JP2010053111A - Gold fine particle and method for manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を側鎖にグラフトしたポリリジン（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）が吸着しているナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）とその用途に関する。 The present invention relates to nanosized rod-shaped gold fine particles (gold nanorods) adsorbed with polylysine (PLL-g-PEG) grafted with polyethylene glycol (PEG) on the side chain, and uses thereof.
本発明は、より具体的には、ＰＥＧのグラフト率を特定の割合に調整したポリリジンを吸着した金ナノロッドとその用途に関する。本発明の技術は、血液中での金ナノロッドの分散安定性を高める方法として有用であり、金ナノロッドを生体内へ投与しバイオマーカーとして利用できるため生体内の近赤外イメージングが可能である。 More specifically, the present invention relates to a gold nanorod adsorbed with polylysine in which the graft ratio of PEG is adjusted to a specific ratio and its use. The technique of the present invention is useful as a method for enhancing the dispersion stability of gold nanorods in blood. Since gold nanorods can be administered into a living body and used as a biomarker, in vivo near-infrared imaging is possible.
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。 When light is applied to metal fine particles dispersed in a solvent, a resonance absorption phenomenon called Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) occurs. The absorption wavelength is determined by the type and shape of the metal and the refractive index of the medium around the metal fine particles. For example, when spherical gold fine particles are dispersed in water, there is an absorption region around 530 nm, and if the shape of the gold fine particles is made into a rod shape (gold nanorod) with a short axis of about 10 nm, it is around 530 nm due to the short axis of the rod. In addition to absorption, it is known to have absorption on the long wavelength side caused by the long axis of the rod (Non-Patent Document 1).
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
These metal fine particle dispersions can be stably dispersed in a solvent without aggregation of the metal fine particles by adsorbing or binding to the surface of the metal fine particles using a low molecular compound or a polymer compound as a protective agent. In particular, gold nanorods are unique gold fine particles whose spectroscopic properties change depending on changes in shape, changes in the state of aggregation, and the environment around the gold nanorods (
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
Gold nanorods are rod-shaped nano-sized gold fine particles having an aspect ratio (major axis length / minor axis length) of more than 1, for example, quaternary ammonium salt hexadecyltrimethylammonium that is a cationic surfactant. Synthesized in water dissolved in bromide (CTAB), it is possible to synthesize gold ions in CTAB aqueous solution by chemical reduction, electroreduction, photoreduction, etc. The synthesized gold nanorods are stable in water by the protective action of CTAB (
近年、窒素や硫黄を吸着基とする分散剤を、水中で合成した金ナノロッドに表面処理して有機溶媒中へ安定に抽出させる方法が報告されている（特許文献５、６）。また、保護鎖としてＰＥＧを共有結合したポリリジン骨格中のアミノ基に近赤外域（６５０〜１３００ｎｍ）に吸収を有する蛍光色素を共有結合させた近赤外蛍光プローブを用いた生体内の近赤外イメージング技術が報告されている（特許文献７）。
In recent years, a method has been reported in which a dispersant containing nitrogen or sulfur as an adsorption group is surface-treated on a gold nanorod synthesized in water and stably extracted into an organic solvent (
