JP2009537533A - ＮＦ−κＢ抑制剤およびその使用 - Google Patents

Abstract

イミダゾリンの4位-酸としてのジアステレオマーを記載する。イミダゾリンジアステレオマーは抗腫瘍薬の活性を強化し、転写因子NF-κBの強力な抑制剤である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2003年5月30日提出の米国特許出願第10/449,662号の一部継続出願であり、これは2003年1月17日提出の米国特許出願第10/347,323号、現在は米国特許第6,878,735号の一部継続出願であり、これは2002年5月31日提出の米国特許仮出願第60/385,162号に対する優先権を主張する。

連邦政府により助成を受けた研究または開発に関する言明
該当しない。

「コンパクトディスクで提出したコンピューターリスティング付表」への参照
該当しない。

（1）発明の分野
本発明は、新規多置換4-酸またはアルキルエステルもしくはアミドイミダゾリンおよびそれらの調製法に関する。特に、本発明は、NF-κBもしくはNF-κBキナーゼを抑制する、抗炎症性ならびに/または抗菌性ならびに/または抗癌剤の化学相乗剤および/もしくは化学増感剤ならびに/または外来および内因性NF-κB活性化物質に対する免疫応答抑制剤である、4-酸またはエステル基を含む多置換イミダゾリンに関する。組成物は、炎症疾患、アルツハイマー病、卒中、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、ホジキン病、カヘキシー、感染症および後天性免疫不全症候群（AIDS）を含む特定のウイルス感染症に関連する炎症、成人呼吸窮迫症候群、毛細管拡張性運動失調、ならびに様々な皮膚関連疾患を治療するのに有用である。組成物は、自己免疫疾患を治療するため、ならびに臓器および組織移植片の拒絶を抑制するためにも有用である。

（2）関連技術の説明
哺乳動物核内転写因子、NF-κBは、アポトーシス（プログラムされた細胞死）の調節を含む遺伝子転写の活性化に関与する多サブユニット複合体である（Baeuerle, Henkel, Ann. Rev. Immunol., 12: 141-179 (1994)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649-683 (1996)）。NF-κBは主に細胞質中のホモダイマー（p50/p50）またはヘテロダイマー（p50/p65）として、抑制タンパク質IκBとの不活性複合体の形で存在する。抗新生物薬（White, J. Biol. Chem. 272: 14914-14920 (1997)；Baldwin, J. Clin. Invest. 107: 241-246 (2001)；Hideshima et al., J. Biol. Chem. 277: 16639-16647 (2002)；Bottero et al., Cancer Res. 61: 7785-7791 (2001)；Um et al., Oncogene 20: 6048-6056 (2001)；Weldon et al., Surgery 130: 143-150 (2001), Arlt et al., Oncogene 20: 859-868 (2001)；Liu et al., J. Immunol. 166: 5407-5415 (2001)；Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 273: 140-146 (2000)）、ウイルス（HIV-1、HTLV-1）、炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-1）、ホルボールエステル、細菌生成物（LPS）、および酸化ストレスを含む多くの細胞刺激が、IKK仲介性のIκBのセリン32および36におけるリン酸化を引き起こし、その後ユビキチン化と、続いて26Sプロテオソーム（proteosome）による分解が起こる（Baeuerle and Henkel, Ann. Rev. Immunol. 12: 141-179 (1994)。IκBの分解により確実にNF-κBが放出される。放出後、NF-κBは核内に移行し、そこでサブユニットが特定のDNA制御要素と結合し、遺伝子転写を開始する。移行中、最適な遺伝子転写のためにさらなるタンパク質リン酸化事象が必要となる（Karin and Lin, Nat. Immunol. 3: 221-227 (2002)；Zhong et al., Cell 89: 413-424 (1997)；Sizemore et al., Mol. Cell Biol 19: 4798-4805 (1999)；Madrid et al., Mol. Cell Biol 20: 1626-1638 (2000)）。このリン酸化事象を担うキナーゼはまだはっきりと同定されてはいないが、増えつつある証拠によりサイクリン依存性キナーゼGSK-3の関与が示唆される（Schwabe and Brenner, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G204-211 (2002)；Ali et al., Chem. Rev. 101: 2527-2540 (2001)）。NF-κB仲介性遺伝子転写の抑制は抑制タンパク質IκBのリン酸化の抑制、IκB分解の抑制、NF-κB（p50/p65）核移行の抑制、NF-κB-DNA結合またはNF-κB仲介性DNA転写の抑制を通して達成することができる（NF-κB抑制剤の包括的総説については、Epinat and Gilmore, Oncogene 18: 6896-6909 (1999)を参照されたい）。NF-κB活性化によって調節される遺伝子はいくつかのサイトカイン（TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、iNOS）、ケモカイン、細胞接着分子、急性期タンパク質、免疫調節タンパク質、エイコサノイド代謝酵素、および抗アポトーシス遺伝子である。

NF-κB活性化は癌関連疾患において役割を果たす。NF-κBは発癌性ras（ヒト腫瘍における最も一般的欠陥）、TNF、イオン化放射線（放射線損傷）および化学療法剤によって活性化される。これらのシグナルによるNF-κBの活性化は抗アポトーシス細胞シグナルのアップレギュレーションを引き起こし、したがって化学療法に対する腫瘍細胞抵抗性を生じる。したがって、NF-κBの抑制は腫瘍の化学療法薬に対する感受性を高める治療法と考えられ、新規癌療法の可能性がある。この治療についての関連情報が下記に記載されている：

NF-κB活性化は炎症障害においても重要な役割を果たす。NF-κBはTNFおよび他の炎症誘発性サイトカインによって活性化される。したがって、NF-κB活性化の非毒性抑制剤による抑制は多くの炎症障害、関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）骨関節炎、骨粗しょう症、および線維性疾患の治療において臨床的用途を有しうる。これについての関連情報が下記に記載されている：

NF-κB活性化は免疫障害において重要な役割を果たす（Ghosh et al., Ann. Rev. Immunol. 16: 225-260 (1998)）。NF-κBの活性化は多くの免疫学的に関連するタンパク質をコードする多様な遺伝子の活発な転写を引き起こす（Baeuerle and Henkel, Ann. Rev. Immunol. 12: 141-179 (1994)；Daelemans et al., Antivir. Chem. Chemother. 10: 1-14 (1999)）。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の場合、感染はNF-κB活性化を来たし、これによりウイルスが常に残留することになる：

HIV-1複製は様々なウイルスタンパク質ならびにウイルス末端反復配列（LTR）と相互作用する細胞転写因子（特にNF-κB）を通して調節される（Asin, S., Taylor, J. A., Trushin, S., Bren, G., Paya, C. V. J Virol, 73, 3893-3903 (1999)）。HIV-1は潜伏状態に入ることができ、この状態では組み込まれたプロウイルスは転写的にサイレントのままである。細胞に潜伏感染し続ける能力は、ウイルスが永続的感染を確立し、宿主の免疫系を避けるのを助ける。潜伏ウイルスはリンパ組織にあるT細胞で遺伝的変種の大きい貯留槽を確立することができる。加えて、最近の試験は、抗ウイルス療法を受けている患者でNF-κBをT細胞における潜伏HIVの再活性化と関連づけている（Finzi, D., Hermankova, M., Pierson, T., Carruth, L. M.,；Buck, C. et al. Science, 278, 1295-1300 (1997)）。この領域の関連する特許はBabaらの欧州特許第0931544号A2およびCallahanらの国際公開公報第02/30423号A1である。

喘息で見られるような慢性気道炎症は、サイトカインと呼ばれる炎症性タンパク質の過剰発現に関連している。加えて、IL-1およびTNFなどの他の炎症メディエーターが関節リウマチなどの関節疾患において大きい役割を果たしている。これらの炎症性タンパク質はすべて核内転写因子κB（NF-κB）によって高度に調節されている（Yamamoto, Y., et al., J. Clin Invest 107 135-142 (2001)；およびHart, L. A., et al., Am J Respir Crit Care Med 158 1585-1592 (1998)）。この調節タンパク質またはそのキナーゼの抗炎症薬による抑制はこれらの疾患の治療において有効であることが明らかにされている（Yamamoto, Y., et al., J. Clin Invest 107 135-142 (2001)；Coward, W. R., et al., Clin Exp Allergy 28 Suppl 3, 42-46 (1998)；Badger, A. M., et al., J. Pharmacol Exp Ther 290 587-593 (1999)；Breton, J. J., et al., J Pharmacol Exp Ther 282 459-466 (1997)；Roshak, A., et al., J Pharmacol Exp Ther 283 955-961 (1997)；Kopp, E., et al., Science 265 956-959 (1994)；Ichiyama, T., et al., Brain Res 911 56-61 (2001)；Hehner, S. P., et al., J Immunol 163 5617-5623 (1999)；Natarajan, K., et al., Proc Natl Acad Sci USA 93 9090-9095 (1996)；およびFung-Leung, W. P., et al., Transplantation 60 362-368 (1995)）。一般的な抗炎症薬であるアスピリン、およびアスピリン様薬物であるサリチル酸エステルは炎症を治療するために広く処方され、それらの有効性はNF-κB抑制によるとされている。しかし、慢性炎症を治療するためには、これらのサリチル酸エステルの細胞レベルは非常に高い濃度でなければならず、一般には1〜3ミリモル濃度の血漿濃度で処方される（Science 265, 956-959 (1994)）。

ペニシリンの発見以来、様々な細菌感染と戦うために100を越える抗菌剤が開発されている。今日、臨床で用いられる抗菌剤は主にβ-ラクタム（ペニシリン、カルバペネム、およびセファロスポリン）、アミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミド、マクロライド（エリスロマイシン）、キノロン、および最後の手段の薬物：バンコマイシン（糖ペプチド）からなる。近年、世界中で多くの新しい細菌株がこれらの薬物に対する抵抗性を生じている。新しい抗菌剤が必要とされている。

グラム陽性またはグラム陰性菌による侵襲性感染は敗血症性ショックおよび死亡の原因となることが多い。両方のタイプの細菌（グラム陽性およびグラム陰性菌）が血流に侵襲すると、宿主において広範囲におよぶ炎症反応を誘発するエンドトキシンのリポ多糖（LPS）（H. Bohrer, J. Clin. Invest. 972-985 (1997)）の結果、ヒトにおいて敗血症症候群を引き起こす。LPSが敗血症性ショックを引き起こすメカニズムは、転写因子NF-κBの活性化を通してである。このタンパク質がそのキナーゼによって活性化されると、サイトカインの大量放出が始まり、致命的となる可能性のある敗血症性ショックに至る。例えば、肺炎球菌は、それ以外は健康な高齢者における第一の死因で、死亡率は40％、ブドウ球菌感染は今日の米国の病院における菌血症の主因である。これらのエンドトキシンに対する過度の宿主反応によって起こる敗血症性ショックは、多臓器機能障害、多臓器不全につながることが多く、いまだに外傷患者の第一の死因である。LPSによるNF-κB活性化の抑制は、したがって、敗血症性ショックおよび他の細菌感染症の治療において有用な治療法であろう。

通常の抗新生物薬に関連する抗腫瘍効果の有効率および持続期間を高めるために、現在用いられている抗増殖剤の有効性を調節することは非常に興味深い。癌の治療において用いられる通常の抗増殖薬は次のグループに大きく分類される（1）DNAおよびRNAに結合する、アルキル化する、鎖の切断を誘導する、塩基対の間に介入する、またはその完全性および機能を維持する酵素に作用することにより、核酸ポリマーの完全性に影響する化合物；ならびに（2）酵素作用を抑制する（例えば、代謝拮抗物質）または細胞の完全性に必要な構造タンパク質の機能を抑制する（例えば、抗チューブリン物質）ためにタンパク質に結合する化学物質。いくつかの癌の治療において有用であると同定されている他の化合物には、乳癌および前立腺癌治療のためにステロイドホルモン作用を遮断する薬物、光化学的に活性化される薬物、放射線増感剤および防護剤が含まれる。

本発明に対して特に興味深いのは、癌細胞の遺伝子構造の完全性に直接影響する化合物である。DNAおよびRNAなどの核酸ポリマーは抗癌剤の第一の標的である。ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、アジリジン（マイトマイシンCなど）含有化合物などのアルキル化剤はDNAを直接攻撃する。シスプラチンおよびカルボプラチンなどの金属配位化合物は同様に核酸構造を直接攻撃し、細胞にとって修復が困難な損傷を生じ、これが次いで細胞死を引き起こしうる。他の核酸作用化合物には、DNAポリマーの核酸塩基対の間に介入するドキソルビシンなどのアントラサイクリン分子、核酸鎖切断を引き起こすブレオマイシン、核酸ポリマー構造に不適切に取り込まれ、最終的に早期DNA連鎖反応停止を引き起こす、ピリミジンおよびプリンヌクレオシド類縁体などの不正ヌクレオシドが含まれる。ゲノムの完全性および機能に影響する特定の酵素を癌細胞内で特定の化学物質によって抑制し、癌細胞死を引き起こすこともできる。これらには、リボヌクレオチドレダクターゼ（例えば、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン）、トポイソメラーゼI（例えば、カンプトテシン）およびトポイソメラーゼII（例えば、エトポシド）に作用する酵素が含まれる。

DNAの機能のほとんどはねじれを解くことを必要とするため、トポイソメラーゼ酵素はスーパーコイルDNAの構造に影響する。トポイソメラーゼI（top1）はスーパーコイルDNAのねじれを解き、二本鎖の一方だけを切断するが、トポイソメラーゼII（top2）は両方切断する。

植物起源のアルカロイドであるカンプトテシン（CPT）がトポイソメラーゼIの公知の抑制剤のうち最も良く、非常に強力な抗癌剤であるとの知見を通して、top1抑制は癌化学療法において重要なものとなっている。CPTは中国の樹木カンレンボク（Camptotheca acuminata）に含まれている。いくつかの腫瘍タイプを治療するために、いくつかの類縁体が商業的使用を承認されている。これらにはCPT-11（イリノテカン）およびトポテカンが含まれる。

いくつかのタイプの癌に対するカンプトテシンの臨床活性が示されているが、腫瘍反応率、反応の持続期間および最終的に患者生存率の改善がいまだにもとめられている。本明細書に記載の発明は、トポイソメラーゼI抑制剤、特にカンプトテシンを含む化学療法剤の抗腫瘍効果を強化することができる新規使用を示す。

関係する文献には下記が含まれる：Cancer Chemotherapeutic Agents, W. O. Foye, ed., (ACS, Washington, D. C.) (1995))；Cancer Chemotherapy Handbook, R. T. Dorr and D. D. VonHoff, (Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut) (1994)；およびM. P. Boland, Biochemical Society Transactions (2001) volume 29, part 6, p 674-678. DNA damage signaling and NF-κB: implications for survival and death in mammalian cells。

NF-κBはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を抑制することが示されている。多くの臨床で用いられる化学療法剤（ビンカアルカロイド、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、カンプトテシンならびに多くの他の薬物を含む）は最近、NF-κBを活性化し、それらの細胞毒性を妨害することが明らかにされている。この抵抗性の形は一般にNF-κB仲介性化学療法抵抗性と呼ばれる。NF-κBの抑制は腫瘍細胞および固形腫瘍の化学療法剤に対する感受性を高めることが示されている。

参考文献：Cusack, J. C., Liu, F., Baldwin, A. S. Drug Resist Updat, 2, 271-273 (1999)；Mayo, M. W., Baldwin, A. S. Science, 274, 784-787 (1996)；Cusack, J. C., Jr., Liu, R., Baldwin, A. S., Jr. Cancer Res, 60, 2323-2330 (2000). Brandes, L. M., Lin, Z. P., Patierno, S. R., Kennedy, K. A. Mol Pharmacol, 60, 559-567 (2001)；Arlt, A., Vorndamm, J., Breitenbroich, M., Folsch, U. R., Kalthoff, H. et al. Oncogene, 20, 859-868 (2001). Cusack, J. C., Jr., Liu, R., Houston, M., Abendroth, K., Elliott, P. J. et al. Cancer Res 61, 3535-3540 (2001)。

