JP2010039374A - Confocal scanning type microscope device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、液侵対物レンズを用いた共焦点顕微鏡技術に関する。 The present invention relates to a confocal microscope technique using an immersion objective lens.
生物標本の観察ツールの１つとして共焦点走査型顕微鏡がある。
生物標本の観察に用いられる共焦点走査型顕微鏡は、一般に、レーザ光源より射出された励起光を対物レンズの焦点位置に配置された標本に照射し、標本から生じた蛍光を光検出器により検出することで標本を観察する。この際、焦点位置と共役な位置に設けられたピンホールにより焦点位置からずれた位置から生じる光は遮断される。このため、共焦点走査型顕微鏡は、標本中の焦点位置以外の部位からの光が重畳して像がぼやけてしまうことがなく、コントラストのよい画像が得られるという特徴がある。
One of biological specimen observation tools is a confocal scanning microscope.
In general, a confocal scanning microscope used for observing a biological specimen irradiates a specimen placed at the focal position of an objective lens with excitation light emitted from a laser light source, and detects the fluorescence generated from the specimen with a photodetector. To observe the specimen. At this time, light generated from a position shifted from the focal position is blocked by a pinhole provided at a position conjugate with the focal position. For this reason, the confocal scanning microscope is characterized in that an image with good contrast can be obtained without superimposing light from a part other than the focal position in the specimen and blurring the image.
このような共焦点走査型顕微鏡では、焦点位置への高い集光性能と高い解像度が必要とされるため、対物レンズと標本の間を、例えば、水や油などの液体（以降、液浸と称する。）で満たした液浸対物レンズが用いられることも少なくない。 Such a confocal scanning microscope requires high focusing performance and high resolution at the focal position, and therefore, between the objective lens and the specimen, for example, a liquid such as water or oil (hereinafter referred to as immersion) In many cases, an immersion objective lens filled with the above is used.
液浸対物レンズを用いた共焦点走査型顕微鏡で標本を観察する場合、液浸が十分に満たされている状態を前提としているため、液浸が満たされていない状態、または、液浸が十分に満たされていない状態では、光が正常に標本に集光せず、共焦点走査型顕微鏡本来の性能が損なわれてしまう。このような不適切な状態はさまざまな要因により発生しうる。例えば、標本を走査するためのステージや対物レンズの移動による液浸の飛散や、標本の経時変化を見るための長期間にわたるタイムラプス観察における液浸の蒸発などがある。 When observing a specimen with a confocal scanning microscope using an immersion objective lens, it is assumed that the immersion is sufficiently satisfied. Therefore, the immersion is not satisfied or the immersion is sufficient. If the condition is not satisfied, light is not normally collected on the specimen, and the original performance of the confocal scanning microscope is impaired. Such an inappropriate state can occur due to various factors. For example, there are scattering of immersion due to movement of a stage for scanning a specimen and an objective lens, and evaporation of immersion in time-lapse observation over a long period of time to observe a change of the specimen over time.
このような技術的な課題を解決するため、標本で反射した励起光の強度を検出し液浸の有無を判定する技術が特許文献１で開示されている。
ところで、特許文献１で開示された技術では、蛍光とは別の経路に反射された励起光を観測することにより液浸の有無を判定する。このため、蛍光観察用とは別の励起光観測用の光検出器が必要となり、システムが過度に複雑化するといった課題がある。また、液浸の有無を判定するための励起光は、蛍光と異なりピンホールを介さずに光検出器に到達することになるため、ピンホールを介した場合のような高精度な光の検出が困難である。
By the way, in the technique disclosed in
このような課題を踏まえ、過度にシステムを複雑化することなく、高精度に液浸の有無を判定する技術が必要とされている。
以上を踏まえ、本発明の目的は、過度にシステムの複雑化を伴うことなく、液浸の有無を高精度に検出する技術を提供することにある。
Based on such problems, there is a need for a technique for determining the presence or absence of immersion with high accuracy without excessively complicating the system.
Based on the above, an object of the present invention is to provide a technique for detecting the presence or absence of liquid immersion with high accuracy without excessively complicating the system.
本発明の第１の態様は、光源と、標本を保持する標本保持部材と、光源から射出される光を標本に集光する対物レンズと、対物レンズにより集光された集光光を標本面上で走査する第１の走査手段と、集光光の集光位置と共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、標本から射出される蛍光と標本保持部材の表面で反射した反射光とを共焦点ピンホールを介して検出する光検出器と、光検出器による反射光の検出結果に基づいて、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する制御装置と、を具備する共焦点走査型顕微鏡装置を提供する。 According to a first aspect of the present invention, a light source, a sample holding member that holds a sample, an objective lens that collects light emitted from the light source onto the sample, and the condensed light collected by the objective lens on the sample surface A first scanning means that scans above, a confocal pinhole disposed at a position conjugate with a condensing position of the condensed light, fluorescence emitted from the specimen, and reflected light reflected from the surface of the specimen holding member; For detecting whether the liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member based on the detection result of the reflected light by the photodetector And a confocal scanning microscope apparatus comprising the apparatus.
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、第１の走査手段は、ガルバノミラーである共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第３の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、表面は、標本と標本保持部材との境界面である共焦点走査型顕微鏡装置である。
A second aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, wherein the first scanning means is a galvano mirror.
A third aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, wherein the surface is a boundary surface between the specimen and the specimen holding member.
本発明の第４の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、表面は、標本保持部材の対物レンズ側の表面である共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第５の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、光軸方向に集光光を走査する第２の走査手段を備え、検出結果は、第２の走査手段により集光光を走査して取得した、集光位置と光検出器で検出される反射光の強度との関係を示すＩ−Ｚプロファイルであり、制御装置は、基準となるＩ−Ｚプロファイルと現在のＩ−Ｚプロファイルとの比較結果により、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。
A fourth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, wherein the surface is a surface of the specimen holding member on the objective lens side.