さらに、α−メトキシ−ω−メルカプトＰＥＧを修飾した金ナノロッドをバイオマーカーとしてマウスに注入し、一定時間経過後に血中や各器官を分別採取しそれぞれの部位における金ナノロッドの濃度を測定することで、ＰＥＧ修飾した金ナノロッドの血液中での分散安定性を報告している（非特許文献５）。また、ＣＴＡＢを除去しつつ、フォスファチジルコリン（ＰＣ）を金ナノロッドへ吸着させ、ＣＴＡＢの細胞毒性を低減させる方法が報告されており、ＣＴＡＢの低減とＰＣの吸着をゼータ電位の変化として測定している（非特許文献６）。また、様々なグラフト率のＰＥＧのポリリジンが報告されている（非特許文献７）。
特許文献１〜４などに記載されている方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆されて水中に分散しているが、ＣＴＡＢは高い細胞毒性を示すため、血液中への投与などの生体内への適用はできない。特許文献５〜６に記載されている方法では、窒素や硫黄で吸着する分散剤を用いて有機溶媒に金ナノロッドを安定に分散させることが可能であるが、血液中での分散安定性は検討されていない。特許文献７に記載されているものは、蛍光色素による生体内の近赤外イメージングを目的とした蛍光プローブであるが、蛍光色素をバイオマーカーに使用した場合は、得られる光信号の定量性に欠けており、再現性の得られる測定結果が得られない。
Gold nanorods synthesized by the methods described in
非特許文献５には、ＰＥＧ修飾による金ナノロッドは血液中で分散安定性が高まることが報告されているが、ＰＥＧ鎖中に反応性の官能基がないため、他の化合物と反応させることはできない。非特許文献６には、ＣＴＡＢを低減してＰＣで修飾した金ナノロッドは細胞毒性を低減することが報告されているが、血液中の分散安定性を高めたものではなく、ゼータ電位はＣＴＡＢの除去割合を指標として数値化したものである。
Non-Patent
本発明は、金ナノロッドについて、従来の上記技術では知られていない新規技術を提供する。具体的には、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを吸着させることによって血液中での分散安定性を高めた、生体に対して安全な金ナノロッドとその用途を提供する。 The present invention provides a novel technique for gold nanorods that is not known from the above-described conventional techniques. Specifically, the present invention provides a gold nanorod safe for a living body and its use, which has improved dispersion stability in blood by adsorbing PLL-g-PEG.
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子とその用途に関する。
〔１〕ポリエチレングリコールを側鎖にグラフトしたポリリジンが吸着していることを特徴とするロッド形状の金微粒子。
〔２〕数平均分子量５００〜５００００のポリエチレングリコールを側鎖にグラフトした数平均分子量１０００〜３０００００のポリリジンが吸着していることを特徴とする上記〔１〕に記載する金微粒子。
〔３〕ポリエチレングリコールのグラフト率が１０〜５０mol％のポリリジンが吸着していることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載する金微粒子。
〔４〕金１mmolに対しポリエチレングリコールを側鎖にグラフトしたポリリジンが含有するアミノ基のモル数として０.０５mmol以上吸着していることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕に記載する金微粒子。
〔５〕金微粒子を水中に分散した分散液のゼータ電位が＋２５ｍＶ以下であることを特徴とする請求項〔１〕〜〔４〕の何れかに記載する金微粒子。
〔６〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である請求項〔１〕〜〔５〕何れかに記載する金微粒子。
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕に記載する金微粒子に吸着しているポリエチレングリコールを側鎖にグラフトしたポリリジンが含有するアミノ基に、コハク酸無水物を反応させてカルボキシル基を付加することを特徴とする金微粒子。
〔８〕請求項〔１〕〜〔６〕に記載する金微粒子に吸着しているポリエチレングリコールを側鎖にグラフトしたポリリジンが含有するアミノ基に、無水酢酸を反応させてアセチル基を付加することを特徴とする金微粒子。
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕の金微粒子をバイオマーカーとして使用した生体内の近赤外イメージング。
The present invention relates to gold fine particles having the following configuration and uses thereof.
[1] Rod-shaped gold fine particles characterized by adsorbing polylysine grafted with polyethylene glycol on side chains.
[2] The gold fine particles as described in [1] above, wherein polylysine having a number average molecular weight of 1000 to 300,000 grafted with polyethylene glycol having a number average molecular weight of 500 to 50,000 is adsorbed on a side chain.
[3] The gold fine particles according to any one of
[4] Gold as described in [1] to [3] above, wherein 0.05 mmol or more is adsorbed as 1 mol of amino group contained in polylysine grafted with polyethylene glycol on the side chain to 1 mmol of gold. Fine particles.
[5] The gold fine particles according to any one of [1] to [4], wherein the dispersion of gold fine particles dispersed in water has a zeta potential of +25 mV or less.