本発明は臨床上重要な化合物としてのイミダゾリンの合成および適用を記載する。イミダゾリンを新しい1,2-双極子付加環化反応により調製した。「ムンチョン（munchone）」のアズラクトンを用いる1,3双極子付加環化反応は、ピロールおよびイミダゾール合成のための一般経路を提供する（Hershenson, F. M. P., Synthesis 999-1001 (1988)；Consonni, R. C., et al., J. chem. Research (S) 188-189 (1991)；およびBilodeau, M. T. C., J. Org. Chem. 63 2800-2801 (1998)）。このアプローチは複素環のイミダゾリン類に対してはまだ報告されていない。イミダゾリンの効率的合成に対し合成および薬理学的興味が持たれ、いくつかの多様な合成アプローチの開発が活気づいた（Puntener, K., et al., J. Org Chem 65 8301-8306 (2000)；Hsiao, Y. H., J. Org. Chem. 62 3586-3591 (1997)）。最近、Arndtsenらはイミン、酸塩化物および一酸化炭素のPd触媒カップリングによる対称置換イミダゾリン-4-カルボン酸の合成を報告した（Dghaym, R. D. D., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40 3228-3230 (2001)）。加えて、N-スルフィニルイミダゾリジンを得るためのアゾメチンイリドのジアステレオ選択的1,3-双極子付加環化がアミノ酸エステルと鏡像異性体として純粋なスルフィンイミンから報告されている（Viso, A., et al., J. Org. Chem. 62 2316-2317 (1997)）。

Ritzelerらの米国特許第6,318,978号は、本発明とは構造的にまったく異なる3,4-ベンズイミダゾールを記載している。これらはNF-κBキナーゼを抑制する。示されているとおり、イミダゾリンおよびベンゼン環に多くの異なる置換基がある化合物で活性が保持されている。M. Karin, Nature immunology, 3, 221-227 (2002)；Baldwin, J. Clin. Invest., 3, 241-246 (2001)；T. Huang et al, J. Biol. Chem., 275, 9501-9509 (2000)；およびJ. Cusack and Baldwin, Cancer Research, 60, 2323-2330 (2000)はNF-κB活性化の癌に対する効果を記載している。Baltimoreの米国特許第5,804,374号および第6,410,516号はNF-κB抑制を記載しており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

抑制の一般法について興味が持たれる特許は、Schwartzらの米国特許第5,821,072号およびDeelyらの第6,001,563号に示されている。

発明の概要
本発明は、哺乳動物における炎症を抑制するための方法であって、多置換4-酸または4-アルキルエステルイミダゾリンを、炎症を抑制するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する。

本発明は、抑制タンパク質であるIκBの分解の抑制による、NF-κBタンパク質の活性化またはそのキナーゼを抑制する方法、およびNF-κBを抑制する能力にも関し、タンパク質またはその活性化タンパク質を、タンパク質の活性化を抑制するのに十分な量の多置換4-酸または4-アルキルエステルもしくはアミドイミダゾリンに接触させる段階を含む。

本発明は、自己免疫疾患、後天性免疫不全症候群（AIDS）を含む特定のウイルス感染症、成人呼吸窮迫症候群、毛細管拡張性運動失調、ならびに乾癬、アトピー性皮膚炎、および紫外線誘導性皮膚損傷を含む様々な皮膚関連疾患を抑制するための方法にも関する。

本発明はさらに、哺乳動物に導入された外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答の抑制に関し、これにより化合物は自己免疫疾患を治療するのに有用、かつ組織、皮膚、および臓器移植片の拒絶を抑制するのに有用となる。本発明はさらに、癌を抑制する方法であって、癌を、癌を抑制するのに十分な量の多置換イミダゾリンに接触させる段階を含む方法に関する。

本発明は、下記式のイミダゾリンに関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；XはOおよびSからなる群より選択され；かつR₅は水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、NH₂、NH-R₆および

からなる群より選択され、R₆およびR₇は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ならびにヘテロアリール、および複素環からなる群より選択され、これらは同じでも異なっていてもよい。

さらに本発明は、下記式のイミダゾリンに関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₈およびR₉は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、および複素環からなる群より選択され、これらは同じでも異なっていてもよい。

さらに、本発明は、アミノイミダゾリンの調製法であって、下記式のイミダゾリン

（式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；XはOおよびSからなる群より選択され；かつR₅は水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、NH₂、NH-R₆および

からなる群より選択され、R₆およびR₇は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ならびにヘテロアリール、および複素環からなる群より選択され、これらは同じでも異なっていてもよい）
を下記式のアミン

と反応させて、下記式の化合物

（式中、R₈およびR₉は水素、アルキル、アシル、アリールアルキル、およびヘテロアルキルからなる群より選択され、これらは同じでも異なっていてもよい）
を得る段階を含む方法に関する。

本発明は、下記式のイミダゾリンに関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。

本発明は特に、下記式のイミダゾリンに関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。好ましくは、R₁はフェニルであり；R₄はベンジルであり；R₅は、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである。同様に好ましくは、R₅はエチルであり；R₂は、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである。最も好ましくは、R₂はメチルであり、かつR₃はフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される。

R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物1）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃が4-メトキシフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物2）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄が4-フルオロフェニルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物3）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がフェニルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物4）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂が1H-インドール-3-イルメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物5）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がピリジン-4-イルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物6）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がHであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物7）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がエトキシカルボニルであり、R₄がHであり、かつR₅がHであるイミダゾリン（化合物8）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がピリジン-4-イルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がEtであるイミダゾリン（化合物9）は好ましい化合物である。R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がEtであるイミダゾリン（化合物10）は好ましい化合物である。

本発明は、式中のR₁、R₂、R₃、およびR₄がアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅が水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらがすべて置換されていてもよい、下記式のイミダゾリン

の調製法であって、
（a）下記の反応混合物
（1）下記式のオキサゾロン

（2）下記式のケトン
R₃=O
；および
（3）下記式のアミン
H₂N-R₄
を、塩化トリメチルシリルまたは酸塩化物および反応物のための溶媒存在下、水非存在下、非反応性ガス存在下、約0から100℃の間の温度で反応させて、イミダゾリンを生成する段階；ならびに
（b）イミダゾリンを反応混合物から分離する段階
を含む方法にも関する。イミダゾリンはアルコールとの反応によりエステル化することができる。イミダゾリンは最も好ましくはアルコールおよび二塩化スルホニルとの反応によりエステル化する。

本発明は、哺乳動物における炎症を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンを、炎症を抑制するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は下等哺乳動物でありうる。投与は哺乳動物に対する経口、局所、または注射（静脈内など）によるものでありうる。

本発明は、微生物を抑制するための方法であって、下記式の化合物の有効量を、微生物を抑制するために投与する段階を含む方法にも関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。抑制はインビトロまたはインビボでありうる。投与は下等哺乳動物またはヒトに対するものでありうる。投与は経口、哺乳動物に対する注射、または局所でありうる。

さらに、本発明はNF-κBまたはNF-κBキナーゼであるタンパク質の分解を抑制する方法であって、タンパク質を下記式の化合物に接触させる段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。化合物はNFκBが関与している腫瘍（癌）の治療においても有用である。抑制は好ましくはインビボである。

本発明はさらに、哺乳動物に導入された外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの有効量を、それによって外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制するように哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。

本発明はさらに、哺乳動物において完全な免疫不全を起こすことなく、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するための方法であって、下記式のイミダゾリンの有効量を、自己免疫疾患を治療するように哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。

本発明はさらに、哺乳動物に移植した臓器の拒絶を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの有効量を、哺乳動物に移植した臓器の拒絶を抑制するように哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。

本発明はさらに、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に潜伏感染している細胞においてHIVの再活性化を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの有効量を、潜伏感染している細胞においてHIVの再活性化を抑制するために投与する段階を含む方法に関する：

式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。

前述の方法のさらなる態様において、R₁はフェニルであり、R₄はベンジルであり、R₅は、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルであり、R₅はエチルであり、R₂は、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルであり、R₂はメチルであり、かつR₃はフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択されるか、または前述の組み合わせである。
R₁は下記である：
（1）下記によって互いに独立に一または二置換されているフェニル
（1）（1） - CN；
（1）（2） - NO₂；
（1）（3） - O-(C₁〜C₄)-アルキル；
（1）（4） - NH₂；または
（1）（5） - (C₁〜C₄)-アルキル-NH₂；
（1）（6） - x（xはハロゲンである）
（2）5から14個の環構成員を有するヘテロアリール
ヘテロアリールは無置換または-N-R¹⁴により互いに独立に一、二、もしくは三置換されており、R¹⁴は-(C₁〜C₆)-アルキル、-(C₃〜C₆)-シクロアルキル、フェニル、ハロゲン、-OH、または-(C₁〜C₄)-アルキルである
または
（3）5から12個の環構成員を有する複素環
複素環は無置換または-N-R¹⁴により互いに独立に一、二、もしくは三置換されており、R¹⁴は-(C₁〜C₆)-アルキル、-(C₃〜C₆)-シクロアルキル、フェニル、ハロゲン、-OH、または-(C₁〜C₄)-アルキルである。

「ハロゲン」なる用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味すると理解される。「アリール」なる用語は、環内に6から14個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基を意味すると理解される。(C₆〜C₁₄)-アリール基は、例えば、フェニル、ナフチル、例えば、1-ナフチル、2-ナフチル、ビフェニリル、例えば、2-ビフェニリル、3-ビフェニリル、および4-ビフェニリル、アントリル、またはフルオレニルである。ビフェニリル基、ナフチル基、および特にフェニル基が好ましいアリール基である。アリール基、特にフェニル基は、同じまたは異なる基、好ましくは(C₁〜C₈)-アルキル、特に(C₁〜C₄)-アルキル、(C₁〜C₈)-アルコキシ、特に(C₁〜C₄)-アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル、ヒドロキシル；ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、もしくは2-ヒドロキシエチルなどのヒドロキシ-(C₁〜C₄)-アルキル、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、ホルミル、アセチル、シアノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル 、(C₁〜C₄)-アルコキシカルボニル、フェニル、フェノキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、またはテトラゾリルから選択される基によって一置換または多置換、好ましくは一置換、二置換、または三置換されうる。さらに、アリールがフェニルであるとき、フェニルは-CN、-NO₂、-O-(C₁〜C₄)-アルキル、-N(R¹¹)₂、-NH-C(O)-R¹¹、-S(O)_xR¹（xは0、1、または2の整数である）、-C(O)-R¹¹（R¹¹は前述の定義のとおりである）、または-(C₁〜C₄)-アルキル-NH₂によって互いに独立に一または二置換されていてもよい。同じことが、例えば、アリールアルキルまたはアリールカルボニルなどの基にも適用される。アリールアルキル基は、特にベンジルならびに1-および2-ナフチルメチル、2-、3-、および4-ビフェニリルメチルと、9-フルオレニルメチルである。置換アリールアルキル基は、例えば、一つまたは複数の(C₁〜C₈)-アルキル基、特に(C₁〜C₄)-アルキル基によってアリール部分で置換されているベンジル基およびナフチルメチル基、例えば、2-、3-、および4-メチルベンジル、4-イソブチルベンジル、4-tert-ブチルベンジル 、4-オクチルベンジル、3,5-ジメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、2-、3-、4-、5-、6-、7-、および8-メチル-1-ナフチルメチル、1-、3-、4-、5-、6-、7-、および8-メチル-2-ナフチルメチル；一つまたは複数の(C₁〜C₈)-アルコキシ基、特に(C₁〜C₄)-アルコキシ基によってアリール部分で置換されているベンジル基、およびナフチルメチル基、例えば、4-メトキシベンジル、4-ネオペンチルオキシベンジル、3,5-ジメトキシベンジル、3,4-メチレンジオキシベンジル、2,3,4-トリメトキシベンジル；ニトロベンジル基、例えば、2-、3-、および4-ニトロベンジル；ハロベンジル基、例えば、2-、3-、および4-クロロ-ならびに2-、3-、および4-フルオロベンジル、3,4-ジクロロベンジル、ペンタフルオロベンジル；トリフルオロメチルベンジル基、例えば、3-および4-トリフルオロメチルベンジル、または3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジルである。

一置換フェニル基において、置換基は2位、3位、または4位に位置することができる。二置換フェニルは、2,3位、2,4位、2,5位、2,6位、3,4位、または3,5位で置換されうる。三置換フェニル基において、置換基は2,3,4位、2,3,5位、2,4,5位、2,4,6位、2,3,6位または3,4,5位に位置することができる。

アリール基についての説明は二価アリーレン基、例えば、1,4-フェニレンまたは1,3-フェニレンとして存在しうるフェニレン基にも適宜に適用される。

フェニレン-(C₁〜C₆)-アルキルは特にフェニレンメチル（-C₆H₄-CH₂-）およびフェニレンエチルである。(C₁〜C₆)アルキレンフェニルは特にメチレンフェニル（-CH₂-C₆H₄-)である。フェニレン-(C₁〜C₆)-アルケニルは特にフェニレンエテニルおよびフェニレンプロペニルである。

「5から14個の環構成員を有するヘテロアリール」なる表現は、5から14個の環構成員を有する単環式または多環式芳香族系の基を意味し、これは環構成員として1、2、3、4、または5個のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子の例はN、O、およびSである。いくつかのヘテロ原子が含まれる場合、これらは同じでも異なっていてもよい。ヘテロアリール基は同様に、(C₁〜C₈)-アルキル、特に(C₁〜C₄)-アルキル、(C₁〜C₈)-アルコキシ、特に(C₁〜C₄)-アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、-N(R¹¹)₂、トリフルオロメチル、ヒドロキシル；ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、もしくは2-ヒドロキシエチルなどのヒドロキシ-(C₁〜C₄)-アルキル、メチレンジオキシ、ホルミル、アセチル、シアノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル 、(C₁〜C₄)-アルコキシカルボニル、フェニル、フェノキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、またはテトラゾリルから選択される、同じまたは異なる基によって一置換または多置換、好ましくは一置換、二置換、または三置換されうる。5から14個の環構成員を有するヘテロアリールは好ましくは、N、O、およびSから選択される1、2、3、または4個、特に1、2、または3個の同じまたは異なるヘテロ原子を含み、かつ(C₁〜C₆)-アルキル、(C₁〜C₆)-アルコキシ、フッ素、塩素、ニトロ、-N(R¹¹)₂、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、ヒドロキシ(C₁〜C₄)-アルキル、(C₁〜C₄)-アルコキシカルボニル、フェニル、フェノキシ、ベンジルオキシ、およびベンジルから選択される1、2、3、または4つ、特に1、2、または3つの同じまたは異なる置換基で置換されうる、単環式または二環式芳香族基を意味する。ヘテロアリールは特に好ましくは、5から10個の環構成員を有する単環式または二環式芳香族基、特にN、O、およびSから選択される1、2、または3個、特に1または2個の同じまたは異なるヘテロ原子を含み、かつ(C₁〜C₄)-アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、-N(R¹¹)₂、(C₁〜C₄)-アルコキシ、フェニル、フェノキシ、ベンジルオキシ、およびベンジルから選択される1または2つの同じまたは異なる置換基で置換されうる、5員または6員単環式芳香族基を意味する。R¹¹は式Iの置換基R⁹で定義されるとおりである。

「5から12個の環構成員を有する複素環」なる表現は、部分飽和または完全飽和である単環式または二環式5員から12員複素環を意味する。ヘテロ原子の例はN、O、およびSである。複素環は無置換あるいは一つもしくは複数の炭素または一つもしくは複数のヘテロ原子上で、同じまたは異なる置換基によって置換されている。これらの置換基はヘテロアリール基について上で定義している。特に、複素環は、炭素上で(C₁〜C₈)-アルキル、例えば、(C₁〜C₄)-アルキル、(C₁〜C₈)-アルコキシ、例えば、メトキシなどの(C₁〜C₄)-アルコキシ、フェニル-(C₁〜C₄)-アルコキシ、例えば、ベンジルオキシ、ヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、もしくはトリフルオロメチルから選択される同じもしくは異なる基によって一置換もしくは多置換、例えば、一置換、二置換、三置換、もしくは四置換されており、かつ/または複素環は、複素環の環窒素上で(C₁〜C₈)-アルキル、例えば、メチルもしくはエチルなどの(C₁〜C₄)-アルキルにより、置換されていてもよいフェニルもしくはフェニル-(C₁〜C₄)-アルキル、例えば、ベンジルにより置換されている。窒素複素環はN-オキシドまたは4級塩としても存在しうる。