A fifth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, further comprising second scanning means for scanning the condensed light in the optical axis direction, and the detection result is the second This is an I-Z profile obtained by scanning the collected light with the scanning means and showing the relationship between the condensed position and the intensity of the reflected light detected by the photodetector. This is a confocal scanning microscope apparatus that determines whether a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member based on a comparison result between the Z profile and the current I-Z profile.
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、比較結果は、基準となるＩ−Ｚプロファイルの半値幅に対する撮影前のＩ−Ｚプロファイルの半値幅の増加率であり、増加率が一定値以上の場合に対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされていないと判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。 According to a sixth aspect of the present invention, in the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, the comparison result is the half width of the IZ profile before photographing with respect to the half width of the reference IZ profile. This is a confocal scanning microscope apparatus that determines that the liquid is not filled between the objective lens and the specimen holding member when the increase rate is a certain value or more.
本発明の第７の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、基準となるＩ−Ｚプロファイルは、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始時に取得される共焦点走査型顕微鏡装置である。 According to a seventh aspect of the present invention, in the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, the reference IZ profile is a state in which a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member. This is a confocal scanning microscope apparatus acquired at the start of observation.
本発明の第８の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、基準となるＩ−Ｚプロファイルは、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始前に予め取得されたＩ−Ｚプロファイルである共焦点走査型顕微鏡装置である。 According to an eighth aspect of the present invention, in the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, the reference IZ profile is a state in which a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member. This is a confocal scanning microscope apparatus that is an IZ profile obtained in advance before observation.
本発明の第９の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、第２の走査手段は、光軸方向に駆動される対物レンズである共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第１０の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、標本を配置するステージを備え、第２の走査手段は、光軸方向に駆動されるステージである共焦点走査型顕微鏡装置である。
According to a ninth aspect of the present invention, in the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, the second scanning means is a confocal scanning microscope apparatus that is an objective lens driven in the optical axis direction. .
A tenth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, further comprising a stage on which the specimen is arranged, and the second scanning means is a stage driven in the optical axis direction. A confocal scanning microscope apparatus.
本発明の第１１の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、反射光の検出は、タイムラプス観察時のインターバル中に行う共焦点走査型顕微鏡装置である。 An eleventh aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, wherein the detection of reflected light is performed during an interval during time-lapse observation.
本発明の第１２の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、制御装置は、液体が満たされていないと判断した場合に、供給手段により液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。 A twelfth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the first aspect, further comprising supply means for supplying a liquid, and the control device determines that the liquid is not filled In addition, a confocal scanning microscope apparatus that supplies a liquid by a supply unit.
本発明の第１３の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、制御装置は、第１の走査手段を制御して表面上の複数点における検出結果を取得し、複数点の各々に対して液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。 According to a thirteenth aspect of the present invention, in the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, the control device controls the first scanning unit to acquire detection results at a plurality of points on the surface. A confocal scanning microscope apparatus that determines whether or not each point is filled with liquid.
本発明の第１４の態様は、第１３の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、複数点は、同一視野内に位置し、制御装置は、複数点の少なくとも１点で液体が満たされていないと判断した場合に、液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。 A fourteenth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the thirteenth aspect, further comprising supply means for supplying a liquid, wherein a plurality of points are located in the same field of view, and the control device is The confocal scanning microscope apparatus supplies a liquid when it is determined that the liquid is not filled with at least one of a plurality of points.
本発明の第１５の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、標本を配置するステージを備え、制御装置は、ステージを制御して表面上の複数点における検出結果を取得し、複数点の各々に対して液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。 A fifteenth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the fifth aspect, further comprising a stage on which the specimen is arranged, and the control unit controls the stage to detect at a plurality of points on the surface. It is a confocal scanning microscope apparatus which acquires a result and judges whether the liquid is satisfy | filled with respect to each of several points.
本発明の第１６の態様は、第１５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、複数点は、それぞれ異なる視野内に位置し、制御装置は、液体が満たされていないと判断した場合に、液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。 A sixteenth aspect of the present invention is the confocal scanning microscope apparatus according to the fifteenth aspect, further comprising supply means for supplying a liquid, wherein a plurality of points are located in different visual fields, and the control device Is a confocal scanning microscope apparatus that supplies a liquid when it is determined that the liquid is not filled.
本発明によれば、励起光観測用の光検出器など、液浸の有無を検出するための追加の構成要素を必要とせず、蛍光と同様に共焦点ピンホールを介して同一の光検出器により励起光を観測するため、過度にシステムの複雑化を伴うことなく、液浸の有無を高精度に検出する技術を提供することができる。 According to the present invention, there is no need for an additional component for detecting the presence or absence of immersion, such as a photodetector for observation of excitation light, and the same photodetector via a confocal pinhole as in fluorescence. Therefore, it is possible to provide a technique for detecting the presence or absence of liquid immersion with high accuracy without excessively complicating the system.
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
本実施形態では、タイムラプス観察における液浸の有無の判定方法について説明する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
<First Embodiment>
In this embodiment, a method for determining the presence or absence of liquid immersion in time-lapse observation will be described.
図１は、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成について例示した図である。以下、図１を参照しながら本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成と動作について説明する。 FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of a confocal scanning microscope according to this embodiment. The configuration and operation of the confocal scanning microscope according to this embodiment will be described below with reference to FIG.
