JP2009544941A - サンプル中のヘプシジンを検出および/または測定する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図2
Description
ヘプシジンは、その産生部位から命名されたが、鉄代謝と関連づけられる重要なペプチドである。鉄代謝における障害を、ヘプシジンレベルを測定し、その後測定したヘプシジンレベルを正常レベルと比較することにより評価可能である。かかる比較は診断を促進させることが可能であり、治療計画を評価することが可能であり、または時間経過に伴う患者の症状進行をモニターすることが可能である。
全ての定量実験を、Turbo ESIイオン源を用いたApplied Biosystems社(Foster City, CA)製API4000(SciEx)トリプル四重極質量分析装置で実施した。前記システムを、Analysisソフトウェア 1.3.1により制御した。安定性および分解産物同定実験を、Xcaliburソフトウェア1.3によって制御されたFinnigan LTQ (Thermo-Electron社)で実施した。
濃度1 mg/mLのヒトヘプシジン(配列番号4)のストック溶液を、10 mM酢酸ナトリウムバッファー(約pH5)にて調製した。1 mg/mlの内部標準物質(配列番号17)のストック溶液を、水にて調製した。配列番号17はAc-Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-CpG-Ser-DTic-CpGの配列を有するものであって、ここでAcはアセチル、Lysはリジン、Argはアルギニン、Proはプロリン、Hypはtrans-4-ヒドロキシ-プロリン、Glyはグリシン、CpGはシクロペンチルグリシン、Serはセリン、およびDTicはD-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸である。いずれのストック溶液も-70℃で保存した。最終濃度100 μg/mlのヘプシジン検量線用作業溶液を、ストック溶液を10 mM酢酸ナトリウムバッファーを用いて希釈することにより調製した。濃度100 ng/mlの最終内部標準物質溶液を、内部標準物質のストック溶液を水にて希釈することにより調製した。
ヒトヘプシジン安定性調査を、ヘプシジン(配列番号4)を10%ヒト血清水中室温でインキュベートすることにより行った。インキュベーションを、5 ml試験管中で20 μLのヘプシジン作業溶液(100 μg/mL)を1980 μLの10%血清水と混合し、初期濃度1 μg/mLとすることにより開始した。0時間、0.5時間、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間および5時間の時点で、インキュベーション溶液から100 μLの溶液を採取した。それぞれの採取試料をSPEにより直ちに抽出して、分析するまで4℃で保存した。
固相抽出をOasis HLB 96-ウェルプレート (Waters社、Milford, MA)で実施した。洗浄溶媒は、水酸化アンモニウムでpHを約10に調節した30%メタノール/水とした。溶出溶媒は、酢酸でpHを約5に調節した90%メタノール/水とした。活性化およびコンディショニングの後、100 μLの血清サンプルおよび200 μLの内部標準物質をSPEプレートにロードし、水および350 μLの洗浄溶媒で洗浄した。溶出を、100 μLの溶出溶媒を用いて行い、100 μLの水で希釈した。結果として得られる200 μLの溶出液は、直ちにLC-MS分析が可能な状態となった。
ヒトヘプシジン(H-hep;配列番号4)のプリカーサーおよびプロダクトイオンを、0.1%ギ酸を含む50:50のメタノール:水(v/v)に溶解した10 μg/mLのヘプシジン溶液を直接注入することにより決定した。ヘプシジンは塩基性ペプチドなので、ESIによる正イオンモードを使用した。図2に示すように、+4(m/z 698.5)および+3(m/z 930.8)の電荷状態であるヘプシジンイオンの形成が主である。電荷のデコンボリューションをした後の、ヘプシジン配列から計算される質量より8 Da少ない2788の平均質量は、8個のシステインアミノ酸の間に形成された4個のジスルフィド結合を示す。図3および4は、両者の電荷状態についてのMS/MSスペクトルを示す。m/z 698およびm/z 931のヘプシジンプリカーサーイオンの衝突解離は、ヒスチジンインモニウムイオンに相当するm/z 110およびフェニルアラニンインモニウムイオンに相当するm/z 120の主要なプロダクトイオンを生成する。m/z 110のプロダクトイオンを導くイオンの遷移のためのESI-MS/MSパラメーターを、ヘプシジン定量のために表IIに示すように最適化した。
タンデム質量分析(MS/MS)は、対象となる分析物の検出に際だった特異性を提供するけれども、LC-MSインターフェイスにおける、LC分離でともに溶出される干渉成分からのイオン化に対する競合は、イオン抑制および化学的ノイズのような望ましくない効果を引き起こす、顕著でかつ不整合なマトリクス効果の原因となりうる。それ故、LC分離前のサンプル精製は、生体マトリクス成分の複雑さおよびHPLC、特に高速LC分離における限定的な分解能のために、LC-MS/MSバイオ分析に対して大きな影響を有する。ヘプシジンが抽出および前濃縮され、一方干渉成分の量が顕著に減少する方法である固相抽出が、ヘプシジンバイオ分析のために使用される。
図6は、ブランク検体のヒト血清から抽出されたヒトヘプシジンのMRMクロマトグラムを示す。m/z 930.60→110.15のイオンの遷移は、m/z 698.10→110.15のイオンの遷移よりもずっときれいなバックグラウンドでかつずっと微弱な血清マトリクスからの干渉を与えたので、それをヘプシジン定量のために選択した。図7は、敗血症患者の血清から抽出されたヘプシジンおよび内部標準物質のクロマトグラムを示す。
