JP2009535340A - ジメチルフェニル化合物の結晶性形態 - Google Patents

Abstract

本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態に関する。本発明はまた、このような結晶形態を含有し、またはこのような結晶形態から調製される医薬組成物；このような結晶形態の調製のために有用な方法および中間体；ならびに例えば肺障害を治療するためのこのような結晶形態の使用方法にも関する。

Description

（発明の分野）
本発明は、ジメチルフェニル化合物の新規な結晶性遊離塩基の形態に関し、この化合物は、肺障害の治療のための治療剤として有用であることが見込まれる。本発明はまた、このような結晶形態を含む、またはこのような結晶形態から調製される医薬組成物；このような結晶形態を調製するのに有用な方法および中間体；ならびに例えば肺障害を治療するためこのような結晶形態を使用する方法にも関する。

（先行技術）
本明細書と同日付で出願された本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第＿＿号（整理番号Ｐ−２２１−ＵＳ１）、および２００６年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／７９４，７０２号（それらの開示内容は、全内容が参照により本明細書中に組み込まれている）には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息などの肺障害を治療するための治療剤として有用な新規なジアルキルフェニル化合物が開示されている。特に、化合物であるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］−ピペリジン−４−イルエステルは、本出願においてムスカリンアンタゴニスト活性およびβ_２アドレナリン受容体アゴニスト活性の両方を有するものとして特に開示されている。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの化学構造を、式Ｉで示す。

肺障害を治療するのに有用な治療剤は、有利なことには吸入によって気道に直接投与される。これに関しては、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）およびネブライザー吸入器を含めた、吸入による治療剤の投与のためのいくつかのタイプの薬剤の吸入装置が開発されてきた。このような装置に使用するための医薬組成物および製剤を調製する場合、吸湿性でも潮解性でもなく、比較的高い融点（すなわち約１３０℃超）を有し、したがって材料が顕著な分解をし、または結晶化度を喪失することなしに微粉化することを可能にする治療剤の結晶形態を有することが非常に望ましい。

式Ｉの化合物の非結晶形態は、以前に開示された。したがって、許容できるレベルの吸湿性および比較的高い融点を有する式Ｉの化合物の、安定的で非潮解性結晶形態への必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態に関する。驚いたことに、式Ｉの化合物のこのような結晶性遊離塩基の形態は、大気中の水分に曝された場合でも、潮解性ではないことが見出された。さらに、このような結晶形態は、許容できるレベルの吸湿性および高い融点、例えば約１３０℃超の融点を有する。

特定の態様では、本発明は、微粉化形態のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態に関する。

他の使用法の中で、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、肺障害を治療するのに有用であることが見込まれる医薬組成物の調製のために有用である。したがって、その組成物の別の態様では、本発明は、医薬として許容される担体と、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態とを含む医薬組成物に関する。

所望であれば、本発明の結晶形態は、ステロイド性抗炎症剤などの他の治療剤と組み合わせて投与することができる。したがって、その組成物の別の態様では、本発明は、（ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態と、（ｂ）第２の治療剤とを含む医薬組成物に関する。またその組成物の別の態様では、本発明は、（ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態と、（ｂ）第２の治療剤と、（ｃ）医薬として許容される担体とを含む医薬組成物に関する。

またその組成物の別の態様では、本発明は、治療剤の組合せに関し、この組合せは、（ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態と、（ｂ）第２の治療剤とを含む。その組成物の別の態様では、本発明は、医薬組成物の組合せに関し、この組合せは、（ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態および医薬として許容される担体を含む医薬組成物と、（ｂ）第２の治療剤および医薬として許容される担体を含む医薬組成物とを含む。

式Ｉの化合物は、β_２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する。したがって、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を治療するための治療剤として有用であることが見込まれる。

したがって、その方法の態様の１つでは、本発明は肺障害を治療する方法に関し、この方法は、治療を必要としている患者に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む。

本発明はまた慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法にも関し、この方法は、患者に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む。

さらに、別のその方法の態様では、本発明は哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法に関し、この方法は、哺乳動物に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む。

本発明はまた、哺乳動物においてムスカリン受容体をアンタゴナイズし、およびβ_２アドレナリン受容体をアゴナイズする方法にも関し、この方法は、哺乳動物に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態を投与するステップを含む。

本発明はまた、式Ｉの化合物の遊離塩基の形態の調製方法にも関する。したがって、別のその方法の態様では、本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態の調製方法に関し、この方法は、
（ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの希釈液溶液を提供するステップと、
（ｂ）カウンター溶媒をステップ（ａ）からの溶液に加え、曇点を生じさせるステップと
を含む。

任意選択で、この方法は、
（ｃ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態の種結晶を、ステップ（ｂ）の生成物に加えるステップをさらに含む。これらの方法の特定の実施形態では、希釈液はメタノールであり、カウンター溶媒は水である。

さらに、本発明は、治療に使用するためのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態に関する。本発明はまた、肺障害の治療用の医薬の製造のためのこのような結晶性遊離塩基の形態の使用にも関する。本発明の他の態様および実施形態は、本明細書において開示されている。

本発明の様々な態様を、添付図面を参照して例示する。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶性遊離塩基の形態に関する。これらの塩中の活性治療剤（すなわち、式Ｉの化合物）は、（Ｒ）配置を有する１つのキラル中心を含有する。しかし、別段の指示がない限り、少量の（Ｓ）立体異性体は、このような異性体の存在によって全体として組成物の有用性がなくならない限り、本発明の組成物中に存在してもよいことを当業者であれば理解しよう。

