JP2010053116A - 含フッ素化合物、それを用いる生体分子の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】式(1)で表される構造を有する含フッ素化合物で、該化合物は、例えば下式の反応で得られる化合物である。
(Rlは極性基を有する親水性リガンド、L1は、−NH−(CH2)p−NHCO−(pは3以上10以下の整数)等、L2は、単数もしくは複数の−CH2−が独立して、−NH−、−O−、−CO−、−SO2−、アリーレン基で置換されていてもよいアルキレン基であり、Rfは、パーフルオロアルキル基等で置換されているアリール基であり、m、nは0もしくは1である。)
【選択図】なし
Description
(実施例1:含フッ素化合物(プローブ)の合成)
(実施例1―1:アミドタイププローブの合成)
図1に示すスキームに従ってリガンドの異なる3種の含フッ素化合物1,2,3(プローブ1,2,3)について合成を行った。
1. 化合物4 (1〜3の共通骨格)の合成
1-1. 化合物4-1の合成
50 mL二口ナスフラスコに3-クロロスルホニル-安息香酸クロリド (590 μL, 3.7 mmol, 2.5 eq)、無水塩化メチレン 5 mLを加え、アルゴン雰囲気下、tert-ブトキシカルボニル(Boc)-1.5-ジアミノペンタン (300 mg, 1.5 mmol, 1eq)、ジイソプロピルエチルアミン (390 μL, 2.3 mmol, 1.5eq)の無水塩化メチレン溶液 5 mLを、水浴下でゆっくり加え、さらに室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / EtOAc : Hexane = 2 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / EtOAc : Hexane = 1 : 1 )にて精製を行った。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 563 mg (収率 90 %)
100 mL二口ナスフラスコに3,5-ビス(トリフルオロメチル)-安息香酸 (500 mg, 1.94 mmol, 1eq)、水溶性カルボジイミド(WSC・HCl) (589 mg, 2.9 mmol, 1.5eq)、無水ジメチルホルムアミド 5 mLを加えたあと、アルゴン雰囲気下、室温で5分ほど攪拌したあと、Boc-1.5-ジアミノペンタン (510 mg, 2.52 mmol, 1.3 eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で8時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチル (300 mL) を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 mL, 2回)、飽和食塩水 (100 mL, 2回)で洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 628 mg (収率 79 %)
50 mLナスフラスコに化合物4-2 (650 mg, 1.47 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 5 mL、トリフルオロ酢酸(TFA) 1 mLを加え、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を690 mg (定量的) を得た。
[実験結果]
白色固体
収量 440 mg (2steps ; 収率 42 %)
2-1. 化合物1-1の合成
100 mL二口ナスフラスコに4-スルファモイル安息香酸 (500 mg, 2.5 mmol, 1 eq)、WSC・HCl (720 mg, 3.8 mmol, 1.5eq)、N, N-ジイソプロピルエチルアミン (1.3 mL, 7.5 mmol, 3eq)、無水ジメチルホルムアミド 20 mLを加えたあと、N-ヒドロキシスクシンイミド (374 mg, 3.3 mmol, 1.3eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で4時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチル (300 mL) を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 mL, 3回)、蒸留水 (100 mL, 3回)、飽和食塩水 (100 mL, 3回)で洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 650 mg (収率 87 %)
50 mLナスフラスコに化合物4 (75 mg, 0.11 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 5 mL、TFA 1 mLを加え、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を80 mg (定量的) を得た。
[実験結果]
白色固体
収量 62 mg (2steps ; 収率 75 %)
3-1. 化合物2-1の合成
100 mL二口ナスフラスコに4-シアノ安息香酸 (500 mg, 2.5 mmol, 1 eq)、WSC・HCl (590 mg, 3.1 mmol, 0.9eq)、N, N-ジイソプロピルエチルアミン (1.1 mL, 6.2 mmol, 1.8eq)、無水ジメチルホルムアミド 20 mLを加えたあと、N-ヒドロキシスクシンイミド (307 mg, 2.7 mmol, 0.8eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチル (300 mL) を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 mL, 3回)、蒸留水 (100 mL, 3回)、飽和食塩水 (100 mL, 2回)で洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 630 mg (収率 76 %)
50 mLナスフラスコに化合物4 (75 mg, 0.11 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 5 mL、TFA 1 mLを加え、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を80 mg (定量的) を得た。
[実験結果]
白色固体
収量 62 mg (2steps ; 収率 79 %)