[6] The long axis length is less than 400 nm, the aspect ratio is larger than 1, and the maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance is in the range of 700 to 2000 nm. Gold fine particles.
[7] Add a carboxyl group by reacting succinic anhydride with the amino group contained in polylysine grafted with polyethylene glycol adsorbed on the gold fine particles described in [1] to [6] above in the side chain. Gold fine particles characterized by that.
[8] Adding an acetyl group by reacting acetic anhydride with an amino group contained in polylysine grafted with polyethylene glycol adsorbed on the gold fine particles according to claims [1] to [6]. Gold fine particles characterized by
[9] Near-infrared imaging in vivo using the gold microparticles of [1] to [8] as a biomarker.
本発明の金ナノロッドは、ＰＥＧのグラフト率を１０〜５０mol％に調整したポリリジンを吸着させることで、金ナノロッドの血液中での分散安定性を高めることができる。また、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧはアミノ基を有しており、金表面との吸着点として機能するばかりでなく、他の化合物を反応させることが可能である。 The gold nanorods of the present invention can increase the dispersion stability of gold nanorods in blood by adsorbing polylysine having a PEG grafting ratio adjusted to 10 to 50 mol%. Moreover, PLL-g-PEG has an amino group, and not only functions as an adsorption point with the gold surface but also allows other compounds to react.
さらに、本発明の金ナノロッドは、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドを用いており、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを吸着させた金ナノロッドを生体内へ投与し、生体内の近赤外イメージング技術を構築することが可能である。 Furthermore, the gold nanorod of the present invention uses a gold nanorod having a maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance in the range of 700 to 2000 nm, and administers the gold nanorod adsorbed with PLL-g-PEG into the living body. It is possible to construct in-vivo near-infrared imaging technology.
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。また、本発明明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの凝集に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。ＰＥＧのグラフト率とは、ポリリジンの側鎖アミンに結合したＰＥＧ鎖の割合〔結合したＰＥＧ量／側鎖アミン量〕を意味する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on embodiments. The concentration% is mass% unless otherwise indicated. In addition, the change in the absorption spectrum in the present invention means a decrease in the absorbance at the maximum absorption wavelength of LSPR and a change in the absorption spectrum shape accompanying the aggregation of gold nanorods. The graft ratio of PEG means the ratio of the PEG chain bonded to the side chain amine of polylysine [the amount of PEG bonded / the amount of side chain amine].
本発明の金ナノロッドは、ＰＥＧを側鎖にグラフトしたポリリジン（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）が吸着していることを特徴とする金微粒子である。ＰＥＧは様々なグラフト率でＰＬＬに結合しており、好ましくは、このＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧは特定の割合で金ナノロッドに吸着されている。 The gold nanorod of the present invention is a gold fine particle characterized by adsorbing polylysine (PLL-g-PEG) grafted with PEG on the side chain. PEG is bound to the PLL at various graft ratios, and preferably this PLL-g-PEG is adsorbed to the gold nanorods at a specific rate.
本発明の生体内の近赤外イメージングは、上記金ナノロッドの近赤外吸収特性とポリリジンの血液中での分散安定性をバイオマーカーとして利用したものである。 In vivo near-infrared imaging of the present invention utilizes the near-infrared absorption characteristics of the gold nanorods and the dispersion stability of polylysine in blood as biomarkers.