式Ｉの化合物は、市販のＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ社、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して命名した。

定義
本発明の化合物、組成物、方法およびプロセスについて記載する場合、下記の用語は、別段の指示がない限り下記の意味を有する。

「融点」という用語は、本明細書で使用する場合、示差走査熱量測定によって最大吸熱的熱流が観察される温度を意味する。

「質量中央径」または「ＭＭＤ」という用語は、粒子を言及するために使用される場合、粒子の塊の半分がそれより大きい直径の粒子に含まれ、半分がそれより小さい直径の粒子に含まれるような直径を意味する。

「微粉化された」または「微粉化された形態の」という用語は、別段の指示がない限り、粒子の少なくとも約９０パーセントが約１０μｍ未満の直径を有する粒子を意味する。

「溶媒和物」という用語は、溶質、すなわち式Ｉの化合物の遊離塩基の形態の１つまたは複数の分子と、溶媒の１つまたは複数の分子とによって形成される複合体あるいは凝集物を意味する。このような溶媒和物は典型的には、実質的に固定したモル比の溶質および溶媒を有する。この用語には、水とのクラスレートを含めたクラスレートも挙げられる。代表的な溶媒には、例示として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが挙げられる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。

「治療有効量」という用語は、治療を必要としている患者に投与した場合、治療を行うのに十分な量を意味する。

「治療する」または「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物（特に、ヒト）などの患者において疾患または病状（ＣＯＰＤなど）を治療することまたは治療を意味し、
（ａ）疾患または病状が起こることを予防すること、すなわち患者の予防的治療、
（ｂ）疾患または病状を回復させること、すなわち患者の疾患または病状を解消または退行させること、
（ｃ）疾患または病状を抑えること、すなわち患者の疾患または病状の進行を遅らせ、または阻止すること、あるいは
（ｄ）患者の疾患または病状の症状を軽減すること
が含まれる。

「単位剤形」という用語は、患者に投与するのに適切な物理的な個別単位を意味する。すなわち各ユニットは、単独で、あるいは１種または複数のさらなるユニットと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された本発明の塩の所定の量を含む。例えば、このような単位剤形は、ドライパウダー吸入器用カプセル剤、定量吸入器からの定用量、カプセル剤、錠剤、丸剤などでよい。

本明細書において使用されるすべての他の用語は、当業者であれば理解するように、それらの通常の意味を有することが意図されている。

本発明の代表的な結晶性遊離塩基の形態
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルは、少なくとも３種の異なる結晶性遊離塩基の形態で存在することが見出された。本発明の目的のために、これらの形態は、本明細書において形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩとして識別される。式Ｉの化合物のこれらの結晶形態は、少なくとも下記の特性によって識別することができる。

形態Ｉ：約１３２℃〜約１３８℃で吸熱的熱流のピークを示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース；約１７．７±０．３、１８．２±０．３、２１．７±０．３および２３．２±０．３の２θ値にて他のピークの中でも有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターン。

形態ＩＩ：約１４２℃〜約１５０℃で吸熱的熱流のピークを示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース；約２０．７±０．３、２１．６±０．３、２２．５±０．３および２３．２±０．３の２θ値にて他のピークの中でも有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターン。

形態ＩＩＩ：約１３４℃〜約１４０℃で吸熱的熱流のピークを示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース；約１５．５±０．３、１８．１±０．３、１９．２±０．３および２１．８±０．３の２θ値にて他のピークの中でも有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターン。

ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルまたはその溶媒和物の結晶化によって調製される。

調製の１つの方法では、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、溶媒中で化合物のスラリーを形成させ、このように得られたスラリーを、結晶体を形成するために十分な時間攪拌することによって調製する。典型的には、このようなスラリーを、周囲温度（すなわち、約２０℃〜約３０℃）で約２４〜約７２時間攪拌する。一般に、スラリーは、溶媒１ミリリットル当たり約３５ｍｇ〜約４５ｍｇ、すなわち約４０ｍｇの化合物を含むであろう。いくつかの場合、溶媒の選択は、どの結晶性遊離塩基の形態がスラリーから生成されるかを決定するであろう。例えば、溶媒がアセトニトリルである場合、形態Ｉが主要な形態として生成された。代わりに、溶媒がイソプロパノールである場合、形態ＩＩが主要な形態として生成された。さらに、溶媒がエタノールである場合、形態ＩＩＩが主要な形態として生成された。溶媒に加えて、他の要因はどの固形が生成されるかに影響を及ぼし得る。

調製の他の方法では、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］−ピペリジン−４−イルエステルを、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトニトリルなどの希釈液に溶解し、水などのカウンター溶媒（逆溶媒）を加え、それによって結晶性遊離塩基の形成がもたらされる。一般に、結晶化手順は、周囲温度で、または混合物を加熱し次いで放置して周囲温度に冷却することによって行うことができる。この方法の特定の実施形態では、希釈液はメタノールであり、カウンター溶媒は水である。

本発明に用いられるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルは、下記の実施例に記載される手順を使用して、または本出願の背景技術の節に記載されている本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願に記載されている手順を使用することによって、市販の出発物質および試薬から容易に調製することができる。