5から14個の環構成員を有するヘテロアリールまたは5から12個の環構成員を有する複素環なる表現の例は、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、1,3,4-オキサジアゾール、1,2,3,5-オキサチアジアゾール-2-オキシド、トリアゾロン、オキサジアゾロン、イソキサゾロン、オキサジアゾリジンジオン；F、CN、CF₃、またはCOO-(C₁〜C₄)-アルキルで置換されているトリアゾール、3-ヒドロキシピロール-2,4-ジオン、5-オキソ-1,2,4-チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルボリンから誘導される基、およびこれらの複素環のベンゾ縮合、シクロペンタ-、シクロヘキサ-、またはシクロヘプタ縮合誘導体である。特に好ましい基は2-もしくは3-ピロリル、4-もしくは5-フェニル-2-ピロリルなどのフェニルピロリル、2-フリル、2-チエニル、4-イミダゾリル、メチルイミダゾリル、例えば、1-メチル-2,4-、もしくは5-イミダゾリル、1,3-チアゾル-2-イル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-、3-、もしくは4-ピリジル-N-オキシド、2-ピラジニル、2-、4-、もしくは5-ピリミジニル、2-、3-、もしくは5-インドリル、置換2-インドリル、例えば、1-メチル-、5-メチル-、5-メトキシ-、5-ベンジルオキシ-、5-クロロ-、もしくは4,5-ジメチル-2-インドリル、1-ベンジル-2-もしくは-3-インドリル、4,5,6,7-テトラヒドロ-2-インドリル、シクロヘプタ[b]-5-ピロリル、2-、3-、もしくは4-キノリル、1-、3-、もしくは4-イソキノリル 、1-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-イソキノリル、2-キノキサリニル、2-ベンゾフラニル、2-ベンゾチエニル、2-ベンゾキサゾリル、もしくはベンゾチアゾリル、またはジヒドロピリジニル、ピロリジニル、例えば、2-もしくは3-(N-メチルピロリジニル)、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロチエニル、またはベンゾジオキソラニルである。

したがって、方法および組成物は細胞増殖疾患、特に新形成を有する宿主の治療のために提供される。本発明の方法において、薬学的に許容されるイミダゾリンおよび抗増殖剤を、好ましくは全身投与する。

方法および組成物は細胞増殖疾患、特に新形成を有する宿主の治療のために提供される。本発明の方法において、薬学的に許容されるイミダゾリンを、抗癌効果を改善するために抗増殖剤と共に、好ましくは全身投与する。好ましい態様において、イミダゾリンは化学相乗剤効果を提供する。

化学物質が公知の抗増殖薬の効果を、化学物質または抗増殖剤を単独で用いた場合の活性に比べて、相加的な様式を越える様式で増強する場合、これは化学相乗剤である。いくつかの場合に、化学増感効果が観察されることもある。これは、単独で用いた場合は著しい抗腫瘍効果を示さないが、抗増殖剤の抗腫瘍効果を抗増殖剤自体の使用に比べて相加的な様式を越える様式で改善する物質の使用の効果と定義される。

本明細書において用いられるイミダゾリンなる用語は、その型および類縁体を含む、その化学ファミリーのすべてのメンバーを含む。イミダゾリンファミリーは、化学構造により、前に記載した環構造と定義される。

本明細書において用いられる抗増殖剤は、細胞分裂停止または細胞毒性を誘導する化合物である。細胞分裂停止は細胞の成長の抑制であり、一方、細胞毒性は細胞を死滅させることと定義される。抗増殖剤の具体例には下記が含まれる：メトトレキセート、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビンなどの代謝拮抗物質；ビンカアルカロイド、パクリタキセル、コルヒチンなどの抗チューブリンタンパク質物質；タモキシフェン、LHRH類縁体などのホルモン拮抗物質；ならびにアルキル化剤のメルファラン、BCNU、CCNU、チオテパ、ドキソルビシンなどの挿入剤およびシスプラチンやカルボプラチンなどの金属配位錯体。

したがって、方法および組成物は細胞増殖疾患、特に新形成を有する宿主の治療のために提供される。本発明の方法において、薬学的に許容されるイミダゾリンおよび抗増殖剤を、好ましくは全身投与する。

方法および組成物は自己免疫疾患または臓器移植片もしくは皮膚移植片を有する宿主の治療のために提供される。本発明の方法において、薬学的に許容されるイミダゾリンを、任意に自己免疫疾患または移植臓器もしくは移植片に関与する免疫応答の抑制を改善するために一つまたは複数の抗自己免疫または抗拒絶剤と共に、好ましくは全身投与する。

目的
本発明の目的は、哺乳動物に導入された外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制する新規化合物を提供することである。

本発明の目的は、哺乳動物に移植された臓器の拒絶に関与する免疫応答を抑制する新規化合物を提供することでもある。

本発明のさらなる目的は、NF-κB活性化を含む、哺乳動物の自己免疫疾患に関与する免疫応答を抑制する新規化合物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、HIVに感染した細胞の細胞核へのNF-κB移行を抑制することにより、HIVを抑制することである。

本発明のさらなる目的は、哺乳動物において完全な免疫不全を起こすことなく、臓器移植片に関与するものなどの外来NFκB活性化物質に対する免疫応答または自己免疫疾患に関与する免疫応答を抑制することである。

本発明のさらなる目的は、抗炎症性、抗菌性であり、NFκBまたはNFκBキナーゼを抑制する新規化合物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、化学療法抵抗性の抑制による癌の抑制を提供することである。

本発明のさらなる目的は、そのような化合物の新規調製法を提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的は、添付の図面および好ましい態様を参照すれば徐々に明らかになるであろう。

発明の詳細な説明
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、政府発行物、政府規制、および参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含む本発明の記載が支配する。

本発明は、転写因子NF-κB（NF-κB）の病的活性化のイミダゾリンによる抑制方法を提供する。これらの物質を合成し、NF-κBの強力な非毒性抑制剤であることを見いだした。そのような化合物は、NF-κBシグナリング経路の活性化が関与する疾患の治療において用いうる。NF-κB活性化の抑制は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、骨関節炎、骨粗しょう症および線維性疾患などの様々な炎症疾患に関連する遺伝子の転写を抑制する。NF-κBの抑制は、全身性紅斑性狼蒼、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ならびに組織および臓器拒絶を含む自己免疫疾患の治療において有用である。加えて、NF-κBの抑制はアルツハイマー病、卒中アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、ホジキン病、カヘキシー、感染症および後天性免疫不全症候群（AIDS）を含む特定のウイルス感染症に関連する炎症、成人呼吸窮迫症候群、毛細管拡張性運動失調、ならびに乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線誘導性皮膚損傷を含む様々な皮膚関連疾患の治療において有用である。特定の態様において、本明細書のイミダゾリンは哺乳動物に導入された外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制する能力を有し、これにより化合物は自己免疫疾患を治療するのに有用、かつ組織、皮膚、および臓器移植片の拒絶を抑制するのに有用となる。

好ましい化合物を図1および6に示す。立体上の位置決めを図2に示す。これらの2つの重要な特長の組み合わせにより、このイミダゾリン群は炎症疾患、癌、自己免疫疾患を治療し、移植臓器、組織、および移植皮膚の拒絶を抑制するための非常に有効な治療薬となる。本発明の目的は、（1）抗炎症剤（例えば、喘息および関節リウマチの治療において）、（2）防腐剤を含む抗菌剤、（3）抗癌剤およびシスプラチンなどの抗癌剤の相乗剤、（4）抗自己免疫剤（例えば、全身性紅斑性狼蒼、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎などの自己免疫疾患の治療のため）ならびに（5）臓器移植および皮膚移植法において移植臓器または移植皮膚の拒絶を抑制するために、他の抗拒絶化合物と共にまたは他の抗拒絶化合物を伴わずに用いるための抗拒絶剤として治療に用いるための多置換イミダゾリンの使用である。

本発明の化合物は、インビトロでNF-κBの非常に強力な抑制剤（0.1μM未満の濃度）であり、細胞における予備的実験では、化合物は72時間の期間で細胞毒性がないことが示された。イミダゾリンのいくつかはいくつかの細菌株に対して50μg/mLのMICの抗菌活性を示した。

本発明は、第一のクラスのイミダゾリン型NF-κB抑制剤の合成に関する。イミダゾリンを、一般的鋳型としてアミノ酸由来オキサゾリジノンを用い、高度にジアステレオ選択的な新規多成分合成を介して調製した。

イミダゾリン-4-カルボン酸合成のための一般法は下記のとおりである。無水CH₂Cl₂（10mL）中のアルデヒド（例えば0.57mmol）、アミン（例えば0.57mmol）の溶液をN₂雰囲気下で2時間還流した。無水CH₂Cl₂（例えば5mL）中のオキサゾロン（例えば0.57mmol）の溶液を加え、混合物をN₂雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物を好ましくはCH₂Cl₂（1：1）から沈澱させるか、またはEtOAc/MeOH（4：1）でのシリカゲルクロマトグラフィ後に単離した。

これはアリール、アシル、アルキルおよび複素環非対称置換イミダゾリンの高度にジアステレオ選択的な新規多成分ワンポット合成である。少数のルイス酸をスクリーニングした後、TMSCl（塩化トリメチルシリル）がアズラクトンおよびイミンの縮合を促進し、イミダゾリンを単一のジアステレオマーとして良好な収率で生じることが判明した（スキーム1）。

スキーム1. イミダゾリンの多成分ワンポット合成

Rがキラルである塩化アシル（RCOCl）を用いて単一の鏡像異性体を得ることができる。アズラクトンが異なるN-アシル-α-アミノ酸から調製され、続いてEDCl（1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド）仲介性脱水反応により、純粋なアズラクトンが高収率で得られた（Schunk et al., Organic letters 2: 907-910 (2000)；Sain et al., Heterocycles 23: 1611-1614 (1985)）。イミンとの付加環化反応はわずかに高い温度（例えば40℃）でよく進行し、高置換イミダゾリンが良好な収率で得られた。塩化トリメチルシリルが存在しない場合、おそらくはケテン中間体を介してβ-ラクタムの生成を引き起こした（Peddibhotla et al., Highly Diastereoselective Multicomponent Synthesis of Unsymmetrical Imidazolines, Organic Letters 4: 3533-3535 (2002)）。NOE実験およびX線結晶学により調べたところ、これらの反応のほとんどでイミダゾリンのトランスジアステレオマーのみが観察された。ジアステレオ選択的多成分ワンポット合成は広範なアリール、アシル、アルキルおよび複素環置換イミダゾリンをすぐれた収率で生成した（表1）。

（表１）イミダゾリン1〜10の調製

^a 化合物1の水素添加（10％Pd/C、H₂ 1気圧）後。
^b 化合物6のエステル化（SOCl₂、EtOH）後。
^c 化合物1のエステル化（SOCl₂、EtOH）後。

この方法の完全なメカニズムの詳細はまだ調査中であるが、反応は、当初予想されたとおり、塩化トリメチルシリルによるオキサゾロンのカルボニル酸素の活性化と、その結果として中間体ニトリリウムイオンに対する開環を引き起こすことによって進行するようには見えない（Ivanova, G. G., Tetrahedron 48 177-186 (1992)）。わずかに過剰のトリエチルアミン存在下で縮合を行うと反応が完全に停止し、酸性条件が必要であることが示唆された。加えて、TiCl₄またはBF₃OEt₂などのルイス酸を加えても、いかなる生成物も生じなかった。これらの知見を考慮して、反応はおそらく1,3-双極子付加環化によって進行すると提唱される。付加環化中のR₂およびR₃部分の間の立体反発によって、ジアステレオ選択性を説明することができる（スキーム2）。

スキーム2. イミダゾリン形成の提唱メカニズム

薬学的組成物において、イミダゾリンは1ミリリットルまたは1グラムあたり1から1,000マイクログラムの用量で抑制性である。これは他の自己免疫疾患治療用化合物もしくは薬物または抗拒絶化合物もしくは薬物と1対100または100対1の比で用いることができる。好ましい態様において、患者を治療するための一つまたは複数のイミダゾリンを患者に薬学的に許容される担体中の抑制用量で提供する。したがって、イミダゾリンを薬学的担体物質と共に、通常の混合、造粒、コーティング、懸濁およびカプセル化法などの当技術分野において公知の方法により、経口または直腸投与用の慣例的製剤に加工する。したがって、経口適用のためのイミダゾリン製剤は、一つまたは複数のイミダゾリンを固体薬学的担体と共に混合し；任意に得られた混合物を造粒し；かつ望まれる場合および/または任意に適当な補助物質を添加した後に、混合物または顆粒を錠剤または糖衣錠の中心の形に加工することにより得ることができる。

固体製剤に適した薬学的担体は、特に、糖、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトール、セルロース製剤および/またはリン酸カルシウム、例えば、リン酸3カルシウムもしくはリン酸水素カルシウムなどの充填剤；例えば、トウモロコシ、コムギ、コメもしくはジャガイモデンプンを用いてのデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン、部分的に遊離の官能基を有するポリアクリレートもしくはポリメタクリレートのエステルなどの結合剤；ならびに/あるいは、必要とされる場合には、前述のデンプン、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの発泡剤である。補助物質は主に流動調節剤および滑沢剤、例えば、ケイ酸、滑石、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのその塩である。糖衣錠の中心は、任意に消化液に対して抵抗性の適当なコーティングと共に提供し、ここで特に、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、および/もしくは二酸化チタンを任意に含む濃縮糖溶液、水性溶媒中のラッカー溶液、あるいは胃液に対して抵抗性のコーティングを生成するための、部分的に遊離の官能基を有するポリアクリレートもしくはポリメタクリレートのエステル、またはフタル酸アセチルセルロースもしくはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適当なセルロース製剤の溶液を、フタル酸エステルもしくはトリアセチンなどの適当な軟化剤と共に、または軟化剤なしで用いる。染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに、例えば、活性成分の様々な用量を特定または標識するために加えてもよい。

経口投与することができる一つまたは複数のイミダゾリンを含むイミダゾリン製剤は、ゼラチン硬カプセル、ならびにゼラチン製の閉鎖硬または軟カプセルおよび、必要とされる場合には、グリセリンまたはソルビトールなどの軟化剤をさらに含む。ゼラチン硬カプセルは顆粒の形の一つまたは複数のイミダゾリンを、例えば、トウモロコシデンプン、任意に造粒したコムギデンプンなどの充填剤、滑石、ステアリン酸マグネシウムまたはコロイド状ケイ酸などの結合剤または滑沢剤、および任意に安定剤との混合物で含むことができる。閉鎖カプセルにおいて、一つまたは複数のイミダゾリンは散剤もしくは顆粒剤の形であるか；または好ましくは適当な溶媒中の懸濁剤の形で存在し、ここで懸濁剤を安定化させるために、例えば、グリセリンモノステアレートを加えることができる。

経口投与する他のイミダゾリン製剤は、例えば、通常の様式で調製した水性懸濁剤で、この懸濁剤は懸濁した形の一つまたは複数のイミダゾリンを1回の用量が十分となる濃度で含む。水性懸濁剤は、せいぜい少量の安定剤ならびに/または着香物質、例えば、サッカリンナトリウム、あるいは特定の量の糖および/もしくはソルビトールまたは類似の物質を含むシロップなどの甘味料のいずれかを含む。同様に、例えば、シェーク調製用の濃縮物または濃縮懸濁液も適当である。そのような濃縮物は1回用量で包装することもできる。

直腸投与に適したイミダゾリン製剤は、例えば、一つまたは複数のイミダゾリンと坐剤基剤との混合物からなる坐剤である。そのような物質は、特に、天然または合成トリグリセリド混合物である。同様に、基剤中の一つまたは複数のイミダゾリンの懸濁液からなるゼラチン直腸カプセル剤も適当である。適当な基剤は、例えば、高級または特に中鎖飽和脂肪酸の液体トリグリセリドである。