図１で例示される共焦点走査型顕微鏡１は、レーザ光源２と、ダイクロイックミラー３と、ガルバノミラー４と、瞳投影レンズ５と、結像レンズ６と、対物レンズ７と、カバーガラス８と、コンフォーカルレンズ９と、共焦点ピンホール１０、光検出器１１と、制御装置１２と、給水装置１３と、水補給ノズル１４を含んで構成されている。対物レンズ７とカバーガラス８の間は、水１５で満たされた状態で使用され、標本１６側からカバーガラス８、水１５、対物レンズ７の順に並べられている。
A
なお、本実施形態では、液浸として水１５を例示したが、特にこれに限定されるものではない。標本１６によっては、例えば、油を用いても良い。また、標本１６と液浸の間にカバーガラス８を用いた構成を例示したが、特にこれに限定されるものではない。また、標本保持部材としてカバーガラス８を例示したが、ガラスボトムディッシュの底面やウェルプレパラートの底面など、厚さや屈折率などにより入射する光に対する光学的な影響を考慮して設計された、その他の標本保持部材により標本を固定しても良い。
In the present embodiment, the
次に、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡１の動作について説明する。まず、レーザ光源２から射出されたレーザ光が標本１６に入射するまでの動作について説明する。
レーザ光源２から射出されたレーザ光は、ダイクロイックミラー３に入射する。レーザ光の光軸に対して傾いて配置されたダイクロイックミラー３は、レーザ光のうち少なくとも標本１６を励起する励起波長成分を反射し、且つ、蛍光を透過する性質を有している。本明細書では、ダイクロイックミラー３で反射された標本１６を励起する励起波長成分を含むレーザ光を励起光と称する。このようなダイクロイックミラー３の性質により、ダイクロイックミラー３に入射したレーザ光は、励起光とそれ以外に分離される。励起光はダイクロイックミラー３により標本方向へ反射され、それ以外の成分はダイクロイックミラー３を透過して不要光として処理される。
Next, the operation of the
Laser light emitted from the
なお、レーザ光源２とダイクロイックミラー３の間には、さらに励起フィルタを設けても良い。この場合、励起波長成分以外の波長成分の少ない励起光を得ることができる。
ダイクロイックミラー３を反射した励起光は、ガルバノミラー４に入射する。共焦点走査型顕微鏡１は、入射光束の焦点位置にある標本１６の一点を観察する構成となっている。このため、観察用の画像を生成するに当たっては、焦点位置を標本１６面上で走査する必要がある。ガルバノミラー４は標本１６面上における焦点位置の走査手段であり、制御装置１２により制御されている。
An excitation filter may be further provided between the
The excitation light reflected from the
なお、標本１６面に垂直な方向、つまり光軸方向については、対物レンズ７を光軸方向に移動させることにより走査する。その他にも、標本１６やカバーガラス８が配置される不図示のステージを移動させることにより光軸方向に走査することも可能である。また、この際の対物レンズ７や不図示のステージの移動も制御装置１２により制御される。
In the direction perpendicular to the surface of the
ガルバノミラー４により焦点位置を制御された励起光は、瞳投影レンズ５、結像レンズ６、対物レンズ７、水１５、カバーガラス８を順番に経由して標本１６へ入射する。
以上のようにして入射した励起光により、標本１６側からは、標本１６が励起されたことにより生じる蛍光や、標本１６面及びカバーガラス８表面で反射された励起光などが光検出器１１側に向けて射出される。
The excitation light whose focal position is controlled by the
From the
次に、光検出器１１に向けて射出された光が光検出器１１に入射するまでの動作について説明する。
標本１６側から射出された蛍光と励起光は、入射時と同様の経路を遡ってダイクロイックミラー３へ入射する。
Next, an operation until light emitted toward the photodetector 11 enters the photodetector 11 will be described.
The fluorescence and excitation light emitted from the
ダイクロイックミラー３は、上述したとおり、励起光を反射し、蛍光を透過する性質を有している。このため、蛍光はダイクロイックミラー３を透過しコンフォーカルレンズ９へ入射する。一方、励起光については、入射した励起光の大部分はダイクロイックミラー３で反射されるが、ごく一部の励起光はダイクロイックミラー３を透過し、蛍光同様にコンフォーカルレンズ９へ入射する。このようにごく一部の励起光がダイクロイックミラー３を透過する理由は、励起光の波長に対するダイクロイックミラー３の透過率が０％ではなく、わずかであるが透過率を有しているためである。
As described above, the
以上のようにしてコンフォーカルレンズ９に入射した励起光と蛍光は、共焦点ピンホール１０上に集光され、共焦点ピンホール１０を介して光検出器１１に入射し検出されることになる。
The excitation light and fluorescence incident on the
ここで、共焦点ピンホール１０は焦点位置と共役な位置に配置されているため、焦点位置からずれた位置から生じた蛍光や励起光は共焦点ピンホール１０により遮断される。これにより焦点位置からの光のみを高精度に検出することができる。
Here, since the
次に、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５の有無についての判定方法について説明する。なお、以降では、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５の有無についての判定を、液浸判定と称する。
Next, a method for determining the presence or absence of
図２は、図１で例示した共焦点走査型顕微鏡１の対物レンズ７と、水１５と、カバーガラス８と、標本１６との位置関係とそれぞれの屈折率について示した概略図である。ここでは、水１５、カバーガラス８、標本１６の屈折率を、それぞれｎｗ、ｎｃ、ｎｓで示している。
FIG. 2 is a schematic diagram showing the positional relationship between the
図２に例示したように水１５、カバーガラス８、標本１６はそれぞれ異なる屈折率を有している。光が屈折率の異なる物質間を通過するとき、屈折率差に応じた反射光が発生する。このため、レーザ光源２から標本１６へ励起光を照射すると、水１５とカバーガラス８との境界面である第１の境界面１７や、カバーガラス８と標本１６との境界面である第２の境界面１８で、境界を構成する物質の屈折率差に応じた割合だけ反射光が発生する。
As illustrated in FIG. 2, the
本実施形態における液浸判定では、これらの反射光を利用する。具体的には、対物レンズ７や不図示のステージなどの光軸方向の走査手段により、入射光の焦点位置を図２に示される光軸１９に沿って、カバーガラス８内部のＣ点から標本１６内部のＥ点まで移動させる。その際に光検出器１１で検出される光検出の強度を、制御装置１２と連携して焦点位置と関連付けて記録する。この焦点位置と光検出の強度の情報（以降、Ｉ−Ｚプロファイルと称する。）を分析することにより液浸判定を行う。
In the immersion determination in the present embodiment, these reflected lights are used. Specifically, the focal position of the incident light is sampled from the point C inside the
図３は、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡１で記録されるＩ−Ｚプロファイルの特性を示した概念図である。縦軸は光検出の強度（Ｉ）、横軸は光軸方向（Ｚ軸方向）の焦点位置（Ｚ）を示している。
FIG. 3 is a conceptual diagram showing characteristics of an I-Z profile recorded by the
まず、図３を参照しながら、本実施形態で記録されるＩ−Ｚプロファイルの形状について説明する。
図３で例示されるように、本実施形態で記録されるＩ−Ｚプロファイルは、第２の境界面１８上のＤ点で光検出の強度（Ｉ）が最高値を示し、Ｄ点から両側のＣ点及びＥ点に向けて光検出の強度（Ｉ）が低下する形状を示す。
First, the shape of the IZ profile recorded in the present embodiment will be described with reference to FIG.