50 mLナスフラスコに塩化アンモニウム (8.7 mg, 0.16 mmol, 2eq) の無水トルエン溶液 2 mLを加えた後、2M トリメチルアルミニウム (0.1 mL, 0.2 mmol, 2.4eq)を氷浴下、ゆっくり滴下した。アルゴン雰囲気下、0℃で1時間撹拌後、化合物2-2 (60 mg, 0.081 mmol, 1eq)の無水トルエン と無水テトラヒドロフランの混合溶液 (1 : 1, 2mL) を加え、80℃で20時間、90℃で24時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。反応溶液にシリカ (2.0g) を加え、クロロホルムとメタノールの混合溶液 (CHCl3 : MeOH = 5 : 1) で固液洗浄を行い、吸引濾過後、同溶媒 (20 mL) で固体を洗浄した後、メタノール (10 mL) で洗浄した。メタノールによる洗浄後の濾液を回収し、溶媒を減圧留去した後、アセトンで再沈殿を行い、生じた固体を吸引濾過により濾別し、溶媒を減圧留去して、黄色固体16 mgを得た。
[実験結果]
白色固体
収量 3 mg (2steps ; 収率 5 %)
4-1. 化合物3-1の合成
100 mLナスフラスコに水酸化カリウム (337 mg, 6 mmol, 1eq) のエタノール溶液9 mL、Benzylmalonic acid diethyl ester (1.5 g, 6 mmol, 1eq) を加え、室温で3時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、残査を5% 炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 mL) に溶解させ、水層を酢酸エチル(100mL,2回)で洗浄した。その後1N 塩酸水溶液でpHを酸性 (pH〜1.0)にし、酢酸エチル(100mL,3回)で抽出を行った。有機層を1N塩酸水溶液 (100 mL、1回) で洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去、真空乾燥させ、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 1.28 g (収率 96 %)
50 mLナスフラスコに化合物4 (25 mg, 0.035 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 2 mL、TFA 1 mLを加え、室温で5時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を28 mg (定量的) を得た。
[実験結果]
白色固体
収量 27 mg (2steps ; 収率 95 %)
50 mLナスフラスコにNH2OKの0.5M メタノール溶液 (1.5 mL, 0.78 mmol, 25eq) を加え、氷浴下、化合物3-2 (25 mg, 0.031 mmol, 1eq)のメタノール溶液2 mLをゆっくり加え、室温で6時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 15 : 1)にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、残査を酢酸エチル (50 mL) に溶解させ、有機層を飽和食塩水 (30 mL, 3回) で洗浄を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 25 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 13 mg (収率 52 %)
図2に示すスキームに従って分子構造の異なる4種の含フッ素化合物、Amide-type(化合物A)、C2-type(化合物B)、C4-type(化合物C)、C8-type(化合物D)について合成を行った。
化合物Aの合成
1-1. 化合物A-1の合成
50 mL二口ナスフラスコに3,5-ビス(トリフルオロメチル)-安息香酸 100 mg (0.40 mmol, 1 eq)、WSC-HCl 110 mg (0.60 mmol, 1.5eq)、HOBt一水和物 89 mg (1.5eq)、ジイソプロピルエチルアミン 202 μL (1.2 mmol, 3eq)、無水ジメチルホルムアミド 5 mL、2-(2-アミノエトキシ)−エタノール 82 mg (0.78 mmol, 2eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で12時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約300 mLを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100 mL、飽和食塩水100 mL、飽和クエン酸水溶液100 mLで各3回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー(SiO2 / CHCl3 : MeOH = 20 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 76 mg (収率 57 %)
50 mL二口ナスフラスコに化合物A-1 76 mg (0.22 mmol, 1 eq)、Boc-C5-SO2Cl 107 mg (0.26 mmol, 1.2eq)、無水塩化メチレン 4 mL、ジイソプロピルエチルアミン 115 μL (0.66 mmol, 3eq)を加え、アルゴン雰囲気下、ジメチルアミノピリジン(DMAP) 13 mg (0.11 mmol, 0.5eq)の無水塩化メチレン溶液 1 mLをゆっくり加えて、室温で6時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成は確認したが反応が終了していなかったので、さらにDMAP 13 mg(計1eq)を加えて、さらに室温で6時間攪拌して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 25 : 1)により精製を行った。溶媒を減圧留去し、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 72 mg (収率 46 %)
50 mLナスフラスコに化合物A-2 72 mg (0.10 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 3 mL、TFA 1 mLを加え、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料 (Rf値;0.4) の消失と目的化合物 (Rf値;0.1)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を73 mg (収率;100%, 定量的) を得た。50 mL二口ナスフラスコに得られた化合物を全量 73 mg (0.10 mmol, 1 eq)、WSC-HCl 29 mg (0.15 mmol, 1.5eq)、HOBt一水和物 23 mg (1.5eq)、ジイソプロピルエチルアミン 52 μL (0.30 mmol, 3eq)、無水ジメチルホルムアミド 2 mL、4-スルファモイル安息香酸 30 mg (0.15 mmol, 1.5eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で12時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 7 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.5)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約300 mLを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100 mL、飽和食塩水100 mLで各3回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 15 : 1→10 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、粘性固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色(粘性)固体