血清中のヒトヘプシジンに対して、10〜100 ng/mLの範囲内で直線的な検量線を得たが、図8に示すように、ゼロ以外の7種全ての標準物質(10、25、50、100、200、500および1000 ng/mL)に関する二連検体の偏差は全て15%以内である。
ペプチドは生体マトリクス内の内在性酵素による分解に感受性が高いことが知られている。25残基のペプチドであるヒトヘプシジンに加えて、N-末端切断型ヘプシジン-20およびヘプシジン-22もまた、ヒト尿中に存在することが報告されている。それ故、ヘプシジン安定性の評価およびその分解産物の同定は、方法開発において重要である。ヘプシジン安定性を、ヘプシジンを初期濃度1 μg/ml、室温で10%ヒト血清/水中においてインキュベートし、その後LC-MS/MS分析することによって評価した。内部標準物質に対するヘプシジンのピーク面積比を、安定性を評価するために使用し、全てのデータを0時間における値に対して基準化した。安定性のデータ(図9)は、ヒトヘプシジンは比較的安定であることを示した。5時間以内のインキュベーションでは、ヘプシジンは10%未満の分解を示した。
癌性貧血を患っている患者からのサンプル(ProteoGenexより得た)およびボランティア(対照)からのサンプルを採取した。100 μLのそれぞれのサンプル、血清ブランク検体およびゼロ以外の7種の濃度(10、25、50、100、250、500、1000 ng/mL)の二連検体からなる較正用標準物質を、Oasis HLB mElution 96-ウェルプレート (Waters社、Milford, MA)を用いるSPEにより抽出した。洗浄溶媒は、水酸化アンモニウムで約10のpHに調節した30%メタノール/水とした。溶出溶媒は、酢酸で約5のpHに調節した90%メタノール/水とした。SPEプレートを500 μLのメタノールで活性化し、500 μLの水でコンディショニングして、その後100 μLの血清サンプルおよび200 μLの内部標準物質を溶出プレートにロードし、350 μLの水および350 μLの洗浄溶媒で洗浄した。溶出を100 μLの溶出溶媒を用いて行い、該溶出液を100 μLの水で希釈した。結果として得られた200 μLの溶出液をLC-MS/MSにより分析した。
サンプル中のヘプシジン-20、ヘプシジン-22、およびヘプシジン-25の相対的および/または絶対的レベルは、期待される生理活性に関連しうる。ヘプシジン-20およびヘプシジン-22は、全長成熟ペプチドの分解産物であると信じられている。ヘプシジン-20は、生物検定においては不活性であることが示されており、これはフェロポーチンと結合することができないことによると推定されている。それ故、ヘプシジン-20および潜在的にヘプシジン-22は、循環性ヘプシジンプールの不活性な構成成分でありうる。慢性腎臓病のような病状においてはヘプシジンの正常な排除が影響されうるので、異なる型の相対的な存在量が影響されうる。この理由から、ヘプシジン-22およびヘプシジン-20に関連する全長物(ヘプシジン-25)の推定を可能にする検出方法を開発することの利点が存在する。
Claims (53)
- サンプルを質量分析に付して、ヘプシジンシグナルを有するマススペクトルを生成し、ヘプシジンシグナルの強度を測定し、シグナル強度をヘプシジン濃度の検量線に相関させて、サンプル中のヘプシジンの存在または濃度を決定することを含む、サンプル中のヘプシジンの存在または濃度を決定する方法。
- 前記ヘプシジンが約84アミノ酸残基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが約61アミノ酸残基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが約20〜約25アミノ酸残基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが配列番号3、配列番号4、配列番号13、配列番号14、配列番号15およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが+4または+3の電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが+2または+1の電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- さらに、ヘプシジンを質量分析に付する前に、サンプルからヘプシジンを分離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分離がクロマトグラフィーを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが液体クロマトグラフィーである、請求項9に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが固相抽出である、請求項9に記載の方法。
- 前記質量分析が液体クロマトグラフィー−質量分析によって分析することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記質量分析がタンデム質量分析を含む、請求項1に記載の方法。
- サンプルからヘプシジンを分離し、そのヘプシジンを質量分析に付して、ヘプシジンシグナルを有するマススペクトルを生成し、ヘプシジンシグナルの強度を測定し、マススペクトル中のシグナル強度をヘプシジン濃度の検量線に相関させて、サンプル中のヘプシジン量を得ることを含む、サンプル中のヘプシジンの存在または濃度を決定する方法。