As illustrated in FIG. 3, in the I-Z profile recorded in the present embodiment, the light detection intensity (I) shows the maximum value at point D on the
Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）までは屈折率が均一であるとみなすことのできるカバーガラス８内部であり、このような位置からはほとんど反射光は生じない。このため、記録されるＩ−Ｚプロファイルでは、Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）までの光検出の強度（Ｉ）は０になるように思われる。
From the point C to the point D (not including the point D) is the inside of the
しかし、実際には、Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）の間においても、Ｄ点から発生した反射光の一部が共焦点ピンホール１０を通過し、光検出器１１で検出されるため、図３で例示されるような形状となる。このような理由から、Ｉ−Ｚプロファイルは、焦点位置からずれた位置からの光を共焦点ピンホールでより多く遮断できるほどＤ点からの広がりの小さい形状を示すことになる。
In practice, however, part of the reflected light generated from point D passes through
ところで、焦点位置からずれた位置からの光を共焦点ピンホールによりどの程度遮断できるかについては、光の波長や共焦点ピンホールの径、対物レンズの開口数などに依存することが知られている。このうち、対物レンズの開口数は、液浸の有無によって変動する値である。 By the way, it is known that how much light from a position shifted from the focal position can be blocked by the confocal pinhole depends on the wavelength of the light, the diameter of the confocal pinhole, the numerical aperture of the objective lens, and the like. Yes. Among these, the numerical aperture of the objective lens is a value that varies depending on the presence or absence of liquid immersion.
そこで、本実施形態では、開口数の違いによるＩ−Ｚプロファイルの形状の変化を分析し、液浸の有無を判定する。
図４Ａは、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５が満たされている（水切れなし）場合のＩ−Ｚプロファイルを例示した図である。図４Ｂは、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５が満たされていない（水切れあり）場合のＩ−Ｚプロファイルを例示した図である。
Therefore, in this embodiment, the change in the shape of the I-Z profile due to the difference in the numerical aperture is analyzed to determine the presence or absence of liquid immersion.
FIG. 4A is a diagram illustrating an I-Z profile in the case where
以下では、図４Ａ及び図４Ｂを参照して、水１５の有無によるＩ−Ｚプロファイルの形状の違いについて具体的に説明する。
対物レンズの開口数は、対物レンズ７と標本１６の間の媒体の屈折率に比例する。このため、水１５が満たされている場合と、満たされていない場合（つまり、空気が満たされている場合）では、水１５が満たされている場合の方が、高い開口数を示す。
Below, with reference to FIG. 4A and FIG. 4B, the difference in the shape of the IZ profile by the presence or absence of the
The numerical aperture of the objective lens is proportional to the refractive index of the medium between the
開口数が高いほど、焦点位置からずれた位置からの光をより多く共焦点ピンホールで遮断できるため、図４Ａに例示される水１５が満たされている場合のＩ−Ｚプロファイルは、図４Ｂに例示される水１５が満たされていない場合のＩ−Ｚプロファイルと比べて、Ｄ点を中心とした狭い範囲で反射光が検出される形状となる。
The higher the numerical aperture, the more light from a position shifted from the focal position can be blocked by the confocal pinhole. Therefore, the IZ profile when the
また、ここでは図示しないが、液浸中に泡などが混入している場合、対物レンズ７と標本１６の間の一部が水１５で満たされていないため、水１５が完全に満たされている場合に比べて開口数が低下する。
Although not shown here, when bubbles or the like are mixed during the immersion, a part between the
このため、図４Ａに例示される水１５が満たされている場合のＩ−Ｚプロファイルに比べて広い範囲で反射光が検出され、図４Ｂに例示される水１５が満たされていない場合のＩ−Ｚプロファイルに比べて狭い範囲で反射光が検出される形状となる。
For this reason, the reflected light is detected in a wider range than the IZ profile in the case where the
次に、液浸判定のためのＩ−Ｚプロファイルの形状の変化の分析方法について説明する。
Ｉ−Ｚプロファイルの形状の定量化は、以下の方法で行う。まず、Ｉ−Ｚプロファイルが示す光検出の強度（Ｉ）の最大値Ｉｍを取得し、取得した最高値の半分の値（以降、半値Ｉｈと称する。）を算出する。次に、半値Ｉｈを検出した際の焦点位置Ｚｈ１、焦点位置Ｚｈ２を取得し、焦点位置Ｚｈ１と焦点位置Ｚｈ２間の距離（以降、半値幅Ｗｈと称する。）を算出する。この半値幅ＷｈをＩ−Ｚプロファイルの形状の指標、特にＩ−Ｚプロファイルの広がりを示す指標と定義する。このようにしてＩ−Ｚプロファイルの形状を定量化した上で、Ｉ−Ｚプロファイルの形状の変化を分析する。
Next, a method for analyzing a change in the shape of the I-Z profile for determining immersion is described.