本発明で用いるＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧは、非特許文献７で報告されている合成法で合成されたポリリジンを使用することができる。本発明で用いるＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧについて、ＰＥＧのグラフト率は１０〜５０mol％が適当であり、１５〜４０mol％が好ましい。ＰＥＧのグラフト率が１０mol％より小さい場合、血液中での分散安定性が悪くなり、金ナノロッドが凝集を起こす可能性が高くなる。また、ＰＥＧのグラフト率が５０mol％より大きい場合、ＰＥＧの立体障害により、金ナノロッドへの吸着性が悪くなる。
As the PLL-g-PEG used in the present invention, polylysine synthesized by the synthesis method reported in
ポリリジンへグラフトするＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）は、５００〜５００００以下が適当であり、Ｍｎ１０００〜２００００が好ましい。Ｍｎ５００００より大きい場合、血液中での分散安定性に変化ないため、コスト的に不利となる。また、ＰＥＧのＭｎ５００より小さい場合、血液中での分散安定性が悪くなり、金ナノロッドが凝集を起こす可能性が高くなる。
The number average molecular weight (Mn) of PEG grafted onto polylysine is suitably 500 to 50,000 or less, and preferably
ＰＥＧをグラフトするポリリジンのＭｎは１０００〜３０００００が適当であり、Ｍｎ５０００〜１０００００が好ましい。Ｍｎ３０００００より大きい場合、金ナノロッドへ吸着するアミノ基は充分に存在するためコスト的に不利である。また、Ｍｎ１０００より小さい場合、アミノ基の数が不足し、金ナノロッドへの吸着が不安定となり、脱離傾向が高まり、金ナノロッドが凝集を起こす可能性が高くなる
本発明で使用する金ナノロッドは、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこれより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
The Mn of polylysine grafted with PEG is suitably 1000 to 300,000, preferably Mn 5,000 to 100,000. When Mn is larger than 300,000, amino groups adsorbed on the gold nanorods are sufficiently present, which is disadvantageous in cost. In addition, when it is smaller than Mn1000, the number of amino groups is insufficient, the adsorption to the gold nanorods becomes unstable, the tendency to desorb is increased, and the gold nanorods are likely to aggregate. The gold nanorods used in the present invention are Rod-shaped gold fine particles having a major axis length of less than 400 nm and an aspect ratio of greater than 1 are preferred. Specifically, gold nanorods having an aspect ratio in which the maximum absorption wavelength of LSPR is in the range of 700 to 2000 nm are suitable. The major axis length of the gold nanorod is more preferably 200 nm or less. If the long axis length is longer than this, the gold nanorods tend to settle, and the dispersion stability in the dispersion medium is lost.
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
Gold nanorods can be synthesized by reducing gold ions in an aqueous solution in which a quaternary ammonium salt represented by the following formula [I] is dissolved. For example, by using n = 15 hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), gold nanorods with CTAB adsorbed on the surface can be obtained. This gold nanorod is stably dispersed in water with CTAB adsorbed.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
ＣＴＡＢは高い細胞毒性を示し、血液中への投与といった生体内への適用はできないため、上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。 Since CTAB exhibits high cytotoxicity and cannot be applied to the living body such as administration into blood, the above-mentioned gold nanorod aqueous dispersion may be used after removing excess surfactant CTAB present in water. Specifically, the gold nanorod aqueous dispersion is centrifuged to settle the gold nanorod on the bottom of the centrifuge tube, and the supernatant containing CTAB is removed. The precipitated gold nanorods are redispersed by adding water. Excess CTAB can be removed by repeating this operation 1-3 times. If CTAB is removed excessively, the gold nanorods aggregate and do not re-disperse in water.
金ナノロッドにＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを吸着させる方法としては、余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッドの水分散液に、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを溶解した水溶液を添加して混合すればよく、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧのアミノ基が金表面へ多点吸着して、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧが吸着した金ナノロッドが得られる。ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの混合割合は、金１mmolに対し、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの含有するアミノ基のモル数として０.０５mol以上が適当である。ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの添加割合がそれより少ないとＰＥＧの相対量が少なくなるため、血液中でも金ナノロッドの分散安定性が悪くなり、凝集を起こす傾向が高くなる。 As a method for adsorbing PLL-g-PEG to gold nanorods, an aqueous solution in which PLL-g-PEG is dissolved may be added to and mixed with an aqueous dispersion of gold nanorods from which excess CTAB has been removed. -Amino groups of PEG are adsorbed on the gold surface at multiple points, and gold nanorods adsorbed with PLL-g-PEG are obtained. The mixing ratio of PLL-g-PEG is suitably 0.05 mol or more as the number of moles of amino groups contained in PLL-g-PEG with respect to 1 mmol of gold. When the addition ratio of PLL-g-PEG is less than that, the relative amount of PEG decreases, so that the dispersion stability of gold nanorods deteriorates in blood and the tendency to cause aggregation increases.
