JP2010057450A - 発光微生物固定化チップ及びそれを用いる有機汚染、環境測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ及びこの発光微生物固定化チップを2℃〜5℃の温度域で保存した後、8℃〜18℃の温度域で2時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、20分間以内の発光量を測定する。
【選択図】 図1
Description
IFO10466 )と酸素電極を用いて溶存酸素量の測定を行うBODS法が開発された。BODS法はBOD5法に比し迅速な測定が可能であり、試料水を添加した溶液に微生物固定化膜を装着した酸素電極を入れ、電流変化を読み取るだけでBODの測定を行える。しかしながら、酸素電極に装着する微生物の固定化方法や固定化した微生物の活性化に高い技術を必要とし、多試料分析やオンサイトでの測定が困難である。
本発明は、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルによって基板上の微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートを得ることならびに、この発光微生物固定化チップ又はシートを2℃〜5℃の温度域で保存した後、BOD測定に臨んで8℃〜18℃の温度域で2時間以内の微生物再活性化処理を施し、試料液を発光微生物固定化チップ又はシートの微小ホール又は凹凸構造に滴下し20分間以内の発光量を測定することからなる。
以下、本発明をその好ましい実施形態に則して詳細に説明する。
アクリル基板(3cm×7cm×0.2cm厚さ)上に、直径:1000μm、深さ:1000μm、各ホール間:5mmの微小ホールを9箇穿設した。これら微小ホールに発光微生物の包理・固定化を行った。
先ず、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum IFO13896株を用いた。この発光細菌を初発菌体濃度が106cells/mlとなるように調節して培養した。培養には、一般的な発光菌培養地である、表1に示すATCCculture medium No.1163を用い、振盪条件:25℃、120rpmで培養を行った。また、実験に使用する発光細菌は、培養令を一定化させ発光強度が最大となるよう、対数増殖後期にあたる植菌後約15時間後の液体培地を採取して使用した。
カバーガラスで被覆された発光微生物固定化チップを冷蔵保存(2℃〜5℃)すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を密閉して冷蔵庫(4℃)で1日から8週間保存した。
一定期間冷蔵保存(2℃〜5℃、好ましくは4℃±1℃)した発光微生物固定化チップに対してBOD標準液を用いた発光測定を行うべく、発光微生物固定化チップの再活性化を行った。先ず、発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックヒータ(TAITEC,CTU−N)の加熱部位にセットした。然る後、13℃で20分間、発光微生物固定化チップをインキュベートして発光微生物を再活性化した。再活性化後、別の同形アクリル板を用いてカバーガラス、寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。
これまでの実験は、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum IFO13896株を用いて行った。この発光微生物によってBODの簡易測定を行う場合、図2に示すように、発光が微弱でありBOD標準溶液滴下後約40分間で濃度間の発光差が認められなくなった。また、発光強度とBOD濃度間の有意差の不足、対応濃度レンジが狭いなどの問題もある。そこで、発明者らは発光細菌Photobacterium phosphoreum IFO13896株に代わる長期保存に適した発光微生物を探索することにした。
海洋由魚貝類、海水を採取し、実験に用いた。これらを接種試料として目的発光微生物のスクリーニング操作を行った。海洋魚類として、メバル(Sebastes inermis )、アジ(Trachurus japonicus )、サバ(Scomber japonicus )、カサゴ(Sebasticus marmoratus )、クサフグ(Takifugu niphobles)、マダイ(Pagrus major)、キス(Sillago japonica)、キュウセン(Halichoeres poecilopterus)、ホシササノハベラ(Pseudolabrus sieboldii)、クジメ(Hexagrammos agrammus)、アナゴ(Conger myriaster)の合計11種類の魚類を採取、収集した。また、海洋貝類として、タマキビ(Littorina brevicula)、オオクサズリガイ(Rhyssoplax komaiana)を採取、収集した。加えて、広島県呉市倉橋町鹿老渡の海岸から採取した海水、泥質を実験に供した。