The quantification of the shape of the IZ profile is performed by the following method. First, the maximum value Im of the light detection intensity (I) indicated by the I-Z profile is acquired, and a half value of the acquired maximum value (hereinafter referred to as a half value Ih) is calculated. Next, the focus position Zh1 and the focus position Zh2 when the half value Ih is detected are acquired, and the distance between the focus position Zh1 and the focus position Zh2 (hereinafter referred to as the half value width Wh) is calculated. This half-value width Wh is defined as an index of the shape of the IZ profile, particularly an index indicating the spread of the IZ profile. After quantifying the shape of the IZ profile in this way, the change in the shape of the IZ profile is analyzed.
すでに説明したように、水１５が満たされていない状態では、水１５が満たされている状態と比較して開口数が低下するため、半値幅Ｗｈが増加する。これを利用して、予め設定された閾値Ｒｔｈ［％］以上に半値幅Ｗｈが増加したか否かで水１５の有無を判定する。以上の方法による液浸判定は、光検出器１１と制御装置１２が連携して行う。また、閾値Ｒｔｈ［％］を比較的小さく設定することで、液浸の有無だけではなく、泡の混入も検出することができる。
As already described, in the state where the
なお、本実施形態では、図２におけるＣ点からＥ点の間のＩ−Ｚプロファイルを取得し、Ｄ点（第２の境界面１８）で発生した反射光により、液浸の有無を判断したが、特にこれに限定されるものではない。図２におけるＡ点からＣ点の間のＩ−Ｚプロファイルを取得し、Ｂ点（第１の境界面１７）で発生した反射光により、液浸の有無を判断してもよい。前者の場合、観察条件に近い状態でＩ−Ｚプロファイルを評価できる利点があるのに対して、後者の場合、焦点位置が標本１６の手前にあるため、標本１６から生じた蛍光の影響を受けにくく、反射光のみの強度をより高い精度で検出することができる利点がある。
In this embodiment, an I-Z profile between point C and point E in FIG. 2 is acquired, and the presence or absence of liquid immersion is determined based on the reflected light generated at point D (second boundary surface 18). However, it is not particularly limited to this. An I-Z profile between point A and point C in FIG. 2 may be acquired, and the presence or absence of immersion may be determined based on the reflected light generated at point B (first boundary surface 17). In the former case, there is an advantage that the IZ profile can be evaluated in a state close to the observation condition, whereas in the latter case, since the focal position is in front of the
図５は、定点タイムラプス観察における液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図５を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。 FIG. 5 is an example of a flowchart for immersion determination in fixed-point time-lapse observation. Hereinafter, the flow of the immersion determination will be specifically described with reference to FIG.
液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始する。具体的には、標本１６をカバーガラス８により保持し、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を満たした状態から開始する。
The immersion determination starts from a state where preparation for time-lapse observation is complete. Specifically, the
まず、ステップＳ１では、制御装置１２が、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。
ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得し、基準となる半値幅（以降、基準半値幅Ｗｈｂ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。
First, in step S1, the
In step S2, under the control of the
なお、基準半値幅Ｗｈｂについては、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂを取得する。 For the reference half-value width Whb, values corresponding to the observation environment may be stored in a database in advance and recorded in a recording device (not shown). In this case, in step S2, the reference half width Whb is acquired from a recording device (not shown).
ステップＳ３では、標本１６を撮影する。
ステップＳ４では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。
In step S3, the
In step S4, the apparatus waits for a predetermined time until it approaches the next shooting time. Note that the fixed waiting time at this time is a time determined according to a time-lapse observation interval or the like.
ステップＳ５では、制御装置１２の制御のもと、光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得し、半値幅Ｗｈを算出する。
ステップＳ６では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂを取得し、半値幅Ｗｈの基準半値幅Ｗｈｂからの増加率Ｒｇｒ［％］を算出する。
In step S5, an I-Z profile is acquired by the photodetector 11 under the control of the
In step S6, the
ステップＳ７では、増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ８へ遷移する。増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ３へ遷移する。
In step S7, it is determined whether or not the increase rate Rgr [%] is equal to or greater than a threshold value Rth [%]. When the increase rate Rgr [%] is equal to or greater than the threshold value Rth [%], it is determined that the
ステップＳ８では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ３へ遷移する。
In step S <b> 8,
以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
このように、タイムラプス観察の撮影毎に液浸判定処理を実施することにより、撮影時には、常に水１５が満たされた環境を維持し、共焦点走査型顕微鏡１本来の性能で撮影することが可能となる。
The above process is repeated until time-lapse observation is completed.
As described above, by performing the liquid immersion determination process for each time-lapse observation photographing, it is possible to always maintain an environment filled with
以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１では、共焦点ピンホール１０を介して光を検出することにより、焦点位置における液浸の有無を高い位置精度で判定することで適切な撮影環境を維持することが可能となる。これにより、液浸の消失による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止する効果が得られる。
As described above, in the
また、閾値Ｒｔｈ［％］の設定によっては、水切れだけではなく泡の混入も検出するできるため、泡の混入による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止することができる。
また、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１では、液浸判定のためだけに必要とされる追加の構成要素は特に必要とされない。このため、過度に共焦点走査型顕微鏡１のシステムを複雑化することなく、液浸判定を行うことができる。
In addition, depending on the setting of the threshold value Rth [%], it is possible to detect not only water breakage but also bubble contamination, so that deterioration of the performance of the confocal scanning microscope due to bubble contamination can be prevented.
Further, in the
なお、本実施形態の液浸判定処理は、タイムラプス観察のインターバル中に実施する。このため、タイムラプス観察で設定した撮影タイミングに影響を及ぼすことなく、上記の効果を得ることができる。
＜第２の実施形態＞
本実施形態では、定点タイムラプス観察における液浸の有無の判定方法について説明する。なお、本実施形態は、同一視野内の複数点で液浸の有無の判定を行う点が第１の実施形態と異なっている。
In addition, the immersion determination process of this embodiment is implemented during the time lapse observation interval. For this reason, the above-described effect can be obtained without affecting the photographing timing set in the time-lapse observation.
<Second Embodiment>
In the present embodiment, a method for determining the presence or absence of immersion in fixed-point time-lapse observation will be described. This embodiment is different from the first embodiment in that the presence / absence of immersion is determined at a plurality of points within the same visual field.