同様に特に興味が持たれるのは、好ましくは粒径の中央値が5μm以下の微粉砕した一つまたは複数のイミダゾリンを、デンプン、特にトウモロコシデンプンまたはコムギデンプン、同様に例えばジャガイモデンプンまたはコメデンプンとの混合物で含む製剤である。これらは、好ましくは、プロペラ様の鋭利な撹拌装置を有する高速混合器で、例えば、3から10分の間の混合時間で、成分が大量の場合には必要に応じて冷却しながら、短時間混合することにより生成する。この混合工程において、一つまたは複数のイミダゾリンの粒子はデンプン粒子上に、一部の粒子の粒径の持続的低下を伴って、均質に沈着する。前述の混合物は慣例的、例えば、前述の補助物質と共に、固体剤形単位に加工する；すなわち、例えば、錠剤もしくは糖衣錠の形に圧縮するか、またはカプセルに充填することができる。しかし、これらは直接、または補助物質、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンの高級脂肪酸とのエステルもしくはラウリル硫酸ナトリウムなどの薬学的に許容される湿潤剤および分散剤、ならびに/または着香物質を加えた後に、水性懸濁剤調製のための濃縮物として、例えば、約5から20倍の量の水と共に用いることもできる。イミダゾリン/デンプン混合物を界面活性剤または他の補助物質と混合する代わりに、これらの物質を懸濁剤を調製するために用いる水に加えてもよい。一つまたは複数のイミダゾリン/デンプン混合物および任意に補助物質からなる、懸濁剤を生成するための濃縮物は、1回用量で、必要とされる場合には気密および防湿様式で包装することができる。

加えて、一つまたは複数のイミダゾリンを患者に腹腔内、鼻内、皮下、または静脈内投与することができる。一般に、腹腔内、鼻内、皮下、または静脈内投与のために、一つまたは複数のイミダゾリンを植物もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒中；望まれる場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤などの通常の添加剤と共に、溶解、懸濁または乳化することにより提供する。好ましくは、一つまたは複数のイミダゾリンを、恒温動物またはヒトにおいて腹腔内、皮下、または静脈内使用のために許容される組成物中で提供する。例えば、そのような組成物は、一つまたは複数のアントラキノンのための担体として、緩衝化リン酸塩溶液などの生理的に許容される溶液を含むことができる。好ましくは、溶液は生理的pHである。特定の態様において、組成物を患者に直接に注射し、静脈内投与により腫瘍を灌流する。

本発明の製剤は、一つまたは複数のイミダゾリンを、恒温動物またはヒトへの投与に適した濃度で含み、この濃度は投与様式に依存して約0.3％から95％の間、好ましくは約2.5％から90％の間である。懸濁剤の場合、濃度は通常は30％以下、好ましくは約2.5％であり；反対に、一つまたは複数のイミダゾリンの錠剤、糖衣錠およびカプセル剤の場合、一つまたは複数のイミダゾリンの必要とされる用量を確実に容易に摂取するために、濃度は好ましくは約0.3％以上である。一つまたは複数のイミダゾリンを含む製剤による患者の治療は、好ましくは経時的にNF-κBを実質的に抑制するのに十分な一つまたは複数のイミダゾリンの用量の1回または複数回投与によって実施する。必要とされる場合には、用量を1日1回投与するか、または数時間の間隔で投与するいくつかの部分用量に分割することができる。特定の場合に、製剤を放射線または化学療法などの一つまたは複数の他の療法と共に、またはその後に用いることができる。一つまたは複数のイミダゾリンの投与用量は、治療する患者（恒温動物の種またはヒト）、治療する患者の全身状態、および治療する疾患のタイプまたは臓器移植片もしくは皮膚移植片のタイプに依存する。

NF-κBの活性化が免疫障害において重要な役割を果たすため、本発明は、自己免疫疾患ならびに臓器および皮膚移植片拒絶を抑制するための免疫抑制薬として有用である（Ghosh et al., Ann. Rev. Immunol. 16: 225-260 (1998)）。NF-κBの活性化は多くの免疫学的に関連するタンパク質をコードする多様な遺伝子の活発な転写を引き起こす（Baeuerle and Henkel, Ann. Rev. Immunol. 12: 141-17 (1994)；Daelemans et al., Antivir. Chem. Chemother. 10: 1-14 (1999)）。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の場合、感染はNF-κB活性化を来たし、これによりウイルスが常に残留することになる（Rabson et al., Adv. Pharmacol. 48: 161-207 (2000)；Pati et al., J. Virol. 77: 5759-5773 (2003)；Quivy et al.、J. Virol. 76: 11091-11103 (2002)；Amini. et al., Oncogene 21: 5797-5803 (2002)；Takada et al., J. Virol. 76: 8019-8030 (2002)；Chen-Park et al., J. Biol. Chem. 277: 24701-24708 (2002)；Ballard, Immunol. Res. 23: 157-166 (2001)；Baldwin, J. Clin. Invest. 107: 3-6 (2001)；Calzado et al., Clin. Exp. Immunol. 120: 317-323 (2000)；Roland et al., DNA Cell Biol 18: 819-828 (1999)；Boykins et al., J. Immunol. 163: 15-20 (1999)；Asin et al., J. Virol. 73: 3893-3903 (1999)；Sato et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:, 293-29 (1998)）。HIV-1複製は様々なウイルス調節タンパク質ならびにウイルス末端反復配列（LTR）と相互作用する細胞転写因子（特にNF-κB）を通して調節される（Asin et al., J. Virol, 73: 3893-3903 (1999)）。HIV-1は潜伏状態に入ることができ、この状態では組み込まれたプロウイルスは転写的にサイレントのままである。細胞に潜伏感染し続ける能力は、ウイルスが永続的感染を確立し、宿主の免疫系を避けるのを助ける。潜伏ウイルスはリンパ組織にあるT細胞で遺伝的変種の大きい貯留槽を確立することができる。加えて、最近の試験は、抗ウイルス療法を受けている患者でNF-κBをT細胞における潜伏HIVの再活性化と関連づけている（Finzi et al., Science 278: 1295-1300 (1997)）。

NF-κB活性化が炎症障害において重要な役割を果たすため、本発明は、炎症障害を治療するのに有用である。NF-κBはTNFおよび他の炎症誘発性サイトカインによって活性化される。したがって、NF-κB活性化の非毒性抑制剤による抑制は多くの炎症障害、関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）骨関節炎、骨粗しょう症および線維性疾患の治療において臨床的用途を有しうる。これについての関連情報が下記に記載されている（Feldmann et al., Ann. Rheum. Dis. 61: Suppl 2, ii13-18 (2002)；Gerard and Rollins, Nat. Immunol. 2: 108-115 (2001)；Hart et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158: 1585-1592 (1998)；Lee and Burckart, J. Clin. Pharmacol. 38: 981-99 (1998)；Makarov, Arthritis Res. 3: 200-206 (2001)；Manna et al., J. Immunol. 163: 6800-6809 (1999)；Miagkov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13859-13864 (1998)；Miossec, Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 47: 675-678 (2001)；Roshak et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2: 316-321 (2002)；Tak and Firestein, J. Clin. Invest. 107: 7-11 (2001)；Taylor, Mol. Biotechnol. 19: 153-168 (2001)；Yamamoto and Gaynor, J. Clin. Invest. 107: 135-142 (2001)；Zhang and Ghosh, J. Endotoxin Res. 6: 453-457 (2000)）。

本明細書において開示する化合物の炎症に対する抑制効果を示すモデルには下記が含まれる。

敗血症ショックモデル：
Ref. Journal of Clinical Investigation 100: 972-985 (1997). Role of NF-κB in the mortality of Sepsis. 動物モデル：雌BALB/cマウス、10〜12週齢、18〜20gを、LPSの致死効果に感作させるため、滅菌PBS（pH7.4）0.1mL中の大腸菌（E. col）LPS（Sigma）混合物、1.75μgおよびD-ガラクトサミン（Sigma、滅菌PBS 0.1mL中15mg）を注射した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5939-5943 (1979)およびJ. Exp. Med. 165, 657-663 (1987)も参照されたい。死亡率を4、8、12、16、20、および24時間後にモニターした。

炎症モデル：
Chang, Eur. J. Pharmacol. 142: 197-205 (1987)に記載のPMAを用いての耳浮腫。イミダゾリン（様々な濃度）20μL、デキサメタゾン（40μg/耳）または媒体（DMSO：エタノール；25：75v/v）をマウスの右耳に、エタノールに溶解したPMA 20μL（5μg/耳）適用の30分前と30分後に局所適用した。耳の腫脹をPMA適用の6時間後にマイクロゲージを用いて測定し、治療（右）および未治療（左）の耳の厚みの差の平均で表した。p<0.05の値を統計学的に有意と考えた。

以下の実施例は本発明のさらなる理解を促進するためのものである。

実施例1〜20
実験の部：
Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-61（1）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（15mL）中のベンズアルデヒド（0.06g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.155g、74％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-5-(4-メトキシフェニル)-4-メチル-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-63（2）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（15mL）中のp-アニスアルデヒド（0.077g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.180g、78％）。

Dl-(3S,4S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-101（3）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（15mL）中のベンズアルデヒド（0.060g、0.57mmol）、4-フルオロアニリン（0.063g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.160g、74％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-125（4）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（2.1g、収率65％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-(1H-インドール-3-イルメチル)-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-128（5）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。4-(1H-インドール-3-イルメチル)-2-フェニル-4H-オキサゾル-5-オン（1.65g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（3.1g、収率68％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-150（6）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（15mL）中のピリジン-4-カルボキサルアルデヒド（0.061g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物を酢酸エチル/メタノール（4：1）を用いてオフホワイト固体として単離した（0.161g、76％）。

Dl(3S,4S)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸：16/17 [JK1-1-135]（7）を下記のとおりに調製した。

無水THF（30mL）中のイミダゾリン-4-カルボン酸10（0.1g、0.27mmol）およびシクロヘキセン（0.1mL、1.25mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら、これに10％Pd/C（45mg、0.06mmol）を加えた。懸濁液を36時間還流した。反応混合物を室温まで冷却し、エタノール（10mL）を加えた。混合物をセライト床を通してろ過し、エタノールで洗浄し、ろ液を減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノールを用いて精製し、白色固体を得た（0.070g、93％）。

Dl-(3S,4S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-メチル-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4,5-ジカルボン酸5-エチルエステル SP-1-175（8）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（15mL）中のトルエン中50％溶液（1.03g/ml）としてのグリオキサル酸エチル（0.058g、0.57mmol）、4-フルオロアニリン（0.063g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチル/メタノール（4：1）を用いて精製し、白色固体を得た（0.152g、72％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4-イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステル JK-1-183（9）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（30mL）中のdl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸12（0.1g、0.27mmol）の懸濁液を0℃でよく撹拌しながら、これに無水ジクロロメタン（5mL）中の塩化オキサリル（0.14g、1.1mmol）の溶液を加えた。DMF（0.001mL）の溶液を反応混合物に加え、0℃でさらに2時間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、反応混合物を0℃まで冷却し、その後、無水エタノール（20mL）を加えた。溶液をさらに1時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、反応混合物をジクロロメタン（30mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（1-0mL）および水（10mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いてさらに精製し、淡黄色油状物を得た（0.097g、91％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステル JK-1-186（10）を下記のとおりに調製した。

無水塩化メチレン（30mL）中のイミダゾリン-4-カルボン酸10（0.1g、0.27mmol）の懸濁液を0℃でよく撹拌しながら、これに無水ジクロロメタン（5mL）中の塩化オキサリル（0.14g、1.1mmol）の溶液を加えた。無水ジクロロメタン（1mL）中のDMF（0.001mL）の溶液を反応混合物に加え、0℃でさらに2時間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、反応混合物を0℃まで冷却し、その後、無水エタノール（20mL）を加えた。溶液をさらに1時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、反応混合物をジクロロメタン（30mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（10mL）および水（10mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いてさらに精製し、無色油状物を得た（0.095g、89％）。

Dl-(3S,4S)-1-メトキシカルボニルメチル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 JK-1-199（11）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（50mL）中の2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.5g、2.85mmol）およびTMSCl（0.37g、3.42mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（20mL）中の(ベンジリデン-アミノ)-酢酸メチルエステル（0.g、mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.70g、70％）。

1-ベンジル-5-(4-メトキシ-フェニル)-2,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-189（12）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（150mL）中のp-アニスアルデヒド（1.4g、10.4mmol）、ベンジルアミン（1.11g、10.4mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジメチル-4H-オキサゾリン-5-オン SP-1-188（1f）（1g、8.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（1.22g、11.3mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（1.9g、65％）。

Dl-(3S,4S)-1-(2-エトキシカルボニル-エチル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 JK-1-215（13）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（80mL）中の2-フェニル-4-ジメチル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.0g、5.7mmol）およびTMSCl（1mL、6.8mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（60mL）中の3-(ベンジリデン-アミノ)-プロピオン酸エチルエステル（1.4g、6.8mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（1.08g、51.4％）。

Dl-(3S,4S)-1-(1-メトキシカルボニル-エチル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 JK-1-192（14）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（50mL）中の2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.25g、1.5mmol）およびTMSCl（0.23mL、1.8mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（20mL）中の2-(ベンジリデン-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル（0.34g、1.8mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.340g、66％）。

1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾル-4-イル)-メタノール 14 [JK-1-123]（15）を下記のとおりに調製した。

無水THF（5mL）中の水素化アルミニウムリチウム（0.12g、0.3mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら、これに無水THF（5mL）中の1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（0.1g、0.27mmol）の溶液を0℃で滴下し、同じ温度で15分間撹拌し、氷冷飽和塩化アンモニウム溶液で反応停止し［警告：塩化アンモニウム溶液は0℃で約30分間維持し；最大限の注意を払って加えるべきである；極度の発熱反応で、反応混合物は0℃にすべきである］、次いで10％HCl（約10mL）を加えた。反応混合物を過剰の酢酸エチル（100mL）で希釈し、水（20mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溝付きろ紙でろ過し、有機層を減圧下で蒸発させて、粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いて精製した。収率：79％；粘稠油状物。

1-ベンジル-4-(2-メトキシカルボニル-エチル)-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-201（16）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（100mL）中のベンズアルデヒド（0.252g、2.4mmol）、ベンジルアミン（0.258g、2.4mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。3-(5-オキソ-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-オキサゾル-4-イル)-プロピオン酸メチルエステル SP-1-182（1e）（0.5g、2mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.282g、2.6mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.54g、60％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-2,4-ジメチル-5-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 15 [JK-1-238]（17）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（60mL）中の2,4-ジメチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.4g、3.5mmol）およびTMSCl（0.58mL、4.2mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（40mL）中のベンジル-ベンジリデン-アミン（0.82g、4.2mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.60g、60％）。

Dl-(3S,4S)-1-ベンジル-2,4-ジフェニル-5-ピリジン-4-イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸 SP-1-195（18）を下記のとおりに調製した。

無水ジクロロメタン（120mL）中のピリジン-4-カルボキシアルデヒド（0.61g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をジクロロメタン/エーテル混合物からの沈澱により精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（1.35g、収率55％）。

化合物19および20を下記のとおりに調製した。

1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸(1-フェニル-エチル)-アミドの1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸からの合成：JK-1-309。

無水塩化メチレン（25mL）中の1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（1.0g、0.27mmol）、(S)-(-)-1-フェニル-エチルアミン（0.36g、29mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら、これにEDCIHCl（0.57g、29mmol）を加え、5分後、塩化メチレン（10mL）中のDMAP（.35g、29mmol）の溶液を加え、5〜6時間撹拌した。反応混合物を水（2×10mL）、飽和炭酸水素ナトリウム（20mL）、水（20mL）、2N HCl（20mL）、次いで水（30mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチルヘキサン混合物（1：1）を用いて精製した。化合物19：収量（0.26g、40.7％）。

化合物20：（0.24g、38％）。

実施例21
すべての化合物の抗炎症活性の可能性を、インビトロでのNF-κBの活性を核抽出物中でBretonおよびCharbot-Fletcherからの方法を用いて調べることにより評価した（Breton et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 282 459-466 (1997)）。簡単に言うと、ヒトジャーカット白血病T細胞（クローンE6-1；アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス）を10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（614ng/mL）、ストレプトマイシン（10μg/mL）およびHepes緩衝液（pH7.2）を補足したRPMI-1640培地（Gibco-BRL、メリーランド州ベゼスダ）中、37℃、5％CO₂で培養する。続いて、ジャーカット細胞（1×10⁷細胞/mL）を様々な濃度のイミダゾリンにより37℃で30分間処理した後、PMA刺激（5.0ng/mL）をさらに5時間行う。核抽出物を二本鎖Cy3標識NF-κBコンセンサスオリゴヌクレオチド