収量 56 mg (2steps ; 収率 71 %)
2-1. 化合物B-1の合成
100 mL二口ナスフラスコに2, 4-ビス(トリフルオロメチル)フェノール 1.0 g (4.35 mmol, 1 eq)、2-ブロモアルコール 1.09 g (8.7 mmol, 2eq)、炭酸カリウム 2.4 g (17.4 mmol, 4eq, 300oCで2〜3h焼き)、無水ジメチルホルムアミド 20 mLを加えたあと、アルゴン雰囲気下、室温で2時間、40 ℃で6時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 20 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.4)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約300 mLを加え、飽和クエン酸水溶液100 mLで3回、飽和食塩水100 mLで1回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して白色固体を得た。精製をカラムクロマトグラフィー(SiO2 / 1回目;CHCl3 : MeOH = 1 : 0→20 :1、2回目;EtOAc : Hexane = 1 : 3)にて2回行い、溶媒を減圧留去、真空乾燥して白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 218 mg (収率 27 %)
50 mL二口ナスフラスコに化合物B-1 50 mg (0.18 mmol, 1 eq)、Boc-C5-SO2Cl 105 mg (0.27 mmol, 1.5eq)、無水塩化メチレン 3 mL、ジイソプロピルエチルアミン 94 μL (0.54 mmol, 3eq)を加え、アルゴン雰囲気下、DMAP 11 mg (0.09 mmol, 0.5eq)の無水塩化メチレン溶液 1 mLをゆっくり加えて、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成と原料(SO2Cl, Rf値;0.5)の消失を確認して、反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / 1回目;CHCl3 : MeOH = 15 : 1、2回目;EtOAc : Hexane = 1 : 3→1 : 1)により精製を行った。溶媒を減圧留去し真空乾燥して、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 52 mg (収率 45 %)
50 mLナスフラスコに化合物B-2 47 mg (0.073 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 4 mL、TFA 1.5 mLを加え、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料 (Rf値;0.5) の消失と目的化合物 (Rf値;0.1)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を48 mg (収率;100%, 定量的) を得た。50 mL二口ナスフラスコに得られた化合物を全量 48 mg (0.073 mmol, 1 eq)、SA-OSu 44 mg (0.15 mmol, 2eq)、ジイソプロピルエチルアミン 31 μL (0.19 mmol, 2.5eq)、無水ジメチルホルムアミド 2 mLを加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.3)の生成と、原料 (Rf値;0.1) の消失を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約100 mL加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50 mL、飽和食塩水50 mLで各3回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / EtOAc : Hexane = 4 : 3→4 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 32 mg (2steps ; 収率 60 %)
3-1. 化合物C-1の合成
100 mL二口ナスフラスコに2, 4-ビス(トリフルオロメチル)フェノール 1.0 g (4.35 mmol, 1 eq)、エチレングリコール-2-モノ-クロロエチルエーテル 1.08 g (8.7 mmol, 2eq)、炭酸カリウム 2.4 g (17.4 mmol, 4eq, 300℃で2〜3h焼き)、リチウムブロミド 378 mg(4.35 mol, 1eq)、無水ジメチルホルムアミド 20 mLを加えたあと、アルゴン雰囲気下、45 ℃で13時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.5)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約300 mLを加え、飽和クエン酸水溶液100 mLで3回、飽和食塩水100 mLで1回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して白色固体を得た。精製をカラムクロマトグラフィー(SiO2 / 1回目;CHCl3 : MeOH = 30 : 1、2回目;EtOAc : Hexane = 1 : 4→1 : 1→1 : 0、3回目;CHCl3 のみ)にて3回行い、溶媒を減圧留去、真空乾燥して透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 360 mg (収率 26 %)