本発明の結晶性遊離塩基の形態を調製する方法は、優位に特定の遊離塩基の形態を生成するために、種結晶の使用を任意選択で含むことができる。例えば、形態ＩＩの種結晶を使用することによって、本質的に種結晶と同一の形態、すなわち形態ＩＩを有する式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態を調製することができる。このような種結晶は、最初に結晶性遊離塩基の形態を形成する場合、または結晶性または部分結晶性の遊離塩基の形態を再結晶させるために使用することができる。

典型的には、種結晶は、攪拌することなくかつ冷却することなく緩慢な結晶化によって調製される。例示として、種結晶を得るために、式Ｉの化合物を典型的には、溶解を可能にするのに十分な温度で希釈液に溶解する。例えば、式Ｉの化合物を、約７５℃〜約８０℃でアセトニトリルと水との１：２混合物に溶解し、次いで放置して周囲温度に約１２時間〜２４時間冷却し、結晶性遊離塩基の形態を提供する。他の実施形態では、約４０重量％〜約８０重量％の水を含有するメタノールを、希釈液として使用する。このように得られた結晶を濾過または他の従来の手段によって単離する。代わりに種結晶を、結晶体の従前の調製から得ることができる。

種結晶を使用した再結晶工程の特定の実施形態では、式Ｉの化合物の遊離塩基の形態を、メタノール（典型的には、化合物１グラム当たり１４０ｍｌを含めた、約１２０ｍｌ〜約１６０ｍｌのメタノール）中で周囲温度にて溶解し、曇点に到達するまで水を加える。次いで、種結晶を加える（典型的には、化合物１グラム当たり約１〜約５ｍｇの種結晶）。このように得られた混合物を周囲温度で攪拌し、その間式Ｉの化合物は結晶化する。このように得られた結晶を、濾過などの従来の手順を使用して単離する。結晶化または再結晶工程のために使用される特定の温度は、希釈液の特徴および希釈液中の結晶塩の濃度によって選択されるであろうことを理解されたい。さらに結晶化を容易にするために、冷却の代わりに蒸発またはカウンター溶媒のいずれかを使用して、再結晶工程を行うことができる。

本発明の一態様では、本発明の結晶性遊離塩基の形態は、それらの物理的特性および／またはスペクトル特性によって規定される。したがって、一実施形態では、本発明は、約１７．７±０．３、１８．２±０．３、２１．７±０．３および２３．２±０．３の２θ値にて有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、ピーク位置が図１に示すものと実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする結晶性遊離塩基の形態に関する。

他の実施形態では、本発明は、約２０．７±０．３、２１．６±０．３、２２．５±０．３および２３．２±０．３の２θ値にて有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、ピーク位置が図２に示すものと実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする結晶性遊離塩基の形態に関する。

さらに他の実施形態では、本発明は、約１５．５±０．３、１８．１±０．３、１９．２±０．３および２１．８±０．３の２θ値にて有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、ピーク位置が図３に示すものと実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする結晶性遊離塩基の形態に関する。

また別の実施形態では、本発明は、図４に示すトレースと実質的に一致するＤＳＣトレースを有する式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。他の実施形態では、これは、図５に示すトレースと実質的に一致するＤＳＣトレースを有する式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。また別の実施形態では、これは、図６に示すトレースと実質的に一致するＤＳＣトレースを有する式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態に関する。

形態ＩＩの結晶性遊離塩基は、４０％相対湿度〜７５％相対湿度の湿度範囲で約０．５％未満の重量増加を伴う可逆的な吸着／脱離プロファイルを有することが示された。

本発明の結晶性遊離塩基の形態のこれらの特徴は、下記の実施例にさらに例示されている。

医薬組成物、組合せおよび製剤
本発明の結晶性遊離塩基の形態は典型的には、医薬組成物または製剤の形態で患者に投与される。このような医薬組成物は、それだけに限らないが、吸入、経口、経鼻、（経皮を含めた）局所および非経口投与方法が挙げられる任意の許容できる投与経路によって患者に投与することができる。

したがって、その組成物の態様の１つでは、本発明は、医薬として許容される担体または賦形剤と式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態とを含む医薬組成物に関する。任意選択で、このような医薬組成物は、所望であれば他の治療剤および／または配合剤を含有してもよい。

本発明の医薬組成物は典型的には、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を含有する。しかし、当業者であれば、医薬組成物は、治療有効量を超える量（すなわち、バルク組成物）、または治療有効量未満の量（すなわち、治療有効量を達成するための多回投与のために設計されている個々の単位用量）を含有することができることを理解するであろう。

典型的には、医薬組成物は、約０．０１〜約１０重量％などの約０．０１〜約３０重量％の治療剤を含めて、約０．０１〜約９５重量％の治療剤を含有する。

任意の従来の担体または賦形剤を、本発明の医薬組成物において使用することができる。特定の担体または賦形剤、あるいは担体または賦形剤の組合せの選択は、特定の患者を治療するために使用される投与方法、あるいは病状または病態のタイプによるであろう。これに関しては、特定の投与方法のための適切な医薬組成物の調製は、十分に製薬技術の当業者の範囲内である。

本発明の医薬組成物に使用される担体または賦形剤は、市販である。例えば、このような材料は、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。さらに例示するために、従来の製剤技術は、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、Lippincott Williams & White、Baltimore、Maryland（２０００年；およびH. C. Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第７版、Lippincott Williams & White、Baltimore、Maryland（１９９９年）における教示によって例示されるように当業者には周知である。

