JP2009536205A - Nkg2dの調節方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウィルス感染に関連する炎症および実質臓器移植拒絶反応を、治療および/または予防するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、NKG2Dを調節することによって、自己反応性T細胞、NK細胞、および/またはNKT細胞の増殖および機能を障害するための治療法を提供する。
NKG2Dは、NK細胞および特定のタイプのT細胞でヒトおよびマウスにおいて発現される活性化受容体である。NKG2Dは、ヒトではUL16結合タンパク質(ULBP1)、ULBP2、ULBP3、ULBP4、およびMHCクラスI鎖関連分子(MICAおよびMICB)を認識し、マウスでは少数の組織適合性抗原60(H60)、レチノイン酸初期誘導性転写物(RAE-1)、およびネズミULBP様転写物1(MULT-1)を認識する。NKG2Dホモダイマーは、コンセンサスp85ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3-K)結合モチーフTyr-Ile-Asn-Met(SEQ ID NO:9に記載されたYINM)を含有する、アダプター分子DAP10と会合する。NKG2DおよびDAP10は、それらの生合成経路において初期に相互作用し、この相互作用が細胞表面へのNKG2Dの輸送に必要である。
本発明は、ウィルス感染に関連する炎症および実質臓器移植拒絶反応を、治療および/または予防するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、NKG2Dを調節することによって、自己反応性T細胞、NK細胞、および/またはNKT細胞の増殖および機能を障害するための治療法を提供する。
本発明は、部分的には、CD8+T細胞、NK細胞、およびある種の活性化されたCD4+T細胞上の活性化受容体であるNKG2Dの調節が、ウィルス感染に関連する炎症および実質臓器移植拒絶反応を予防および/または治療するための効果的な手段であるという驚くべき知見に基づく。1つの局面において、本発明者らは、NKG2Dの内部移行を刺激するための薬剤および方法を見出し、NKG2D活性化に関連する症候群を治療するための有用な治療的様式としてのそのような薬剤を同定した。本薬剤および方法は、天然の可溶性NKG2Dリガンドが内部移行を刺激することができない(例えば、慢性炎症性症候群に存在すると信じられているもののような)条件下で特に有用である。本発明は、さらに、そのような炎症性症候群を治療するためにNKG2Dの機能的発現を低下させるためのいずれの手段も含む。いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、主としてNKG2Dに対するそれらの活性化に依存する白血球のサブセットのみに影響する。
別途記載または明瞭に文脈上示されない限り、本発明の実施において、NKG2D媒介細胞活性化を低下させるいずれの薬剤も用いることができる。そのような薬剤の非限定的例は、NKG2Dリガンド、またはNKG2D結合断片、変種、またその誘導体;(例えば、NKG2D結合活性のような)抗体、またはその断片、変種または誘導体;細胞においてNKG2DまたはDAP10生産を阻害する核酸(またはその変種または誘導体)、または小分子;NKG2D-DAP10複合体の形成または機能に干渉するペプチドまたは小分子;NKG2Dシグナル変換を変化させる小分子、および前述のいずれかの組み合わせを含む。例示的なNKG2Dリガンドは、例えば、米国特許第6,653,447号;Carayannopoulos et al., J Immunol, 169(8):4079-83, 2002;Carayannopoulos et al., Eur J Immunol, 32(3):597-605, 2002: Sutherland et al., J Immunol, 168(2):671-9, 2002;Sutherland et al., Immunol Rev, 181:185-92, 2001;およびCosman et al., Immunity, 14(2):123-33, 2001)に見出すことができる。
本発明による1つのタイプのNKG2D調節剤は、NKG2Dリガンドを含む。典型的には、そのようなリガンドは、天然可溶性リガンドが効果的でない条件下で、NKG2D内部移行を刺激するにおいてそれらを効果的とする、(例えば、MICA、MICB、およびULBPの可溶性形態のような)天然可溶性NKG2Dリガンドに対していくつかの修飾を呈する。例えば、(すなわち、膜貫通および細胞質ドメインを欠く;例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願US2003/0165835参照)MICAおよびMICBタンパク質の可溶性形態、またはNKG2D結合活性を保有するそれらの断片は慣習的な方法を用いて化学的に架橋して、複数のNKG2D分子に結合することができ、それにより、内部移行を刺激する多量体NKG2Dリガンドを形成することができる。NKG2D結合活性は、例えば、競合結合、フローサイトメトリーなどを含むいずれかの手段を用いてアッセイすることができる。他の一連の態様において、多量体NKG2Dリガンドは、MICA、MICB、またはULBPに由来するNKG2D結合ドメインの(適当なスペーサーによって分離された)タンデムリピートを有するポリペプチドをコードする核酸の発現によって生産することができる。もう一連の態様において、リガンドは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)のようなさらなる化学基を取り込むことができる。
本発明は、NKG2D媒介シグナル伝達経路を介して、有意な活性化なしで、例えば、NKG2Dの内部移行を刺激するもののような、NKG2D媒介活性化を減少させるのに用いることができるいずれかの抗体の使用を含む。そのような抗体の非限定的例は、NKG2Dのいずれかの適当な細胞外または膜内エピトープに対して産生される抗体;DAP10のいずれかの適当な細胞外または膜内エピトープに対して産生される抗体;および可溶性NKG2DリガンドまたはNKG2D-NKG2Dリガンド複合体に対して産生される抗体を含む。また、二特異的抗体、すなわち、2つの結合ドメインの各々が異なる結合エピトープを認識する抗体が含まれる。NKG2Dのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第6,262,244号に開示され、DAP10のアミノ酸配列は Wu et al., Science 285:730, 1999に開示されており、MICAおよびMICBポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、米国特許出願US 2003/0165835に開示されており、それらは全て、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明は、転写、翻訳または翻訳後レベルにおいてNKG2D細胞表面発現の調節を含む。いくつかの態様において、モジュレーターは、非限定的に、DNA、RNA、キメラRNA/DNA、タンパク質核酸、および他の核酸誘導体を含む核酸ベースのものである。
によってコードされるものを含む。NKG2Dの細胞表面発現を低下させることができるいずれの配列も本発明を実施するのに用いることができると理解される。
本発明は、種々の炎症性自己免疫疾患およびNKG2D活性化に関連する症候群を含む、炎症性疾患を予防および/または治療する方法を提供する。そのような症候群は、非限定的に、ストレス関連NKG2Dリガンド(例えば、MICA、MICB、およびULBP)の誘導の結果、自己反応性T細胞および/またはNK細胞の過剰な活性化および/または拡大をもたらす臨床的状況を含み、これは、IL-2、TNF-α、およびIL-15のようなサイトカインの増大したレベルに反映され得る。
