準蛋白質として分子量１３，７００：リボヌクレアーゼＡ、分子量２５，０００：キモトリプシノーゲンＡ、分子量４３，０００：オブアルブミン、分子量６８，０００：アルブミン、分子量１５８，０００：アルドラーゼを用い、それらの移動度から本酵素の分子量を推測した結果、およそ７５，０００〜８０，０００程度であった（図９）。
<Physical property evaluation, gel filtration chromatography>
When the purified enzyme was subjected to Tsk-gel G2000SW (7.5 mm ID × 30 cm) equilibrated with 20 mM Bis-Tris buffer (pH 7.0) containing 0.3 M sodium chloride, it was detected as a single peak. It was found that the product was purified to a high purity. As a standard protein, molecular weight 13,700: ribonuclease A, molecular weight 25,000: chymotrypsinogen A, molecular weight 43,000: ovalbumin, molecular weight 68,000: albumin, molecular weight 158,000: aldolase, and their mobility were used. As a result of estimating the molecular weight of the enzyme, it was about 75,000 to 80,000 (FIG. 9).
＜物性評価、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
精製酵素の分子量をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べた結果、分子量３８，０００と分子量３７，０００の２つのバンドが確認された。このことから、この酵素が２量体であることがわかった（図１０）。
<Physical property evaluation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis>
As a result of examining the molecular weight of the purified enzyme by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, two bands having a molecular weight of 38,000 and a molecular weight of 37,000 were confirmed. From this, it was found that this enzyme is a dimer (FIG. 10).
＜内部部分アミノ酸配列解析、逆相クロマトグラフィー＞
精製酵素を、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社 ２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）に供試し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶媒の直線濃度勾配で溶出させ２量体を分離し、分子量３８，０００のサブユニット画分を得た。回収した画分を減圧乾燥器でアセトニトリル溶媒を除きアミノ酸配列決定用の試料とした。
<Internal partial amino acid sequence analysis, reverse phase chromatography>
The purified enzyme was tested in YMC-Pack PROTEIN-RP (YMC 2.0 mm ID × 15 cm) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid solvent, and 80% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid. The dimer was separated by elution with a linear concentration gradient of the solvent to obtain a subunit fraction having a molecular weight of 38,000. The collected fraction was used as a sample for amino acid sequencing by removing acetonitrile solvent with a vacuum dryer.
１．ＴＣＡ沈殿
先の分取サンプル（タンパク量５０ｕｇ相当）にトリクロロ酢酸を最終濃度１０％となるように添加し、４℃で１０分間冷却した。遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）して沈殿を回収した。それにアセトンを加えて超音波洗浄器上で沈殿物を分散させ、トリクロロ酢酸を除去した。それを遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）し上澄みを除き沈殿を減圧乾燥器で乾燥させた。
1. TCA precipitation Trichloroacetic acid was added to the preparative sample (corresponding to 50 ug of protein) to a final concentration of 10% and cooled at 4 ° C. for 10 minutes. The precipitate was collected by centrifugation (18,000 × g, 15 minutes). Acetone was added thereto and the precipitate was dispersed on an ultrasonic cleaner to remove trichloroacetic acid. It was centrifuged (18,000 × g, 15 minutes), the supernatant was removed, and the precipitate was dried in a vacuum dryer.
２．還元アルキル化
ＴＣＡで濃縮した試料を、６Ｍ塩酸グアニジンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶解し、タンパク質のジスルフィド結合を切断するため、還元剤であるジチオスレイトールを添加し、窒素置換を行い３０分間常温で保持した。システイン残基の再結合を抑えるため、ヨードアセトアミドを添加し、暗所で１時間保持して還元化された試料を得た。
2. Reductive alkylation A sample concentrated with TCA is dissolved in Tris-HCl buffer (pH 9.0) containing 6M guanidine hydrochloride, and dithiothreitol, a reducing agent, is added to cleave the disulfide bond of the protein. And kept at room temperature for 30 minutes. In order to suppress recombination of cysteine residues, iodoacetamide was added, and the sample was reduced by being kept in the dark for 1 hour.
３．メタノール・クロロホルムによる試料の濃縮及び脱塩
還元した試料をメタノール：クロロホルム：蒸留水=４：１：３混合液で攪拌して１０,０００×ｇで３分間遠心分離した。水相と有機溶媒相の間にタンパク質が得られ、水相を吸引器で除去した。その後、メタノールを添加して、１８，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄みを除き、沈殿を回収した。減圧乾燥を行い、プロテアーゼ消化用試料とした。
3. Concentration and desalting of sample with methanol / chloroform The reduced sample was stirred with a mixture of methanol: chloroform: distilled water = 4: 1: 3 and centrifuged at 10,000 × g for 3 minutes. Protein was obtained between the aqueous phase and the organic solvent phase, and the aqueous phase was removed with an aspirator. Thereafter, methanol was added, and the mixture was centrifuged at 18,000 × g for 15 minutes to remove the supernatant, and the precipitate was recovered. The sample was dried under reduced pressure to obtain a protease digestion sample.
