JP2010094075A - Method for detecting small-sized rna - Google Patents
Method for detecting small-sized rna Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010094075A JP2010094075A JP2008267568A JP2008267568A JP2010094075A JP 2010094075 A JP2010094075 A JP 2010094075A JP 2008267568 A JP2008267568 A JP 2008267568A JP 2008267568 A JP2008267568 A JP 2008267568A JP 2010094075 A JP2010094075 A JP 2010094075A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- small
- small rna
- dna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
本発明は、マイクロRNAおよびnon−coding RNA分子のような小型RNAを検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting small RNAs such as microRNA and non-coding RNA molecules.
non−coding RNA(ncRNA)とは、タンパク質をコードしないRNAの総称であり、ハウスキーピングRNAと調節系のRNAとに大別される。前者のハウスキーピングRNAとしては、リボゾームRNA(rRNA)、運搬RNA(tRNA)、スプライシングに関与する核内低分子RNA(snRNA)、rRNAの修飾に関与する核小体低分子RNA(snoRNA)等が知られている。一方、後者の調節系RNAについては、生体機能の解明に重要な機能を果たしている因子として、近年特に注目を集めているものであり、遺伝子発現やRNAの細胞内分布を調節し遺伝子発現抑制機構に重要な役割を担っていることが最近になって明らかにされつつある。この調節系RNAが機能する遺伝子発現抑制機構は、RNA干渉(RNAi)と呼ばれ、1988年に線虫を用いた実験で明らかにされ、その後、ショウジョウバエや哺乳類細胞でも同様の機構の存在が明らかとなった。この調節系RNAとしてのncRNAは、鎖長がおよそ20〜25塩基であり、その作用機序は、マイクロRNA(miRNA)による翻訳抑制と、snall interference RNA(siRNA)による標的mRNAの切断及び標的DNA領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシングとに大別される。 Non-coding RNA (ncRNA) is a general term for RNAs that do not encode proteins, and is broadly classified into housekeeping RNAs and regulatory RNAs. Examples of the former housekeeping RNA include ribosomal RNA (rRNA), transport RNA (tRNA), small nuclear RNA (snRNA) involved in splicing, and small nuclear RNA (snoRNA) involved in rRNA modification. Are known. On the other hand, the latter regulatory RNA has attracted particular attention in recent years as a factor that plays an important role in elucidating biological functions, and regulates gene expression and intracellular distribution of RNA to suppress gene expression. Recently, it has been revealed that it plays an important role. The gene expression suppression mechanism in which this regulatory RNA functions is called RNA interference (RNAi), and was clarified in an experiment using nematodes in 1988, and then the existence of a similar mechanism in Drosophila and mammalian cells is also evident. It became. The ncRNA as a regulatory RNA has a chain length of about 20 to 25 bases, and its mechanism of action is the suppression of translation by microRNA (miRNA), the cleavage of target mRNA by snail interference RNA (siRNA), and the target DNA It is broadly divided into gene silencing through heterochromatinization of regions.
miRNAは、内在性miRNAからヘアピン様構造のRNA(前駆体)として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素(Drosha、Dicer)により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット(検出対象)とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは15〜25塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。 miRNA is transcribed from endogenous miRNA as RNA (precursor) having a hairpin-like structure. This precursor is cleaved by a dsRNA cleaving enzyme (Drosha, Dicer) having a specific enzyme RNase III cleaving activity, then changed into a double-stranded form, and then becomes a single strand. One of the antisense strands is incorporated into a protein complex called RISC and is considered to be involved in the suppression of mRNA translation. Thus, since miRNA has different aspects at each stage after transcription, usually when miRNA is targeted (detection target), such as a hairpin structure, a double-stranded structure, a single-stranded structure, etc. Various forms need to be considered. miRNA consists of RNA of 15 to 25 bases, and its existence has been confirmed in various organisms.