50 mL二口ナスフラスコに化合物C-1 60 mg (0.19 mmol, 1 eq)、Boc-C5-SO2Cl 115 mg (0.29 mmol, 1.5eq)、無水塩化メチレン 1 mL、ジイソプロピルエチルアミン 99 μL (0.57 mmol, 3eq)を加え、アルゴン雰囲気下、DMAP 12 mg (0.1 mmol, 0.5eq)の無水塩化メチレン溶液 1 mLをゆっくり加えて、室温で3時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成と原料(C-1, Rf値;0.5)の消失を確認して、反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 30 : 1)により精製を行った。溶媒を減圧留去し真空乾燥して、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 98 mg (収率 75 %)
50 mLナスフラスコに化合物C-2 95 mg (0.14 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 3 mL、TFA 1 mLを加え、室温で1.5時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料 (Rf値;0.5) の消失と目的化合物 (Rf値;0)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を106 mg (収率;100%, 定量的) を得た。50 mL二口ナスフラスコに得られた化合物を全量 106 mg (0.14 mmolで計算, 1 eq)、SA-OSu 63 mg (0.21 mmol, 1.5eq)、ジイソプロピルエチルアミン 73 μL (0.42 mmol, 3eq)、無水ジメチルホルムアミド 4 mLを加え、アルゴン雰囲気下、室温で3時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.4)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約100 mL加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50 mL、飽和食塩水50 mLで各3回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 25 : 1→10 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 73 mg (2steps ; 収率 69 %)
4-1. 化合物D-1の合成
100 mL二口ナスフラスコにテトラエチレングリコール 5 g (25.7 mmol, 5.1 eq)、無水ピリジン 2 mL (25 mmol, 5eq)、無水塩化メチレン 15 mLを加え、アルゴン雰囲気下、滴下漏斗を用いてトシルクロライド 0.96 g (5 mmol, 1eq)の無水塩化メチレン溶液 10 mLを30分かけてゆっくり滴下し、その後室温で3時間撹拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH =10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成と原料(トシルクロライド、Rf値;0.9)の消失を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去した。精製をカラムクロマトグラフィー(SiO2 / CHCl3 : MeOH = 1 : 0→20 :1)にて行い、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して透明油状物を得た。同定は1H-NMRにて行った。
[実験結果]
透明油状物
収量 1.25 g(収率 72%)
100 mL二口ナスフラスコに2, 4-ビス(トリフルオロメチル)フェノール 230 mg (1 mmol, 1 eq)、炭酸カリウム 346 mg (2.5 mmol, 2.5eq, 300℃で2〜3h焼き)、無水ジメチルホルムアミド 3 mLを加えたあと、アルゴン雰囲気下、D-1 418 mg (1.2 mmol, 1.2eq)の無水ジメチルホルムアミド 2 mLをゆっくり加え、室温で2時間、50 ℃で13時間攪拌した。TLC (SiO2 / EtOAc : Hexane = 1 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.4)の生成と原料(フェノール、Rf値;0.9)の消失を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約300 mLを加え、飽和クエン酸水溶液100 mLで3回、飽和食塩水100 mLで2回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して白色固体を得た。精製をカラムクロマトグラフィー (SiO2 /2回目;EtOAc : Hexane = 1 : 1→4 : 1)にて行い、溶媒を減圧留去、真空乾燥して淡黄色油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
淡黄色油状物
収量 252 mg (収率 63 %)
50 mL二口ナスフラスコに化合物D-2 73 mg (0.18 mmol, 1 eq)、Boc-C5-SO2Cl 105 mg (0.27 mmol, 1.5eq)、無水塩化メチレン 3 mL、ジイソプロピルエチルアミン 94 μL (0.54 mmol, 3eq)を加え、アルゴン雰囲気下、DMAP 11 mg (0.09 mmol, 0.5eq)の無水塩化メチレン溶液 1 mLをゆっくり加えて、室温で1.5時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.6)の生成と原料(SO2Cl, Rf値;0.7)の消失を確認して、反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / 1回目;EtOAc : Hexane = 1 : 1→4 : 1、2回目;CHCl3 : MeOH = 25 : 1)により精製を行った(化合物3-2と目的化合物とを分離することはできなかったので、混合物として回収)。溶媒を減圧留去し真空乾燥して、透明油状物を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
透明油状物(化合物D-2との混合物として)
収量 56 mg (収率、NMRより19%)