４．リジルエンドペプチダーゼ消化
先の脱塩・濃縮サンプルを6M尿素でよく溶解させ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて攪拌した。サンプルタンパク重量の１／５０（Ｗ／Ｗ）となるようにリジルエンドペプチダーゼを添加した。３７℃で１６時間反応させ、ギ酸を添加し酵素反応を止めた。
4). Lysyl endopeptidase digestion The previously desalted and concentrated sample was well dissolved in 6M urea, and 0.1M Tris-HCl buffer (pH 8.5) was added and stirred. Lysyl endopeptidase was added so as to be 1/50 (W / W) of the sample protein weight. The reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours, and formic acid was added to stop the enzyme reaction.
５．逆相ＨＰＬＣによるペプチドマッピング
先のリジルエンドペプチダーゼで消化した試料を、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で平衡化したＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８カラム（ＹＭＣ社 ２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）に供試し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶媒の直線濃度勾配で吸ペプチド断片を溶出した。紫外部吸収検出器の波長２１５ｎｍで検出した結果、およそ２０個のペプチド断片を得た。
5). Peptide mapping by reverse phase HPLC The sample digested with the above lysyl endopeptidase was applied to a Hydrosphere C18 column (YMC 2.0 mm ID × 15 cm) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid solvent, and 0.1% The peptide-absorbing peptide fragment was eluted with a linear concentration gradient of 80% acetonitrile solvent containing% trifluoroacetic acid. As a result of detection using an ultraviolet absorption detector at a wavelength of 215 nm, approximately 20 peptide fragments were obtained.
６．アミノ酸配列解析
先に得たペプチド断片を、自動アミノ酸配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製 Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９Ｘ−ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ）で解析し５つの断片のアミノ酸配列情報を得た（図１１）。
この部分アミノ酸配列情報をもとに、ＦＡＳＴＡによるデータベース比較を行った結果、このペプチド断片は、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの内部アミノ酸配列と完全に一致した。先のゲルろ過による分子量とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動、部分アミノ酸配列情報から、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧへ変換する酵素が、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼであると同定した（図１１）。また、このアラビノースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をこれまで報告されている２種の１，５−ＡＦに作用する還元酵素のそれと比較した。その結果、豚肝臓由来の１，５−ＡＦ還元酵素（非特許文献５）との相同性は３０．８％、微生物由来の１，５−ＡＦ還元酵素(非特許文献７)との相同性は１０．８％であった。
6). Amino acid sequence analysis The previously obtained peptide fragment was analyzed with an automatic amino acid sequencing apparatus (Procise 49X-HT Protein-Sequencer manufactured by Applied Biosystem) to obtain amino acid sequence information of five fragments (FIG. 11).
As a result of database comparison by FASTA based on this partial amino acid sequence information, this peptide fragment completely matched the internal amino acid sequence of D-arabinose dehydrogenase. From the molecular weight obtained by the previous gel filtration, SDS-polyacrylamide electrophoresis, and partial amino acid sequence information, the enzyme that converts 1,5-AF to 1,5-AG was identified as D-arabinose dehydrogenase (FIG. 11). . Moreover, the amino acid sequence of this arabinose dehydrogenase was compared with that of the reductase acting on two kinds of 1,5-AF reported so far. As a result, the homology with porcine liver-derived 1,5-AF reductase (Non-patent Document 5) is 30.8%, and the homology with microorganism-derived 1,5-AF reductase (Non-patent Document 7). Was 10.8%.
至適ｐＨ（還元活性）
０．５Ｍの各種緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５：酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５：ビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０：トリス緩衝液、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）を０．２ｍｌ、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１．８ｍｌとする。３０℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間保温後、３７５ｎｍの波長を測定する。吸光度の減少量から、還元酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした。
Optimum pH (reducing activity)
Various buffer solutions of 0.5 M (pH 4.0 to 5.5: acetate buffer, pH 5.5 to 7.5: bis-Tris buffer, pH 7.5 to 9.0: Tris buffer, pH 9.0 pH 10.0: 0.2 ml of glycine-sodium hydroxide buffer), 0.2 ml of 250 mM 1,5-AF solution, 0.2 ml of 5 mM NADPH solution, and 1.8 ml with distilled water. After maintaining at 30 ° C. for 5 minutes, 0.2 ml of an appropriately diluted enzyme solution is added and mixed to start the reaction. After incubating at 30 ° C. for 20 minutes, a wavelength of 375 nm is measured. Reductase activity was determined from the decrease in absorbance. The highest enzyme activity was taken as 100 (%).