一方、siRNAは、ウイルス、トランスポゾン、トランスジーン、内在性dsRNA等の長鎖dsRNAから、RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素(Dicer)により切り出される。その後、dsRNAの片方のアンチセンスRNAが、RISC、又はRITSと称するタンパク質複合体に取り込まれ、複合体としてmRNAの分解又は転写抑制に関与する。従って、siRNAの取り得る態様としては、dsRNAとしての二本鎖の状態、RISCとの複合体を形成している一本鎖の状態もあるので、通常、siRNAをターゲット(検出対象)とする場合は、長鎖dsRNA、切断後のsiRNA、又は一本鎖等の各種形態を考慮する必要がある。 On the other hand, siRNA is cleaved from long-chain dsRNAs such as viruses, transposons, transgenes, and endogenous dsRNAs by a dsRNA cleaving enzyme (Dicer) having RNase III cleavage activity. Thereafter, one antisense RNA of dsRNA is incorporated into a protein complex called RISC or RITS, and is involved in mRNA degradation or transcriptional repression as a complex. Therefore, siRNA can have a double-stranded state as dsRNA and a single-stranded state forming a complex with RISC. Therefore, when siRNA is usually used as a target (detection target) It is necessary to consider various forms such as a long dsRNA, a cleaved siRNA, or a single strand.
ところで、一般に、核酸固定化基板(DNAチップ)を用いた発現解析では、数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定された基板を用いて被験試料をDNAチップに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被験試料中の遺伝子量を知ることができる。DNAチップ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由である。しかしながら、検出対象が上記の小型RNAの場合、細胞又は組織に含まれる上記の小型RNAは鎖長が200ヌクレオチド以下と短く、また配列は非常に類似するため、DNAチップ上で特異的に上記の小型RNAを区別することは難しく、さらに細胞又は組織に含まれる上記の小型RNAは微量であるため、高感度に上記の小型RNAを区別することは難しい。 By the way, in general, in expression analysis using a nucleic acid-immobilized substrate (DNA chip), a test sample is placed on a DNA chip using a substrate on which probes using base sequences corresponding to hundreds to tens of thousands of genes are immobilized. By adding, the gene in the sample binds to the probe, and the amount of gene in the test sample can be known by measuring the amount of binding by some means. Selection of the gene corresponding to the probe to be immobilized on the DNA chip is free. However, when the detection target is the above-mentioned small RNA, the above-mentioned small RNA contained in a cell or tissue has a short chain length of 200 nucleotides or less and the sequence is very similar. It is difficult to distinguish small RNAs, and since the small RNAs contained in cells or tissues are very small, it is difficult to distinguish the small RNAs with high sensitivity.
従って、上記の小型RNAの短い鎖長の核酸を検出し解析しようとする分野においては、高感度かつ高精度に上記の小型RNAを検出できる有効な技術の確立が急務の課題となっている。 Accordingly, in the field of detecting and analyzing nucleic acids having a short chain length of the above-mentioned small RNA, establishment of an effective technique capable of detecting the above-mentioned small RNA with high sensitivity and high accuracy is an urgent issue.
その解決策の一つとして、上記の小型RNAに含まれるグアニン塩基を特異的に認識するプローブを用いて上記の小型RNAを標識した被験試料をDNAチップに添加してmiRNAを測定する方法が提案されている(例えば、特許文献1参照)。しかしながら、通常、上記の小型RNAに含まれるグアニン塩基の位置は多様であり、上記の小型RNAに含まれるグアニン塩基の数は一定でないため、上記の小型RNAに含まれるグアニン塩基の数によっては検出が困難な上記の小型RNAが生じる。 As one of the solutions, a method for measuring miRNA by adding a test sample labeled with the above small RNA to a DNA chip using a probe that specifically recognizes a guanine base contained in the above small RNA is proposed. (For example, refer to Patent Document 1). However, since the positions of guanine bases contained in the small RNA are usually diverse and the number of guanine bases contained in the small RNA is not constant, detection is possible depending on the number of guanine bases contained in the small RNA. The above-mentioned small RNA is produced that is difficult to
また上記の小型RNAの3’末端にアミノ修飾されたアデニン塩基を酵素的に複数個付加し、付加したアミノ修飾済みアデニン塩基にプローブを標識した被験試料をDNAチップに添加してmiRNAを測定する方法が提案されている(例えば、特許文献2参照)。しかしながら、3’末端へ付与されるアデニン塩基数にはバラツキが存在し、上記の小型RNAへ標識されるプローブ数は一定にならないため、上記の小型RNAへの3’末端へ付与されるアデニン塩基数によっては検出が困難なmiRNAもしくはncRNA等が生じる。 In addition, a plurality of amino-modified adenine bases are enzymatically added to the 3 ′ end of the above small RNA, and a test sample in which a probe is labeled on the added amino-modified adenine base is added to a DNA chip, and miRNA is measured. A method has been proposed (see, for example, Patent Document 2). However, since the number of adenine bases imparted to the 3 ′ end varies and the number of probes labeled on the small RNA is not constant, the adenine base imparted to the 3 ′ end on the small RNA Depending on the number, miRNA or ncRNA that is difficult to detect is generated.