本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体を含むこともできる、NKG2Dモジュレーターを含む薬学的製剤を含む。薬学的に許容される担体はいずれかのおよび全ての適当な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤、ならびに本発明によって提供されるNKG2Dモジュレーターもしくは関連組成物またはその組み合わせに生理学的に適合する他のものを含む。薬学的に許容される担体の例は水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組み合わせの一つまたは複数を含む。多くの場合、そのような組成物に、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムを含むのが望ましい。薬学的に許容される物質は、NKG2Dモジュレーター、関連組成物または組み合わせの貯蔵寿命または有効性を望ましくは増強させることができる、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液のような補助的物質の少量を含む。薬学的組成物の担体および他の成分についての適当性は、NKG2Dモジュレーター、関連組成物または組み合わせの所望の生物学的特性に対する有意な負のインパクトの欠如に基づいて決定される。
NKG2D活性化についてのアッセイ法
IL-2活性化ヒトNK細胞を、MICAポリペプチドが発現される条件下でヒトMICAをコードするcDNAでトランスフェクトされているマウスBa/F3細胞のような適当な51Cr標識標的細胞培養物;および対照細胞としての、トランスフェクトされていない同一標的細胞と共に培養する。51Crの放出をモニターして、細胞溶解を示す。対照を超えるレベルにおいて、活性化されたNK細胞によるMICA発現細胞の溶解は、NKG2D特異的活性化を示す。
NKG2D内部移行についてのアッセイ法
ヒトNKG2Dを発現する細胞を、ビオチン標識抗NKG2D抗体の存在下で1時間以上37℃にて培養する。対照として、NKG2D+細胞を、0.05%アジ化ナトリウムの存在下で4℃にてビオチン標識抗NKG2Dと共に培養して、内部移行を妨げる。細胞を洗浄して、過剰の抗体を除去し、および、蛍光色素標識ストレプトアビジンで染色して、ビオチン結合NKG2D抗体を検出する。および、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって内部移行を評価する。4℃にてビオチン標識抗NKG2D抗体と共にインキュベートした細胞と比較した、37℃にてビオチン標識抗NKG2D抗体との共培養後における細胞表面のNKG2Dの量の減少は内部移行の1つのインジケーターである。これは、細胞の固定および浸透化、および一次抗NKG2D抗体を検出する蛍光色素標識第二工程の抗体での染色によってさらに確認することができる。内部移行されれば、第二工程の抗体は、蛍光顕微鏡によって目視されるように、37℃で培養した細胞の内側の一次抗NKG2D抗体を検出するであろう。
マウスにおいて自己免疫疾患を予防するNKG2D遮断
以下の実験は、動物モデル系、NODマウスにおけるI型糖尿病の発症に対するNKG2D遮断の効果をテストするために行った(Ogasawara et al., Immunity, 20:757-767, 2004)。
NODマウスはTaconic(Germantown, NY)から購入した。NOD.scidマウスはJackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。8.3 TcR-トランスジェニックNODマウスは記載されている(Verdaguer et al., J Exp Med, 186:1663-1676, 1997)。全てのマウスはUCSF動物施設において特異的病原体フリー条件下で維持し、実験は、UCSF動物研究委員会のガイドラインに従って行った。2連続測定で血糖レベルが300mg/dLより大きくなると糖尿病と診断した。血糖レベルは血糖モニター(Walgreen's, Deerfield, IL)を用いることによって測定した。
マウス島は以下のように単離した。簡単に述べれば、0.3mg/mlコラゲナーゼP(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を膵臓管に注射した。膨張した膵臓を摘出し、37℃にて13〜17分インキュベートした。4つの異なる密度(1.108、1.096、1.069および1.037)を含むEurocollin-Ficoll勾配での遠心によって島を精製した。遠心の後、1.069/1.096における組織断片を集め、洗浄した。その後、単一細胞を得るために、非酵素的細胞解離溶液によって島細胞を解離させた(Sigma, St. Louis, MO)。
NKG2Dの検出のために、細胞(〜1×106)を0.25μgビオチニル化またはPE標識抗NKG2D mAb(クローン191004)で染色した。細胞をFITC結合抗CD8、APC結合抗CD8、FITC結合抗CD44、またはFITC結合抗Ly-6Cで共染色した。RAE-1を検出するために、細胞を、全ての5つの公知のRAE-1タンパク質を認識するビオチニル化抗汎用RAE-1 mAb(Londoen et al., J Exp Med.197:1245-1253, 2003)または抗RAE-1mAb(クローンCX1)(Ogasawara et al., 前記, 2003)で染色した。PE結合ストレプトアビジンまたはAPC結合ストレプトアビジンを用いて、ビオチニル化mAbを検出した。細胞をmAbと共に20分間インキュベートし、0.01%NaN3を含有するPBSで洗浄した。細胞はFACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)またはGuava ViaCount(商標)およびGuava Express(商標)ソフトウェアを備えた小デスクトップGuava(登録商標)Personal Cytometer(Hayward, CA)を用いることによって分析した。目に見えるリンパ球集団は前方および側方散乱プロフィールに基づき、ヨウ化プロピジウム染色の欠如によってゲートした。免疫組織化学のために、器官をOCT媒体中にスナップ凍結させ、切片を調製し、慣習的な技術によって染色した。イメージはDeltavision顕微鏡(Applied Precision, Issaquah, WH)を用いて獲得し、計算デコンボリューションはsofdWoRxソフトウェア(Applied Precision)を用いて行った。
定量的(リアル-タイム)PCRは、製造業者の指示に従って、ABI 7700(Applied Biosystems)を用いて行った。プローブはApplied Biosystemsから購入した。RAE-1特異的プローブおよびプライマーは従前に記載されている(Ogasawara et al., 前記, 2003)。全ての公知のRAE-1転写物を検出するのに用いるユニバーサルプライマーは:センス、5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3'(SEQ ID NO:6);アンチセンス5'-catcattage tgatctccag ctca-3'(SEQ ID NO:7)であり、プローブは5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3'(SEQ ID NO:8)であった。全RNAをDNase Iで処理し、および、ランダムへキサマープライマーを用いて第一ストランドcDNAを合成した。リアル-タイムPCRについてのサイクリング条件は:50℃10分間、続いて、95℃30秒間および60℃2分間の50サイクルであった。データは、Sequence Detector v1.7 Analysis Software(Applied Biosystems)を用いて分析した。統計学的解析は2標本t検定を用いて行った。
T細胞は、MACS(Miltenyi Biotec Inc., Germany)を用いる磁性細胞ソーティングによって、糖尿病16週齢NODマウスの脾臓およびリンパ節から単離した。T細胞(純度>98%)はCD19+、CD24+、およびMHCクラスII+細胞の枯渇での陰性選択によって濃縮した。尾静脈への注射によって、約7.5×106T細胞は4〜5週齢NOD.scidマウスに導入した。養子免疫伝達マウスにおける血糖レベルは毎週調べた。