医薬として許容される担体としての機能を果たす材料の代表的な例には、それだけに限らないが、下記が挙げられる。（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース、ならびにその誘導体、（４）トラガカント粉末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤、（９）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質なしの水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液溶液、（２１）クロロフルオロカーボンおよびハイドロフルオロカーボンなどの圧縮噴射ガス、ならびに（２２）医薬組成物に用いられる他の無毒適合性の物質。

本発明の医薬組成物は典型的には、本発明の結晶性遊離塩基の形態を、医薬として許容される担体および任意選択の成分と完全および密接に混合またはブレンドすることによって調製される。必要に応じてまたは所望により、このようにして得られた均一にブレンドされた混合物は、次いで従来の手順および装置を使用して、錠剤、カプセル剤、丸剤、缶、カートリッジ、ディスペンサーなどに成形または充填することができる。

一実施形態では、本発明の医薬組成物は、吸入投与に適切である。吸入投与のために適切な医薬組成物は典型的には、エアロゾルまたは粉末の形態であろう。このような組成物は一般に、ネブライザー吸入器、定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）または同様の送達装置などの周知の送達装置を使用して投与される。

本発明の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、ネブライザー吸入器を使用して吸入によって投与される。このようなネブライザー装置は典型的には、治療剤を含む医薬組成物を患者の気道に運ぶ霧として噴霧する高速空気流を生じる。したがって、噴霧吸入器での使用のために製剤される場合、治療剤を典型的には、適切な担体に溶解し、溶液を形成する。あるいは、治療剤を微粉化し、適切な担体と混合し、微粉化粒子の懸濁液を形成することができる。吸入によって治療剤を投与するのに適切なネブライザー装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的なネブライザー装置または製品には、Ｒｅｓｐｉｍａｔ Ｓｏｆｔｍｉｓｔ Ｉｎｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、ＡＥＲｘ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｄｉｇｍ社）、ＰＡＲＩ ＬＣ Ｐｌｕｓ Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｐａｒｉ ＧｍｂＨ社）などが挙げられる。

噴霧吸入器に使用するための代表的な医薬組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの式Ｉの化合物を含む等張水溶液を含む。このような組成物は、典型的には等張食塩水中に式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態を溶解することによって調製される。一実施形態では、このような溶液は、約４〜約６のｐＨを有する。

本発明の他の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、ドライパウダー吸入器を使用して吸入によって投与される。このようなドライパウダー吸入器は典型的には、吸気の間に患者の呼吸流に分散する易流動性粉末として治療剤を投与する。易流動性粉末を実現するために、治療剤は典型的には、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）またはこれらの組合せなどの適切な賦形剤で製剤される。治療剤は典型的には、微粉化され、適切な担体と混合され、吸入に適切なブレンドを形成する。

ドライパウダー吸入器で使用するための代表的な医薬組成物は、乾燥粉砕ラクトースおよび式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の微粉化粒子を含む。

このような乾燥粉末製剤は、例えば、ラクトースを治療剤と混合し、次いで成分を乾燥ブレンドすることによって作製することができる。あるいは、所望であれば、治療剤は、賦形剤なしで製剤することができる。次いで、医薬組成物は典型的には、乾燥粉末送達装置で使用するために、乾燥粉末ディスペンサー、あるいは吸入カートリッジまたはカプセルに充填される。

吸入によって治療剤を投与するのに適切なドライパウダー吸入用送達装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的なドライパウダー吸入用送達装置または製品には、Ａｅｏｌｉｚｅｒ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、Ａｉｒｍａｘ（ＩＶＡＸ社）、ＣｌｉｃｋＨａｌｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔａ Ｂｉｏｍｅｄ社）、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｄｉｓｋｕｓ／Ａｃｃｕｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｅａｓｙｈａｌｅｒ（Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ社）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ａｖｅｎｔｉｓ社）、ＦｌｏｗＣａｐｓ（Ｈｏｖｉｏｎｅ社）、Ｈａｎｄｉｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、Ｐｕｌｖｉｎａｌ（Ｃｈｉｅｓｉ社）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＳｋｙｅＨａｌｅｒ／Ｃｅｒｔｉｈａｌｅｒ（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ社）、Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社）、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社）、Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ（Ａｖｅｎｔｉｓ社）などが挙げられる。

本発明のまた他の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、定量吸入器を使用して吸入によって投与される。このような定量吸入器は典型的には、圧縮噴射ガスを使用して一定量の治療剤を放出する。したがって、定量吸入器を使用して投与される医薬組成物は典型的には、液化噴射剤中に治療剤の溶液または懸濁液を含む。ＣＣｌ_３Ｆなどのクロロフルオロカーボン、ならびに１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ２２７）などのヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）を含めた任意の適切な液化噴射剤を用いることができる。クロロフルオロカーボンがオゾン層に影響を与えることについての懸念から、ＨＦＡを含有する製剤が、一般に好ましい。ＨＦＡ製剤のさらなる任意選択の成分には、エタノールまたはペンタンなどの共溶媒、ならびにトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチン、およびグリセリンなどの界面活性剤が挙げられる。

定量吸入器に使用するための代表的な医薬組成物は、約０．０１重量％〜約５重量％の式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態、約０重量％〜約２０重量％のエタノールおよび約０重量％〜約５重量％の界面活性剤を含み、残りはＨＦＡ噴射剤である。