本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成や液浸の有無の判定方法は、第１の実施形態と同様であり、ここでは説明を割愛する。
図６は、定点タイムラプス観察における複数点での液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図６を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。
The configuration of the confocal scanning microscope according to the present embodiment and the method for determining the presence or absence of liquid immersion are the same as those in the first embodiment, and a description thereof is omitted here.
FIG. 6 is an example of a flowchart for immersion determination at a plurality of points in fixed-point time-lapse observation. Hereinafter, the flow of the immersion determination will be specifically described with reference to FIG.
液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始するのは、第１の実施形態における定点タイムラプス観察の場合と同様である。
まず、ステップＳ１では、各種初期化処理を行う。具体的には、制御装置１２は、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。その他、同一視野内で液浸の有無を判定する複数の観測点の座標などを取得する。
The immersion determination starts from a state in which preparation for time-lapse observation is completed, as in the case of fixed-point time-lapse observation in the first embodiment.
First, in step S1, various initialization processes are performed. Specifically, the
なお、以降では、同一視野内での複数の観測点を識別する一時変数として観測点変数Ｖを導入する。例えば、同一視野内のＮ点（ここで、Ｎは自然数。）の観測点で液浸判定を行う場合、観測点変数Ｖは０からＮ−１までのいずれかの整数値をとり、Ｎ点の各々はそれぞれ異なる観測点を示すものとする。ここでは、観測点変数Ｖを初期値０に設定する。 In the following, an observation point variable V is introduced as a temporary variable for identifying a plurality of observation points within the same visual field. For example, when immersion determination is performed at N observation points (where N is a natural number) in the same field of view, the observation point variable V takes any integer value from 0 to N−1, and N points Each represents a different observation point. Here, the observation point variable V is set to the initial value 0.
ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測点変数Ｖでの基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。
In step S <b> 2, the focus position is moved to the observation point corresponding to the observation point variable V by the
ステップＳ３では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ４では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップ５へ遷移し、Ｎ未満であればステップ２へ遷移する。
In step S3, the observation point variable V is incremented by one.
In step S4, it is determined whether the observation point variable V is N or more. If the observation point variable V is greater than or equal to N, the process proceeds to step 5, and if less than N, the process proceeds to step 2.
なお、基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）については、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を取得する。 As for the reference half-value width Whb (V), values corresponding to the observation environment may be stored in a database in advance and recorded in a recording device (not shown). In this case, in step S2, the reference half width Whb (V) is acquired from a recording device (not shown).
ステップＳ５では、観測点変数Ｖを０にリセットする。
ステップＳ６では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測点変数Ｖでの半値幅Ｗｈ（Ｖ）を算出する。
In step S5, the observation point variable V is reset to zero.
In step S <b> 6, the focus position is moved to the observation point corresponding to the observation point variable V by the
ステップＳ７では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を取得し、半値幅Ｗｈ（Ｖ）の基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）からの増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］を算出する。
In step S7, the
ステップＳ８では、増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ９へ遷移する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ１０へ遷移する。
In step S8, it is determined whether or not the increase rate Rgr (V) [%] is equal to or greater than a threshold value Rth [%]. When the increase rate Rgr (V) [%] is equal to or greater than the threshold value Rth [%], it is determined that the
ステップＳ９では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ１２へ遷移する。
In step S <b> 9,
ステップＳ１０では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ１１では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップＳ１２へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ６へ遷移する。
In step S10, the observation point variable V is incremented by one.
In step S11, it is determined whether the observation point variable V is N or more. If the observation point variable V is greater than or equal to N, the process proceeds to step S12, and if less than N, the process proceeds to step S6.
ステップＳ１２では、制御装置１２の制御のもと、標本１６を撮影する。
ステップＳ１３では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機した後、ステップ５へ遷移する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。
In step S12, the
In step S13, after waiting for a fixed time until the next shooting time is approached, the process proceeds to step 5. Note that the fixed waiting time at this time is a time determined according to a time-lapse observation interval or the like.
以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。さらに、本実施形態では、同一視野内の複数の観測点で液浸判定処理を実施することにより、特定の観測点における部分的な水切れについても検出可能となり、液浸の部分的な消失による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止することができる。
＜第３の実施形態＞
第１及び第２の実施形態では、標本１６内の一領域（一視野）を経時的に観察する定点タイムラプスにおける液浸の有無の判定方法について説明した。
The above process is repeated until time-lapse observation is completed.
As described above, the
<Third Embodiment>
In the first and second embodiments, the method for determining the presence or absence of liquid immersion in a fixed-point time lapse in which one region (one visual field) in the
本実施形態では、標本１６内の複数の領域を経過時的に観察する多点タイムラプスにおける液浸の有無の判定方法について説明する。なお、本実施形態では、各々の領域において第２の実施形態と同様に複数点で液浸の有無の判定を行う例を示すが、特にこれに限定されるものではない。第１の実施形態と同様に各々の領域の１点で液浸の有無の判定を行ってもよい。
In the present embodiment, a method for determining the presence or absence of liquid immersion in a multipoint time lapse in which a plurality of regions in the
本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成や液浸の有無の判定方法は、第１の実施形態と同様であり、ここでは説明を割愛する。
図７は、多点タイムラプス観察における複数点での液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図７を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。
The configuration of the confocal scanning microscope according to the present embodiment and the method for determining the presence or absence of liquid immersion are the same as those in the first embodiment, and a description thereof is omitted here.
FIG. 7 is an example of a flowchart for immersion determination at a plurality of points in multipoint time-lapse observation. Hereinafter, the flow of the immersion determination will be specifically described with reference to FIG.
液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始するのは、第１の実施形態の場合と同様である。
まず、ステップＳ１では、各種初期化処理を行う。具体的には、制御装置１２により、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。その他、複数の観察領域の位置情報や、一観察領域内で液浸の有無を判定する複数の観測点の位置情報を取得する。
It is the same as in the case of the first embodiment that the immersion determination starts from a state where preparation for time-lapse observation is complete.