また、上記の小型RNAを脱リン酸化した3’末端にプローブが1つ標識された1つのシトシン塩基を付加した被験試料をDNAチップに添加してmiRNAを測定する方法などが提案されている(例えば、特許文献3、非特許文献1参照)。しかしながら、通常、一個のシトシン塩基の大きさは小さく、標識するプローブの大きさは大きいため、1個のグアニン塩基を付与するだけでは標識プローブの立体障害によって検出が困難な上記の小型RNAが生じる。また、上記の小型RNAは微量のため、1個のプローブの標識だけでは十分に強いシグナルが得られず検出が困難な上記の小型RNAが生じる。 In addition, a method of measuring miRNA by adding a test sample in which one cytosine base labeled with one probe at the 3 ′ end obtained by dephosphorylating the above small RNA is added to a DNA chip has been proposed ( For example, see Patent Document 3 and Non-Patent Document 1). However, since the size of one cytosine base is usually small and the size of the probe to be labeled is large, the above small RNA that is difficult to detect due to the steric hindrance of the labeled probe is generated only by adding one guanine base. . In addition, since the small RNA described above is in a very small amount, a sufficiently strong signal cannot be obtained with only one probe label, and the above small RNA is difficult to detect.
また、ビオチン標識したランダムプライマーを用いて小型RNAを逆転写し、ビオチン標識した相補DNAを検出する方法(非特許文献2参照)が知られているが、5μgの被験資料を必要とするため、被検資料によっては測定できない場合もある。 In addition, a method is known in which small RNA is reverse-transcribed using a biotin-labeled random primer to detect biotin-labeled complementary DNA (see Non-Patent Document 2). Measurement may not be possible depending on the inspection data.
また小型RNAの3’末端を化学修飾し、ビオチン化して検出する方法(非特許文献3参照)が知られているが、修飾の作業工程が多いため測定ノイズが入ってしまう。
本発明の解決しようとする課題は、被験試料に含まれる鎖長が200ヌクレオチド以下と短く、配列は非常に類似する、非常に微量な上記の小型RNAを高感度、かつ高精度に検出できる方法を提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is a method that can detect a very small amount of the above-mentioned small RNA with high sensitivity and high accuracy, the chain length of which is contained in a test sample is as short as 200 nucleotides or less and the sequence is very similar. Is to provide.
本発明は、以下の特徴を有する。 The present invention has the following features.
本発明は第一の実施態様において、担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型RNAを検出する方法であって、該小型RNAまたは該小型RNAと相補的な配列を有するDNAの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることを特徴とする、小型RNAを検出する方法である。 In the first embodiment, the present invention provides a test using a selective binding substance-immobilized carrier having a concavo-convex part on the surface of the carrier and a selective binding substance immobilized on the top surface of the convex part of the concavo-convex part. A method for detecting small RNA contained in a sample, comprising reacting a labeled substance having a labeled substance bound to at least one end of the small RNA or DNA having a sequence complementary to the small RNA with a selective binding substance A method for detecting small RNAs.
また別の実施形態において、前記標識体が、小型RNAまたは小型RNAと相補的な配列を有するDNAの3’末端に標識物質を結合させた標識体である、小型RNAを検出する方法である。 In another embodiment, the method is for detecting small RNA, wherein the labeled body is a labeled body in which a labeling substance is bound to the 3 'end of small RNA or DNA having a sequence complementary to the small RNA.
また別の実施形態において、前記標識体が、小型RNAまたは小型RNAと相補的な配列を有するDNAの3’末端にリンカー配列を介して標識物質を結合させた標識体である、小型RNAを検出する方法である。 In another embodiment, small RNA is detected, wherein the labeled body is a labeled body in which a labeling substance is bound to the 3 ′ end of small RNA or DNA having a sequence complementary to small RNA via a linker sequence. It is a method to do.
本発明は、微量のRNAサンプルに含まれる小型RNAを高いS/N比で検出する方法を提供するものであり、これにより小型RNAを高感度に検出することが可能になる。 The present invention provides a method for detecting small RNA contained in a small amount of RNA sample with a high S / N ratio, and this makes it possible to detect small RNA with high sensitivity.
以下に本発明をさらに具体的に説明する。 The present invention will be described more specifically below.