このような組成物は典型的には、冷却または加圧ヒドロフルオロアルカンを、治療剤、（存在する場合は）エタノールおよび（存在する場合は）界面活性剤を含有する適切な容器に加えることによって調製する。懸濁液を調製するために、治療剤を微粉化し、次いで噴射剤と混合する。次いで製剤を、定量吸入装置の一部を形成するエアロゾル缶に充填する。

吸入によって治療剤を投与するのに適切な定量吸入装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的な定量吸入装置または製品には、ＡｅｒｏＢｉｄ Ｉｎｈａｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、Ａｔｒｏｖｅｎｔ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ａｅｒｏｓｏｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、Ｆｌｏｖｅｎｔ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｍａｘａｉｒ Ｉｎｈａｌｅｒ（３Ｍ社）、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ Ｉｎｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）、Ｓｅｒｅｖｅｎｔ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ａｅｒｏｓｏｌ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）などが挙げられる。

他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口投与に適切である。経口投与に適切な医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カシェ剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤の形態；あるいは水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油型または油中水型液体エマルジョンとして；あるいはエリキシル剤またシロップ剤としてなどでよく、各々が活性成分として所定の量の本発明の結晶性遊離塩基の形態を含有する。

固体剤形の経口投与用である場合（すなわち、カプセル剤、錠剤、丸剤などとして）、本発明の医薬組成物は典型的には、活性成分として本発明の結晶性遊離塩基の形態、およびクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどの１種または複数の医薬として許容される担体を含む。任意選択でまたは代わりとして、このような固体剤形はまた、（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤あるいは増量剤、（２）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶液遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）セチルアルコールおよび／またはモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（８）カオリンおよび／またはベントナイト粘土などの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよび／またはその混合物などの滑沢剤、（１０）着色剤、ならびに（１１）緩衝剤も含む。

離型剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および香料剤、保存料および抗酸化剤もまた、本発明の医薬組成物中に存在することができる。医薬として許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。錠剤、カプセル剤、丸剤などのためのコーティング剤には、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸、メタクリル酸エステルコポリマー、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）などの腸溶性コーティングに使用されるコーティング剤が挙げられる。

所望であれば、本発明の医薬組成物はまた、例示として、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、または他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフィアを使用して活性成分の徐放または制御放出を実現するために製剤することもできる。

さらに、本発明の医薬組成物は、任意選択で乳白剤を含有してもよく、任意選択で遅延するような方法で、消化管の特定の部分のみに、または優先的に活性成分を放出するように製剤してもよい。使用することのできる包埋組成物の例には、高分子物質およびワックスが挙げられる。活性成分はまた、適切であれば１種または複数の上記の賦形剤と共にマイクロカプセル化形態でもよい。

経口投与用の適切な液体剤形には、例示として、医薬として許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。このような液体剤形は典型的には、活性成分；ならびに例えば水または他の溶媒などの不活性希釈剤；エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含む。懸濁剤は、活性成分に加えて、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物などの懸濁化剤を含有してもよい。当然ながら、液体投与形態中の溶液として投与される場合、結晶性遊離塩基の形態は、もはや結晶形態ではなく、液体担体に溶解している。

経口投与用の場合、本発明の医薬組成物は、単位剤形に包装することができる。「単位剤形」という用語は、患者への投与に適切な物理的個別単位を意味し、すなわち、各ユニットが、単独または１種もしくは複数のさらなるユニットと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性剤を含有する。例えば、このような単位剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤などでよい。

本発明の結晶性遊離塩基の形態はまた、公知の経皮的送達系および賦形剤を使用して経皮的にも投与することができる。例えば、結晶性遊離塩基の形態は、プロピレングリコール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、アザシクロアルカン−２−オンなどの浸透エンハンサーと混合し、パッチまたは同様の送達系に組み入れることができる。ゲル化剤、乳化剤および緩衝液を含めたさらなる賦形剤を、所望であればこのような経皮的組成物に使用することができる。

さらに、本発明の結晶性遊離塩基の形態は、非経口的、すなわち、静脈内、皮下または筋肉内に投与することができる。非経口投与のために、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は典型的には、滅菌水、生理食塩水、植物油などの非経口投与のために許容される担体に溶解する。例示として、静脈内用組成物は典型的には、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態から調製した滅菌水溶液を含み、溶液は約４〜約７の範囲のｐＨを有する。

所望であれば、本発明の結晶性遊離塩基の形態は、１種または複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。この実施形態では、本発明の結晶性遊離塩基の形態は、他の治療剤と物理的に混合して両方の薬剤を含有する組成物を形成するか、または各薬剤が別々の異なる組成物中に存在し、それを患者に同時または順次に投与するかのいずれかである。

例えば、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、従来の手順および装置を使用して第２の治療剤と混合して、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態と第２の治療剤とを含む組成物を形成することができる。さらに、治療剤は、医薬として許容される担体と混合して、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態、第２の治療剤および医薬として許容される担体を含む医薬組成物を形成することができる。この実施形態では、組成物の成分を典型的には、混合またはブレンドし、物理的混合物を生じさせる。次いで、物理的混合物を、本明細書に記載する経路のいずれかを使用して治療有効量で投与する。