- 前記分離がクロマトグラフィーを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが液体クロマトグラフィーである、請求項15に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが固相抽出である、請求項15に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが約84アミノ酸残基を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが約20〜約25アミノ酸残基を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが+4または+3の電荷を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記ヘプシジンが+2または+1の電荷を有する、請求項14に記載の方法。
- サンプルを逆相カラムへ導入し、該逆相カラムを溶出溶媒で処理することを含んでなり、結果として得られる溶出物がヘプシジンを含む、サンプルからヘプシジンを分離する方法
- 前記溶出溶媒がメタノール、水、またはそれらの混合物を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記メタノールの濃度が約20〜約50体積%である、請求項23に記載の方法。
- 前記逆相カラムがC3、C8、C18、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルが血漿サンプルまたは血清サンプルである、請求項1、14、または22に記載の方法。
- 前記サンプルが哺乳動物由来である、請求項1、14、22、または26に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項27に記載の方法。
- 前記ヒトが敗血症または炎症性症状を患っていない、請求項28に記載の方法。
- 鉄恒常性が破壊されている、請求項28に記載の方法。
- 前記鉄恒常性が正常を下回っている、請求項30に記載の方法。
- 前記鉄恒常性が正常を上回っている、請求項30に記載の方法。
- 1以上の鉄指標値が表Iに示された範囲を超えている、請求項30に記載の方法。
- 1以上の鉄指標値が表Iに示された範囲外である、請求項30に記載の方法。
- 前記ヒトが炎症もしくは炎症関連症状を患っているか、または患っていることが疑われる、請求項28に記載の方法。
- 前記症状が、敗血症、炎症性貧血、癌性貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、末期腎疾患、慢性腎臓病、鉄欠乏性貧血、フェロポーチン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、血管炎、全身性エリテマトーデス、異常ヘモグロビン症、赤血球障害および腎不全からなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記ヒトが非炎症性症状を患っているか、または患っていることが疑われる、請求項28に記載の方法。
- 前記非炎症性症状が、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、索状脊髄症、偽脳炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、冠動脈心疾患および末梢閉塞性動脈疾患からなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記ヒトが急性期反応を患っているか、または患っていることが疑われる、請求項28に記載の方法。
- 前記急性期反応が、敗血症、膵炎、肝炎およびリウマチ性疾患からなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記ヒトがエリスロポエチン療法または赤血球新生療法に対して反応性が低下している、請求項28に記載の方法。
- 前記赤血球新生療法がダルベポエチンアルファである、請求項41に記載の方法。
- 患者からのサンプル中のヘプシジン濃度の決定を含む、貧血を患っている患者の治療方法であって、該決定が、サンプルからヘプシジンを分離し、ヘプシジンを質量分析に付して、ヘプシジンシグナルを有するマススペクトルを生成し、ヘプシジンシグナルの強度を測定し、マススペクトル中のシグナル強度をヘプシジン濃度の検量線に相関させて、サンプル中のヘプシジン含量値を得ることを含むことを特徴とする、前記方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約10 ng/mL以下である、請求項43に記載の方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約5 ng/mL以下である、請求項43に記載の方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約2 ng/mL以下である、請求項43に記載の方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約1 ng/mL以下である、請求項43に記載の方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約30 ng/mL以上である、請求項43に記載の方法。
- 前記ヘプシジン濃度が約50 ng/mL以上である、請求項43に記載の方法。
- a) それぞれの容器が既知量でかつ異なる量のヘプシジンを含む、複数のヘプシジン容器;
b) (a)のそれぞれの容器に加えて混合し、また試験サンプルに加えて混合するための標準物質を含む容器;ならびに
c) (1)(a)および(b)から検量線を作成する;および(2)該検量線を用いて試験サンプル中のヘプシジン濃度について試験サンプルをアッセイするための取扱説明書;
を含むキット。 - 前記標準物質が同位体標識された標準物質を含む、請求項50に記載のキット。
- 前記標準物質が配列番号4の配列を含む、請求項51に記載のキット。
- 前記ヘプシジンが配列番号4の配列を含む、請求項52に記載のキット。
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