50 mLナスフラスコに化合物D-3とD-2の混合物 56 mg (NMRより0.035 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン 2.5 mL、TFA 1 mLを加え、室温で1時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)にて反応追跡を行い、原料 (Rf値;0.5) の消失と目的化合物 (Rf値;0.1)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、トルエンとの共沸を2回行い、真空乾燥して透明油状物を58 mg (収率;100%, 定量的) を得た。50 mL二口ナスフラスコに得られた化合物を全量 58 mg (0.035 mmol, 1 eq)、SA-OSu 33 mg (0.11 mmol, 3eq)、ジイソプロピルエチルアミン 21 μL (0.12 mmol, 3.5eq)、無水ジメチルホルムアミド 2 mLを加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌した。TLC (SiO2 / EtOAc : Hexane = 1 : 1)にて反応追跡を行い、目的化合物 (Rf値;0.2)の生成を確認して反応を終了した。溶媒を真空ポンプにて減圧留去し、酢酸エチルを約100 mL加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50 mL、飽和食塩水50 mLで各3回洗浄を行った。有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1)による精製を行った。溶媒を減圧留去し、さらに残査を酢酸エチル 50 mLに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム 30 mLで4回、飽和炭酸カリウム水溶液 30 mLで3回、飽和食塩水 30 mLで1回洗浄を行い、SA-OSuを極力除いた。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥させ、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去し、白色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
白色固体
収量 16 mg (2steps ; 収率 53 %)
(実施例2−1:タンパク質存在下・非存在下・阻害剤共存下での、SA-type プローブ 1によるF−NMR測定)
タンパク質存在下、非存在下あるいはタンパク質阻害剤共存下での、SA-type プローブ 1(以下プローブ 1)のF−NMR測定を行った。実験条件として プローブ 1濃度は 100 もしくは50 μMとし、ストック溶液50 mM DMSO溶液を1もしくは0.5 μL用いて調製した。図3中(a), (b)は100 μM, (c) は50 μMの結果を示した。酵素hCA I濃度は50 μM とした。阻害剤(Et ; 6-ethoxybenzimidazole sulfonamide(以下、Inhibitor (Et)と略す)の濃度は250 μMとした。この阻害剤は Ki = 8 nMであり、非常に強い阻害剤である。溶媒は500 μLの50 mM HEPES buffer(pH 7.2)で 0.2 mMのTFAを含んでおり、さらに50 μLの重水を添加したものを用いた。NMR測定は400 MHz NMRで行った。積算回数は1,024 回、測定時間約16minであった。以後、F−NMR測定の共通の条件として、外部標準(TFA in CDCl3、-76.5ppm)を測定しreferenceを合わせた後、buffer中に添加しているTFA にて内部標準(TFA in neutral H2O, -75.6 ppm)を決定してからそれぞれのサンプルのChemical shiftを概算した。また、TFAのピーク(0.2 mM)の積分比を1.0とし、これと比較して積分比を評価した。その他の測定パラメータは次のように設定した:OBSET ; 149.50 kHz、OBFIN ; 72.50 Hz、Point ; 16384、FREQU ; 36036.04 Hz、Acquisition time ; 0.4547 sec、PD ; 0.5000 sec、PW1 ; 8.000 μsec、IRNUC ; 1H。結果を図3に示した。タンパク質存在下では非常にシャープなピークが、タンパク質の濃度に応じた積分比で観測された(a)が、タンパク質非存在下(b)、あるいは強力な阻害剤を加えた場合(c)にはこのピークは全く観測されなかった。タンパク質の在否に依存したF−NMRのシグナルスイッチングが観測された。
プローブ濃度を固定し、タンパク質濃度を変えた際のF−NMRピークの積分比を概算した。含フッ素化合物プローブ1濃度は50 μM で固定した。酵素hCA Iの濃度は75, 50, 25, 10, 5 μMとした。溶媒は500 μLの0.2 mMのTFA 含有50 mM HEPES buffer(pH 7.2)を用いた。50 μLの重水を添加し、F−NMR測定を600 MHz NMRで行った。積算回数は酵素濃度75〜25 μM では1,024 回(測定時間16分)、酵素濃度10 〜 5μMでは4,096 回(測定時間1時間)とした。結果を図4に示した。hCAIの量に応じた積分比のピークが、-62.6ppmに観測された。また、hCAI濃度の測定限界は本実験条件下では約5 μM程度であることが明らかとなった。また、hCAIが低濃度の場合は、-62.9 ppmに非常にシャープなピークが観測され始めた。これはモノマー分散している含フッ素化合物プローブ1であると思われる。以上の結果より、プローブ1により、酵素の定量が可能であることが確認できた。
600nmの吸光度測定を行った。プローブ1濃度を25, 50, 75, 100 μMに調整した(DMSO 0.6%)。溶媒は0.2mM TFA 含有50mM HEPES buffer(pH 7.2)を用いた。結果を図5に示した。濃度に応じて濁度は上昇した。またhCAを添加すると吸光度はバックグラウンドレベルまで低下することがわかった。これらの結果から、水中における会合体の形成ならびに酵素添加時の会合体消失、モノマー分散が確認された。
動的光散乱(DLS)測定(NICOMP 380zls)にて会合体の大きさを測定した。プローブ 1 濃度は25, 50, 75, 100 μMを調製した(DMSO 0.6%)。溶媒は0.2mM TFA を含む50mM HEPES buffer(pH 7.2)を用いた。結果を図6に示した。いずれの濃度でも、200から300nmの粒径であった。hCAを添加すると光散乱強度が非常に小さくなり、測定できなかった(データ示さず)。酵素依存性の応答挙動は濁度測定でも見られており、本結果も会合体形成−消失を裏付ける結果である。
会合体の透過型電子顕微鏡(TEM)観察(JEOL, JEM-1025(100kV))を行った。プローブ 1濃度は25 μM (0.6% DMSO)とした。酵素hCA1濃度は25 μMとした。サンプル溶液をグリッドに10μLで2回滴下し、室温で終夜乾燥させた後、観察した。結果を図7に示す。100から200nmの球状会合体と、20から50nmの球状会合体とが見られた。図8には酵素添加サンプルのTEM観察像を示す。会合体の数は酵素なしの像に比べ、有意に低下していることが示された。この結果より水中における会合体の形成が確認された。