あるいは治療剤は、患者へ投与する前は、別々の異なったままでよい。この実施形態では、治療剤は投与前に物理的に混合していないが、別々の組成物として同時または順次に投与される。例えば、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、各治療剤のために別々の区画（例えば、ブリスターパック）を用いる吸入送達装置を使用して、他の治療剤と同時または順次に吸入によって投与することができる。あるいは、別々の送達装置、すなわち各治療剤に１つの送達装置を使用して、組合せを投与することができる。さらに、治療剤は、異なる投与経路、すなわち１つは吸入で、他方は経口投与によって送達することができる。

本発明の結晶性遊離塩基の形態と相容性のある任意の治療剤を、このような形態と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、第２の治療剤は、吸入によって効果的に投与される。例示として、本発明の化合物と共に使用してもよい治療剤の代表的なタイプには、それだけに限らないが、ステロイド性抗炎症剤（副腎皮質ステロイドおよびグルココルチコイドを含めた）、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、およびＰＤＥ_４阻害剤；ＰＤＥ_３阻害剤、アデノシン２ｂモジュレーターおよびβ_２アドレナリン受容体アゴニストなどの気管支拡張剤；グラム陽性の抗生物質、グラム陰性の抗生物質、および抗ウイルス剤などの抗感染症薬；抗ヒスタミン剤；プロテアーゼ阻害剤；Ｄ_２アゴニストおよびニューロキニンモジュレーターなどの求心性遮断剤；およびムスカリン受容体アンタゴニスト（抗コリン剤）などの抗炎症剤が挙げられる。このような治療剤の多くの例は、当技術分野で周知である。本発明の化合物と組み合わせて投与される他の治療剤の適切な用量は典型的には、約０．０５μｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。

本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の結晶性遊離塩基の形態と組み合わせて使用することができるステロイド性抗炎症剤の代表的な例には、それだけに限らないが、ジプロピオン酸ベクロメタゾン；ブデソニド；プロピオン酸ブチキソコルト；２０Ｒ−１６α，１７α−［ブチリデンビス（オキシ）］−６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１７β−（メチルチオ）アンドロスタ−４−エン−３−オン（ＲＰＲ−１０６５４１）；シクレソニド；デキサメタゾン；６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸（Ｓ）−（２−オキソテトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル；フルニソリド；プロピオン酸フルチカソン；メチルプレドニゾロン；フランカルボン酸モメタゾン；プレドニゾロン；プレドニゾン；ロフレポニド；ＳＴ−１２６；トリアムシノロンアセトニドなど、または医薬として許容されるその塩が挙げられる。このようなステロイド性抗炎症剤は市販であり、または従来の手順および試薬を使用して調製することができる。例えば、ステロイド性抗炎症剤の調製および使用は、２００４年６月１５日に発行された米国特許第６，７５０，２１０（Ｂ２）号；２００４年７月６日に発行された米国特許第６，７５９，３９８（Ｂ２）号；２００３年３月２５日に発行された米国特許第６，５３７，９８３号；２００２年２月１４日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００１９３７８（Ａ１）号；およびそこに引用されている参考文献に記載されている。

ステロイド性抗炎症剤が用いられるときに、本発明の結晶性遊離塩基の形態と同時投与する場合、典型的には治療的に有益な効果を有する量で投与される。典型的には、ステロイド性抗炎症剤は、用量当たり約０．０５μｇ〜約５００μｇを実現するのに十分な量で投与されるであろう。

下記の例では、代表的な本発明の医薬組成物を例示する。

（実施例Ａ）
乾燥粉末組成物
微粉化された式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（１００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（２５ｇ）とブレンドする（例えば、粒子の約８５％以下が約６０μｍ〜約９０μｍのＭＭＤを有し、１５％以上の粒子が１５μｍ未満のＭＭＤを有するラクトース）。次いで、このブレンドされた混合物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの式Ｉの化合物を実現するのに十分な量で可剥性のブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ドライパウダー吸入器を使用して投与する。

（実施例Ｂ）
乾燥粉末組成物
微粉化された式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（１ｇ）を、粉砕ラクトース（２００ｇ）とブレンドし、結晶性遊離塩基の形態と粉砕ラクトースとの重量比が１：２００のバルク組成物を形成する。ブレンドされた組成物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの式Ｉの化合物を送達することができる乾燥粉末吸入装置に詰める。

（実施例Ｃ）
乾燥粉末組成物
微粉化された式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（１００ｍｇ）および微粉化されたステロイド性抗炎症剤（５００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（３０ｇ）とブレンドする。次いで、このブレンドされた混合物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの式Ｉの化合物を得るのに十分な量で、可剥性のブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ドライパウダー吸入器を使用して投与する。

（実施例Ｄ）
定量吸入器用組成物
微粉化された式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（１０ｇ）を、レシチン（０．２ｇ）を脱塩水（２００ｍＬ）に溶解することによって調製した溶液に分散させる。このようにして得られた懸濁液を噴霧乾燥し、次いで微粉化し、約１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子を含む微粉化された組成物を形成する。次いで、微粉化された組成物を、定量吸入器によって投与される場合用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの式Ｉの化合物を実現するのに十分な量の加圧した１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含有する定量吸入カートリッジに充填する。

（実施例Ｅ）
ネブライザー用組成物
式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（２５ｍｇ）を、クエン酸緩衝（ｐＨ５）等張食塩水（１２５ｍＬ）に溶解する。化合物が溶解するまで混合物を攪拌し、超音波処理する。溶液のｐＨを調べ、必要に応じて１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をゆっくり加えることによってｐＨ５に調節する。用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの式Ｉの化合物を実現するネブライザー装置を使用して溶液を投与する。