本明細書において小型RNAとは、脊椎動物、ホヤ類、半索類、軟体動物類、環形動物および節足動物を含む多くの進化的に分岐した生物種を構成する200塩基長未満の範囲であるRNAを意味する。また、マイクロRNA(miRNA)は小型RNAに含まれる15〜25塩基の一本鎖RNAであり、様々な生物でその存在が確認されている。 As used herein, small RNA refers to a range of less than 200 bases that constitutes many evolutionarily branched species including vertebrates, squirts, peninsulas, molluscs, annelids and arthropods. It means a certain RNA. Micro RNA (miRNA) is a single-stranded RNA of 15 to 25 bases contained in a small RNA, and its presence has been confirmed in various organisms.
本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)及び当技術分野における慣用に従うものとする。さらに「ポリヌクレオチド」とは、RNA及びDNAのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAのいずれもが含まれる。また上記RNAには、totalRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA及び合成RNAのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。 In the present specification, indications using abbreviations such as nucleotides and polynucleotides are in accordance with “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office) and customary in the art. To do. Furthermore, “polynucleotide” is used as a nucleic acid including both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, miRNA, and synthetic RNA. In the present specification, the polynucleotide is used interchangeably with the nucleic acid.
本発明の小型RNAを検出する方法は、担体表面に固定化された選択結合性物質に、その選択結合性物質と反応する小型RNAまたは小型RNAと相補的な配列を有するDNAを含む溶液を接触させ、接触した状態を観察することで小型RNAを検出する。 In the method for detecting small RNA of the present invention, a selective binding substance immobilized on a carrier surface is contacted with a solution containing small RNA that reacts with the selective binding substance or DNA having a sequence complementary to the small RNA. The small RNA is detected by observing the contact state.
相補配列(相補鎖、逆鎖)とは、小型RNAを構成する塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、(ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ)に対してA:T(U)、G:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。 A complementary sequence (complementary strand, reverse strand) is a full-length sequence of a polynucleotide consisting of a base sequence constituting a small RNA, or a partial sequence thereof (referred to herein as a normal strand for convenience) A: T (U) A polynucleotide having a base-complementary relationship based on a base pair relationship such as G: C. However, such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the target positive strand base sequence, but has a complementary relationship that allows hybridization with the target normal strand under stringent conditions. There may be.
本発明において、選択結合性物質固定化担体としては、例えば特開2006-78197号公報に記載のものを用いることができるで。 In the present invention, as the selective binding substance-immobilized carrier, for example, those described in JP-A-2006-78197 can be used.
選択結合性物質とは、被験試料に含まれる小型RNAと直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。本発明の小型RNAを検出する方法においては、具体的にはDNA、RNA、PNA、LNA(LockedNucleicAcid)などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。 The selective binding substance means a substance that can selectively bind directly or indirectly to a small RNA contained in a test sample. In the method for detecting small RNA of the present invention, specifically, nucleic acid derivatives such as DNA, RNA, PNA, LNA (Locked Nucleic Acid) can be used. Here, in the case of a nucleic acid, a derivative is a labeled derivative with a fluorophore, a modified nucleotide (e.g., a halogen or an alkyl such as methyl, an alkoxy such as methoxy, an alkoxy such as methoxy, a nucleotide or a base containing a group such as carboxymethyl, Chemically modified derivatives such as derivatives containing nucleotides etc. that have undergone double bond saturation, deamination, substitution of oxygen molecules with sulfur molecules, and the like.
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが10塩基から100塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。さらに、20塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から20〜100塩基がより好ましい。 A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Applicable to substances. The selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance or may be obtained from a living cell or the like. Particularly preferred as the selective binding substance is a nucleic acid. Among these nucleic acids, nucleic acids called oligonucleic acids having a length of 10 to 100 bases can be easily artificially synthesized with a synthesizer. Furthermore, if it is less than 20 bases, 20-100 bases is more preferable from the viewpoint that the stability of hybridization is low.
検出したい小型RNAは、miRNA(マイクロRNA)であっても良い。その情報は例えば、http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtmlにアクセスすることで知ることができる。目的とするmiRNAを検出するには、検出対象のmiRNAと相補な配列を有する核酸を選択結合性物質として用いればよい。 The small RNA to be detected may be miRNA (micro RNA). The information can be found by accessing, for example, http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml. In order to detect the target miRNA, a nucleic acid having a sequence complementary to the miRNA to be detected may be used as the selective binding substance.