至適ｐＨ（酸化活性）
０．５Ｍの各種緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５：酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５：ビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０：トリス緩衝液、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）を０．２ｍｌ、１ＭのＤ−アラビノース溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１．８ｍｌとする。３０℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間保温後、３４０ｎｍの波長を測定する。吸光度の増加量から、酸化酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした相対活性を算出した。
Optimum pH (oxidation activity)
Various buffer solutions of 0.5 M (pH 4.0 to 5.5: acetate buffer, pH 5.5 to 7.5: bis-Tris buffer, pH 7.5 to 9.0: Tris buffer, pH 9.0 pH 10.0: glycine-sodium hydroxide buffer) 0.2 ml, 1M D-arabinose solution 0.2 ml, 5 mM NADP + solution 0.2 ml, and distilled water 1.8 ml. After maintaining at 30 ° C. for 5 minutes, 0.2 ml of an appropriately diluted enzyme solution is added and mixed to start the reaction. After incubating at 30 ° C. for 20 minutes, a wavelength of 340 nm is measured. The oxidase activity was determined from the increase in absorbance. The relative activity was calculated with the highest enzyme activity as 100 (%).
至適温度
０．５Ｍビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）を０．２ｍｌ、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１，８００ｍｌとする。２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５℃で２０分間保温後、３７５ｎｍの波長を測定する。吸光度の減少量から、還元酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした。
Optimum temperature 0.2 ml of 0.5 M Bis-Tris buffer (pH 6.5), 0.2 ml of 250 mM 1,5-AF solution, 0.2 ml of 5 mM NADPH solution, 1,800 ml with distilled water To do. After maintaining at 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, and 55 ° C. for 5 minutes, 0.2 ml of an appropriately diluted enzyme solution is added and mixed to start the reaction. After incubating at 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, and 55 ° C. for 20 minutes, a wavelength of 375 nm is measured. Reductase activity was determined from the decrease in absorbance. The highest enzyme activity was taken as 100 (%).
実施例２
１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへの変換を以下の条件で行った。
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）、１００ｍＭの１，５−ＡＦ、２００ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．１ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合し３０℃で保温した。０から２４時間までの８時間毎の経時変化のＨＰＬＣ測定結果クロマトグラムを示す。１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへ変換され、１，５−ＡＧ以外の反応生成物を含まない反応溶液を得た（図１２）。
Example 2
Conversion from 1,5-AF to 1,5-AG was performed under the following conditions.
Each sample was mixed at 30 ° C. to a final concentration of 50 mM bis-Tris buffer (pH 6.5), 100 mM 1,5-AF, 200 mM NADPH, 0.1 unit of D-arabinose dehydrogenase per ml. Keep warm. The HPLC measurement result chromatogram of the time-dependent change for every 8 hours from 0 to 24 hours is shown. Conversion from 1,5-AF to 1,5-AG yielded a reaction solution containing no reaction product other than 1,5-AG (FIG. 12).
実施例３
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭの１，５−ＡＦ、２００ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．２ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合し３０℃で保温した。０から２４時間までの８時間毎の経時変化のＨＰＬＣ測定結果クロマトグラムを示す。１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへ変換され、１，５−ＡＧ以外の反応生成物並びに１，５−ＡＦも含まない反応溶液を得た。また、２４時間反応での１，５−ＡＧ含量は、９．７（ｇ／Ｌ）であった（図１３）。
Example 3
Each sample was mixed at 30 ° C. to a final concentration of 50 mM bis-Tris buffer (pH 7.0), 100 mM 1,5-AF, 200 mM NADPH, 0.2 units of D-arabinose dehydrogenase per ml. Keep warm. The HPLC measurement result chromatogram of the time-dependent change for every 8 hours from 0 to 24 hours is shown. 1,5-AF was converted to 1,5-AG to obtain a reaction solution containing no reaction product other than 1,5-AG and 1,5-AF. The 1,5-AG content after 24 hours reaction was 9.7 (g / L) (FIG. 13).
実施例４
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、２５ｍＭの１，５−ＡＦ、２．０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．０１ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合したものをコントロールとした。次に上記溶液に、最終濃度１００ｍＭとなるように、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｌ−フコースまたはＬ−ガラクトースを添加して２４時間毎の１，５−ＡＧ生成量をＨＰＡＥ−ＰＡＤにて測定した。その経時変化のグラフを示す。Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｌ−フコース、Ｌ−ガラクトースの添加群すべてにおいて、１，５−ＡＧ生成量が１．５〜２．５倍以上増加した（図１４）。
Example 4
Each sample was mixed so that the final concentration was 50 mM bis-Tris buffer (pH 7.5), 25 mM 1,5-AF, 2.0 mM NADPH, and 0.01 unit of D-arabinose dehydrogenase per ml. Was used as a control. Next, D-arabinose, L-xylose, L-fucose or L-galactose is added to the above solution to a final concentration of 100 mM, and the amount of 1,5-AG produced every 24 hours is determined by HPAE-PAD. It was measured. The graph of the change with time is shown. In all the groups to which D-arabinose, L-xylose, L-fucose and L-galactose were added, the amount of 1,5-AG produced increased 1.5 to 2.5 times or more (FIG. 14).
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