（実施例Ｆ）
硬質ゼラチンカプセル
式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（５０ｇ）、噴霧乾燥ラクトース（４４０ｇ）およびステアリン酸マグネシウム（１０ｇ）を完全にブレンドする。このようにして得られた組成物を、経口投与される硬質ゼラチンカプセル（カプセル当たり５００ｍｇの組成物）に充填する。

（実施例Ｇ）
経口懸濁液
下記の成分を完全に混合し、経口投与用懸濁液を形成する。

このようにして得られた懸濁液は、懸濁液１０ｍＬ当たり１００ｍｇの活性成分を含有する。懸濁液を経口投与する。

（実施例Ｈ）
注射用組成物
式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態（０．２ｇ）を、０．４Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（２．０ｍＬ）とブレンドする。このようにして得られた溶液のｐＨを、必要に応じて０．５Ｎの塩酸水溶液または０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ４に調節し、次いで注射用に十分な水を加え、２０ｍＬの総容量とする。次いで、混合物を無菌フィルター（０．２２ミクロン）で濾過し、注射による投与に適した滅菌溶液を提供する。

有用性
式Ｉの化合物は、β_２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する、したがって、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態は、β_２アドレナリン受容体またはムスカリン受容体に媒介される病状、すなわち、β_２アドレナリン受容体アゴニストまたはムスカリン受容体アンタゴニストによる治療によって寛解する病状を治療するための治療剤として有用であることが見込まれる。このような病状は、Eglenら、Muscarinic Receptor Subtypes：Pharmacology and Therapuetic Potential、DN&P、１０（８）号、４６２〜４６９頁（１９９７年）；Emilienら、Current Therapeutic Uses and Potential of beta-Adrenoceptor Agonists and Antagonists、European J. Clinical Pharm.、５３（６）号、３８９〜４０４頁（１９９８年）およびそこで引用されている参考文献の教示によって例示されているように当業者には周知である。このような病状には、例示として、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎および喘息様気管支炎および気腫）、喘息、肺線維症などの可逆性気道閉塞と関連がある肺障害または疾患が挙げられる。他の状態には、早期分娩、うつ病、うっ血性心不全、皮膚疾患（例えば、炎症性、アレルギー性、乾癬性および増殖性皮膚疾患）、消化性酸を低下させることが望ましい状態（例えば、消化性潰瘍および胃潰瘍）および筋肉疲労疾患が挙げられる。

したがって、一実施形態では、本発明は、肺障害を治療するための方法に関し、この方法は治療を必要としている患者に式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む。肺障害を治療するために使用する場合、本発明の結晶性遊離塩基の形態は典型的には、１日当たりの多回用量、１日当たりの単回用量または１週間当たりの単回用量で吸入によって投与されるであろう。一般に、肺障害を治療するための用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。

その方法の態様の１つでは、本発明は、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法に関し、この方法は患者に式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む。一般に、ＣＯＰＤまたは喘息を治療するための用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。「ＣＯＰＤ」という用語は、Barnes、Chronic Obstructive Pulmonary Disease、N. Engl. J. Med.、２０００年：３４３号：２６９〜７８頁、およびそこで引用されている参考文献の教示によって例示されているような、慢性閉塞性気管支炎および気腫を含めた種々の呼吸状態を含むことを当業者は理解している。

吸入によって投与する場合、本発明の化合物は典型的には、気管支拡張を生じる効果を有する。したがって、その方法の態様のその他では、本発明は、哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法に関し、この方法は、哺乳動物に、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む。一般に、気管支拡張を生じさせる用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。

治療剤として使用する場合、本発明の結晶性遊離塩基の形態は、任意選択で他の治療剤または薬剤と組み合わせて投与される。特に、ステロイド性抗炎症剤と共に本発明の結晶性遊離塩基の形態を投与することによって、三重の治療（すなわち、β_２アドレナリン受容体アゴニスト活性、ムスカリン受容体アンタゴニスト活性および抗炎症活性）を、２種の治療剤のみを使用して達成することができる。２種の治療剤を含有する医薬組成物（および組合せ）は典型的には、３種の治療剤を含有する組成物と比較して、製剤および／または投与がより容易であるため、このような２種の成分の組成物は、３種の治療剤を含有する組成物よりも有意な利点を提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明の医薬組成物、組合せおよび方法は、ステロイド性抗炎症剤をさらに含む。

当業者には周知の様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態の特性および有用性を示すことができる。例えば、代表的なアッセイを、下記の実施例においてさらに詳細に記載する。

下記の調製および実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を例示するために提示する。しかし、特定の実施形態および態様の例示は、別段の指示がない限り本発明の範囲を何ら限定することを意図しない。

下記の実施例において使用するすべての試薬、出発物質および溶媒は、民間の供給業者（Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆｌｕｋａ社、Ｓｉｇｍａ社など）から購入し、別段の指示がない限りさらに精製せずに使用した。