と共に室温で20分間インキュベートする。粗製混合物を、1×トリスホウ酸/EDTA緩衝液中で調製した5％非変性ポリアクリルアミドゲルに載せ、200Vで2時間電気泳動する。電気泳動後、ゲルをNF-κB-DNA結合検出のためにホスフォイメジャー（Biorad FX PLUS）を用いて分析する。

細胞のイミダゾリンへの処理により、核内NF-κB活性の顕著な抑制が認められた。図3は、イミダゾリン8〜10による核内NF-κB-DNA結合の低下を明白に示している（図3、レーン5〜10）。

イミダゾリンで処理した細胞は、核内NF-κB活性の顕著な抑制を示した（図3）。図3は、100nM濃度のイミダゾリン8〜10存在下での核内NF-κB-DNA結合の顕著な低下を明白に示している（図3、レーン5〜10）。

レーン5でゆっくり移動するバンドが明らかにないことは、ジャーカット白血病T細胞において1μM濃度の化合物8による顕著（94％）なNF-κB抑制を示すものである。レーン6は100nM濃度の化合物8による核内のNF-κB-DNA結合の88％抑制を示している。

実施例22
すべての化合物をNF-κBを抑制する能力について試験し、収集したデータを表2に示す。現在、一連の化合物の中で最も活性が高いのは複素環式イミダゾリン9で、100nM濃度でNF-κBの88％抑制を示した。予備試験の結果は、イミダゾリンが72時間までは顕著な細胞毒性を示さないことを示している。

（表２）イミダゾリン1〜10によるNF-κBの抑制

一連の化合物の中で最も活性が高いのは化合物8であった。

哺乳動物ジャーカット細胞白血病T細胞におけるIC₅₀値：IC₅₀値は細胞内でタンパク質/酵素の50％が抑制される化合物の濃度と定義される（表3）。

（表３）

実施例23
化合物4、6、および7を、細菌の抑制について試験した。合計9つの細菌株をスクリーニングした。下記のグラム陰性およびグラム陽性菌が含まれた：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、エンテロバクター-エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、大腸菌（Esherichia coli）、クレブシエラ−ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、セラチア−マルセッセンス（Serratia marcescens）、バチルス-セリウス（Bacillus cerius）、バチルス-サチルス（Bacillus subtillus）およびミクロコッカス-ルテウス（micrococcus luteus）。細菌単離株を保存庫から取り出し、栄養寒天プレートに画線し、35℃で18〜24時間インキュベートした。3〜5の単離コロニーを食塩溶液5mLに懸濁することにより、希釈標準細菌懸濁液を調製した。この懸濁液の濁度を0.5マックファーランド標準液と等しくなるよう光度測定により注意深く調節した。阻止円の直径を、NCCLSガイドラインに従い、カチオン補足ミュラー-ヒントン寒天を用いての標準化ディスク分散法によりもとめた（National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. Fifth Edition: Approved Standard M7-A5. Wayne, PA: NCCLS (2000)）。最小阻止濃度（MIC）は、明白な阻止円を生じる最低濃度と考えた。接種寒天プレートを大気中、35℃で16〜20時間インキュベートした。阻止円の直径をミリメートルで読み取った。結果を表4に示す。

（表４）

実施例24
RIF-1マウス腫瘍モデルにおけるイミダゾリンの治療
いくつかのNF-κB抑制剤（化合物1、3、4、および6）を動物で試験した。腫瘍細胞をマウスの背部の両側に注射した。腫瘍が100mm³に達したら、マウスを化合物の腹腔内注射により治療した。腫瘍容積を週に3回、治療第1日のサイズの4倍に達するまで測定した。データを「4倍までの日数」または未治療対照群に対する治療群の「4倍までの日数」の比で記録する。

化合物4（1-SP-4-84）存在下でのシスプラチン（CDDP）およびカンプトテシン（CPT）によるマウスの併用治療は、シスプラチンの多大な化学相乗作用（chemopotentiation）を示した（図4A）。加えて、実験第22日にその容積の4倍未満のままであった腫瘍8つのうち4つはこの群であった。化合物4存在下でカンプトテシンの顕著な化学相乗作用は認められなかった。

化合物6（1-SP-6-95）は、シスプラチンならびにカンプトテシンの顕著な化学相乗作用を示した（図4B）。しかし、6による化学相乗作用は化合物4で見られたものほど強くはなかった。

イミダゾリン存在下および非存在下でのシスプラチン（CDDP）およびカンプトテシン（CPT）によるマウスの併用治療により、化合物1および3はシスプラチンまたはカンプトテシンいずれとも顕著な化学相乗作用を示さないことが判明した（データは示していない）。

化合物4のシスプラチンとの併用療法は、シスプラチン（0.82日）またはカンプトテシン（3.79日）単独と比べて10.27日を越える腫瘍成長遅延（日数）を示した（表5）。加えて、このRIF-1マウスモデルの腫瘍の半分は、化合物4との併用治療に曝露した場合、第22日の時点で腫瘍容積の4倍のカットオフ点に達しなかった。

（表５）腫瘍成長遅延のRIF-1マウスモデルにより評価したイミダゾリンの抗腫瘍効果
CGX-E060

^* 第22日に4倍未満の腫瘍8つのうち4つはこの群であった。
略語：CDDP（シスプラチン）およびCPT（カンプトテシン）およびIP（腹腔内注射）。

このデータは、一般的に用いられる抗癌剤の化学相乗作用におけるイミダゾリンの有効性を例示している。これらの新規NF-κB抑制剤（特に化合物4）による化学療法抵抗性の抑制は、抗癌剤単独での腫瘍の治療に比べて、腫瘍成長の著しい遅延をもたらす。

実施例25
図5および6に示すとおり、T細胞におけるNF-κBの強力な抑制剤である新しいクラスのイミダゾリンが合成されている。

発明者らは最近、置換イミダゾリンの高度にジアステレオ選択的な新規多成分ワンポット合成を報告した（図5）（Peddibhota et al., Org. Lett 4: 3533-3535 (2002)）。これらの低分子量骨格はアルキル、アリール、アシル、および複素環置換基に適用可能な4点の多様性を含む。驚くことに、アズラクトン（またはオキサゾロン）の使用は、立体選択的で多様性の高いイミダゾリン骨格群を効率的に合成するに至っていなかった。しかし、N-メチル化メソイオンオキサゾロン（または「ムンチョン」）を用いての1,3双極子付加環化は周知で、ピロールおよびイミダゾール合成のための一般的経路を提供する（Gerard and Rollines, Nat. Immunol. 2: 108-115 (2001)；Hart et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158: 1885-1592 (1998)；Makarov, Arthritis Res. 3: 200-206 (2001)）。少数のルイス酸をスクリーニングした後、発明者らはTMSClがオキサゾロンおよびイミンの反応を促進し、イミダゾリン骨格を単一のジアステレオマーとして非常に良好な収率で生じることを見いだした（図6）。多くのイミダゾリンのライブラリを調製し、そのうちのいくつかを生物学的性質について評価した。これらの物質をスクリーニングした後、発明者らはイミダゾリンがNF-κB活性化の強力な抑制剤であることを見いだした。これらの化合物の合成を以下に記載する。

特に記載がないかぎり、反応は窒素雰囲気下、乾燥器で乾燥したガラス容器内で行った。すべての市販試薬はそれ以上精製せずに用いた。すべての溶媒は試薬等級であった。THFは窒素雰囲気下でナトリウム/ベンゾフェノンから新しく蒸留した。トルエン、ジクロロメタンおよびTMSClは窒素雰囲気下でCaH₂から新しく蒸留した。すべての反応は磁気により撹拌し、Analtech 0.25mmプレコーティングシリカゲルプレートでの薄層クロマトグラフィによりモニターした。カラムクロマトグラフィはEM Scienceにより供給されるシリカゲル60（230〜400メッシュ）で行った。収率は特に記載がないかぎりクロマトグラフィおよび分光学的に純粋な化合物について言う。融点は顕微鏡付加装置付きのMel-Temp（Laboratory devices）装置でもとめた。赤外スペクトルはNicolet IR/42分光器で記録した。プロトン、炭素、およびNMRスペクトルはVarian Gemini-300分光器またはVarian VXR-500分光器で記録した。化学シフトは溶媒クロロホルム（¹Hではδ7.24、¹³Cではδ77.0）およびジメチルスルホキシド（¹Hではδ2.49、¹³Cではδ39.5）の残留ピークに対して報告する。高分解能質量スペクトルはUniversity of South Carolina, Department of Chemistry & BiochemistryのMass Spectrometry LaboratoryでMicromass VG-70S質量分析計で得た。ガスクロマトグラフィ/低分解能質量スペクトルはTRIO-I EI質量分析計に連結したHewlet-Packard 5890 Series IIガスクロマトグラフで記録した。すべての化学物質はAldrich Chemical Co.から入手し、受け取ったままで用いた。

（表６）

^* 誘導体：kおよびl-エチルエステル；m-アルコール。

（表７）

^* 誘導体：kおよびl-エチルエステル；m-アルコール。

前述の化合物の一般合成法は下記のとおりであった。

2-オキサゾリン-5-オンの合成は下記のとおりであった。ジクロロメタン（20mL）中のベンゾイルアミノ酸（2mmol）およびEDCI.HCl（2mmol）の溶液を0℃で、ラセミ化合物の場合は1時間、光学活性化合物の場合は15分間撹拌した。反応混合物を冷（氷を含む）水、NaHCO₃水溶液、および水（各10mL）で逐次洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発乾固させて、オキサゾロンを固体または油状物で得た。

イミダゾリン-4-カルボン酸の合成は下記のとおりであった。無水トルエン/無水ジクロロメタン（10mL）中のアルデヒド（1mmol）およびアミン（1mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。溶媒を減圧下で蒸発させ、イミンをジクロロメタン（10mL）に再溶解した。この溶液にオキサゾロン（1mmol）およびクロロトリメチルシラン（1.3mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をジクロロメタン/ヘキサン（1：1）から沈澱させるか、または酢酸エチル/メタノール（4：1）を用いてのシリカゲルクロマトグラフィ後に単離した。

化合物33（2a）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（15mL）中のベンズアルデヒド（0.06g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.155g、74％）。HRMS (EI): calculated for C₂₄H₂₂N₂O₂ [M-H]⁺ 369.1603, found [M-H]⁺ 369.1610；M. P.: decomposes at 185-190℃。

化合物34（2b）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-5-(4-メトキシフェニル)-4メチル-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（15mL）中のp-アニスアルデヒド（0.077g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.180g、78％）。HRMS (EI): calculated for C₂₅H₂₄N₂O₃ [M-H]⁺ 397.1709, found [M-H]⁺ 399.1717；M. P.: decomposes at 205-208℃。

化合物28（2c）、dl-(4S,5S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（15mL）中のベンズアルデヒド（0.060g、0.57mmol）、4-フルオロアニリン（0.063g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.160g、74％）。HRMS (EI): calculated for C₂₃H₁₉FN₂O₂ [M-H]⁺ 373.1352, found [M-H]⁺ 373.1359；M. P.: decomposes at 230-232℃。

化合物31（2d）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（15mL）中のピリジン-4-カルボキシルアルデヒド（0.061g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.061g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物を酢酸エチル/メタノール（4：1）を用いてオフホワイト固体として単離した（0.161g、76％）。HRMS (EI): calculated for C₂₃H₂₁N₃O₂ [M-H]⁺ 370.1556, found [M-H]⁺ 370.1556；M. P.: decomposes at 185-190℃。

化合物29（2e）、dl-(4S,5S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-メチル-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4,5-ジカルボン酸5-エチルエステルを下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（15mL）中のトルエン中50％溶液（1.03g/mL）としてのグリオキサル酸エチル（0.058g、0.57mmol）、4-フルオロアニリン（0.063g、0.57mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.1g、0.57mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.08g、0.74mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチル/メタノール（4：1）を用いて精製し、白色固体を得た（0.152g、72％）。HRMS (EI): calculated for C₂₀H₁₉FN₂O₄ [M-H]⁺ 369.1251, and observed [M-H]⁺ 369.1255；M. P.: decomposes at 190-193℃。

化合物40（2g）、dl-(4S,5S)-1-メトキシカルボニルメチル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成調製した。無水ジクロロメタン（50mL）中の2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.5g、2.85mmol）およびTMSCl（0.37g、3.42mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（20mL）中の(ベンジリデン-アミノ)-酢酸メチルエステル（0.g、mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.70g、70％）。MS (EI): calculated for C₂₀H₂₀N₂O₄ (m/z) 352.14, observed m/z=353.2；M. P.: decomposes at 215-217℃。

化合物42（2h）、dl-(4S,5S)-1-(1-メトキシカルボニル-エチル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（50mL）中の2-フェニル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（0.25g、1.5mmol）およびTMSCl（0.23mL、1.8mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（20mL）中の2-(ベンジリデン-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル（0.34g、1.8mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.340g、66％）。MS (EI): calculated for C₂₁H₂₂N₂O₄ (m/z) 366.4 observed m/z 366.6。M. P.: decomposes at 222-226℃。

化合物41（2i）、dl-(4S,5S)-1-(2-エトキシカルボニル-エチル)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（80mL）中の2-フェニル-4-ジメチル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.0g、5.7mmol）およびTMSCl（1mL、6.8mmol）の溶液をよく撹拌しながら、これに無水塩化メチレン（60mL）中の3-(ベンジリデン-アミノ)-プロピオン酸エチルエステル（1.4g、6.8mmol）の溶液を加え、混合物を窒素雰囲気下で10時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（1.08g、51.4％）。MS (EI): calculated for C₂₂H₂₄N₂O₄ (m/z) 380.44 observed m/z=380.7。M. P.: decomposes at 218-220℃。

化合物37（2J）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステルを下記のとおりに調製した。無水塩化メチレン（30mL）中のイミダゾリン-4-カルボン酸2a（0.1g、0.27mmol）の懸濁液を0℃でよく撹拌しながら、これに無水ジクロロメタン（5mL）中の塩化オキサリル（0.14g、1.1mmol）の溶液を加えた。無水ジクロロメタン（1mL）中のDMF（0.001mL）の溶液を反応混合物に加え、0℃でさらに2時間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、反応混合物を0℃まで冷却し、その後、無水エタノール（20mL）を加えた。溶液をさらに1時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、反応混合物をジクロロメタン（30mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（10mL）および水（10mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いてさらに精製し、無色油状物を得た（0.095g、89％）。MS (EI): calculated for C₂₆H₂₆N₂O₂ (m/z) 398.2, observed m/z=398.9。

化合物38（2k）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4-イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステルを下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（30mL）中のdl-(3S,4S)-1-ベンジル-4-メチル-2-フェニル-5-ピリジン-4イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸2d（0.1g、0.27mmol）の懸濁液を0℃でよく撹拌しながら、これに無水ジクロロメタン（5mL）中の塩化オキサリル（0.14g、1.1mmol）の溶液を加えた。無水ジクロロメタン（1mL）中のDMF（0.001mL）の溶液を反応混合物に加え、0℃でさらに2時間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、反応混合物を0℃まで冷却し、その後、無水エタノール（20mL）を加えた。溶液をさらに1時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、反応混合物をジクロロメタン（30mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（10mL）および水（10mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いてさらに精製し、淡黄色油状物を得た（0.097g、91％）。MS (EI): calculated for C₂₅H₂₆N₂O₂ (m/z) 399.19 observed m/z 399.3。

化合物45（2l）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾル-4-イル)-メタノールを下記のとおりに合成した。無水THF（5mL）中の水素化アルミニウムリチウム（0.12g、0.3mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら、これに無水THF（5mL）中の1-ベンジル-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（0.1g、0.27mmol）の溶液を0℃で滴下し、同じ温度で15分間撹拌し、氷冷飽和塩化アンモニウム溶液で反応停止し［警告：塩化アンモニウム溶液は0℃で約30分間維持し；最大限の注意を払って加えるべきである；極度の発熱反応で、反応混合物は0℃にすべきである］、次いで10％HCl（約10mL）を加えた。反応混合物を過剰の酢酸エチル（100mL）で希釈し、水（20mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溝付きろ紙でろ過し、有機層を減圧下で蒸発させて、粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィで酢酸エチルを用いて精製した。収率：79％；粘稠油状物、m/z: 357.2。