First, in step S1, various initialization processes are performed. Specifically, the
なお、以降では、同一視野内での複数の観測点を識別する一時変数として観測点変数Ｖを、多点観察のための複数の観察領域を識別する一時変数として観察領域変数Ｗを導入する。例えば、同一視野内のＮ点（ここで、Ｎは自然数。）の観測点で液浸判定を行う場合、観測点変数Ｖは０からＮ−１までのいずれかの整数値をとる。また、多点観察をＭ個（ここで、Ｍは自然数。）の観察領域で行う場合、観察領域変数Ｗは０からＭ−１までのいずれかの整数値をとる。ここでは、観測点変数Ｖ及び観察領域変数Ｗをともに初期値０に設定する。 In the following, an observation point variable V is introduced as a temporary variable for identifying a plurality of observation points within the same visual field, and an observation region variable W is introduced as a temporary variable for identifying a plurality of observation regions for multipoint observation. For example, when immersion determination is performed at N observation points (where N is a natural number) in the same field of view, the observation point variable V takes any integer value from 0 to N-1. Further, when multipoint observation is performed in M (M is a natural number) observation regions, the observation region variable W takes any integer value from 0 to M-1. Here, both the observation point variable V and the observation region variable W are set to the initial value 0.
ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、不図示のステージを移動することにより観察領域変数Ｗに対応する観察領域に視野を移動する。
ステップＳ３では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測領域変数Ｗ、観測点変数Ｖでの基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。
In step S2, under the control of the
In step S <b> 3, under the control of the
ステップＳ４では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ５では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップＳ６へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ３へ遷移する。
In step S4, the observation point variable V is incremented by one.
In step S5, it is determined whether the observation point variable V is N or more. If the observation point variable V is greater than or equal to N, the process proceeds to step S6, and if it is less than N, the process proceeds to step S3.
ステップＳ６では、観察領域変数Ｗを１だけインクリメントし、且つ、観測点変数Ｖを０にリセットする。
ステップＳ７では、観察領域変数ＷがＭ以上か否かを判定する。観察領域変数ＷがＭ以上であればステップＳ８へ遷移し、Ｍ未満であればステップＳ２へ遷移する。
In step S6, the observation region variable W is incremented by 1 and the observation point variable V is reset to 0.
In step S7, it is determined whether the observation region variable W is M or more. If the observation region variable W is equal to or greater than M, the process proceeds to step S8, and if less than M, the process proceeds to step S2.
なお、基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）については、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２及びステップＳ３では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を取得する。 For the reference half-value width Whb (V, W), values corresponding to the observation environment may be stored in a database in advance and recorded in a recording device (not shown). In that case, in step S2 and step S3, the reference half-value width Whb (V, W) is acquired from a recording apparatus (not shown).
ステップＳ８では、観察領域変数Ｗを０にリセットする。
ステップＳ９では、制御装置１２の制御のもと、不図示のステージを移動することにより観測領域変数Ｗに対応する観察領域に視野を移動する。
In step S8, the observation region variable W is reset to zero.
In step S9, the visual field is moved to the observation region corresponding to the observation region variable W by moving a stage (not shown) under the control of the
ステップＳ１０では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測領域変数Ｗ、観測点変数Ｖでの半値幅Ｗｈ（Ｖ，Ｗ）を算出する。
In step S <b> 10, under the control of the
ステップＳ１１では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を取得し、半値幅Ｗｈ（Ｖ，Ｗ）の基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）からの増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］を算出する。
In step S11, the
ステップＳ１２では、増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ１３へ遷移する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ１４へ遷移する。
In step S12, it is determined whether or not the increase rate Rgr (V, W) [%] is equal to or greater than a threshold value Rth [%]. If the increase rate Rgr (V, W) [%] is equal to or greater than the threshold value Rth [%], it is determined that the
ステップＳ１３では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ１６へ遷移する。
In step S <b> 13,
ステップＳ１４では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ１５では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップ１６へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ１０へ遷移する。
In step S14, the observation point variable V is incremented by one.
In step S15, it is determined whether the observation point variable V is N or more. If the observation point variable V is greater than or equal to N, the process proceeds to step 16, and if less than N, the process proceeds to step S10.
ステップＳ１６では、制御装置１２の制御のもと、標本１６を撮影する。
ステップＳ１７では、観察領域変数Ｗを１だけインクリメントし、且つ、観測点変数Ｖを０にリセットする。
In step S16, the
In step S17, the observation region variable W is incremented by 1 and the observation point variable V is reset to 0.
ステップＳ１８では、観察領域変数ＷがＭ以上か否かを判定する。観察領域変数ＷがＭ以上であればステップＳ１９へ遷移し、Ｍ未満であればステップＳ９へ遷移する。
ステップＳ１９では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機した後、ステップＳ８へ遷移する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。
In step S18, it is determined whether or not the observation region variable W is M or more. If the observation region variable W is greater than or equal to M, the process proceeds to step S19, and if less than M, the process proceeds to step S9.
In step S19, after waiting for a fixed time until the next shooting time is approached, the process proceeds to step S8. Note that the fixed waiting time at this time is a time determined according to a time-lapse observation interval or the like.
以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
このように、タイムラプス観察の撮影毎に液浸判定処理を実施することにより、多点観察のような液浸の飛散が発生しやすい環境においても、撮影時には、常に水１５が満たされた環境を維持し、共焦点走査型顕微鏡１本来の性能で撮影することが可能となる。
The above process is repeated until time-lapse observation is completed.