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧが吸着した金ナノロッドは、ＰＥＧのグラフト率が異なるＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを用いることによって表面電荷（ゼータ電位）を調整することができる。 Gold nanorods adsorbed with PLL-g-PEG can be adjusted in surface charge (zeta potential) by using PLL-g-PEG having a different grafting ratio of PEG.
様々なグラフト率のＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧは、相対的に金ナノロッド表面のアミノ基の密度が変化するため、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを金ナノロッドに吸着させた場合、ゼータ電位を調整することができる。具体的には、ＰＥＧのグラフト率が高いＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを金ナノロッドに吸着するとゼータ電位は低くなり、ＰＥＧのグラフト率が低いＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを金ナノロッドに吸着するとゼータ電位は高くなる。 Since PLL-g-PEG with various graft ratios relatively changes the density of amino groups on the surface of the gold nanorod, the zeta potential can be adjusted when PLL-g-PEG is adsorbed on the gold nanorod. . Specifically, zeta potential decreases when PLL-g-PEG having a high PEG graft ratio is adsorbed on gold nanorods, and zeta potential increases when PLL-g-PEG having a low PEG graft ratio is adsorbed on gold nanorods. .
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを吸着させた金ナノロッドのゼータ電位は、＋２５ｍＶ以下が適当であり、＋２０ｍＶ以下が好ましい。ゼータ電位が＋２５ｍＶより大きい場合、血液中での分散安定性が悪くなり、凝集を起こす傾向が高くなる。 The zeta potential of the gold nanorod on which PLL-g-PEG is adsorbed is suitably +25 mV or less, preferably +20 mV or less. When the zeta potential is larger than +25 mV, the dispersion stability in blood is deteriorated and the tendency to cause aggregation is increased.
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ中のアミノ基は、他の化合物と反応させることができる。例えば、カルボン酸やカルボン酸無水物と反応させて金ナノロッドのゼータ電位を低くすることができる。なお、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ中のアミノ基と反応させる化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）など、アミノ基と反応する官能基を有する化合物であれば、制限なく使用することができる。 The amino group in PLL-g-PEG can be reacted with other compounds. For example, the zeta potential of the gold nanorod can be lowered by reacting with carboxylic acid or carboxylic anhydride. In addition, if the compound made to react with the amino group in PLL-g-PEG has a functional group which reacts with an amino group, such as N-hydroxysuccinimide ester (NHS), it can be used without a restriction | limiting.
本発明は、（イ）ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ中のアミノ基にコハク酸無水物を反応させてカルボキシル基を付加することによってゼータ電位を変化させたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ吸着金ナノロッド、（ロ）ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ中のアミノ基に無水酢酸を反応させてアセチル基を付加（アセチル化）することによってゼータ電位を変化させたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ吸着金ナノロッドなどを含む。 The present invention relates to (a) a PLL-g-PEG-adsorbed gold nanorod whose zeta potential is changed by reacting a succinic anhydride with an amino group in PLL-g-PEG to add a carboxyl group, Examples include PLL-g-PEG adsorbed gold nanorods in which the zeta potential is changed by reacting an amino group in PLL-g-PEG with acetic anhydride to add an acetyl group (acetylation).
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、血液中で安定に分散するため、バイオマーカーとして使用できる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステムなどを構築することができる。 The gold nanorod used in the present invention has an LSPR absorption peak at 700 to 2000 nm and is stably dispersed in blood, and thus can be used as a biomarker. In particular, near-infrared light with a wavelength of 800 nm to 1200 nm is less affected by water absorption (Near Infrared Window) and is a safe wavelength range for the living body. By irradiating near-infrared light from outside the living body, It is possible to measure changes in spectral characteristics depending on the dispersion state or aggregation state of the administered gold nanorods, and it is possible to construct a near-infrared light analysis system, a bioimaging system, or the like.