小型RNAと相補的な配列を有するDNAは、被験試料に含まれる小型RNAを、逆転写酵素などを用いて得ることができる。 A DNA having a sequence complementary to a small RNA can be obtained by using a reverse transcriptase or the like from a small RNA contained in a test sample.
本明細書において検出・診断対象となる被験試料としては、組織試料、生物体全体、細胞培養物、または体液などからなる天然源等が挙げられる。 Examples of test samples to be detected / diagnosed in this specification include natural sources such as tissue samples, whole organisms, cell cultures, body fluids, and the like.
本発明では、小型RNAまたは小型RNAの相補配列を有するDNA少なくとも3’末端または5’末端のいずれかに標識物質を結合させることで標識した標識体を用いる。好ましくは、3’末端に標識物質を結合させる。標識物質の結合には酵素反応、化学反応などを用いることができる。好ましくは、酵素を用いて反応させる。さらに好ましくは、小型RNAの3’末端に標識体を結合させる。 In the present invention, a labeled body labeled by binding a labeling substance to either at least the 3 'end or the 5' end of small RNA or DNA having a complementary sequence of small RNA is used. Preferably, a labeling substance is bound to the 3 'end. For binding of the labeling substance, an enzyme reaction, a chemical reaction, or the like can be used. Preferably, the reaction is performed using an enzyme. More preferably, a label is bound to the 3 'end of the small RNA.
標識物質は、少なくとも2つ以上の核酸の重合体であるリンカー配列を含んでいても良い。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase,Poly A polymeraseなどを用いても良い。 The labeling substance may contain a linker sequence that is a polymer of at least two or more nucleic acids. For the enzyme reaction, T4 RNA ligase, Terminal Deoxyditol Transfer, Poly A polymerase, or the like may be used.
本発明において、使用できる標識物質としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン(シアニン2)、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン(シアニン3)、シアニン3.5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン(シアニン5)、シアニン5.5、シアニン7、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられる。 In the present invention, as the labeling substance that can be used, known substances used for labeling such as fluorescent dyes, phosphorescent dyes, and radioisotopes can be used. Preference is given to fluorescent dyes that are easy to measure and easy to detect signals. Specifically, cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorescein, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), cyanine 5.5, known fluorescent dyes such as cyanine 7 and oyster.
蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いることができる。 For detection of the fluorescent dye, a fluorescent microscope, a fluorescent scanner, or the like can be used.
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン(CdSe)、カドミウムテルル(CdTe)、インジウムガリウムリン(InGaP)、シルバーインジウム硫化亜鉛(AgInZnS)などが挙げられる。 Moreover, you may use the semiconductor fine particle which has luminescent property as a label | marker. Examples of such semiconductor fine particles include cadmium selenium (CdSe), cadmium tellurium (CdTe), indium gallium phosphide (InGaP), silver indium zinc sulfide (AgInZnS), and the like.
小型RNAまたは小型RNAと相補的な配列を有するDNAの末端へ標識体を結合させる方法は、酵素反応を用いて行うことができる。酵素反応として、T4RNALigaseを用いることも好ましい。 The method of binding a label to the end of a small RNA or a DNA having a sequence complementary to the small RNA can be performed using an enzymatic reaction. It is also preferable to use T4 RNA Ligase as the enzyme reaction.
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例1
(DNAチップ)
選択結合性物質固定化担体として「3D−Gene(登録商標) Human miRNA oligo chip」(東レ株式会社;TRT-XR311)を用いた。
Example 1
(DNA chip)
“3D-Gene (registered trademark) Human miRNA oligo chip” (Toray Industries, Inc .; TRT-XR311) was used as the selective binding substance-immobilized carrier.
(RNAの標識)
末端に標識物質を結合させる方法として、「miRCURY LNA microRNA Hy5 Power labeling kit」(エキシコン社;208030-A)を用いた。被験試料には、miRNAの含有が確認されたFirstChoice Human Liver Total RNA(ABI社;AM7960)を用いた。上述のtotalRNA 100ng、300ng、500ng、1000ngのそれぞれについて、メーカー推奨のプロトコールでmiRNAを標識した。
(RNA labeling)
As a method for binding a labeling substance to the terminal, “miRCURY LNA microRNA Hy5 Power labeling kit” (Exicon; 208030-A) was used. As the test sample, FirstChoice Human River Total RNA (ABI; AM7960), which was confirmed to contain miRNA, was used. For each of the above totalRNA 100ng, 300ng, 500ng, and 1000ng, miRNA was labeled according to the manufacturer's recommended protocol.