プローブ1濃度は50 μM、酵素hCA1は50 μM、溶媒は0.1mM TFA入り50mM HEPES buffer (pH7.2)を用いた。擬似夾雑系とするため、BSA、ConA、α-Chymotrypsin、Hemoglobin(Hb)それぞれ1.5mg/500 μLになるように測定系に添加した。F−NMR測定は、プローブ添加直後に測定し、積算回数1,024回で行った。結果を図9に示す。hCA存在下でのみ、その濃度に応じたピーク面積比のピークが観測された。特異的にhCAのみに認識されていると考えられる。同様にして、FBS(非働化ウシ胎児血清)を終濃度70%添加した系で測定し、血清存在下でのhCA I検出を試みた。結果を図10に示す。hCA存在下でのみ、その濃度に応じたピーク面積比のピークが観測された。血清には大量のアルブミンが存在するが、これにはほとんど吸着していないものと思われる。
赤血球には、hCA Iが120 μM, hCAIIが30 μMで内在することが報告されている。どちらも試験管内では、このプローブでは同じケミカルシフトでピークが現れるため、IとII合わせた量がピークとして観測されると考えられる。実験条件は、赤血球細胞(RBC) 2 mLをHBS bufferで洗浄(1,500 rpm×5min×3回)し、プローブを所定量添加した上清(HBS buffer)を加えて、10minインキュベート後、再度遠心により上清を除き、プローブを取り込ませたRBC溶液とした。このRBC溶液にD2O、TFA入りBufferを混ぜて、F−NMRの測定を行った(RBC solution ; 450 μL、D2O ; 100 μL、1mM TFA入り50mM HEPES buffer (pH7.2) 50 μL)。プローブ1 濃度は100 μM、阻害剤濃度は500 μM とした。400MHz F−NMRにより、積算回数2,048回(測定時間32min)で測定を行った。結果を図11に示した。hCAに認識されたプローブ1由来のピークが細胞内においてもシャープに観測された。また、阻害剤共存下では、シグナルが観測されなかったことより、プローブ1は細胞内のhCAを認識し、検出していることが明らかとなった。以上の結果からわかるように、プローブ1は細胞内の酵素を検出できるという特徴を有する。
トリプシンの阻害剤としてアミジニウム型阻害剤をリガンドとした含フッ素化合物プローブ2を合成し、会合体形成とF−NMR測定を行った。まず会合体形成条件を検討した。塩濃度を100, 300, 500, 1000 mMと変化させ、DLS(NICOMP 380zls)により粒径を測定した。プローブ2 濃度は100 μMとした。溶媒は50mM HEPES buffer、pH 7.2(0.2mM TFA)であった。結果を図12に示す。生理塩濃度(100mM NaCl + HEPES 50mM)では散乱強度が小さかったため測定できず、会合体形成は見られなかった。300 mM塩濃度から会合は起こっていることが確認された。これらのサンプルのF−NMRを行った(積算回数1,024)。結果を図13に示す。塩濃度増加に従って、プローブ2のモノマーに由来するピークが減少していくことが明らかとなった。DLS測定の結果と合わせると、塩濃度増加に従って会合しやすくなり、その結果、Fのピークも減少していくと考えられる。ただし、シグナルOffになるには、1000 mMの塩濃度が必要であり、生理条件下から離れている。そこで次に、F−NMRのpH依存性を検討した。アミジニウム基はpH 7.2では2価カチオンがメインであるため、静電反発により会合しにくいと考えられる。そこで、塩基性雰囲気にして会合を促進できるかどうかを検討した。プローブ2濃度は100 μM (0.2% DMSO)、トリプシン濃度は100 μM、 測定溶媒は0.2mM TFA含有50mM Tris-HCl buffer、pH は8.0 もしくは8.5で測定した(400MHz F−NMR、積算回数1,024)。結果を図14に示す。pH 8.5(300 mM NaCl)まで塩基性にすると、pH 7.2(1000mM NaCl)の条件と同等のFシグナルオフ状態になることが明らかとなった。
合成したスルホン酸エステルタイプの4種の含フッ素化合物について、同様にして酵素hCA存在下、非存在下のF−NMR測定を行った。図15、図16、図17、図18にそれぞれC2-typeプローブ、C4-typeプローブ、C8-typeプローブ、Amide-typeプローブの結果を示した。いずれのプローブにおいても、酵素添加前はシグナルは確認されず、酵素添加直後シグナルが出現することを確認した。
吸光度測定のため、C4-typeプローブの濃度 25, 50, 75, 100, 200, 300 μMの溶液(DMSO contents 0.6%)を調製した。溶媒は50 mMリン酸バッファー(pH 7.2)とした。600 nmの吸光度を測定した。結果を図19に示す。濁度は100 μMまで、濃度に比例して増加した。次に、光散乱測定を行った。C4-typeプローブの濃度 50 , 75 , 100 , 200 μM (0.6 % DMSO contents) を調製した。溶媒は0.2mM TFA を含む50 mM HEPES(pH 7.2)とした。酵素hCAII (human Carbonic Anhydrase II)濃度は150 μMとした。サンプル調整後、5分後に測定した。結果を図20に示す。濃度に関係なく400 nm程度の会合体を形成していることが明らかとなった。また、酵素を添加すると会合体の粒径は非常に小さくなった(80 nm)。次に酵素添加前後の溶液の吸光度測定を行った。プローブ濃度C4-typeは75 μM、酵素hCAII (human Carbonic Anhydrase II) 濃度は150 μMとした。結果を図21に示す。酵素添加前に比べ、酵素添加後では吸光度が低下した。以上の結果より、水中では、会合体を形成しており、酵素添加後には会合体が減少あるいは消失していることが示された。
[実験結果]
白色固体
収量 68 mg (2steps ; 収率 56 %)
リガンドと19Fプローブを直接連結した含フッ素化合物 5のF−NMR測定を行った。プローブ濃度100 μM / 500 μL ( 50 mM DMSO stock)とした。溶媒は0.2 mM TFA入り50 mM HEPES buffer(pH 7.2)で、D2O を 50 μL (10%)添加した。酵素hCA 1濃度は50 μM / 500 μLとした。結果を図22に示す。酵素非存在下ではNMR オフ状態であり、酵素存在下ではピークが出現した。
酵素hCA共存下、非共存下での含フッ素化合物(プローブ 1)のF−MRI評価を行った。同時に1H−MRI評価も行った。測定条件は上記のF−NMR測定と同様とし、内部標準としてTFAを0.2 mM含む50 mM HEPES buffer(pH 7.2)にD2O(終濃度10%)
を添加したサンプルを用いた。結果を図23に示す。酵素hCA共存下、非共存下での含フッ素化合物の1HのMRI像と19FのMRI像を示している。1HのMRI像では、どちらの系でも水プロトン由来のシグナルが検出されている。この像からは酵素の在否を確認することはできない。一方、19FのMRI像では、含フッ素化合物のみの系ではシグナルが消失しており、酵素hCA共存下ではシグナルが明確に確認できた。これまでの結果同様に、酵素認識による19FのNMRシグナルのスイッチング挙動を観察することが出来た。この結果より、プローブ1はF−MRIのスイッチングプローブとして機能し、酵素を高いS/N比で検出することが可能であることが示された。