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、参考例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. Reference examples are also shown. The following examples measure the absorption wavelength shift of LSPR mainly in the wavelength region near 900 nm of gold nanorods, but also in the wavelength region from 700 to 2000 nm by changing the aspect ratio of gold nanorods. A similar shift in absorption wavelength can be measured.
分光特性は日本分光株式会社製測定機（V-670）を用いて測定した。ゼータ電位はMalverne社製測定器（Zeta-sizer Nano―ZS）を用いて測定した。ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧは非特許文献７の合成方法を用いて合成した。
Spectral characteristics were measured using a measuring instrument (V-670) manufactured by JASCO Corporation. The zeta potential was measured using a measuring device (Zeta-sizer Nano-ZS) manufactured by Malverne. PLL-g-PEG was synthesized using the synthesis method of
〔ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの合成〕
非特許文献７の合成法に従い、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを合成した（図１、合成スキーム）。原料に、Ｍｎ２８０００のポリリジン、Ｍｎ５０００のＰＥＧを使用して、以下のＰＥＧのグラフト率が異なる２種のＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧを得た。
（イ）ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１：グラフト率３６mol％、Ｍｎ３１３０００
（ロ）ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−２：グラフト率５mol％、Ｍｎ９６０００
[Synthesis of PLL-g-PEG]
In accordance with the synthesis method of
(A) PLL-g-PEG-1: Graft rate 36 mol%, Mn 313000
(B) PLL-g-PEG-2:
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００ｍＭのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液を得た（ＮＲｓ水分散液、金１mmol/Ｌ）。
[Preparation of gold nanorod aqueous dispersion]
A gold nanorod aqueous dispersion synthesized in a 400 mM CTAB aqueous solution is placed in a centrifuge tube and centrifuged at 14000 (× g) relative centrifugal acceleration (centrifugal acceleration divided by the gravitational acceleration of the earth) for 10 minutes. Nanorods were allowed to settle to the bottom of the centrifuge tube. The supernatant liquid was put into another centrifuge tube, and the settled gold nanorods were redispersed with water. The supernatant in another centrifuge tube was centrifuged again at 14,000 (× g) for 10 minutes to settle the gold nanorods, and the supernatant was removed to remove excess CTAB. The precipitated gold nanorods were redispersed with water, and combined with the previous redispersion liquid to obtain a gold nanorod aqueous dispersion (NRs aqueous dispersion,
〔実施例１〕
ＮＲｓ水分散液にＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１水溶液を、金と含有するアミノ基のモル比が１：０.１となるように添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、２日間透析して余剰のＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１を除去した。得られたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１が吸着した金ナノロッド（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１）水分散液は、ゼータ電位が＋１７.５ｍＶであり、処理前の分光特性から変化なく、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１の吸着により金ナノロッドは安定に分散した（図２）。
[Example 1]
A PLL-g-PEG-1 aqueous solution was added to the NRs aqueous dispersion so that the molar ratio of gold to the amino group contained was 1: 0.1, and the mixture was stirred for 24 hours with a vortex mixer. After the stirring, the excess PLL-g-PEG-1 was removed by dialysis for 2 days. The obtained gold nanorod (PLL-g-PEG-NRs-1) aqueous dispersion on which PLL-g-PEG-1 was adsorbed had a zeta potential of +17.5 mV and remained unchanged from the spectral characteristics before treatment. The gold nanorods were stably dispersed by the adsorption of -g-PEG-1.