プレート法を用いた海洋試料から新たに分離された発光細菌株(55株)について、発光能が高い株の選抜を行った。分離株は全て20mlの分離培地を分注した50mlの三角フラスコに植菌後、好気条件下に液体振盪培養(25℃、120rpm)を行った。この培養液について、植菌から12時間後の発光の強さを目視で比較し、発光が強いものを選抜し発光微生物固定化チップに供する発光微生物の候補として以後の実験に用いた。
選抜された発光細菌(AT−1株、KN−5株、MN−2株)を表1に示す増殖培地に初期菌体濃度が106cells/mlとなるように調節して植菌し、好気条件下に液体振盪培養(25℃、120rpm)を行った。最大発光条件に相当する対数増殖期後期にあたる、植菌から約12時間後の培養液をエッペンドルフチューブに採取した。その後、遠心分離(TOMYMX−301、4℃、15,000rpm、3分間)を行って菌体と培養液を分離した。上澄みを取り去った後、エッペンドルフチューブに培養液1.5mlを加え、同様に遠心分離して上澄みを取り除いた(合計3mlの培養液の菌体ペレットに相当)。このようにして作製した菌体ペレットに、炭素源を除いた表1に示す増殖培地を1.5ml加えて菌体を懸濁し、再度同様の遠心分離によって菌体を洗浄した。この洗浄操作を2度行い、エッペンドルフチューブ内に菌体ペレットを得た。
カバーガラスで覆われた発光微生物固定化チップを冷蔵条件(2℃〜5℃)で保存すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を巻いて7日間保存した。保存した発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックインキュベータ(HAITEC,CTU−N)にセットした。発光微生物固定化チップを13℃、20分間の条件でインキュベートして、発光細菌を再活性化した。
再活性化後、同形のアクリル板を用いてカバーガラスおよび寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。次いで、予め酸素ガスで2分間バブリングしておいたBOD標準溶液(0,8,16ppm)を各微小ホールに1滴ずつ滴下し、図1に示す簡易測定システムを用いて発光の測定を行った(測定条件:ISO1600、露光時間2分間)。撮影したデータをフラッシュメモリーデバイスなどによってノート型パソコンに転送し、画像解析ソフトウエアScion Image を用いて数値化した。
KN−5株において、BOD0ppmでの発光量が多いこと、0ppmと16ppm間の濃度に対する発光レンジがグレースケール値にして約25〜30であり、測定レンジが狭いという問題が判明した。そこで発明者らは、有機物を含まない(0ppm)条件での微生物発光の抑制、発光強度と各BOD濃度間の有意差の拡大、濃度レンジの拡大を目的として、有機物質を含まない培地溶液で一定時間、菌体をインキュベートするレスティング処理を発光微生物固定化に供する菌体に施した。最終選抜菌株を段落0033において述べた条件で培養、遠心分離による集菌、洗浄を行い、次いでレスティング処理を行った。処理後、段落0034において述べた操作で菌体をシリカゲルで発光微生物固定化チップに固定化した。
12時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップを1日〜7日間、4℃で保存し、経過1日毎の生物発光の変化を観察して発光微生物固定化チップの安定性を調べた。その際、発光微生物の再活性化条件は、これまでに述べたと同様の条件である。その結果、保存日数7日間を通して安定な生物発光が観察された。また、発光強度とBOD濃度の相関性を確認でき、図9乃至図12に示すように、BOD濃度に対する発光レンジも測定に十分な範囲を確保できていることが明らかとなった。保存7日間を通して、グレースケール値にして40〜60の発光レンジが維持されていた。しかしながら、図9に示すように、発光強度の値は保存日数が増すにつれて低下する傾向が見られ、16ppmのBOD標準液を滴下して20分後の発光を比較すると、図9に示すように、1日間および2日間保存した発光微生物固定化チップからはグレースケール値にして約245の発光強度が確認されたが、図10に示すように、3日目においてはグレースケール値にして約235、4日目においてはグレースケール値にして約175にまで低下した。さらに、図12および図13に示すように、5日目では145、6日目7日目では125にまで発光強度が低下した。