化合物39（2m）、dl-(4S,5S)-4-メチル-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水THF（30mL）中のイミダゾリン-4-カルボン酸2a（0.1g、0.27mmol）およびシクロヘキセン（0.1mL、1.25mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら、これに10％Pd/C（45mg、0.06mmol）を加えた。懸濁液を36時間還流した。反応混合物を室温まで冷却し、エタノール（10mL）を加えた。混合物をセライト床を通してろ過し、エタノールで洗浄し、ろ液を減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノールを用いて精製し、白色固体を得た（0.070g、93％）。MS (EI): calculated for C₁₇H₁₆N₂O₂ (m/z) 280.12 observed m/z: 280.1；M. P.: decomposes at 222-224℃。

化合物32（2n）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（2.1g、収率65％）。HRMS (EI): calculated for C₂₉H₂₄N₂O₂ [(M-H)-CO₂]⁺ 387.1526 and observed [(M-H)-CO₂]⁺ 387.1539；M. P.: decomposes at 153-155℃。

化合物35（2o）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-2,4-ジフェニル-5-ピリジン-4-イル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（120mL）中のピリジン-4-カルボキシアルデヒド（0.61g、0.57mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をジクロロメタン/エーテル混合物からの沈澱により精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（1.35g、収率55％）。MS (EI): calculated for C₂₄H₂₂N₂O₂ (m/z) 434.34, found (m/z) 434.2。

化合物30（2p）、dl-(4S,5S)-1-(4-フルオロフェニル)-2,4-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4,5-ジカルボン酸5-エチルエステルを下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（250mL）中のトルエン中50％溶液（1.03g/mL）としてのグリオキサル酸エチル（0.85g、8.3mmol）、4-フルオロアニリン（0.93g、8.3mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（2g、8.3mmol）およびクロロトリメチルシラン（1.16、10.8mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/エーテルからの沈澱により精製し、白色固体を得た（2.4g、68％）。MS (EI): calculated for C₂₅H₂₁FN₂O₄ [M]⁺ 432.15, and observed [M]⁺ 432.4。

化合物36（2q）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-(1H-インドール-3-イルメチル)-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。4-(1H-インドール-3-イルメチル)-2-フェニル-4H-オキサゾル-5-オン（1.65g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（3.1g、収率68％）。HRMS (EI): calculated for C₃₂H₂₇N₃O₂ [M-H]⁺ 484.2025 and observed [M-H]⁺ 484.2011；M. P.: decomposes at >250℃。

化合物44（2r）、dl-(4S,5S)-1-ベンジル-4-(2-メトキシカルボニル-エチル)-2,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（100mL）中のベンズアルデヒド（0.252g、2.4mmol）、ベンジルアミン（0.258g、2.4mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。3-(5-オキソ-2-フェニル-4,5-ジヒドロ-オキサゾル-4-イル)-プロピオン酸メチルエステル SP-1-182（1e）（0.5g、2mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.282g、2.6mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。生成物をジクロロメタン/ヘキサン混合物（1：1）を用いて白色固体として沈澱させた（0.54g、60％）。MS (EI): calculated for C₂₄H₂₂N₂O₂ (m/z) 442.5, found (m/z) 442.2。

化合物2s、dl-(4S,5S)-1,2-ジベンジル-4,5-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-ベンジル-4-フェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.43g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物はジアステレオマーの混合物（3：1比）で、収率60％で得た。上記トランス-ジアステレオマーをメタノール/エーテルからの沈澱を繰り返すことにより得た。HRMS (EI): calculated for C₃₀H₂₆N₂O₂ [(M-H)-CO₂]⁺ 402.5 and observed [(M-H)-CO₂]⁺ 402.1。

化合物46（2t）、dl-(4S,5S)-1,2-ジベンジル-4-メチル-5-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸、および化合物47（3t）、dl-(4S,5R)-1,2-ジベンジル-4-メチル-5-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸を下記のとおりに合成した。無水ジクロロメタン（250mL）中のベンズアルデヒド（1.13g、10.58mmol）、ベンジルアミン（1.13g、10.58mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2-ベンジル-4-メチル-4H-オキサゾリン-5-オン（2g、10.58mmol）およびクロロトリメチルシラン（1.48g、10.58mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。ジクロロメタン/エーテル混合物を用いて白色固体として沈澱下生成物（0.6g、30％）はシス異性体（3t）であることが判明した。次いで、トランス異性体（2t）が母液から沈澱した。次いで、痕跡量の（3）を除去し、特徴づけのために少量を再沈澱させた（0.15g、7％）。

化合物および合成法を表8および9にまとめている。

（表８）

^* 誘導体：kおよびl-エチルエステル；l-アルコール。

（表９）

N.O.-最適化していない。

実施例26
図5のイミダゾリンの、NF-κBの核移行を抑制する能力を記載する。NF-κBのp50/p65ヘテロダイマーの核移行抑制をp65-ELISAアッセイにより確認した。細胞をPDTC（陽性対照-IκBリン酸化を抑制し、したがってNF-κB移行を抑制すると報告されている）およびイミダゾリン32で、PMA活性化前に30分間処理し、続いて30分間のインキュベーション後に核抽出物を単離した。PDTCおよびイミダゾリンは100nM〜5.0μMの範囲の濃度でNF-κB p50/p65ヘテロダイマー移行の著しい抑制を示した（図7、イミダゾリン32の代表的滴定）が、ハイメニアルディシン（陰性対照-NF-κB-DNA結合を抑制するが、核移行は抑制しない）は抑制を示さなかった。したがって、これらの結果はイミダゾリン32がマイクロモルよりも低い濃度でNF-κB移行を著しく抑制することを示しており、PDTCよりも活性が高いことさえ判明した。同様の結果が化合物28〜33についても得られた（図8）。

化合物28〜33を、T細胞における毒性について評価し、著しい毒性を示さないことが明らかとなった。細胞死を48時間にわたって評価し、結果を表10に示し、「最も毒性」の抑制剤32の代表的グラフを図9に示す。

（表１０）

併用試験の前に、化合物の毒性をマウスモデルで調べた。化合物28〜33は100mg/kgまでの濃度でマウスに対し明らかな毒性は示さなかった。簡単に言うと、薬物をDMSOに溶解し、第0日に100μLをマウスに腹腔内注射（IP）で投与する。最初は、化合物28、32、および33の5.0および50mg/kg用量を用いた。これらがよく耐容された（図6A）ため、化合物29および31を50および100mg/kgで用いた（図10B）。体重が初期値から少なくとも10％低下しなければ、毒性は顕著ではないと考えた。体重および死亡を二つの毒性尺度とした。これらのモデルで2週間の間に毒性は観察されなかった。化合物30も同じ型の実験で非毒性であることが判明した。

結果は、これらの新規イミダゾリンが転写因子NF-κBの強力な抑制剤であることを示しており、T細胞および動物モデルにおいて非毒性であることが明らかとなった。炎症疾患、特定のウイルス感染症、自己免疫疾患などのNF-κB調節疾患および障害の治療、ならびに臓器および組織移植片拒絶の抑制において、非毒性の強力なNF-κB抑制剤の併用は有用である。

実施例27
本実施例はイミダゾリン28〜33のNF-κB活性化に対する抑制効果およびそのシスプラチンへの化学相乗能力を示す。

カンプトテシン（CPT）はカンレンボク（Camptotheca acuminata Decaisne）の果実の抽出物から単離されたアルカロイドで、トポイソメラーゼ抑制剤であることが明らかとなった（Denny, ACS Press: Washington, D. C., 483-500 (1995)）。現在のところ、CPT-11およびトポテカンを含むいくつかの水溶性類縁体は米国の臨床試験を成功裡に通過している（Wall, Med. Res. Rev. 18: 299-314 (1998)）。カンプトテシンは安定な三元トポイソメラーゼI-DNA切断可能複合体の生成を介してその抗腫瘍活性を示す。この切断されたDNA複合体の安定化がシグナリング経路を開始し、最終的にアポトーシス細胞死を引き起こす（Pommier et al., Biochim. Biophys. Acta 1400: 83-105 (1998)；Macdonald et al., Comprehensive natural products chemistry；Elsevier-North Holland: Amsterdam, pp 593-614 (1999)）。

トポイソメラーゼI-DNA切断可能複合体の安定化に加えて、カンプトテシンは核内転写因子NF-κBによって仲介されるDNA修復メカニズムも活性化する（Boland, Biochem Soc Trans 29: 674-678 (2001)；Bottero et al., Cancer Res 61: 7785-7791 (2001)；Huang et al., J Biol Chem 275: 9501-9509 (2000)；Piret and Piette, Nucl. Acids Res. 24: 4242-4248 (1996)）。カンプトテシン（CPT）などのDNA損傷物質によるNF-κBの活性化が、いくつかのグループにより異なる細胞株で報告されている（Bottero et al., Cancer Res 61: 7785-7791 (2001)；Huang et al., J Biol Chem 275: 9501-9509 (2000)；Piret and Piette, Nucl. Acids Res. 24: 4242-4248 (1996)）。CEM白血病T細胞はカンプトテシンによるNF-κB活性化に感受性であることが示され、これらの結果は発明者らの研究室でもEMSAアッセイを用いて確認された（図3）（Piret and Piette, Nucl. Acids Res. 24: 4242-4248 (1996)）。CEM細胞を様々な濃度のカンプトテシン（CPT）と共にまたはCPTなしでインキュベートした。陽性対照はPMA/PHA活性化を含んでいた（図11、レーン2）。レーン3は、NF-κB/DNA複合体を明白に同定するために、PMA/PHA活性化と、続くNF-κB p65抗体による抽出物の処理を用いての陽性対照を含んでいた。

予期されたとおり、核抽出物のp65抗体による処理は、NF-κB/DNA結合の著しい低下を引き起こした（レーン3）。陰性対照として、細胞を活性化せずにおき、核抽出物をNF-κBコンセンサス配列で処理して、NF-κBのわずかなバックグラウンドレベルのみを示した（レーン4）。CEM細胞を10μMから10nMの範囲の濃度のカンプトテシンで処理することで（図11、レーン5〜8）、NF-κB活性化による著しい量のNF-κB/DNA結合が認められた。

カンプトテシン仲介性NF-κB活性化のイミダゾリンによる抑制は下記のとおりである。NF-κB活性化の誘導は広範なシグナリング経路を介して進行しうる（Delhase et al., Science 284: 309-313 (1999)；Karin, Oncogene 18: 6867-6874 (1999)）。NF-κB活性化の抑制は多くの異なる経路の抑制を介して進行しうる（Epinat and Gilmore, Oncogene 18: 6896-6909 (1999)）。したがって、これらの経路の調節物質は一般的活性化抑制剤として作用しうるが、他にも特定の誘導経路を抑制するものもある（Epinat and Gilmore, Oncogene 18: 6896-6909 (1999)）。イミダゾリンがカンプトテシン誘導NF-κB活性化の特定の経路を抑制するかどうかを調べるために、発明者らはイミダゾリン存在下でカンプトテシン誘導NF-κB核結合の抑制を試験した。

CEM細胞を、カンプトテシン（0.1μM）による活性化の30分前に様々な濃度のイミダゾリン32で処理した。図12に示すとおり、イミダゾリン32を添加することで、カンプトテシン誘導NF-κB核結合が用量依存的様式で抑制された。対照レーンは下記を含んでいた：DNAのみ（レーン1）、PMA/PHA活性化NF-κB（レーン2）、スーパーシフトを提供する、p65抗体で処理したPMA/PHA活性化NF-κB（レーン3）および非活性化対照（レーン4）。NF-κBのカンプトテシンによる活性化はNF-κB-DNAを示す強いバンドを呈した（レーン5）。非選択的NF-κB抑制剤のPDTC存在下でのDNA結合の抑制は、結合の低下を引き起こした（レーン6）。10μMから10nM濃度の範囲のイミダゾリン32による処理後、カンプトテシン誘導DNA結合の同様の低下がレーン7〜10で明らかに認められる。レーン5（0.1μM CPTによる活性化）とレーン7（0.1μM CPT＋10μM化合物32による活性化）との比較により、NF-κB-DNA複合体生成の著しい低下が示されている。

イミダゾリン28〜33を、CEM細胞におけるカンプトテシンの活性を増強する能力について評価した。アポトーシスの誘導はカンプトテシンを含むほとんどの化学療法剤の特長である。アポトーシス細胞の系統的分解を活性カスパーゼによって行う（Thornberry et al., Nature 356: 768-774 (1992)；Nicholson et al., Trends Biochem. Sci. 22: 299-306 (1997)）。標準アポトーシスアッセイはPromegaのAPO-ONE均質カスパーゼ-3/7アッセイで、細胞においてアポトーシスの誘導を直接定量するためにこのカスパーゼ活性を利用する（Thornberry et al., Nature 356: 768-774 (1992)；Nicholson et al., Trends Biochem. Sci. 22: 299-306 (1997)）。NF-κB抑制が抗アポトーシスシグナリング経路の抑制-したがってアポトーシスの増強を介して化学療法剤の活性を増強するとの仮説に従い（Boland, Biochem Soc Trans 29: 674-678 (2001)；Chiao et al., Cancer 95: 1696-1705 (2002)）、発明者らはこのカスパーゼ3/7アッセイを用いてイミダゾリンの効果を調べた。このアッセイはイミダゾリン存在下および非存在下でのカンプトテシンにより誘導されるアポトーシス細胞死のレベルを定量し、カンプトテシンによりアポトーシス増強の直接レベルを確立することになる。代表的な細胞死のグラフを図13A〜Fに示す。

グラフは2つの非常に重要な生物学的効果を示している。イミダゾリンは薬物（イミダゾリン）だけの線（黒い三角）で示されるとおり、非毒性（またはCEM細胞において少なくとも著しい細胞毒性効果は示さない）と思われる。イミダゾリンは、トポイソメラーゼ抑制剤のカンプトテシン（CPT）と併用する場合、アポトーシスを顕著に誘導すると思われる（×の線 対 四角のCPTだけの線）。カンプトテシンの濃度はすべての実験で一定の0.1μMに維持し、イミダゾリンとの併用処理後にアポトーシスの顕著な用量-時間反応誘導が認められた。

（表１１）

^a 図13A〜Fに示すデータの完全なセット。
^b 一つの実験からのデータ。

ここまでのところ、一連の化合物の中で最も活性が高いものの一つはトリフェニル置換ベンジルイミダゾリン32である。イミダゾリン32は1.0μMでカンプトテシン誘導性のアポトーシスのレベルを4倍に増強した（表11および図14参照）。

このアポトーシス（カスパーゼ-3）アッセイで細胞を1.0μMまでのイミダゾリンだけで48時間処理した場合、ならびに10μMまでのイミダゾリンで72時間の細胞計数により試験した場合、細胞死の顕著な誘導は見られなかった（データは示していない）。いくつかの他のイミダゾリンによるアポトーシス誘導についての発明者らの結果を表11にまとめている。

これは、CEM細胞を0.1μMカンプトテシン（CPT）で処理した48時間後のアポトーシス細胞死の数を、0.1μMカンプトテシン（CPT）および1.0μMイミダゾリン32で併用処理した後の死滅細胞の数と比較することにより評価した。

同様の実験において、イミダゾリン32はシスプラチンに対して化学相乗効果を有することが判明した（図15Aおよび15B）。0.1マイクロモル濃度のシスプラチンと0.1マイクロモル濃度の32との併用は、1.0マイクロモル濃度のシスプラチン（10倍増加）自体よりもT細胞（CEM細胞）において多くのアポトーシスを誘導することが明らかとなった。

材料と方法
NF-κB-DNA結合についてのEMSAアッセイは下記のとおりであった。ヒトジャーカット白血病T細胞（クローンE6-1；アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル）を10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（614ng/mL）、ストレプトマイシン（10μg/mL）およびHEPES緩衝液（pH7.2）を補足したRPMI-1640培地（Gibco-BRL、メリーランド州ロックビル）中、37℃、5％CO₂で培養した。続いて、ジャーカット細胞（1×10⁶細胞/mL）を様々な濃度の化合物により37℃、5％CO₂で30分間処理した後、PMA（50ng/mL）およびPHA（1mM/mL）刺激をさらに30分間行った。細胞を遠心分離により回収し、氷冷PBSで洗浄し、核抽出物を以前に記載されたとおりに調製した（Dignam, et al., Nucl. Acids Res 11: 1475-1489 (1983)）。抽出物のタンパク質濃度をBioRad試薬でBradford (1976)の方法に従って定量した。核抽出物を二本鎖Cy3標識NF-κBコンセンサスオリゴヌクレオチド