〔実施例２〕
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１を、水、及び１０％血清中で分散した状態で７日間保管し、波長８９０ｎｍの吸光度の変化を確認した結果、顕著な変化は確認されず、水、及び血清中で安定に分散可能であった（図３（水）、図４（血清））。
[Example 2]
PLL-g-PEG-NRs-1 was stored for 7 days in a state dispersed in water and 10% serum, and as a result of confirming a change in absorbance at a wavelength of 890 nm, no significant change was confirmed. It was stably dispersible in serum (FIG. 3 (water), FIG. 4 (serum)).
〔実施例３〕
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液を、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し、水、及びｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で再分散し、波長８９０ｎｍの吸光度の変化を確認したところ、遠心分離操作前後で顕著な分光特性変化は確認されず安定に分散可能であった（図５）。
Example 3
The PLL-g-PEG-NRs-1 aqueous dispersion is centrifuged for 10 minutes at a relative centrifugal acceleration of 5000 (× g), redispersed with water and phosphate buffer (PBS) pH 7.4, When the change in absorbance at 890 nm was confirmed, no significant change in spectral characteristics was observed before and after the centrifugation operation, and the dispersion was stably dispersible (FIG. 5).
〔実施例４〕
マウスから採血した血液中にＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１を分散し、室温に１時間静置した後、２０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し血球細胞を除き、分光特性を測定した結果、顕著な変化は確認されず、血液中で安定に分散可能であった（図６）。
Example 4
PLL-g-PEG-NRs-1 is dispersed in blood collected from a mouse and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 2000 (× g) for 10 minutes to remove blood cells, and spectroscopy. As a result of measuring the characteristics, no significant change was confirmed, and it was possible to stably disperse in the blood (FIG. 6).
〔実施例５〕
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液を、３０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し水に再分散した。得られたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液に、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したコハク酸無水物とトリエチルアミンをＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１の含有するアミノ基のモル数と同モル数になるようそれぞれ加え、２時間静置した。この溶液を３０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のコハク酸無水物とトリエチルアミンを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させてゼータ電位を測定したところ、反応前の＋１７.５ｍＶから−１４.４ｍＶに変化しており、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１中のアミノ基とコハク酸無水物が反応して表面電荷が変化したことを確認した。
Example 5
The PLL-g-PEG-NRs-1 aqueous dispersion was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 3000 (× g) for 10 minutes and redispersed in water. In the obtained PLL-g-PEG-NRs-1 aqueous dispersion, succinic anhydride and triethylamine dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) were added in moles of amino group containing PLL-g-PEG-1. Each was added so as to have the same number of moles as the number, and allowed to stand for 2 hours. This solution was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 3000 (× g) for 10 minutes to precipitate gold nanorods, and the supernatant was removed to remove excess succinic anhydride and triethylamine. When the precipitated gold nanorods were redispersed with water and the zeta potential was measured, it was changed from +17.5 mV before the reaction to -14.4 mV, and the amino group in PLL-g-PEG-NRs-1 and succinic acid were changed. It was confirmed that the surface charge was changed by the reaction of the acid anhydride.
〔実施例６〕
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液を、３０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し水に再分散した。得られたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液に、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した無水酢酸とトリエチルアミンをＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１の含有するアミノ基のモル数と同モル数になるようそれぞれ加え、２時間静置した。この溶液を３０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のコハク酸無水物とトリエチルアミンを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させてゼータ電位を測定したところ、反応前の＋１７.５ｍＶから−１１.４ｍＶに変化しており、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−１中のアミノ基と無水酢酸が反応してアセチル化され、表面電荷が変化したことを確認した。
Example 6
The PLL-g-PEG-NRs-1 aqueous dispersion was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 3000 (× g) for 10 minutes and redispersed in water. In the obtained PLL-g-PEG-NRs-1 aqueous dispersion, acetic anhydride and triethylamine dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) were added to the number of moles of amino groups contained in PLL-g-PEG-1. Each was added to the same number of moles and allowed to stand for 2 hours. This solution was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 3000 (× g) for 10 minutes to precipitate gold nanorods, and the supernatant was removed to remove excess succinic anhydride and triethylamine. The precipitated gold nanorods were redispersed with water and the zeta potential was measured. As a result, the gold nanorods changed from +17.5 mV before the reaction to -11.4 mV, and the amino groups in PLL-g-PEG-NRs-1 and anhydrous It was confirmed that acetic acid reacted and was acetylated to change the surface charge.