養子T細胞導入は従前に記載されているように行った(Serra et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:15566-15571, 2002)。簡単に述べれば、8.3 TcR-トランスジェニックリンパ球はリンパ節および脾臓から単離した。T細胞(純度>95%)は、MACSを用いる磁性ソーティングによって陰性選択によって濃縮した。CFSE(5μM)で標識した約1×107T細胞は、0日での尾静脈への注射によって10週齢NODマウスに導入した。抗NKG2D mAb(CX5)またはcIg(200μg/注射)は-1、+1、および+5日に受容体NODマウスに注射した。
NKG2DとRAE-1との相互作用が自己免疫糖尿病の発症に関連するか否かを調べるために、全ての公知のRAE-1遺伝子の転写物を検出するために定量的RT-PCRアッセイ法を開発した。豊富なRAE-1転写物が後期前糖尿病NODマウス(12〜16週齢)の膵臓で検出されたが、週齢を適合させたBALB/cマウスの膵臓には検出されなかった(図1a)。比較的より顕著ではないが、RAE-1転写物もまた4〜6週齢NODマウスの膵臓で検出された。RAE-1もまた(BおよびT細胞を欠く)成体NOD.scidマウスの膵臓で検出された(図1b)。統合すると、これらの結果は、RAEの発現が継続する自己免疫応答と無関係であることを示した。RAE-1が年齢と共に膵臓において選択的にアップレギュレートされるか否かを調べるために、若いNODマウスからの特別な器官におけるRAE-1転写物のレベルを、後期前糖尿病NODマウスにおける同一器官におけるものと比較した。この基準により、RAE-1は、肝臓、脾臓、腎臓および胸腺と比較して、年齢と共に前糖尿病マウスの膵臓において比較的より増加した(図1c)。
NODマウスにおける糖尿病の発症はCD4+およびCD8+T細胞双方を必要とするので、NKG2D発現は、末梢免疫組織から単離されたT細胞で、およびNODマウスの膵臓における浸潤白血球で分析した。図2aに示すように、NKG2Dは10および5週齢NODマウスにおける膵臓に浸潤するCD8+T細胞のサブセットで検出された。膵臓-浸潤NKG2D+CD8+T細胞のパーセンテージは病気進行と共に増加する(図2a)。より小さな割合のNKG2D+CD8+T細胞はPLNおよび脾臓で検出された(図2a,b)。さらに、膵臓およびPLNにおけるNKG2D+CD8+T細胞は高レベルのCD44を発現するが、Ly-6Cはそうでないことが見出された(図2b)。(CD3を発現しない)CD8-NKG2D+白血球の集団もまたNOD膵臓に浸潤する白血球で観察され(図2a)、これらの細胞の多くはK細胞および骨髄様細胞抗原で共発現した。正常な非糖尿病マウス株についての報告(Jamieson et al., Immunity, 17:19-29, 2002)として、NKG2Dは、10週齢または25週齢NODマウスいずれかの膵臓または末梢リンパ様組織ではCD4+T細胞または220+B細胞で検出されなかった。
前糖尿病島での浸潤CD8+T細胞およびNKG2Dリガンド上のNKG2Dの発現は、糖尿病形成におけるこれらの分子に対する役割を示した。前糖尿病NODマウスを中和抗NKG2D mAbで処理することによってこの仮説を検定した。CX5抗マウスNKG2D mAbはNKG2Dのそのリガンドへの結合を遮断し、CX5とのNKG2D保有細胞のインキュベーションの結果、受容体が調節され内部移行された。重要なことには、CX5でのインビボでのマウスの処理は、NKG2D+NK細胞またはCD8+T細胞を枯渇させなかった。NODマウスを7〜25週齢において抗NKG2D mAbで処理した。希釈剤のみで処理したマウスは糖尿病を発症し、15週齢で開始し、全て(n=7)28週までに病気を有した(図3a,b)。対照的に、抗体処理は5週間前に停止したが、抗NKG2Dで処理したNODマウス(n=7)はいずれも30週齢で糖尿病を発症しなかった(図3a,b)。
NKG2D遮断がエフェクターCD8+T細胞に影響するか否かに取り組むために、糖尿病16週齢NODマウスから単離したT細胞を(T細胞を欠くが、糖尿病を発症しない)NOD.scid受容体に養子免疫伝達した。導入の時点において、CD8+T細胞の小さなパーセンテージのみがNKG2Dを発現した(図5a)。しかしながら、導入から5週間後に、実質的な数のNKG2D+CD8+T細胞が、受容体マウスにおいて膵臓、PLNおよび脾臓で検出され(図5a)、これは、予め存在するNKG2D+T細胞の拡大、または導入されたCD8+T細胞でのNKG2Dの獲得を示唆する。cIg処理受容体マウスにおける膵臓に浸潤するCD8+T細胞の約15%はNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性であり、他方、抗NKG2D mAb処理マウスで見出されたのは有意に少なかった(図5b,c)。NKG2Dは対照Ig処理NODマウスにおけるほとんどのNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性自己反応性CD8+T細胞にNKG2Dが存在したが、抗NKG2D mAb療法を受領するマウスでは検出されなかった(図5c)。糖尿病NODマウスからのT細胞を受領する全ての対照Ig処理NOD.scidマウスにおいて糖尿病は発症しなかったが、療法を受けつつ糖尿病を発症した抗NKG2D mAb処理マウスはなかった(図5d)。
抗NKG2D処理マウスの膵臓におけるより少数のNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性CD8+T細胞の発見は、mAb療法が自己反応性T細胞の拡大を遮断した可能性と合致した。この仮説を直接的に検定するために、8.3TcR-トランスジェニックT細胞をCSFEで標識し、10週齢NOD受容体に養子免疫伝達し、対照Igまたは抗NKG2D mAbいずれかで処理した(図6)。導入前に、8.3TcR-トランスジェニックNODマウスのリンパ節および脾臓からのドナーCD8+T細胞は>90%NRP-V7/H2Kdテトラマー陽性であったが、NKG2Dを発現しなかった(図6a)。2日後に、対照Igで処理したマウスの膵臓に浸潤する導入されたCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックNOD CD8+T細胞はNKG2Dを発現し(図6b)、すでに増殖していた;しかしながら、膵臓または腸間膜リンパ節に存在する導入されたT細胞でCSFEの希釈は観察されなかった(図6c)。導入から4および8日後、対照Igで処理したマウスの、腸間膜リンパ節ではなく、膵臓および膵臓リンパ節におけるCFSE標識8.3TcR-トランスジェニックT細胞は、かなりの増殖を示した(図6c)。驚くべき対照的に、NKG2Dは、抗NKG2D mAbで処理したNODマウスの膵臓における導入されたCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックCD8+T細胞の細胞表面で検出されなかった(図6b)。さらに、膵臓におけるこれらの細胞の拡大は、対照Igで処理したマウスと比較して実質的に阻害された(図6c)。興味深いことには、抗NKG2D mAbでの処理は、リンパ節における細胞と比較して、膵臓に浸潤するCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックT細胞の増殖に対してかなり顕著な効果を有した。NRP-V7/H2Kdテトラマーで検出された膵臓における内因性CSFE-未標識T細胞の拡大もまた、対照Ig処理マウスと比較して、抗NKG2D mAbでの処理によってやはり減少した。対照Igおよび抗NKG2D mAb処理NODマウスにおける膵臓に浸潤する養子免疫伝達8.3TcR-トランスジェニックT細胞の増殖の定量は、自己反応性抗原-特異的CD8+T細胞の拡大に対して抗NKG2D療法の顕著な効果を示した(図6d)。
shRNAによるNKG2Dの細胞表面発現の調節