In this way, by performing immersion determination processing for each time-lapse observation, even in an environment where immersion scattering is likely to occur, such as in multipoint observation, an environment that is always filled with
以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１によっても、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
なお、本発明は、上述の実施の形態に例示した構成に限らず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることは言うまでもない。
As described above, also by the
Needless to say, the present invention is not limited to the configuration exemplified in the above-described embodiment, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
１ 共焦点走査型顕微鏡
２ レーザ光源
３ ダイクロイックミラー
４ ガルバノミラー
５ 瞳投影レンズ
６ 結像レンズ
７ 対物レンズ
８ カバーガラス
９ コンフォーカルレンズ
１０ 共焦点ピンホール
１１ 光検出器
１２ 制御装置
１３ 給水装置
１４ 水補給ノズル
１５ 水
１６ 標本
１７ 第１の境界面
１８ 第２の境界面
１９ 光軸
DESCRIPTION OF
Claims (16)
標本を保持する標本保持部材と、
前記光源から射出される光を前記標本に集光する対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された集光光を前記標本面上で走査する第１の走査手段と、
前記集光光の集光位置と共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、
前記標本から射出される蛍光と前記標本保持部材の表面で反射した反射光とを前記共焦点ピンホールを介して検出する光検出器と、
前記光検出器による前記反射光の検出結果に基づいて、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する制御装置と、を具備することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 A light source;
A specimen holding member for holding the specimen;
An objective lens that focuses light emitted from the light source onto the specimen;
First scanning means for scanning the sample surface with the condensed light collected by the objective lens;
A confocal pinhole disposed at a position conjugate with the condensing position of the condensed light;
A photodetector for detecting fluorescence emitted from the specimen and reflected light reflected by the surface of the specimen holding member through the confocal pinhole;
A controller for determining whether or not a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member based on a detection result of the reflected light by the photodetector. Confocal scanning microscope device.
前記第１の走査手段は、ガルバノミラーであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the first scanning means is a galvanometer mirror.
前記表面は、前記標本と前記標本保持部材との境界面であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the surface is a boundary surface between the specimen and the specimen holding member.
前記表面は、前記標本保持部材の前記対物レンズ側の表面であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the surface is a surface of the specimen holding member on the objective lens side.
さらに、光軸方向に前記集光光を走査する第２の走査手段を備え、
前記検出結果は、前記第２の走査手段により前記集光光を走査して取得した、前記集光位置と前記光検出器で検出される前記反射光の強度との関係を示すＩ−Ｚプロファイルであり、
前記制御装置は、基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルと現在の前記Ｉ−Ｚプロファイルとの比較結果により、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
Furthermore, a second scanning means for scanning the condensed light in the optical axis direction is provided,
The detection result is obtained by scanning the condensed light with the second scanning unit, and indicates an I-Z profile indicating a relationship between the condensed position and the intensity of the reflected light detected by the photodetector. And
The control device determines whether or not a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member based on a comparison result between the reference I-Z profile and the current I-Z profile. A confocal scanning microscope apparatus.
前記比較結果は、基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルの半値幅に対する撮影前の前記Ｉ−Ｚプロファイルの半値幅の増加率であり、
前記増加率が一定値以上の場合に前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされていないと判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
The comparison result is an increase rate of the half width of the IZ profile before photographing with respect to the half width of the reference IZ profile,
A confocal scanning microscope apparatus that determines that the liquid is not filled between the objective lens and the specimen holding member when the increase rate is a certain value or more.
前記基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルは、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始時に取得されることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
The reference IZ profile is an IZ profile in which a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member, and is acquired at the start of observation. Focus scanning microscope device.
前記基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルは、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始前に予め取得されたＩ−Ｚプロファイルであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
The reference IZ profile is an IZ profile in which a liquid is filled between the objective lens and the specimen holding member, and an IZ profile acquired in advance before the observation is started. A confocal scanning microscope apparatus characterized by the above.
前記第２の走査手段は、光軸方向に駆動される前記対物レンズであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the second scanning unit is the objective lens that is driven in an optical axis direction.
さらに、前記標本を配置するステージを備え、
前記第２の走査手段は、光軸方向に駆動される前記ステージであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
Furthermore, a stage for arranging the specimen is provided,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the second scanning unit is the stage driven in an optical axis direction.
前記反射光の検出は、タイムラプス観察時のインターバル中に行うことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
The confocal scanning microscope apparatus is characterized in that the reflected light is detected during an interval during time-lapse observation.
さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
前記制御装置は、前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記供給手段により前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 1,
And further comprising supply means for supplying the liquid,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the control device supplies the liquid by the supply means when determining that the liquid is not filled.
前記制御装置は、前記第１の走査手段を制御して前記表面上の複数点における前記検出結果を取得し、前記複数点の各々に対して前記液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
The control device controls the first scanning unit to acquire the detection results at a plurality of points on the surface, and determines whether or not the liquid is filled in each of the plurality of points. A confocal scanning microscope apparatus.
さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
前記複数点は、同一視野内に位置し、
前記制御装置は、前記複数点の少なくとも１点で前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 13,
And further comprising supply means for supplying the liquid,
The plurality of points are located in the same field of view,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the control apparatus supplies the liquid when it is determined that the liquid is not filled at at least one of the plurality of points.
さらに、前記標本を配置するステージを備え、
前記制御装置は、前記ステージを制御して前記表面上の複数点における前記検出結果を取得し、前記複数点の各々に対して前記液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 5,
Furthermore, a stage for arranging the specimen is provided,
The control device controls the stage to acquire the detection results at a plurality of points on the surface, and determines whether or not the liquid is filled in each of the plurality of points. Confocal scanning microscope device.
さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
前記複数点は、それぞれ異なる視野内に位置し、
前記制御装置は、前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 The confocal scanning microscope apparatus according to claim 15,
And further comprising supply means for supplying the liquid,
The plurality of points are located in different visual fields,
The confocal scanning microscope apparatus, wherein the control apparatus supplies the liquid when it is determined that the liquid is not filled.
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| JP2012093387A (en) * | 2010-10-22 | 2012-05-17 | Olympus Corp | Microscope system |
| JP2015018234A (en) * | 2013-07-11 | 2015-01-29 | カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｍｂｈ | Method for detecting immersion medium and controlling supply of immersion medium |
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