〔参考例１〕
ＮＲｓ水分散液にＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１水溶液を、金と含有するアミノ基のモル比が１：０.０１となるように添加する以外は実施例１と同様にして、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−１が吸着した金ナノロッド（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−２）水分散液を得た。得られた水分散液は、処理前の分光特性から大きく変化し、金ナノロッドは安定に分散しなかった（図２）。得られたＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−２を、水、及び１０％血清中に７日間保管した結果、分光特性の変化が確認され、水、及び血清中で安定に分散しなかった（図３（水）、図４（血清））。
[Reference Example 1]
In the same manner as in Example 1, except that an aqueous PLL-g-PEG-1 solution was added to the NRs aqueous dispersion so that the molar ratio of the amino group containing gold was 1: 0.01, PLL-g- A gold nanorod (PLL-g-PEG-NRs-2) aqueous dispersion in which PEG-1 was adsorbed was obtained. The obtained aqueous dispersion greatly changed from the spectral characteristics before the treatment, and the gold nanorods were not stably dispersed (FIG. 2). As a result of storing the obtained PLL-g-PEG-NRs-2 in water and 10% serum for 7 days, a change in spectral characteristics was confirmed, and it was not stably dispersed in water and serum (Fig. 3 (water), FIG. 4 (serum)).
〔参考例２〕
ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−２を使用する以外は実施例１と同様にしてＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−２が吸着した金ナノロッド（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−３）水分散液を得た。得られた水分散液は、ゼータ電位が＋３１.２ｍＶであり、処理前の分光特性から変化なく、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−２の吸着により金ナノロッドは安定に分散した（図２）。また、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−３を、水、及び１０％血清中で分散した状態で７日間保管し、波長８９０ｎｍの吸光度の変化を確認した結果、顕著な変化は確認されず、水、及び血清中で安定に分散可能であった（図３（水）、図４（血清））。このＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−３水分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し、水、及びｐＨ７.４のＰＢＳで再分散し、波長８９０ｎｍの吸光度の変化を確認したところ変化が確認され、特にＰＢＳに再分散した場合、顕著な変化が確認された（図５）。さらに、マウスから採血した血液中にＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ−ＮＲｓ−３を分散し、室温に１時間静置した後、２０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し血球細胞を除き、分光特性を測定した結果、吸光度の低下が確認され血液中で安定に分散しなかった（図６）。
[Reference Example 2]
A gold nanorod (PLL-g-PEG-NRs-3) aqueous dispersion adsorbed with PLL-g-PEG-2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that PLL-g-PEG-2 was used. The obtained aqueous dispersion had a zeta potential of +31.2 mV, and the gold nanorods were stably dispersed by the adsorption of PLL-g-PEG-2 without change from the spectral characteristics before the treatment (FIG. 2). In addition, PLL-g-PEG-NRs-3 was stored for 7 days in a state dispersed in water and 10% serum, and as a result of confirming a change in absorbance at a wavelength of 890 nm, no significant change was confirmed. And stably dispersible in serum (FIG. 3 (water), FIG. 4 (serum)). This PLL-g-PEG-NRs-3 aqueous dispersion was centrifuged for 10 minutes at a relative centrifugal acceleration of 5000 (× g), redispersed with water and PBS of pH 7.4, and the change in absorbance at a wavelength of 890 nm was observed. When confirmed, a change was confirmed, particularly when redispersed in PBS (FIG. 5). Furthermore, PLL-g-PEG-NRs-3 is dispersed in the blood collected from the mouse, left to stand at room temperature for 1 hour, and then centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 2000 (× g) for 10 minutes to remove blood cells. As a result of measuring the spectral characteristics, a decrease in absorbance was confirmed, and the dispersion was not stably dispersed in blood (FIG. 6).
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