以下の実験を行って、NKG2D発現に対する阻害性RNAの効果を調べた。IRES-eGFPエレメントを含有するベクターにおけるヒトNKG2DをコードするDNAは安定にCHO細胞にトランスフェクトされた。および、マウスCD8(mCD8)をコードするcDNAで、および(shDNA03と命名される)ヒトNKG2Dのセグメントと相同な22塩基対(bp)cDNA(SEQ ID NO:10に記載された5'-ggatgggact agtacacatt cc-3')を含有するプラスミド(InVitroGenからのpCR2.1-TOPOベクター)で、安定にトランスフェクトされたNKG2D発現細胞を(リポフェクタミンおよび標準的方法を用いて)トランスフェクトした。特異性を示す対照として、NKG2D発現CHO細胞を、mCD8で、およびヒトNKG2Dと同様であるが、3つの突然変異したヌクレオチド(SEQ ID NO:13に記載された5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3')を持つ22bp cDNAで二重にトランスフェクトした。左側パネルにおける細胞は、マウスCD8 cDNA(mCD8)を含有するプラスミドでのみトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、マウスCD8に対する、およびヒトNKG2Dに対するモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。二変量ドットプロットが得られ、これは、(i)マウスCD8対-ヒトNKG2D、および(ii)eGFP(ヒトNKG2D-IRES-eGFPベクターの拡大から得られる固有の緑色蛍光)対-ヒトNKG2Dを表す蛍光を呈する。
抗NKG2Dモノクローナル抗体の使用による細胞表面NKG2Dの調節
以下の実験を行って、NKG2Dに向けられたモノクローナル抗体の、NKG2Dの細胞表面発現を調節する能力を評価した。
F1マウスにおいて非経口骨髄移植片拒絶反応を予防するNKG2D遮断
以下の実験を行って、動物モデル系、(C57BL/6×BALB/c)、F1(CB6F1)マウスにおける、ハイブリッド耐性の発生に対するNKG2D遮断の効果をテストした(F1受容体による非経口骨髄移植片の拒絶)。
約6〜8週齢のC57BL/6、BALB/c、およびCB6F1マウスは、National Cancer Institute Animal Program(Frederick, MD)から購入した。RAE-1εトランスジェニックマウスを作成し、C57BL/6バックグラウンドに戻し交配させた(Ehrlich et al.,未公表観察)。C57BL/6バックグラウンドでのDAP12-/-マウス(戻し交配9世代)は従前に記載されており(Bakker et al., Immunity, 13:45-353, 2000)、DAP10-/-はC57BL/6胚性幹細胞から作成した(Phillips et al.,未公表観察)。全ての実験は、UCSF Committie on Animal Researchのガイドラインに従って行った。
抗マウスNKG2D mAb、クローンCX5(ラットIgG1イソタイプ)は、従前に記載されたように、精製されたマウスNKG2Dタンパク質でラットを免疫化することによって作成した(Ogasawara et al., Immunity, 18:41-51, 2003)。抗マウスNKG2D、クローン191004(ラットIgG2aイソタイプ)は、組換えマウスNKG2D細胞外ドメイン(R&D Systems, Minneapolis, MN)で免疫化したラットからのB細胞とマウス骨髄腫との融合から得られたハイブリドーマから生産した。全ての抗NKG2D mAbは、NKG2D細胞外ドメインを認識し、NKG2Dのそのリガンドへの結合を効果的に遮断する。インビボ注射では、検出可能なエンドトキシン(<0.3pg注射)を含有しない精製された抗NKG2D mAb CX5および抗NK1.1 mAb PK136を用いた。抗NKG2D mAb CX5は、インビボで注入された場合に、NKG2D保有NK細胞またはT細胞を枯渇させない阻止抗体である(Ogasawara et al., Immunity, 20, 757-7567, 2004;Lodoen et al., J Exp Med, 197:1245-1253, 2003;およびLodoen et al., J Exp Med, 200:1075-108, 2004)。対照ラットIgGはSigma(St. Louis, MO)から購入した。抗マウス汎用-RAE-1 mAb(クローン186107、ラットIgG2bイソタイプ)、抗マウスH60 mAb(クローン205310)および抗マウスMULT1 mAb(クローン237104)は記載されているように作成した(Lodoen et al., 前記, 2003;)およびLodoen et al., 前記、2004)。他の抗体はBD PharMingenまたはeBioscience(San Diego, CA)から購入した。
ネズミ骨髄は従前に記載されているように移植した(George et al., J Immunol, 163:1859-1867, 1999)。簡単に述べれば、骨髄導入の2日前にmAb処理(200μg/マウス)を行い、受容体をポリI:C(Sigma、200μg/マウス)で処理して、骨髄細胞の注入から1日前にNK細胞媒介移植片拒絶をブーストした(Murphy et al., J Exp Med, 166:1499-1509, 1987)。0日に、マウスを致死量(11Gy)の137Csγ照射に曝露することによって照射し、および、4×106BM細胞を静脈内注射した。導入から5日後に、マウスに26μgの5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(Sigma, St. Louis, MO)を静脈内投与して、内因性チミジン合成を抑制した(George et al., 前記, 1999)。30分後に、マウスに3μ Ciの5-[125I]ヨード-2'-デオキシウリジン(Amersham Life Science,Arlington Heights IL)を静脈内投与した。6日に、脾臓を受容体マウスから摘出し、ガンマカウンターでカウントした。
簡単に述べれば、1×107 Ly5.2 B6 BM細胞をNK細胞-枯渇した照射した受容体マウス(照射の吸収された量=11Gy)に従前に記載されているように静脈内導入した(Ogasawara et al., Nature, 391:701-703, 1998)。再構成の間に、マウスを抗生物質に維持した。
NK細胞は従前に記載されているように濃縮した(Ogasawara et al., J Immunol, 169:3676-3685, 2002)。簡単に述べれば、脾臓細胞を抗マウスCD4 mAb(クローンGK1.5)および抗マウスCD8 mAb(クローン53-6.7)と共にインキュベートし、その後に、これらの細胞を、ヤギ抗マウスIgおよびヤギ抗ラットIg(Advanced Magnetic, Inc, Cambridge, MA)で被覆した磁性ビーズと混合した。CD4、CD8、および表面Ig(sIg)陽性細胞は、磁性細胞ソーティングによって取り出した。
ヒトIgG1 Fcに融合したマウスNKG2D(mNKG2D-Ig)の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質を用いて、NKG2Dリガンドを検出した(Cerwenka et al., Immunity, 12:721-727, 2000)。PE結合ヤギ抗ヒトIgG Fcγ断片(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を第二工程の試薬として用いた。細胞(1×106)を0.5μgのmNKG2D-Igで、および0.25μgの他のmAbで染色した。いずれのNKG2Dリガンドが発現されたかを判断するために、細胞を、全ての5つの公知のRAE-1タンパク質(すなわち、RAE-1α、β、γ、δ、およびε)を認識するビオチニル化抗汎用RAE-1 mAb、ビオチニル化抗H60 mAbまたは抗MULT1 mAbで染色した。PE結合ストレプトアビジンまたはAPC結合ストレプトアブジンを用いて、ビオチニル化mAbsを検出した。NKG2Dの検出のために、細胞(〜1×106)を0.25μgのビオチニル化またはPE標識抗NKG2D mAb(クローン191004)で染色した。細胞を抗CD43、抗Ly6C/G、抗CD11c、抗B220、抗CD3、抗TER119、抗NK1.1および抗CD49d(DX5) mAbで共染色した。細胞をmAbと共に20分間インキュベートし、0.01%NaN3を含有するPBSで洗浄した。細胞はFACS Calibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)フローサイトメーターを用いて分析した。目に見えるリンパ球集団を、前方および側方散乱プロフィールに基づいて、かつヨウ化プロピジウム染色の欠如によってゲートした。