(実施例6−1:化合物6(Biotin-type 6)の合成)
[実験結果]
白色固体
収量 10 mg (2steps ; 収率 21 %)
リガンド部をビオチンとする化合物6(以下Biotin-type 6と略すことがある)の機能評価を行った。ビオチンはアビジンに対して非常に高い親和性を有しており、両者を混合すると速やかにビオチン−アビジン複合体が形成される。この相互作用を、Biotin-type 6とアビジンを用いてF−NMR測定により観察することを試みた。実験条件として、Biotin-type 6(濃度100 μM、500 μL (50 mM DMSO stock, 1 μL)とAvidin(濃度100 μM (ε(280nm) = 35,700 cm-1M-1 (モノマー単位) より濃度決定)を用いた。バッファーは50 mM HEPES buffer (pH 7.2, 0.2 mM TFA, 500 mM NaCl)を用い、D2Oを終濃度10%となるように添加した。
原子間力顕微鏡(AFM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、透過型電子顕微鏡(TEM)により、プローブ1からなる会合体を直接観察した。マイカ基板にプローブ1溶液 [25 μM、溶媒;50 mM HEPES buffer (pH 7.2, 0.2 mM TFA入り)]をスピンコート(1,500 rpm×15 sec)したあと、終夜真空乾燥してからAFM観察を行った(SEIKO SPA-400)。SEM観察では、シリコンウェハー基盤にプローブ1溶液[25 μM、溶媒;50 mM HEPES buffer (pH 7.2, 0.2 mM TFA入り)]をディッピングしたあと終夜真空乾燥し、白金蒸着してから観察した(JEOL JFC-1600)。TEM観察では、カーボン支持膜にプローブ1溶液[25 μM、溶媒;50 mM HEPES buffer (pH 7.2, 0.2 mM TFA入り)]をディッピングしたあと、終夜真空乾燥してから非染色で観察した(JEOL JEM-1025 (100 kV))。図26に結果を示す。図26(a)はTEM像を、図26(b)はAFM像を、図26(c)にはSEM像を示す。スケールバーは0.5 μmである。図からわかるように、200から500 nmの会合体が観察され、溶液中のDLSの結果と一致する。また、立体的な情報が得られるSEM、AFMの観察結果より、この会合体が球状様物体であることが明らかとなった。
プローブ1によるhCAのF−MRIならびに酵素阻害剤のcell-based assayを試みた。実験条件として、精製酵素を用いた系(以下in vitroと略すことがある)では、hCA I 濃度は100 μM / 1 mL、プローブ1濃度は200 μM (50 mM DMSO stockより)、阻害剤濃度は1 mM (プローブ1の5等量)で、測定は0.2mM TFA入り50mM HEPES buffer中で行った。今回、阻害剤として、6-ethoxybenzothiadiazole sulfonamide(EZA)、4-sulfamoylbenzoic acid(SBA)を用いた。赤血球中 ( 以下in RBC と略すことがある)での測定は、RBC (Red Blood Cell) は2.5 mL、プローブ1(濃度300 μM)を上清3mLに添加してピペッティング後に遠心(1,500rpm×5min)して上清除去し、1mM TFA入り50mM HEPES bufferを添加して測定した(TFA終濃度167 μM)。阻害実験では、阻害剤EZA, SBA(濃度1.5 mM (プローブ1の5等量))をプローブ1と共に上清に添加して、前述の方法と同様に上清除去し、1mM TFA入り50mM HEPES bufferを添加して測定した(TFA終濃度167 μM)。測定条件として、Bruker Biospec 70/20 USR (外部磁場;7T)を用い、共鳴周波数はH−MRIでは300 MHz、F−MRIでは282 MHz、F−NMR測定では2000回積算した。F−MRIでは、FOV = 32*8 cm, Matrix = 128*32, スライス選択無し(投影像)とし、精製酵素を用いたin vitroの系では Fast Spin Echo法、1200回積算(30min)、分解能1.25mm×1.25mmで行い、赤血球中 ( in RBC )測定ではGradient Echo法、400回積算(3.5h, F-probe部分) あるいは200回積算(TFA部分)で行った。
(実施例9−1:化合物7(HER2-type)の合成)
図28にF-probe 7の合成スキームを示した。文献(K. M. Shokat et al, Nat. Chem. Biol., 3, 229 (2007) )に従い、化合物7-6を合成した。以下、化合物7-7からF-probe 7の合成について説明する。
1-1. 化合物7-7の合成
50 mL二口ナスフラスコに化合物7-6 (220 mg, 0.056 mmol, 1eq)、無水塩化メチレン (5 mL)、無水ピリジン (129 μL, 1.6 mmol, 4eq)、p-トルエンスルホ
ニルクロリド (93 mg, 0.49 mmol, 1.2eq) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で2.5時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 20 : 1) にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去後、残査に酢酸エチル (200 mL) を加え、飽和クエン酸水溶液 (80 mL, 2回)、飽和食塩水 (80 mL, 2回)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(80 mL, 2回) で洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 40 : 1) による精製を行った。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して黄色発泡性固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
黄色発泡性固体
収量 214 mg (収率 75 %)