(ハイブリダイゼーション)
全ての標識済みmiRNAをそれぞれ「ハイブリダイゼーションバッファー」(東レ株式会社;TRT-XR301)に溶解し、37℃で16時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、DNAチップを30℃の0.5×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び42℃の0.2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び30℃の0.05×SSC溶液による連続した条件で洗浄した。
(Hybridization)
All labeled miRNAs were each dissolved in “hybridization buffer” (Toray Industries, Inc .; TRT-XR301) and hybridized at 37 ° C. for 16 hours. After completion of hybridization, the DNA chip was subjected to a solution containing 0.5 × SSC and 0.1% SDS at 30 ° C., a solution containing 0.2 × SSC and 0.1% SDS at 42 ° C., and 0 ° C. at 30 ° C. Washed in continuous conditions with 0.05 × SSC solution.
(遺伝子発現量の測定)
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったDNAチップをDNAチップスキャナー(ScanArrayLite、パーキンエルマージャパン)を用いてスキャンし、画像を取得してGenePixPro5.0(Molecular Device社)にて蛍光強度を数値化した。統計学的処理は「Speed T.著,「Statistical analysis of geneexpression microarray data」,Chapman&Hall/CRC」及び「Causton H.C.ら著「Abeginner’s guide Microarray gene expression data analysis」,Blackwell publishing」を参考にして行った。すなわち、ハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、各々のmiRNAについてシグナル強度を算出した。
(Measurement of gene expression level)
The DNA chip hybridized by the above method was scanned using a DNA chip scanner (ScanArrayLite, PerkinElmer Japan), an image was acquired, and the fluorescence intensity was digitized by GenePixPro5.0 (Molecular Device). Statistical processing is as follows: “Speed T.,“ Statistical analysis of gene expression microarray data ”, Chapman & Hall / CRC”, and “Courton H. C. et al.“ Abeginner's guide ”. I went there. That is, for the data obtained from the image analysis after hybridization, the logarithmic value was taken and the signal intensity was calculated for each miRNA.
「3D−Gene Human miRNA oligo chip」(東レ株式会社;TRT-XR311)は約800種のマイクロRNAを検出することができるが、この中から配列番号1,2,3,4で表されるRNAを選択し解析に用いた。 “3D-Gene Human miRNA oligo chip” (Toray Industries, Inc .; TRT-XR311) can detect about 800 types of microRNAs, from which RNA represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 Was selected and used for analysis.
その結果を「Array3」として図1,2,3,4、5に示す。配列番号1のRNAの結果を図1に、配列番号2のRNAの結果を図2、配列番号3のRNAの結果を図3、配列番号4のRNAの結果を図4に示す。図5に実施例および比較例1、比較例2のノイズの値を示している。比較例1、および比較例2については後述する。 The results are shown in FIGS. 1, 2, 3, 4, and 5 as “Array 3”. The result of RNA of SEQ ID NO: 1 is shown in FIG. 1, the result of RNA of SEQ ID NO: 2 is shown in FIG. 2, the result of RNA of SEQ ID NO: 3 is shown in FIG. 3, and the result of RNA of SEQ ID NO: 4 is shown in FIG. FIG. 5 shows noise values of the example, the comparative example 1, and the comparative example 2. Comparative example 1 and comparative example 2 will be described later.
各図は実施例1および比較例1、2の結果から得られたシグナル強度を縦軸にした棒グラフで表している。左からArray1-1000ng(比較例1)、Array2-3000ng(比較例2)、Array3-100ng(実施例1においてtotalRNAが100ngの場合)、Array3-300ng(実施例1においてtotalRNAが300ngの場合)、Array3-500ng(実施例1においてtotalRNAが500ngの場合)、Array3-1000ng(実施例1においてtotalRNAが1000ngの場合の結果を示している。)の結果を示す。 Each figure is represented by a bar graph in which the signal intensity obtained from the results of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 is plotted on the vertical axis. From left to right, Array1-1000 ng (Comparative Example 1), Array2-3000 ng (Comparative Example 2), Array3-100 ng (when totalRNA is 100 ng in Example 1), Array3-300 ng (when totalRNA is 300 ng in Example 1), The results of Array3-500 ng (when totalRNA is 500 ng in Example 1) and Array3-1000 ng (showing results when totalRNA is 1000 ng in Example 1) are shown.