モノクローナル抗体媒介再指向性細胞障害アッセイ法は従前に記載されているように行った(Lanier et al., J Immunol, 141:3478-3485, 1988)。標的細胞を、10%FCSを含有するRPMI-1640培地中で、50μCiのNa2(51Cr)O4で37℃にて2時間標識し、培地で3回洗浄し、細胞障害アッセイ法で用いた。51Cr標識標的細胞(5×103)およびエフェクター細胞を、三連にて、示されたエフェクター/標的(E/T)比率にて、96ウェルマイクロタイタープレートのU底ウェル中で混合した。4時間のインキュベーション時間の後、細胞を含まない上清を集め、Micro-betaカウンター(Wallac, Turku, Finland)にて放射能を測定した。自然発生放出は最大放出の15%未満であった。特異的51Cr放出のパーセンテージは以下の式に従って計算した:%特異的溶解=(実験-自然発生)放出×100/(最大-自然発生)放出。
NKG2Dリガンドをコードする遺伝子は多形であり;BLAB/c(B/c)マウスはRAE-1α、βおよびγ遺伝子を有し、他方、C57BL/6(B6)マウスはRAE-1δおよびε遺伝子を保有する(Cerwenka and Lanier, Tissue Antigens, 61:335-343, 2003)。同様に、B/cマウスはH60を発現するが、B6マウスは発現しない(Malarkannan et al., J Immunol, 161:3501-3509, 1998)。B/c、B6および(BALB/c x C57BL/6)F1(CB6F1)マウスから単離したBM細胞を分析して、NKG2DリガンドはBM細胞で発現されるか否かを判断した。細胞をマウスNKG2D-IgG Fc融合タンパク質で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。低レベルのNKG2Dリガンドは新たに単離されたB/c BM細胞の表面で検出されたが、B6 BM細胞の表面では検出されなかった(図13a)。いずれのNKG2Dリガンドが発現されたかを判断するために、BM細胞を抗汎用RAE-1、抗H60および抗MULT1モノクローナル抗体(mAb)で染色した。RAE-1およびH60は新たに単離されたB/c BM細胞は低レベルで発現され、他方、MULT1は検出されなかった(図13b)。対照的に、RAE-1は、B/c、B6またはCB6F1マウスからの新たに単離された脾臓細胞で検出されなかった。
本発明の開発の間に、RAE-1が、B/c骨髄で再構成されたCB6F1マウスの脾臓における増殖する先祖細胞で発現されたという知見は、本発明者らに対して、NKG2Dがハイブリッド抵抗性に関与することを示唆した。これは、対照抗体(cIg)、中和非枯渇抗NKG2D mAb(CX5)(Ogasawara et al., Immunity、20:757-767, 2004)、またはNK細胞-枯渇抗NK1.1 mAb(PK136)で予め処理した照射CB6F1マウスへのB/c BM細胞の導入によって確認した。受容体マウスの造血系細胞再構成は、7日に脾臓を収穫するのに12時間先立って、125IUdRを注射することによって評価した。cIg処理マウスはB/c BM細胞を拒絶し、これは以前の報告と合致し(Lotzova et al., Transplantation, 35:490-494, 1983)、CB6F1マウスにおけるNK細胞の枯渇はB/c骨髄細胞の拒絶を効率的に妨げ、その結果、脾臓における放射性標識の取り込みが実質的に増加した(図14a)。非枯渇中和抗NKG2D mAbもまた、NK細胞を枯渇する効果と匹敵して、125IUdRの取り込みを劇的に増加させた。
F1受容体における非経口骨髄移植の拒絶を遮断する抗NKG2D mAb処理能力は、F1 NK細胞による非経口H-2の認識がNKG2D依存性拒絶に必要であるか否か、またはNK細胞もまた同系骨髄細胞を拒絶できるかの問題を生起し、但し、RAE-は十分に高レベルで発現されるものとする。同系照射CB6F1受容体に再度定着するCB6F1骨髄細胞(図13c,e)、および同系照射B6受容体に再度定着するB6骨髄細胞は、B/cの再度定着する骨髄細胞(図13d,e)と比較して、非常に低いレベルのRAE-1を発現したに過ぎなかった。従って、B6またはCB6F1骨髄細胞でのRAE-1の発現が、同系骨髄移植片の拒絶を引き起こすか否かを調べるために、ヒトβ-アクチンプロモーターによって駆動されるRAE-1εを発現し、その結果、全ての組織においてRAE-1εが発現されるトランスジェニックマウスを作成した。図15aに示すように、B6 RAE-εトランスジェニックマウスからの新たに単離された骨髄細胞でのRAE-1εの発現レベルは、再度定着するB/c骨髄細胞に存在するRAE-1のレベルと同様である(図13d,e)。
マウスにおいて、NKG2D転写物の別のRNAスプライシングは、NKG2D-SおよびNKG2D-Lと呼ばれる2つのタンパク質イソ形態を作成する。NKG2D-Lは休止NK細胞において圧倒的に発現され、DAP10アダプタータンパク質と会合し、他方、NKG2D-SはNK細胞の活性化によって誘導され、DAP10またはDAP12いずれかと会合する(Diefenbach et al., Nat Immunol、3:1142-1149, 2002)。RAE-1εトランスジェニックB6マウスからの骨髄細胞を照射された野生型、DAP10-/-、およびDAP12-/-C57BL/6受容体に移植して、DAP10またはDAP12または双方のアダプターがNKG2D媒介拒絶に関与するか否かを判断した。マウスに5日に125IUdRを注射し、脾臓を収穫し、6日にカウントした。野生型B6マウスと比較して、DAP-10-/-B6マウスは、RAE-1εトランスジェニックB6骨髄移植片を拒絶するにおいてかなりの欠乏を示した(図16a)。対照的に、野生型B6マウスよりは僅かによくないが、DAP12-/-B6受容体はDAP10-/-B6マウスよりも効果的にRAE-1εトランスジェニックB6骨髄細胞を拒絶した(図16b)。野生型、DAP10-/-およびDAP12-/-B6マウスは、全て、枯渇抗NK1.1 mAbで、または非枯渇中和抗NKG2D mAbで処理した場合、RAE-1εトランスジェニックB6骨髄移植片を拒絶しなかった。これらの結果は、NKG2D依存性骨髄細胞拒絶における、DAP10の圧倒的な役割、およびDAP12のより少ない役割を示す。それにも拘らず、本発明を製造し、使用するためには、メカニズムの理解は必要でない。
NODマウスからのNK細胞の活性化はRAE-1の発現を誘導し、その結果、NK細胞でNKG2Dのリガンド依存性調節がもたらされる(Ogasawara et al., Immunity, 18, 41-51, 2003)。RAE-1εトランスジェニックB6からのNK細胞の表面でのNKG2Dの発現の分析は、野生型マウスからのNK細胞と比較して、NKG2Dの低下した発現を明らかにした(図17a)。RAE-1εトランスジェニックB6でのNKG2Dの量は実質的に減少したが、脾臓におけるNK細胞の数、およびNK細胞でのNK1.1、Ly-49D、Ly-49A、Ly-49C/I,Ly-49F/I/C/H、およびLy-49G2の発現は、野生型NK細胞と同様であった。NKG2Dの機能がRAE-1εトランスジェニックNK細胞で損なわれるか否かを調べるために、cIg、抗NKG2D mAbおよび抗NK1.1 mAbを用いて、抗体-再指向性細胞障害アッセイ法を行った。RAE-1εトランスジェニックNK細胞のNK1.1依存性細胞傷害性活性は野生型B6 NK細胞のそれと同一であったが、NKG2D依存性細胞傷害性はRAE-1εトランスジェニックNK細胞で損なわれた(図17b)。