50 mL二口ナスフラスコに化合物7-7 (100 mg, 0.14 mmol, 1eq)、無水DMF (5 mL)、炭酸カリウム (58 mg, 0.42 mmol, 3eq)、3,5-Bis-trifluoromethyl phenol (64 mg, 0.28 mmol, 2eq) を加え、アルゴン雰囲気下、40℃で10時間攪拌した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 20 : 1) にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去し、残査に酢酸エチル (100 mL) を加え、飽和クエン酸水溶液 (50 mL, 2回)、飽和食塩水 (50 mL, 2回)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50 mL, 2回) で洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、カラムクロマトグラフィー (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 40 : 1) による精製を行った。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して黄色固体を得た。同定は1H-NMRにより行った。
[実験結果]
黄色固体
収量 80 mg (収率 76 %)
50 mLナスフラスコに化合物7-8 (80 mg, 0.11 mmol, 1eq)、エタノール (1.5 mL)、酢酸 (300 μL)、鉄粒子 (49 mg, 0.88 mmol, 8eq) を加え、80℃で1時間還流撹拌
した。TLC (SiO2 / CHCl3 : MeOH = 10 : 1) にて反応追跡を行い、原料の消失と目的化合物の生成を確認して反応を終了した。溶媒を減圧留去し、残査に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (50 mL) を加え、酢酸エチル (80 mL、3回) で抽出を行い、有機層を再度飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (50 mL, 3回) 、飽和食塩水 (50 mL, 1回) で洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去したあと、不純物を含む黄緑色油状物 (76 mg) を得た。
[実験結果]
黄色固体
収量 26 mg (2steps ; 収率 33 %)
F-probe 7のF-NMR測定を行った。F-probe 7の濃度は100 μM (50 mM DMSO
stockより調製)とした。溶媒として、バッファー水溶液(pH 7.2, 50 mM HEPES, no salt, 10% D2O) あるいは70% CD3OD(重エタノール)の2種類を用いて測定した。
結果を図29に示す。図29(a)にはF-probe 7の構造式を、図29(b)にはバッファー水溶液中のF-probe 7のF-NMRスペクトル、図29(c)には70% CD3OD(重エタノール)中のF-probe 7のF-NMRスペクトルを示す。図29(b)から、水中ではF-probe 7由来のピークは観測されなかった。一方、図29(c)が示すように、70% CD3OD(重エタノール)中ではF-probe 7由来のピークが観測された(-64.04 ppm)。以上の結果より、F-probe 7は水中で会合体を形成し、フッ素のNMRシグナルが消失しているが、会合体の崩壊によりフッ素のNMRシグナルが現れることが示された。
(実施例10−1:フッ素化合物A-3(Kiminami type)の合成)
1. A-1合成
図30に化合物8(以下c(RGDyK)-19F2と略す事がある)の合成スキームを示す。まずインテグリンリガンドであるc(RGDyK)ペプチドを通常のペプチド固相合成法に従って合成し、その後フッ素化合物A-3を縮合してc(RGDyK)-19F2を得た。
c(RGDyK)ペプチドの合成スキームを図31に示す。図32には、合成したc(RGDyK)ペプチド粗精製物のHPLCチャートを示す。分取後のMALDI-TOF-MS から20.68 min のピークがターゲットであるc(RGDyK)のピークであることがわかった(収率5.3%)。次に、図33に示すように、c(RGDyK)ペプチドにフッ素化合物A-3を結合してc(RGDyK)-19F2を得た。まず公知の手法に従い、フッ素化合物A-3のカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)でエステル化し、フッ素化合物A-3の活性化エステル体を得た。次いで、このフッ素化合物A-3の活性化エステル体(4.5 mM)とc(RGDyK)ペプチド(3 mM)を2%トリエチルアミンを含むDMSO(167μL)中で、室温18時間反応させることで、縮合させた。その後、蒸留水(333μL)を加え反応をクエンチした。反応物のMALDI-TOF-MSスペクトルを図34に示す。反応18時間後の縮合反応物において、ターゲットの質量ピーク(1268.21)が観測され、ターゲット生成を確認できた。また、図34から未反応c(RGDyK)の質量(620.32; [M+H]+)が観測されないことより、縮合反応は18 時間でほぼ終了していることがわかった。
化合物8(c(RGDyK)-19F2)のF−NMR測定(室温、積算1024回)を行った。化合物8の濃度は57.8 μM、溶媒はDMSO(88% DMSO, 2% H2O, 10% D2O)、あるいはPBSバッファー(7% DMSO, 83% PBS, 10% D2O)を用いた。内部標準としてTFA(100 μM)を添加した。結果を図36に示す。DMSO中では、化合物8由来のピーク(-63.4 ppm)が観測された。一方、PBS中ではこのピークは見られないことから、化合物8はPBS中で凝集体を形成する結果、F−NMRシグナルがオフになっているものと考えられる。
Claims (6)
- 式(1)で表される構造を有する含フッ素化合物。
- 前記L1が、下記式(2)、式(26)のいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の含フッ素化合物。
- 前記L2が、下記式(3)、式(4)、式(5)、式(6)、式(7)のいずれかから選ばれることを特徴とする請求項1または2に記載の含フッ素化合物。
- 前記Rfが、下記式(8)、式(25)のいずれかであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の含フッ素化合物。
- 前記Rlが下記式(10)、式(11)、式(12)、式(21)、式(23)、式(24)のいずれかから選ばれることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の含フッ素化合物。
- 核磁気共鳴法を利用した生体分子の検出方法であって、該生体分子と請求項1乃至5のいずれかに記載の含フッ素化合物とを接触させる工程と、接触の前後での該プローブに由来する19Fを検出核とするNMRシグナルの変化を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする生体分子の検出方法。
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