と共に室温で20分間インキュベートする。結合混合物（25mL）は10mM HEPES-NaOH（pH7.9）、4mMトリス-HCl（pH7.9）、6.OmM KCl、1mM EDTA、1mM DTT、10％グリセロール、0.3mg/mLウシ血清アルブミンおよび1mgポリ(dI.dC)を含んでいた。結合混合物（核抽出物タンパク質10mg）をCy3標識オリゴヌクレオチド（0.16pmol）と共に室温で20分間インキュベートした。混合物を、1×トリスホウ酸/EDTA緩衝液中で調製した4％ポリアクリルアミドゲルに載せ、200Vで20分間電気泳動した。電気泳動後、ゲルをNF-κB--DNA結合検出のためにホスフォイメジャー（Biorad FX PLUS）を用いて分析した。

p65-ELISAアッセイによる移行の抑制は下記のとおりであった。核内に移行したp65/p50ヘテロダイマーの量をNF-κB p65サンドイッチELISAアッセイ（Imgenex Corp.）を用いて測定した。ジャーカット細胞を2×10⁶細胞/mLまで培養し、50ng/mL PMAおよび1μg/mL PMA/PHAで処理し、37℃、5％CO₂でインキュベートした。細胞を30分後に回収し、核抽出物をDignamらによって以前に記載されたとおりに調製する（Dignam, et al., Nucl. Acids Res 11: 1475-1489 (1983)）。次いで、NF-κB p65サンドイッチELISAキットを製造者のプロトコルに従って用い、核内に移行したp65をモニターし、定量した。PDTCはNF-κB移行の抑制剤であると報告されており、発明者らのデータはこれがNF-κB移行を100nMから5.0μMの範囲の濃度で抑制することを確認した。

カスパーゼ3/7アッセイを用いてのアポトーシスの誘導は下記のとおりであった。CEM細胞（CCRF-CEM）；アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル）を10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（614ng/mL）、ストレプトマイシン（10μg/mL）およびhepes緩衝液（pH7.2）を補足したRPMI-1640培地（Gibco-BRL、メリーランド州ロックビル）中、37℃、5％CO₂で培養した。DMSOをすべての薬物のベクターとして用い、対照実験に加えた。細胞培養物を1μM、0.1μMまたは10nMのイミダゾリンで処理し、37℃、5％CO₂でインキュベートした。一定量を96穴ウェルプレートに移し、等量のApo-ONE（商標）均質カスパーゼ-3/7アッセイ（Promega Corporation）試薬と混合した。プレートの内容物をゆっくり混合し、1時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光をMolecular Imager FX Proにより、532nmで測定した。報告したデータは、特に記載がないかぎり、すべて2つの独立した実験の平均であった。

2002の良好な収率と高いジアステレオ選択性の、アズラクトン鋳型への塩化トリメチルシリル仲介性1,3-双極子付加環化を用いての抗イミダゾリンの調製（スキーム3；図16）（Arlt, A., et al., Oncogene 20, 859-868 (2001)；およびLin, Y. C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 552-556 (1995)）。加えて、この経路はシン-またはアンチ-イミダゾリンのジアステレオ選択的生成法も提供する（Sharma, V., et al., Org. Lett. 7, 5091-5094 (2005)）。これらの2つのアプローチを用いて、50を越える化合物をシスまたはトランスイミダゾリンのいずれかとして調製した。完全なジアステレオ選択性（>95：5）はR-部分の性質によって得ることができる。アンチ-ジアステレオマーはR₁＝フェニル基およびR₂＝アルキルまたはアリール基で得ることができた。しかし、R₁がメチルで、R₂がメチル、ベンジルまたはイソプロピルである場合、ジアステレオマーの混合物が得られた。シン-イミダゾリンはR₂置換基＝アリール基で主要または単一生成物として得られた。これらの結果は、π-受容体R₃の可能な役割を示唆している。ラセミイミダゾリンTCH-001は、発明者らが以前に報告したオキサゾロンおよびイミンのTMSCl仲介性1,3-双極子付加環化を介して調製したラセミイミダゾリンのライブラリから最も有効な化合物と同定された。このトランス（R₂とR₃に関して）イミダゾリンの小さいグループを、カスパーゼによるApo-One（商標）アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を用い、CEM細胞におけるCPT誘導アポトーシスを増強する能力について評価した（図17）。

図18Aは、CEM細胞においてCPTと共に48時間インキュベートした場合の、ラセミイミダゾリンTCH-001（化合物1d、図17）の効果を示している。CEM細胞におけるCPT誘導アポトーシスの増強を、≦10nM CPTの濃度で調べ、ここで化合物は白血病細胞のDNA異常を引き起こすが、著しいアポトーシスは見られない（Cusack, J. C, Jr., et al., Cancer Res. 60, 2323-2330 (2000)）。細胞のイミダゾリンによる処理はアポトーシスのレベルには影響がなく（図18A）、イミダゾリンが顕著な細胞毒性を示さないことが示唆された。10nM CPTによる処理は12時間後に始まる一部の細胞死を引き起こした。細胞を非細胞毒性ラセミTCH-001（10nM）で前処理し、続いてCPT（10nM）で処理すると、48時間後に完全なアポトーシス細胞死を引き起こした（図18A）。しかし、CPT処理の1時間後にラセミTCH-001を加えても、アポトーシスの誘導に効果はない。このラセミTCH-001による前または後処理の異なる効果は、ラセミTCH-001がCPTにより開始される「生存シグナル」を遮断することを示している。Apo-One（商標）アッセイと一致して、Yo-pro 1染色した細胞集団を蛍光顕微鏡検査にかけると、蛍光の増大により特長づけられる細胞透過性の増大が観察された（図18C）。

図19Aは、NF-κBのラセミTCH-001による抑制の提唱メカニズムを示している。

ラセミTCH-001がカンプトテシン誘導NF-κB活性化の特定の経路を抑制するかどうかを調べるために、ラセミTCH-001存在下でのカンプトテシン誘導NF-κB-DNA結合の抑制を図19Bに示すとおりに調べた。CEM細胞を、カンプトテシン（1μM）による処理の30分前に様々な濃度のラセミTCH-001で処理した。ピロリジンジチオカルボン酸（PDTC）は非選択的NF-κB抑制剤で、陽性対照（レーン7）として用いた。2時間インキュベートした後、核を単離し、標識κBコンセンサス配列で処理した。ラセミTCH-001の添加は、カンプトテシン誘導NF-κB-DNA結合を用量依存的様式で抑制した（レーン8〜12）。例えば、レーン5（1μM CPTで活性化）をレーン8（1μM CPT＋1μMラセミTCH-001で活性化）と比較すると、NF-κB-DNA複合体生成の著しい減少が認められる。

図20Aは、ラセミTCH-001によるNF-κBのカンプトテシン誘導核移行の抑制について提唱されるモデルを示している。

次に、NF-κBの核移行を抑制するラセミTCH-001の能力を、図20Bに示すとおり、p65サンドイッチELISAアッセイを用いて調べた。NF-κBの活性化を0.5時間行い、NF-κBのTNF-α活性化を陽性対照として用い、移行したp65のレベルを100％に正規化した。陰性対照は活性化なしの核p65のレベルを含んでいた（Roshak, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 955-961 (1997)；Breton, J.J., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 282 459-466 (1997)）。細胞をTNF-αまたはCPT（1.0μM）で処理すると、核内NF-κBの著しい増加を引き起こした（それぞれカラム1および2）。対照として、細胞を非選択的NF-κB抑制剤（PDTC（5μM））で前処理すると、CPT活性化後に核移行の顕著な抑制が見られた（カラム3）。活性化の30分前に細胞をラセミTCH-001で前処理しても、移行の顕著な抑制が認められた（カラム4）。様々な濃度範囲のイミダゾリン（1〜100nM）が移行の抑制を引き起こした。同様の結果がTNF-αで活性化したHeLa細胞ならびにPMA/PHAで活性化したジャーカット細胞で得られた（データは示していない）。これらの知見はラセミTCH-001がナノモル濃度のレベルでNF-κBの核移行を抑制することを示している。

キナーゼ活性の抑制
インビトロキナーゼアッセイ：ラセミTCH-001をインビトロで下記の英国Upstateによるキナーゼに対して、Kinase Profiler Assayを製造者のプロトコルに従い用いて試験した：AMPK、Axl、Blk、CDK2/サイクリンE、CDK5/p35、c-RAF、Fes、Flt3、Fyn、1GF-1R、IR、JNK1α1、JNK2α2、JNK3、Lck、Lyn（ヒト）、MAPK1、MAPK2（ヒト）、MEK1、MKK4、MKK6、MKK7b、MSK1、p70S6K、PDK1、PAK2、PKA（ヒト）、PKBβ、PKCα、PKCy、PKCδ、PKCε、PKCμ、SGK、Yes、Syk、TrkB、ZAP-70。いかなるキナーゼ活性の抑制も検出されなかった（イミダゾリン濃度10μMまで試験した）。これらの試験に基づき、ラセミTCH-001がキナーゼ活性の抑制を介して核移行を抑制するとは考えられない。

提唱されるI-κB分解の抑制を図21Aに示す。I-κBのCPT誘導リン酸化およびその後の分解を、図21Bに示すとおり、ラセミTCH-001存在下および非存在下、細胞質抽出物でpS32 ELISAを用いて評価した。2μM CPTを用いての経時的実験により、I-κBリン酸化には60分が最適な時間であることが判明した（データは示していない）。イミダゾリンによる前処理を行った、または行っていない、CPT処理細胞からの細胞質抽出物をSer-32および36のリン酸化について分析した。プロテアソーム抑制剤であるAlln（N-アセチル-Leu-Leu-ノルロイシナル）（Tozawa, K., et al., Urological Research 30, 53-58 (2002)；Schow, S. R., et al., Cell Immunol 175, 199-202 (1997)）およびIKK抑制剤であるパルテノライド（parthenolide）（Kwok, B. H., et al., Chem Biol 8, 759-766 (2001)；Hehner, S. P., et al., J. Immunol 163, 5617-5623 (1999)）を対照として用いて、NF-κB移行および遺伝子転写につながるI-κB分解に関与する二段階をマークした。pS32 ELISAと並行して、リン酸化パーセントを正確にもとめるために全I-κBレベルを測定した。予期されたとおり、プロテアソーム抑制剤のAllnはリン酸化I-κBの蓄積を示す（カラム3）が、IKKキナーゼ抑制剤はリン酸化の低下を示した（カラム4）。ラセミTCH-001による細胞の前処理の後、リン酸化I-κBαの蓄積が観察された。値をI-κBの全量に対して正規化し、CPT活性化についてはIC₅₀値190nM、TNF-α活性化についてはIC₅₀値2.2nMを得た。

CPT誘導NF-κB転写の抑制
NF-κB仲介性遺伝子転写に影響するラセミTCH-001の能力を示すために、発明者らは図22に示すとおり、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてNF-κB仲介性ルシフェラーゼ産生の抑制を評価した。HeLa細胞に6×κB駆動レポーター遺伝子pNF-κB-Lucを形質移入し、ラセミTCH-001、パルテノライド、ALLNおよびDMSO対照存在下および非存在下で、TNF-α（10ng/μL）またはカンプトテシン（3μM）で活性化した。ルシフェラーゼ産生をDual-Gloレポーターアッセイ（promega）を用いて分析した。構成的に活性化したプラスミドpFC-MEKKを転写の陽性対照として用いた。pCIS-CKをκB駆動レポーター遺伝子に対する陰性対照として用いた。pRL-TKをコレポーターとして用いた。ラセミTCH-001は、細胞をTNF-αで活性化した場合のNF-κB誘導転写を52％抑制し、EC₅₀値は0.95μMであった。イミダゾリンはCPT誘導NF-κB転写をEC₅₀値9.8μMで抑制した。

化学療法剤の増強
イミダゾリン1dの癌細胞；CEM、HT1080、HeLaおよび非癌性線維芽細胞（SL89）への効果を、CPTおよびCDDPが95％アポトーシスを誘導する濃度（CC₉₅）併用）を計算することにより定量した。表13から、癌性細胞株のみがアポトーシスの強い増強を示すことが明らかである。CPTおよびCDDP両方のCC₉₅値は、癌性細胞をイミダゾリンで前処理した後に激しく低下した（74倍まで）。非癌性線維芽細胞（SL89）では、ラセミTCH-001による前処理後にアポトーシスの増加は見られなかった。

（表１３）有効性の癌細胞特異的増強
^* データは薬物曝露48時間後の2つの独立した実験の平均で報告。イミダゾリン自体は顕著なレベルのアポトーシスを誘導しなかった（10μMまで試験）。CPT＝カンプトテシン、CDDP＝シスプラチン。

白血病細胞におけるアポトーシスシグナルの増強を定量するために、追加の実験を行った。簡単に言うと、試験を次の2つの実験群に分けた：1つは薬剤を細胞に持続的に曝露し、もう1つは細胞を最初に薬物に曝露した後、薬物を除去して新鮮培地を補足した。細胞を1、10および100nM濃度のイミダゾリンで予備インキュベートし、その後滴定範囲のCPT濃度に曝露した。様々な時点でデータを取り、解析した。データを表14にまとめており、イミダゾリンで前処理した細胞におけるカンプトテシンのCC₉₅に対する効果を示す。

表14は、持続的曝露および洗浄細胞において95％細胞毒性を引き起こす細胞毒性濃度の比較を示しており、2つの独立した実験の平均である。NT：試験していない。

（表１４）

強化はDNA損傷を必要としうる
ラセミTCH-001が、タキソール、ビンクリスチン、カンプトテシンおよびシスプラチンを含む様々な抗癌剤による薬物仲介性細胞死を強化しうるかどうかを調べた。CEM細胞において、DNA損傷を誘導する薬剤（シスプラチンおよびカンプトテシン）は、図23に示すとおり、イミダゾリンによる前処理後にアポトーシスの強い増強を一貫して示した。しかし、ラセミTCH-001は、CEM細胞において、チューブリン抑制剤であるタキソールの非常に軽微な増強しか示さず、ビンクリスチンについては顕著な増強は示さなかった。さらなる調査により、タキソールはCEM細胞においてNF-κBを活性化しないが、CPTはNF-κBを用量依存的様式で活性化することが判明した。これは、DNA損傷に関連する薬物誘導アポトーシスおよび抗アポトーシスシグナリング経路がラセミTCH-001による有効性の増強に移入されることを示唆している。

ラセミTCH-001の化学分割ならびにSS鏡像異性体TCH-002およびRR鏡像異性体TCH-003の生物学的活性
ラセミTCH-001を、R(+)-1-フェニルエタノールとのEDCI仲介性エステル化により化学的に分割して2つのジアステレオマーエステルとし、これを加水分解して(S,S)鏡像異性体TCH-002および(R,R)鏡像異性体TCH-003を全収率44％で得た（スキーム4）。鏡像異性体を結晶化し、これらの絶対配置をX線結晶学により決定した（スキーム4；図24）。ジアステレオマーエステルならびに鏡像異性体2および3を、CPTによる48時間のアポトーシスの増強について試験した。いずれの化合物も48時間で著しい細胞死を誘導しなかったが、(R,R)鏡像異性体TCH-003はCPTのアポトーシス作用を強化し（CC₉₅併用＝0.53nM、83倍の増強）、これは(S,S)鏡像異性体TCH-002（CC₉₅併用＝2.4nM、18倍の増強）のほぼ5倍であった。エステルはカスパーゼによるApo-Oneアッセイ（商標）で評価して、アポトーシスの強い増強を示さなかった（データは示していない）。

FACS分析
アポトーシスは核内の特徴的変化、ミトコンドリア機能の損失、膜小疱形成などを含む複雑な細胞のメカニズムである（Hengartner, M. O., Science 267, 1456-1462 (1995)）。CEM細胞をラセミTCH-001（添付の図24において化合物1dと表記）、SS鏡像異性体TCH-002、およびRR鏡像異性体TCH-003で30分間処理し、その後0.01μM CPTで12時間および48時間処理した。所望の時点で、細胞を回収し、染色し、分類した。フローサイトメトリー実験で確認し、ラセミTCH-001、SS鏡像異性体TCH-002、およびRR鏡像異性体TCH-003はそれ自体ではアポトーシスを誘導しなかった（図24B、上図）が、CPTとの併用でアポトーシスを増強した（図24B、下図）。