慢性関節リウマチの予防および治療のためのNKG2D遮断
これは、NKG2Dが炎症の部位に存在することを示すことができる関節炎の慢性動物モデルでテストすることができる。そのようなモデルの例は、慢性コラーゲン誘導関節炎である(Malfait et al.,Arthritis and Rheumatism 44:1215-1224, 2001)。
セリアック病の予防および治療のためのNKG2D遮断
MICはセリアック病(CD)患者における腸上皮表面で強く発現され、これは、今度は、NKG2Dを介して上皮内Tリンパ球(IEL)を共活性化し、上皮細胞標的の細胞溶解に導く(Meresse et al., Immunity, 21:357-366, 2004;およびHeu et al., Immunity, 21:367-377, 2004)。本発明者らは、本明細書において記載したNKG2Dを遮断する組成物および方法もまたセリアック病の予防および治療に適当であると考える。炎症性腸病(IBD)の発生に対するNKG2D遮断の効果は、例えば、以下の2つの結腸のネズミモデルのいずれかの1つのような適当な小さな動物のモデルでテストされるであろう:SCIDマウスにおけるTNB誘導(Chin et al.,Digestive Diseases and Sciences 39:513-525, 1994)またはT-細胞導入モデル(Powrie et al., Int Immunol 5:1461 et seq., 1993)。
ウィルス性肝炎の予防および治療のためのNKG2D遮断
以下の実験を実施して、B型肝炎ウィルス(HBV)感染のネズミモデルにおける、急性肝炎の発症に対するNKG2D遮断の効果をテストした(参照により本明細書に組み込まれる、Baron et al., Immunity, 16:583-594, 2002)。
HBV-Env:マウス血統107-5D(正式名称、Tg[Alb-1.HBV] Bri66;近交系B10.D2, H-2d)(Chisari et al., Proc Natl Acad Sci USA, 84:6909-6913, 1987)。HBV-複製:血統1.3.46(正式名称、Tg[HBV 1.3ゲノム] chi46)(Guidotti et al., J Virol, 69:6158-6169, 1995)。両方の系統を、リコンビナーゼ活性化遺伝子1(RAG-1)ノックアウト(KO)動物と交雑した。HBV-Envトランスジェニックマウスには、マウスアルブミンプロモーターの構成的転写制御下にあるHBVエンベロープコード領域全体(サブタイプayw)が含まれる。これらのマウスは、その肝細胞内で、HBVの小型、中型、および大型エンベロープタンパク質を発現する。HBV複製マウスは、末端に重複したHBV DNA構築物を含む(Guidotti et al, 上記, 1995)。これらのマウスは、その肝細胞および近接した曲尿細管内に、高レベルのウィルス複製を有する。これらの動物で見られる複製レベルは、慢性持続性HBV肝炎の患者の感染した肝臓で観察されるレベルに匹敵するが、マウスは、細胞病理学の証拠を示さない(Guidotti et al, 上記, 1995)。様々なHBV-Env+ Rag-/-およびHBV複製Rag-/-マウス(8〜10週齢)に、6〜10週齢の野生型B10.D2オスマウス由来のドナー脾細胞を静脈内注射した (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)。記載する間隔でマウスの尾の静脈を出血させ、血清を採取した。示した時点で他のマウスを屠殺して、組織学検査のために肝臓を採取した。すべてのマウスは、UCSFの無菌施設で管理した。
COBAS MIRAおよび自動分析装置を用いて、標準的な光度測定方法により、血清アラニンアミノ基転移酵素(ALT)を測定した。
消化培地(0.2 mg/mLコラゲナーゼおよび0.02 mg/mL DNアーゼおよび5%FCSを含む、RPMI培地)により、下大静脈の胸部を介して、マウス肝臓を5分間灌流した。次いで金属ストレーナを通すことで、肝臓をホモジェナイズした。細胞調製物を遠心分離して肝細胞を除去し(30 RCF、3分)、残った細胞をパーコール勾配で遠心分離して境界面の免疫細胞を回収した。
市販の肝臓灌流培地(GIBCO, カタログ番号17701-038)で5分間、およびその後消化培地(NEAA、培地を伴い、0.12〜0.2 mg/mLコラゲナーゼを含む、DMEM低グルコース50%/F-12 50%ミックス)で8分間、下大静脈マウスの胸部を介して、肝臓を灌流した。肝臓を非常に小さい断片に切断し、70μmのナイロン細胞ストレーナを通して濾過した。濾過した溶液を、30 RCFで3分間遠心分離し、トリパンブルーを用いて細胞を計数した。
肝臓内免疫細胞を、最初にFc-ブロック1:5で、次にPE標識した抗NKG2D、抗TCRβビオチン、およびAPC標識した抗NK1.1抗体、ならびにそれらのアイソタイプ対照で染色した。抗TCRβビオチン抗体およびそのアイソタイプ対照に対する二次抗体として、ストレプトアビジン-Qdot605を用いた。肝細胞を、精製した抗pan-RAE-1、抗Mult-1、および抗ラットIgG2a抗体で染色し、DAPI陰性集団に対してゲートをかけた。ヤギ抗ラットPEを、二次抗体として用いた。活性化されたNK T細胞において、最も明るいTCRβ表面染色を得るために、図18Dに対する異なる設定を用いて、LSR IIに対してFACS分析を行った。Flowjoソフトウェアを用いて、データを分析した。
製造業者の指示に従ってABI 7300(Applied Biosystems)を用いて、定量的(リアルタイム)PCRを行った。
特異的プローブ:
(SEQ ID NO:14に記載のpan-RAE-1)および
(SEQ ID NO:15に記載のHPRT)。
プライマー:
総RNAを、DNアーゼIで処理した。リアルタイムPCRのサイクル条件:50℃で2分、95℃で10分、その後95℃で15秒と60℃で1分を40サイクル。
記載のように(Ogasawara et al., 上記、2003)作成した抗マウスNKG2D mAbであるクローンCX5(ラットIgG1)は、NKG2D細胞外ドメインを認識し、NKG2Dのそのリガンドへの結合を効果的に遮断する。同系ナイーブ脾細胞の養子免疫伝達の前日および4日後、マウス1匹当たり200μgのCX5またはラットIgG(Sigma, ST. Louis, MO)を、腹膜腔に注射した。
養子免疫伝達(AT)後3日目および/または4日目に、様々なマウスから肝臓内免疫細胞を溶出した。細胞を計数し、すぐに抗サイトカインプレコーティング96ウェルマイクロプレート内に配置した(BD, エリスポットマウスIFN-γおよびIL-4キット)。条件あたり二つ組で、8連続2または3倍希釈を試験した。AIDエリスポットリーダーを用いて、スポットを自動的に計数した。
組織カセット内の10%ホルマリン中に配置した肝臓片を、標準的なプロトコールに従い、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
2つの試料のスチューデントt検定を実施し、P<0.05を有意とみなした。
非古典的なNK T細胞の活性化は、急性肝炎の発症に必須ではないが、NK細胞単独では、抗肝臓免疫応答を開始しない(Baron et al, 上記、2002)。本明細書に記載のように、同系の脾細胞の養子免疫伝達の3日後にHBV-Env+ Rag-/-マウスの肝臓に存在するIFN-γ産生細胞の細胞プロファルを、現在検討している。HBV-Env- Rag-/-マウス内のそれぞれ19%および29%のNKおよびNK T細胞とは対照的に、HBV-Env+ Rag-/-マウス内のそれぞれ約41%および43%のNKおよびNK T細胞が、IFN-γを分泌する。両方の血統で、肝臓内のT細胞、およびNK1.1陰性、TCR陰性肝臓内免疫細胞によるIFN-γの産生は、検出不能であった。したがって、IFN-γ産生は、このモデルではNKおよびNKT細胞によるもので占められる。