図1,2,3,4から、実施例においてはtotalRNAの量が増加するにしたがってシグナル強度が増加していることがわかる。また、ノイズの値はtotalRNAの量に関係しないことが図5から分かる。 1, 2, 3, and 4, it can be seen that in the examples, the signal intensity increases as the amount of total RNA increases. Further, it can be seen from FIG. 5 that the noise value is not related to the amount of total RNA.
比較例1
凹凸部が設けられていない平坦なガラス基板で作成されたDNAチップの場合と比較した。
Comparative Example 1
This was compared with the case of a DNA chip made of a flat glass substrate not provided with uneven portions.
基板として、「DNAマイクロアレイ用コートスライドガラス」(松浪硝子)を用いた。以下の条件で、それぞれ選択結合性物質(プローブDNA)としてオリゴヌクレオチドを固定化した。配列番号1、2,3,4のRNAと相補配列のDNA(約20塩基、5’末端アミノ化)を合成した。この配列番号1,2,3,4のRNAと相補配列のDNAは5’末端がアミノ化されている。このオリゴヌクレオチドを、終濃度が0.03nmolおよびμLとなるようにDNAマイクロアレイ用SpottingSolution(松浪硝子)に溶解した。この溶液をアレイヤー(スポッター)(日本レーザー電子製;GeneStamp−II)を用いて、計4点スポットした。以上のようにして得られた分析用チップを、「Array1」とした。 “Coated slide glass for DNA microarray” (Matsunami Glass) was used as the substrate. Under the following conditions, oligonucleotides were immobilized as selective binding substances (probe DNAs), respectively. DNA of complementary sequence (about 20 bases, 5 'terminal amination) was synthesized with the RNAs of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4. The DNA of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and the complementary sequence DNA are aminated at the 5 'end. This oligonucleotide was dissolved in Spotting Solution for DNA microarray (Matsunami Glass) so that the final concentration was 0.03 nmol and μL. A total of four spots were spotted on this solution using an arrayer (spotter) (manufactured by Nippon Laser Electronics; GeneStamp-II). The analysis chip obtained as described above was designated as “Array1”.
RNAの標識は、「miRCURY LNA microRNA Hy5 Power labeling kit」(エキシコン社;208030-A)を用いた。被験試料には、miRNAの含有が確認されたFirstChoice Human Liver TotalRNA(ABI社;AM7960)を用いた。上述のtotalRNA1000ngを用いた。ハイブリダイゼーションは、マイクロピペットを用いてArray1のオリゴヌクレオチドがスポットされた面にアプライした。ギャップカバーガラス(松浪硝子)を被験試料溶液がアプライされた面に載せて、ハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社;TX711)にセットし、37℃で16時間反応させた。遺伝子発現量の測定は実施例と同様である。その結果を図1,2,3,4、5に「Array1-1000ng」として示す。 For labeling of RNA, “miRCURY LNA microRNA Hy5 Power labeling kit” (Exicon Inc .; 208030-A) was used. As the test sample, FirstChoice Human River TotalRNA (ABI; AM7960), which was confirmed to contain miRNA, was used. The above total RNA of 1000 ng was used. Hybridization was applied to the surface on which the array 1 oligonucleotide was spotted using a micropipette. A gap cover glass (Matsunami Glass) was placed on the surface to which the test sample solution was applied, set in a hybridization chamber (Takara Bio Inc .; TX711), and reacted at 37 ° C. for 16 hours. The measurement of the gene expression level is the same as in the example. The result is shown as “Array 1-1000 ng” in FIGS.
図1,2,3,4から分かるように、Array1-1000ngのシグナル強度は、実施例におけるtotalRNAが300ngの場合よりも低い。また、図5からノイズの値が同等であることから、実施例1は比較例1より少ないtotalRNA量を用いても高いS/N比で検出することができているといえる。 As can be seen from FIGS. 1, 2, 3, and 4, the signal intensity of Array 1-1000 ng is lower than that of 300 ng of total RNA in the Examples. Moreover, since the noise values are equivalent from FIG. 5, it can be said that Example 1 can be detected with a high S / N ratio even when using a smaller total RNA amount than Comparative Example 1.