化合物の調製
ラセミTCH-001
dl-(3S,4S)-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸：
無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で4時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（2.1g、収率65％）。M.P.: decomposes at 153-155℃。

(4S,5S)ラセミTCH-001（2）：
M.P. decomposed at 148-149℃。[α]_D=-47.58°, c=1, CHCl₃；

(4R,5R)ラセミTCH-001（3.HCl）：
M.P. decomposed at 147-148℃。[α]_D=+47.87°, C=1, CHCl₃；M.P. decomposed at 147-149℃。

化合物1d
dl-(3S,4S)-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸：
無水ジクロロメタン（120mL）中のベンズアルデヒド（0.6g、5.7mmol）、ベンジルアミン（0.61g、5.7mmol）の溶液を窒素雰囲気下で2時間還流した。2,4-ジフェニル-4H-オキサゾリン-5-オン（1.35g、5.7mmol）およびクロロトリメチルシラン（0.8g、7.4mmol）を加え、混合物を窒素雰囲気下で6時間還流し、次いで室温で終夜撹拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィでエタノール/酢酸エチル（1：5）を用いて精製し、生成物をオフホワイト固体で得た（2.1g、収率65％）。M.P.: decomposes at 153-155℃。

ジアステレオマーの調製−図26Aおよび26B
化合物2および3：
窒素雰囲気下、火炎乾燥したフラスコ内で、無水塩化メチレン（20ml）中の1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（0.1g、0.18mmol）の懸濁液をよく撹拌しながら0℃に維持した。この混合物にEDCI.HCl（36mg、0.18mmol）と、続いてDMAP（22mg、0.18mmol）を加え、20分間撹拌した。(R)-(+)-1-フェニル-エタノール（43.5mg、2eq.、0.36mmol）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を2N HCl（2×20ml）、飽和炭酸水素ナトリウム（2×20ml）、および食塩水（20ml）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで40％エーテル/ヘキサン混合物を用いて精製した。これらを特長分析し、還流下、2N NaOH/EtOHで別々に加水分解した。反応混合物を冷却し、pH3まで酸性化し、CHCl₃で抽出した。有機層を乾燥し、減圧下で蒸発させて、2つの鏡像異性体を収率44％で得た。
ジアステレオマー（SSR）：
S,S,R-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸1-フェニル-エチルエステル:

ジアステレオマー（RRR）：
R,R,R-1-ベンジル-2,4,5-トリフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-4-カルボン酸1-フェニル-エチル:エステル

(4S,5S)-1-ベンジル-4,5-ジヒドロ-2,4,5-トリフェニル-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（2）:
M. P. decomposed at 148-149℃。

(4R,5R)-1-ベンジル-4,5-ジヒドロ-2,4,5-トリフェニル-1H-イミダゾール-4-カルボン酸（3.HCl）:
M. P. decomposed at 147-148℃。

本明細書では本発明を例示した態様に関連して記載しているが、本発明はそれに限定されるものではないことが理解されるべきである。当業者であればその範囲内の他の改変および態様を理解するであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

化合物1から20の構造を示す。 代表的な化合物1のX線結晶構造を示す。 イミダゾリン8〜10を用いた核抽出物のEMSAである。レーン1、DNAのみ（対照）；レーン2、DNA、核抽出物（10μg）およびp50ホモダイマー（対照）；レーン3、DNA、PMA活性化した核抽出物（10μg）（対照）；レーン4、DNA、PMA活性化していない核抽出物（10μg）（対照）；レーン5、DNA、化合物8（1.0μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）；レーン6、DNA、化合物8（0.1μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）；レーン7、DNA、化合物9（1.0μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）；レーン8、DNA、化合物9（0.1μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）；レーン9、DNA、化合物10（0.1μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）；レーン10、DNA、化合物10（0.1μM）でPMA活性化後の核抽出物（10μg）。 図4Aおよび4Bは、化合物4および6による腫瘍成長の遅延を示す。 イミダゾリン骨格28〜33の合成を示す。 新規イミダゾリン28〜50の構造を示す。37および38は(COCl)₂、EtOHによるエステル化後である。39はH₂、5％Pd/Cによる水素添加後である。 p65 ELISAで評価しての化合物32によるNF-κBの核移行の抑制を示す。 p65 ELISAで評価しての化合物28〜33によるNF-κBの核移行の抑制を示す。 化合物32に反応しての経時的細胞死がわずかであることを示す。 化合物28、32、および33がマウスに対して有毒でないことを示す。 化合物29および31がマウスに対して有毒でないことを示す。 カンプトテシンによるNF-κB活性化についてのEMSAアッセイを示す。レーン1：NF-κBコンセンサスオリゴヌクレオチド（0.16pmol/λ）；レーン2：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（PMA/PHA、20μg）；レーン3：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（PMA/PHA、20μg）＋抗体p65；レーン4：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（-PMA/-PHA、20μg）；レーン5：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（10μM CPT、20μg）；レーン6：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（1μM CPT、20μg）；レーン7：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT、20μg）；レーン8：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.01μM CPT、20μg）。CPTとのインキュベーションはすべて2時間行った。PMA/PHAの陽性対照は4時間インキュベートした。 イミダゾリン32によるCPT活性化NF-κBの抑制についてのEMSAアッセイを示す。レーン1：NF-κBコンセンサスオリゴヌクレオチド（0.16pmol/λ）；レーン2：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（PMA/PHA）；レーン3：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（PMA/PHA）＋抗体p65；レーン4：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（-PMA/-PHA）；レーン5：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT）；レーン6：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT＋5μM PDTC）；レーン7：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT＋10μM 32）；レーン8：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT＋1μM 32）；レーン9：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT＋0.1μM 32）；レーン10：NF-κBコンセンサスオリゴ（0.16pmol/λ）＋核抽出物（0.1μM CPT＋0.01μM 32）。CPTとのインキュベーションはすべて2時間行った。PMA/PHAの陽性対照は4時間インキュベートした。 1μMイミダゾリン31によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 0.1μMイミダゾリン31によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 0.01μMイミダゾリン31によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 1μMイミダゾリン30によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 0.1μMイミダゾリン30によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 0.01μMイミダゾリン30によるCEM細胞のカンプトテシンに対する増感を示す。 CPT（0.1μM）と様々な濃度のイミダゾリン32との併用処理において48時間後に測定したアポトーシスの用量依存的増強を示す図である。 イミダゾリン32によるシスプラチンの化学相乗作用を示す。黒い丸は0.1μMシスプラチンおよび0.1μMイミダゾリン32であり；黒い三角は1.0μMシスプラチンであり；黒い四角は0.01μMシスプラチンであり；黒い菱形は10μMイミダゾリン32である。 イミダゾリン32および0.1μMシスプラチンの用量反応を示す。 トランスおよびシス-イミダゾリン合成のスキーム3を示す。 ラセミイミダゾリン1a〜1hの増強活性を示す図である。CEM細胞においてカンプトテシン（10nM）により誘導されたアポトーシス反応の調節におけるトランスイミダゾリンの比較。化学相乗指数（CI）を、イミダゾリンが白血病細胞におけるカンプトテシンの有効性を増強しうるかどうかを調べるアッセイの基本的結果と規定した。 図18Aは、イミダゾリンラセミTCH-001（化合物1dとして示す、図18）を前処理としてCPTと共に48時間インキュベートした場合のCEM細胞に対する効果を示すグラフである。図18Bは、後処理を示すグラフである。図18Cは、透過性増大による細胞における蛍光結果を示す。 図19Aは、化合物1d（ラセミTCH-001）によるNF-κB抑制の模式図である。図19Bは、ゲル電気泳動の結果を示す。 図20Aは、化合物1d（ラセミTCH-001）によるNF-κB移行の抑制を示す模式図である。図20Bは、移行の抑制の結果を示す棒グラフである。 図21Aは、ジアステレオマー1d（ラセミTCH-001）によるI-κB分解の抑制を示す模式図である。図21Bは、結果を示す棒グラフである。 化合物1d（ラセミTCH-001）によるNF-κB仲介性ルシフェラーゼ産生の抑制を示すグラフである。 タキソールがNF-κBを活性化するはたらきをしないことを示す棒グラフである。 1d（ラセミTCH-001）から化合物TCH-002およびTCH-003を生成するためのスキーム4を示す。 図25Aおよび25BはCEM細胞で測定したカスパーゼ3/7活性を示す。ラセミ1d、ならびに鏡像異性体2および3存在下および非存在下でのCEM白血病細胞におけるCPTのCC₉₅比較。データは2つの別々の実験の平均で報告（図24B）。FACS分析（上）細胞のみ、ラセミTCH-001（0.1μM）、RR鏡像異性体TCH-003（0.1μM）、SS鏡像異性体TCH-002（0.1μM）；（下）CPT（0.01μM）、ラセミTCH-001→CPT（0.01μM）、RR鏡像異性体TCH-003→CPT（0.01μM）、SS鏡像異性体TCH-002→CPT（0.01μM）。右下四分の一は例えばアポトーシス(％)（+/-標準偏差）を示す。 1d（ラセミTCH-001）のSS鏡像異性体TCH-002およびRR鏡像異性体TCH-003への分割のためのスキームを示す。

Claims (79)

1. 下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なR₂,R₃,S,SまたはR,Rトランス鏡像異性体：
   

   

   式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
2. R₁がフェニルである、請求項1記載のイミダゾリン。
3. R₄がベンジルである、請求項1記載のイミダゾリン。
4. R₅が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項1記載のイミダゾリン。
5. R₅がエチルである、請求項4記載のイミダゾリン。
6. R₂が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項1記載のイミダゾリン。
7. R₂がメチルである、請求項6記載のイミダゾリン。
8. R₃がフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される、請求項1記載のイミダゾリン。
9. R₁がフェニルであり、R₂が方法であり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHである（化合物1）、請求項1記載のイミダゾリン。
10. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃が4-メトキシフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHである（化合物2）、請求項1記載のイミダゾリン。
11. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄が4-フルオロフェニルであり、かつR₅がHである（化合物3）、請求項1記載のイミダゾリン。
12. R₁がフェニルであり、R₂がフェニルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHである（化合物4）、請求項1記載のイミダゾリン。
13. R₁がフェニルであり、R₂が1H-インドール-3-イルメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHである（化合物5）、請求項1記載のイミダゾリン。
14. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がピリジン-4-イルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がHである（化合物6）、請求項1記載のイミダゾリン。
15. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がHであり、かつR₅がHである（化合物7）、請求項1記載のイミダゾリン。
16. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がエトキシカルボニルであり、R₄がHであり、かつR₅がHである（化合物8）、請求項1記載のイミダゾリン。
17. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がピリジン-4-イルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がエチルである（化合物9）、請求項1記載のイミダゾリン。
18. R₁がフェニルであり、R₂がメチルであり、R₃がフェニルであり、R₄がベンジルであり、かつR₅がエチルである（化合物10）、請求項1記載のイミダゾリン。
19. 哺乳動物における炎症を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体を、炎症を抑制するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
20. 哺乳動物がヒトである、請求項19記載の方法。
21. 哺乳動物が下等哺乳動物である、請求項19記載の方法。
22. 投与が哺乳動物に対する経口投与である、請求項19、20、または21のいずれか一項記載の方法。
23. 投与が哺乳動物に対する局所投与である、請求項19、20、または21のいずれか一項記載の方法。
24. 投与が哺乳動物に対する注射による投与である、請求項19、20、または21のいずれか一項記載の方法。
25. 投与が哺乳動物に対する静脈内投与である、請求項19、20、または21のいずれか一項記載の方法。
26. 微生物を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体の有効量を、微生物を抑制するために投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
27. 抑制がインビトロにおけるものである、請求項26記載の方法。
28. 炎症がインビボにおけるものである、請求項26記載の方法。
29. 投与が哺乳動物に対する投与である、請求項26記載の方法。
30. 哺乳動物がヒトである、請求項29記載の方法。
31. 投与が哺乳動物に対する経口投与である、請求項26、27、または28のいずれか一項記載の方法。
32. 投与が哺乳動物に対する注射による投与である、請求項26、27、または28のいずれか一項記載の方法。
33. 投与が哺乳動物に対する静脈内投与である、請求項26、27、または28のいずれか一項記載の方法。
34. 投与が哺乳動物に対する局所投与である、請求項26、27、または28のいずれか一項記載の方法。
35. NF-κBまたはNF-κBキナーゼであるタンパク質の分解を抑制する方法であって、タンパク質を下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,R鏡像異性体に接触させる段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
36. 抑制がインビボにおけるものである、請求項35記載の方法。
37. 抑制が癌の治療におけるものである、請求項35記載の方法。
38. 哺乳動物における腫瘍または癌の成長を抑制する薬物と共に、腫瘍または癌を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体を、腫瘍または癌を抑制するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
39. 哺乳動物がヒトである、請求項38記載の方法。
40. 哺乳動物が下等哺乳動物である、請求項38記載の方法。
41. 投与が哺乳動物に対する経口投与である、請求項38、39、または40のいずれか一項記載の方法。
42. 投与が哺乳動物に対する局所投与である、請求項38、39、または40のいずれか一項記載の方法。
43. 投与が哺乳動物に対する注射による投与である、請求項38、39、または40のいずれか一項記載の方法。
44. 投与が哺乳動物に対する静脈内投与である、請求項38、39、または40のいずれか一項記載の方法。
45. 薬物がプラチナート（platinate）である、請求項38記載の方法。
46. 薬物がカンプトテシンである、請求項38記載の方法。
47. 請求項38、39、または40のいずれか一項記載の方法。
48. 下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体を投与する段階；および
    （b）腫瘍または癌の成長を抑制する薬物
    を含む組成物：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
49. 薬物がプラチナートである、請求項48記載の組成物。
50. 薬物がカンプトテシンである、請求項48記載の組成物。
51. 薬学的担体を伴う、請求項48、49、または50のいずれか一項記載の組成物。
52. 哺乳動物に導入された外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体の有効量を、それによって外来NF-κB活性化物質に対する免疫応答を抑制するように哺乳動物に投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
53. R₁がフェニルである、請求項52記載の方法。
54. R₄がベンジルである、請求項52記載の方法。
55. R₅が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項52記載の方法。
56. R₅がエチルである、請求項52記載の方法。
57. R₂が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項52記載の方法。
58. R₂がメチルであり、かつR₃がフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される、請求項52記載の方法。
59. 哺乳動物において完全な免疫不全を起こすことなく、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体の有効量を、自己免疫疾患を治療するように哺乳動物に投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
60. R₁がフェニルである、請求項59記載の方法。
61. R₄がベンジルである、請求項59記載の方法。
62. R₅が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項59記載の方法。
63. R₅がエチルである、請求項59記載の方法。
64. R₂が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項59記載の方法。
65. R₂がメチルであり、かつR₃がフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される、請求項59記載の方法。
66. 哺乳動物に移植した臓器の拒絶を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体の有効量を、哺乳動物に移植した臓器の拒絶を抑制するように哺乳動物に投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
67. R₁がフェニルである、請求項66記載の方法。
68. R₄がベンジルである、請求項66記載の方法。
69. R₅が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項66記載の方法。
70. R₅がエチルである、請求項66記載の方法。
71. R₂が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項66記載の方法。
72. R₂がメチルであり、かつR₃がフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される、請求項66記載の方法。
73. ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に潜伏感染している細胞においてHIVの再活性化を抑制するための方法であって、下記式のイミダゾリンの実質的に純粋なS,SまたはR,Rトランス鏡像異性体の有効量を、潜伏感染している細胞においてHIVの再活性化を抑制するために投与する段階を含む、方法：
    

    

    式中、R₁、R₂、R₃、およびR₄はそれぞれアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、5から14個の環構成員を含むヘテロアリール、および5から12個の環構成員を含む複素環からなる群より独立に選択され；かつR₅は水素およびアルキル基からなる群より選択され、これらはすべて置換されていてもよい。
74. R₁がフェニルである、請求項73記載の方法。
75. R₄がベンジルである、請求項73記載の方法。
76. R₅が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項73記載の方法。
77. R₅がエチルである、請求項73記載の方法。
78. R₂が、1から4個の炭素原子を含む低級アルキルである、請求項73記載の方法。
79. R₂がメチルであり、かつR₃がフェニルおよび置換フェニルからなる群より選択される、請求項73記載の方法。

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