NKおよびNKT細胞は、ウィルス感染細胞または腫瘍細胞の排除において中心的な役割を担い、NKG2Dは、全てのNK細胞およびNK T細胞の大半で発現する活性化受容体および/または共刺激受容体である。HBV-Env+ Rag-/-およびHBV-Env- Rag-/-マウスの肝臓内および血液中の、NK1.1陽性細胞表面で発現するNKG2Dレベルを分析した。両方のマウス由来のNK1.1+細胞が、NKG2Dを同程度の量発現した(図18A)。しかしながら、NKG2Dの表面レベルは、NKまたはNK T細胞の活性化状態によって変化する。したがって、NKG2Dの発現を、HBV抗原陽性肝細胞に対する急性免疫応答の間評価した。同系脾細胞を、HBV-Env+ Rag-/-およびHBV-Env- Rag-/-マウスへ養子免疫伝達した。急性肝炎の発症を、血液へのアラニンアミノ基転移酵素(ALT)の放出を測定することによって判定した(図18B)。およそ3日目の免疫応答のピーク時に、HBV-Env+ Rag-/-およびHBV-Env- Rag-/-の肝臓から溶出した細胞内のNKG2D発現を、FACSによって決定した。HBV-Env+ Rag-/-マウス由来のNKおよびNKT細胞が、HBV-Env- Rag-/-マウスから溶出した同じ集団よりも、NKG2Dをより高いレベルで発現することを見出した(図18C)。循環するNK細胞も同様に、HBV-Env+ Rag-/-マウスでNKG2Dを高いレベルで発現した(図18D)。これにより、HBV-Env+ Rag-/-マウスでのNKおよびNKT細胞の活性化において、および結果として急性肝臓損傷の発生において、NKG2Dが役割を担うことが示される。
循環するおよび常在するNKおよびNKT細胞は、急性肝炎の発症の際、より多くの量のNKG2Dを発現した。マウスでは、NKG2Dが、ウィルスに感染した細胞または形質転換された悪性細胞内でアップレギュレートされる遺伝子のRAE-1ファミリーおよびMult-1ファミリーを認識する。HBV-Env+ Rag-/-およびHBV-Env- Rag-/-マウスの灌流した肝細胞および肝臓内免疫細胞におけるNKG2Dリガンド発現を評価した。HBV-肝細胞と比較した場合、RAE-1の発現レベルの上昇が、HBV+肝細胞の表面で見出された。HBV-Env+ Rag-/-およびHBV-Env- Rag-/-マウスの肝臓由来の肝臓内免疫細胞が、同様に低いレベルの表面RAE-1を示したことから(図19A)、この上昇は、HBV-Envタンパク質を発現する細胞内でのみ検出された。対照的に、Mult-1表面発現は、分析したいずれの細胞でも検出されなかった(図19C)。これは、肝細胞内のHBV抗原の発現が、その表面上のタンパク質のRAE-1ファミリーの発現を誘導することを示す。したがって、初めに本明細書に記載した通り、HBV発現肝細胞(HBV感染肝臓の暗示)が、NKおよびNKT細胞内で発現する活性化NKG2D受容体との相互作用を介して、宿主の生得様免疫システムに通知することができる。
HBV-Env+ Rag-/-トランスジェニックマウスの肝臓壊死は、肝細胞によって発現されるHBV抗原に対する養子免疫伝達された同系ナイーブ非古典的NK T細胞の急性免疫応答によって引き起こされる(Baron et al. 上記、2002)。しかしながら、NK T細胞活性化のメカニズムは、本発明の開発の前には知られていなかった。CMVによる感染は、結果としてNKG2Dリガンドの発現上昇をもたらし、このシグナル伝達経路の活性化は、細胞傷害性およびサイトカイン産生に必要である(Groh et al, 上記、2001)。同様に、RAE-1は、HBV抗原も発現した肝細胞で独占的にアップレギュレートされた。急性B型肝炎の発症の際のNKG2D受容体の中和効果を、モノクローナル阻止抗体(CX5)を用いて試験した(Ogasawara et al., 上記、2003)。簡潔には、同系ナイーブ脾細胞の養子免疫伝達の前日およびその4日後に、HBV-Env+ Rag-/-マウスを、200μgのCX5 mAbまたはアイソタイプ対照(ラットIgG1)で処理した。図20Aに示すように、NKG2D受容体の遮断は、全てのHBV-Env+ Rag-/-マウスの肝臓損傷を防止したが、一方、養子免疫伝達後3日目および4日目の血清ALT値によって明らかなように、ラットIgGアイソタイプ対照は全く効果がなく、全てのマウスは重傷の急性肝炎の兆候を示した。さらに、ラットIgGで処理した全てのマウスは、養子免疫伝達後6日目に黄色い血清を有した。これは、血清の総ビリルビンレベルの増加と相関している。対照的に、抗NKG2D mAbで処理したHBV-Env+マウスは、血清ビリルビン量の増加を示さなかった。組織学分析はまた、ラットIgGで処理したマウスのみが、養子免疫伝達後4日目に、小葉の炎症、肝細胞損傷、および門脈の炎症によって病理学的に特徴付けられる重篤な肝炎ならびに壊死性肝細胞を発症したことを示した(図20B)。これらの組織学的異常は、同じ時点では、抗NKG2D mAbで処理した全てのマウスに存在しなかった(図20B)。これらの結果により、HBV発現肝細胞に対する急性免疫応答において、および壊死性肝臓傷害の発生に対して、NKG2Dが担う基本的な役割が実証される。したがって、「感染した」細胞によるRAE-1発現の上昇は、活性化シグナルとして作用し、それによって免疫システムに通知することが企図される。
抗NKG2DおよびラットIgG処理マウスのサイトカインプロファルもまた、調査した。同系野生型脾細胞の養子免疫伝達後3日目および4日目に、IFN-γ(図20C)、TNF-α、およびIL-4(図20D)を産生する肝臓内免疫細胞の数を、エリスポットによって定量化した。養子免疫伝達の3日後、抗NKG2D mAb処理マウスと比較して、ラットIgGを受けたマウスでは、IFN-γ、TNF-α、およびIL-4産生細胞の数は、それぞれ8倍、10倍、および7倍増加した。抗NKG2Dで処理したマウスにおけるサイトカイン産生細胞の数は非常に少なく、同系野生型脾細胞を受けたHBV-Env+Rag-/- CD1d-/-マウスと同じ桁数であった(Baron et al., 上記、2002)。養子免疫伝達の4日後、抗NKG2D mAbまたはIgG処理マウスの肝臓内免疫細胞によるサイトカイン産生の差異は、なお明白である。したがって、NKG2Dの遮断は、HBV抗原を発現するマウスで、肝臓内免疫細胞によるサイトカイン産生を著しく損なった。
その適切なストイキオメトリで全てのウィルスタンパク質を発現することにより肝臓内HBVの複製を示すHBV複製Rag-/-マウスを、同様に検査した。HBV複製+ Rag-/-由来のNK1.1陽性肝臓内免疫細胞の表面上で発現するNKG2D量を、同系脾細胞の養子免疫伝達の2日目および3日後に判定した。図21Bで示すように、HBV複製+ Rag-/-マウスのNK1.1+細胞内のNKG2D発現の増加が観察された。さらに、HBV-Env+Rag-/-マウスで観察されたように、ラットIgG処理対照と比較して、抗NKG2D mAbで処理したHBV複製+ Ragでは、肝臓損傷レベルが低下し、IFN-γおよびIL-4を産生する肝臓免疫細胞が浸潤する(図21A、21C、および21D)。
心臓同種移植片拒絶反応の予防および治療のためのNKG2D遮断
以下の実験を実施して、心臓同種移植片移植の動物モデルにおける実質臓器拒絶反応の発症に対するNKG2D遮断の効果をテストした(参照により本明細書に組み入れられる、McNerney et al., Am J Transplant, 6:505-513, 2006)。
移植後、NKG2Dリガンドの誘導を評価するために、Balb/CおよびC57Bl/6の皮膚または心臓移植片を、C57BL/6レシピエントに移植し、組織を様々な時点で採取した。総RNAを単離して、リアルタイム定量的PCRを用いてNKG2Dリガンドの発現を評価した。同系および同種異系移植片の両方で、初期の時点で、NKG2Dリガンド(RAE-1)の発現はアップレギュレートされた。同系群では発現レベルはベースラインに戻ったが、一方同種異系群では7日目までにリガンドが大きくアップレギュレートされた(図23A)。これはおそらくアロ反応性T細胞によって引き起こされるさらなる損傷に起因する。T細胞欠乏宿主においてNKG2Dリガンドレベルがベースラインに戻ることから(図23B)、この遅いアップレギュレーションは、厳密には適応免疫応答に依存性であった。Rae-1発現も同様に、心臓同種移植片で7日目にアップレギュレートされ、同系移植片と比較して同種異系移植片でより高いレベルが見られた(図23C)。