7日間保存した発光微生物固定化チップを用いて、BOD測定用の検量線を作成した。BOD標準溶液の濃度と生物発光との間に直線的な相関性を示す検量線が得られ、図13に示すように、発光強度(Y)に対してBOD濃度(X)とするとき、Y=3.0405X+770709(R2=0.9996)の相関式(近似式)が得られた。実際のBOD測定にあっては、この逆関数を用いた。
実試料として、広島県三次市の馬洗川、広島県庄原市の国兼川、太刀洗川、はげら池から採取した水、および県立広島大学の排水処理場から原水、沈澱池の水、滅菌前の水、滅菌後の水を採取し、実験に供した。7日間保存した発光微生物固定化チップを用いて本発明の有機汚染測定方法によって、ラボ内で疑似オンサイト的にBOD測定を行い測定データを得た。このデータを図13に示す検量線に当てはめ、BOD値を求めた。一方、公定法(BOD5)を用いて、同一試料のBOD測定を行った。
本発明の実施例で用いた発光細菌KN−5株に対して、グラム染色(Hucker法)、アピテスト(日本ビオメリューAPI20NE)を用いた簡易生化学同定試験を行った。先ず、グラム染色(Hucker法)では、培養液の100μlを900μlの滅菌蒸留水に懸濁し、希釈した菌体をスライドガラスに滴下後自然乾燥し、ガスバーナで軽く焙り固定化を行った。これにクリスタルバイオレット(溶液1)クリスタルバイオレット:1.0g、95%エタノール10ml 溶液2)蓚酸アンモニウム:0.4g、蒸留水:40ml 使用時に溶液1)、2)を混合)で菌体塗布面を覆い、1分間放置した後、流水で流した。次いで、ルゴール溶液で塗布面を覆い、1分間放置し、流水で流した後、脱色液(95%エタノールとアセトンを7:3の割合で混合)を用いて脱色を行った。その後、サフラニン液で塗布面を覆い、30秒間放置後、流水で洗浄した。スライドガラスを自然乾燥した後、位相差顕微鏡(OLYMPUS BX50)を用いて確認を行い、紫に染まった場合は陰性と判断した。また、コントロールとして、グラム陽性菌に納豆菌(Bacillus subtilis )、グラム陰性菌に大腸菌(Ecsherichia coli)を用いた。
発光細菌KN−5株の16SrDNAの塩基配列に基づく系統分類を行うために、発光細菌KN−5株からゲノムDNAの抽出を行った。先ず、培養菌液1mlをエッペンドルフチューブに採取し、遠心分離(TOMY MX−301、25℃、18,000rpm、3分間)を行って、上澄みを除き、菌体ペレットに557μlのTEバッファーを加えて懸濁した。この懸濁液に30μlの10%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶液、3μlの20mg/mlプロテナーゼKを加え、数回アジテーションを行って混合した後、37℃で1時間インキュベート(TAITEC CTU−N)した。1時間後、100μlの5MNaCl溶液、80μlのCTAB/NaCl溶液を加えよく懸濁した後、65℃で10分間インキュベートした。10分後、750μlのCl(クロロホルム:イソアミルアルコール=1:1)を加えてよく懸濁し、遠心分離(TOMY MX−301、25℃、14,000rpm、5分間)を行った。
Claims (2)
- 基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ。
- 請求項1に記載の発光微生物固定化チップを2℃〜5℃の温度域で保存した後、BOD測定に臨んで8℃〜18℃の温度域で2時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、20分間以内の発光量を測定するようにしたことを特徴とする発光微生物固定化チップによる有機汚染、環境測定方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103091290A (zh) * | 2013-01-04 | 2013-05-08 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法 |
CN114577785A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-06-03 | 杭州春来科技有限公司 | 一种水质毒性检测方法及系统 |
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2008
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Non-Patent Citations (2)
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JPN6012028309; 日本化学会講演予稿集, (2008.03), 88th, [2], p.1544(3PA-107) * |
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