比較例2
異なる標識方法との比較として、グアニン塩基を特異的に認識して標識する方法を比較した。標識にはLabel ITmiRNA Labeling Kit,Cy5(タカラバイオ社;V8610)を用い、上述のtotalRNA3000ngについて、メーカー推奨のプロトコールでmiRNAを標識した。標識方法以外は実施例1と同様である。その結果を図1,2,3,4、5に「Array2-3000ng」として示す。
Comparative Example 2
As a comparison with different labeling methods, a method of specifically recognizing and labeling a guanine base was compared. For labeling, Label ITmiRNA Labeling Kit, Cy5 (Takara Bio Inc .; V8610) was used, and for the above totalRNA of 3000 ng, miRNA was labeled according to the manufacturer's recommended protocol. Except for the labeling method, it is the same as in Example 1. The results are shown as “Array 2-3000 ng” in FIGS.
図1,2,3,4から分かるように、Array2-3000ngのシグナル強度は、実施例においてtotalRNAが1000ngの場合よりも低い(図1,2,3,4参照)。また、図5からノイズの値が同等であることから、実施例1は比較例2より少ないtotalRNA量を用いても高いS/N比で検出することができているといえる。 As can be seen from FIGS. 1, 2, 3, and 4, the signal intensity of Array 2-3000 ng is lower in the Examples than when total RNA is 1000 ng (see FIGS. 1, 2, 3, and 4). Moreover, since the noise values are equivalent from FIG. 5, it can be said that Example 1 can be detected with a high S / N ratio even when using a smaller total RNA amount than Comparative Example 2.
以上の実施例1、比較例1および比較例2の結果から、実施例1に示した方法を用いることで比較例1および比較例2よりも少ない被験試料からmiRNAを高いS/N比で検出することができているといえる。 From the results of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 described above, miRNA was detected at a high S / N ratio from fewer test samples than Comparative Example 1 and Comparative Example 2 by using the method shown in Example 1. It can be said that it is possible.
Claims (3)
The small RNA according to claim 1 or 2, wherein the labeled body is a labeled body in which a labeling substance is bound to the 3 'end of a small RNA or DNA having a sequence complementary to the small RNA via a linker sequence. How to detect.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008267568A JP2010094075A (en) | 2008-10-16 | 2008-10-16 | Method for detecting small-sized rna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008267568A JP2010094075A (en) | 2008-10-16 | 2008-10-16 | Method for detecting small-sized rna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010094075A true JP2010094075A (en) | 2010-04-30 |
Family
ID=42256213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008267568A Pending JP2010094075A (en) | 2008-10-16 | 2008-10-16 | Method for detecting small-sized rna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2010094075A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012147800A1 (en) * | 2011-04-25 | 2012-11-01 | 東レ株式会社 | Composition for predicting sensitivity to trastuzumab therapy in breast cancer patients and method using same |
-
2008
- 2008-10-16 JP JP2008267568A patent/JP2010094075A/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012147800A1 (en) * | 2011-04-25 | 2012-11-01 | 東レ株式会社 | Composition for predicting sensitivity to trastuzumab therapy in breast cancer patients and method using same |
JP6026408B2 (en) * | 2011-04-25 | 2016-11-16 | 東レ株式会社 | Composition and method for predicting therapeutic sensitivity to trastuzumab in breast cancer patients |
US9873916B2 (en) | 2011-04-25 | 2018-01-23 | Toray Industries, Inc. | Method for predicting response to trastuzumab therapy in breast cancer patients |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6730525B2 (en) | Chemical composition and method of using the same | |
EP3421610B1 (en) | METHOD FOR EVALUATING QUALITY OF miRNA DERIVED FROM BODY FLUID | |
US9145582B2 (en) | Microarray techniques for nucleic acid expression analyses | |
US9677130B2 (en) | Methods to detect and quantify RNA | |
WO2018056432A1 (en) | Method for detecting hemolysis in blood sample and hemolysis detection chip | |
CN1867680A (en) | Oligonucleotide microarray | |
US11348663B2 (en) | Method and device for comparative analysis of miRNA expression level | |
WO2010087409A1 (en) | Method for detecting nucleic acid | |
US10622093B2 (en) | Method and device for correcting level of expression of small RNA | |
JP2010094075A (en) | Method for detecting small-sized rna | |
JP5998674B2 (en) | Comparative analysis method of small RNA expression level | |
KR101753434B1 (en) | Method for analyzing rna | |
JP2007300829A (en) | Method for preparing specimen provided to dna microalley and the like | |
JP2010029174A (en) | Hybridization solution | |
CN1954085A (en) | Detection of RNA with micro-arrays |