Claims (50)
- ウィルス性肝炎を治療または予防するのに適した条件下で、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、ウィルス性肝炎を治療または予防する方法。
- 対象が、B型肝炎ウィルス(HBV)に急性感染している、請求項1記載の方法。
- 対象が、HBVに慢性感染している、請求項1記載の方法。
- 対象が、C型肝炎ウィルス(HCV)に急性感染している、請求項1記載の方法。
- 対象が、HCVに慢性感染している、請求項1記載の方法。
- 対象が、血清アラニンアミノ基転移酵素(ALT)の上昇したレベルを有する、請求項1記載の方法。
- 投与する段階の結果として、肝臓の壊死が低減する、請求項1記載の方法。
- 投与する段階の結果として、対象の肝臓内のサイトカインレベルが低下する、請求項1記載の方法。
- サイトカインがインターフェロンγを含む、請求項8記載の方法。
- サイトカインがインターロイキン4を含む、請求項8記載の方法。
- サイトカインが腫瘍壊死因子αを含む、請求項8記載の方法。
- 投与する段階の結果として、対象の肝臓を浸潤するリンパ球が減少する、請求項1記載の方法。
- 細胞が、NKG2D+CD8+T細胞、NKG2D+CD4+T細胞、NKG2D+γδT細胞、NKG2D+NK細胞、およびマクロファージからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 薬剤が、NKG2Dに結合する抗体、またはそのNKG2D結合断片を含む、請求項1記載の方法。
- 抗体が、NKG2Dと、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、およびULBP4からなる群より選択されるNKG2Dリガンドとの相互作用を低減する、請求項14記載の方法。
- 抗体が、NKG2DとDAP10との相互作用を低下させる、請求項14記載の方法。
- 抗体が、細胞表面のNKG2D量を減少させる、請求項14記載の方法。
- 抗体が、細胞表面NKG2Dが内部移行する速度を増大させる、請求項14記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項14記載の方法。
- モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項19記載の方法。
- 薬剤が、NKG2Dをコードする核酸の転写または翻訳を低下させる核酸を含む、請求項1記載の方法。
- 対象に抗ウィルス剤を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 抗ウィルス剤が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログである、請求項22記載の方法。
- ウィルス性肝炎を治療または予防するのに適した条件下で、抗ウィルス剤と、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤とを、それを必要とする対象に投与する段階を含む、ウィルス性肝炎を治療または予防する方法。
- 薬剤が、NKG2Dに結合する抗体、またはそのNKG2D結合断片を含む、請求項24記載の方法。
- 抗体が、NKG2Dと、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、およびULBP4からなる群より選択されるNKG2Dリガンドとの相互作用を低減する、請求項25記載の方法。
- 抗ウィルス剤が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログである、請求項24記載の方法。
- 抗ウィルス剤と、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤とを含む、組成物。
- 薬剤が、NKG2Dに結合する抗体、またはそのNKG2D結合断片を含む、請求項28記載の組成物。
- 抗体が、NKG2Dと、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、およびULBP4からなる群より選択されるNKG2Dリガンドとの相互作用を低減する、請求項29記載の組成物。
- 抗ウィルス剤が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログである、請求項28記載の組成物。
- ウィルス感染に関連する炎症を治療または予防するのに適した条件下で、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤を、それを必要とする対象に投与する段階を含む方法。
- 実質臓器同種移植の拒絶反応を治療または予防するのに適した条件下で、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、実質臓器同種移植の拒絶反応を治療または予防する方法。
- 移植片が、心臓同種移植片、肺同種移植片、心臓/肺同種移植片、腎臓同種移植片、膵臓同種移植片、腎臓/膵臓同種移植片、肝臓同種移植片、腸同種移植片、および皮膚同種移植片からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
- 移植片が心臓同種移植片である、請求項33記載の方法。
- 投与する段階が、同種移植片の移植の前および後に行われる、請求項33記載の方法。
- 細胞が、NKG2D+CD8+T細胞、NKG2D+CD4+T細胞、NKG2D+γδT細胞、NKG2D+NK細胞、およびマクロファージからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
- 薬剤が、NKG2Dに結合する抗体、またはそのNKG2D結合断片を含む、請求項33記載の方法。
- 抗体が、NKG2Dと、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、およびULBP4からなる群より選択されるNKG2Dリガンドとの相互作用を低減する、請求項38記載の方法。
- 抗体が、NKG2DとDAP10との相互作用を低減する、請求項38記載の方法。
- 抗体が、細胞表面のNKG2D量を減少させる、請求項38記載の方法。
- 抗体が、細胞表面NKG2Dが内部移行する速度を増大させる、請求項38記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項38記載の方法。
- モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項43記載の方法。
- 対象に補助療法を投与する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
- 補助療法が免疫調節剤を含む、請求項45記載の方法。
- 免疫調節剤が、シクロスポリンA、タクロリムス、シロリムス、エベロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、アザチオプリン、およびFTY-720からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
- 補助療法が、抗生物質、抗ウィルス剤、抗真菌薬物、抗潰瘍薬物、および利尿剤の1つまたは複数を含む、請求項46記載の方法。
- 同種移植片の移植後の投与が、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤の週2回投与を含む、請求項36記載の方法。
- 免疫調節剤と、細胞のリガンド誘導性NKG2D活性化を低下させる薬剤とを含む、組成物。
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