下記の実施例において、ＨＰＬＣ分析は典型的には、Ａｇｉｌｅｎｔ社から供給されるＺｏｒｂａｘ Ｂｏｎｕｓ ＲＰ２．１×５０ｍｍカラム（Ｃ１４カラム）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ社（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）Ｓｅｒｉｅｓ１１００機器（３．５ミクロン粒径を有する）を使用して行った。２１４ｎｍのＵＶ吸光度で検出を行った。移動相「Ａ」は、２％アセトニトリル、９７．９％水、および０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）であり、移動相「Ｂ」は、８９．９％アセトニトリル、１０％水、および０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）であった。ＨＰＬＣ（１０〜７０）データは、６分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の１０％〜７０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。ＨＰＬＣ（５〜３５）データは、５分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の５％〜３５％の移動相Ｂのグラジエントで得た。ＨＰＬＣ（１０〜９０）データは、５分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の１０％〜９０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。

液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）データを典型的には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）モデルＡＰＩ−１５０ＥＸ機器で得た。ＬＣＭＳ１０〜９０データは、５分間にわたり１０％〜９０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。

小規模の精製を、典型的には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＰＩ１５０ＥＸ Ｐｒｅｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎシステムを使用して行った。移動相「Ａ」は、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する水（ｖ／ｖ）であり、移動相「Ｂ」は、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。少量の試料（約３〜５０ｍｇの回収試料サイズ）のために、下記の条件を典型的には使用した。２０ｍＬ／分の流量；１５分グラジエントおよび５ミクロン粒子を有する２０ｍｍ×５０ｍｍのＰｒｉｓｍ ＲＰカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）。より大量の試料（すなわち、粗試料約１００ｍｇ超）のためには、下記の条件を典型的には使用した。６０ｍＬ／分の流量；３０分グラジエントおよび１０ミクロン粒子を有する４１．４ｍｍ×２５０ｍｍのＭｉｃｒｏｓｏｒｂ ＢＤＳカラム（Ｖａｒｉａｎ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。

^１Ｈ ＮＭＲデータについて、下記の略語を使用する。ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項、ｂｒ＝ブロード、ｎｄ＝未決定。

（実施例１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イソシアナート（９７．５ｇ、５２１ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−１−ベンジルピペリジン（１０５ｇ、５４９ｍｍｏｌ）（両方ともＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから市販されている）を、共に７０℃で１２時間加熱し、その間にビフェニル−２−イルカルバミン酸１−ベンジルピペリジン−４−イルエステルの形成をＬＣＭＳによってモニターした。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、エタノール（１Ｌ）を加え、次いで６Ｍの塩酸（１９１ｍＬ）をゆっくりと加えた。次いで反応混合物を周囲温度に冷却し、ギ酸アンモニウム（９８．５ｇ、１．５６ｍｏｌ）を加え、溶液を窒素ガスで２０分間激しく泡立てた。次いで、パラジウム（活性炭上で１０重量％（乾量基準））（２０ｇ）を加えた。反応混合物を４０℃で１２時間加熱し、次いでセライトパッドで濾過した。次いで溶媒を減圧下で除去し、１Ｍの塩酸（４０ｍＬ）を粗残渣に加えた。次いで、水酸化ナトリウム（１０Ｎ）を加え、ｐＨを１２に調節した。水層を酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、乾燥し（硫酸マグネシウム）、次いで溶媒を減圧下で除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１５５ｇ、１００％）を得た。HPLC (10〜70) R_t = 2.52; MS m/z: [M+H⁺] C₁₈H₂₀N₂O₂計算値297.15;実測値297.3。

（実施例２）
３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸
ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（５０ｇ、６７．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、アクリル酸（１５．０５ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を、還流させながら５０℃で１８時間加熱し、次いで溶媒を除去した。メタノール（６００ｍＬ）を加え、この混合物を７５℃で２時間加熱し、次いで室温に冷却し、濃厚なスラリーを形成させた。固体を濾過によって回収し、メタノール（５０ｍＬ）で洗浄し、空気乾燥し、３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸（６１ｇ、９６％純度）を白色粉末として得た。

（実施例３）
Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝−ホルムアミド酢酸塩
ステップＡ Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド
５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、Ｎ−｛２−ベンジルオキシ−５−［（Ｒ）−２−ブロモ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］フェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、２１５ｍｍｏｌ）およびＮ−メチル−２−ピロリドン（３００ｍＬ）を加えた。ベンジルアミン（６９．４ｍＬ、６４８ｍｏｌ）を加え、反応混合物を窒素でフラッシュした。次いで反応混合物を９０℃に加熱し、約８時間攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却し、水（１．５Ｌ）および酢酸エチル（１．５Ｌ）を加えた。層を分離し、有機層を水（５００ｍＬ）、水と飽和ブラインとの１：１混合物（計５００ｍＬ）で洗浄し、次いで再び水（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、粗Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、９０％収率、７５〜８０％純度）をオレンジ色から茶色の濃厚な油として得た。

ステップＢ Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝−ホルムアミド酢酸塩
粗Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、１９４ｍｍｏｌ）を、メタノール（１Ｌ）および酢酸（２５ｍＬ、２９１ｍｍｏｌ）に溶解した。このようにして得られた混合物を、乾燥窒素でパージし、次いで水酸化パラジウムオンカーボン（２０ｇ、２０重量％、約５０％水）を加えた。反応混合物に、室温にて攪拌しながら約１０時間水素を泡立たせた。次いで、混合物を乾燥窒素でパージし、混合物をセライトで濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチル（６００ｍＬ）を残渣に加えた。この混合物を約２時間攪拌し、その時点で濃厚な黄色のスラリーが生じた。スラリーが濾過し、沈殿物を空気乾燥し、Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（４８ｇ、９８％純度）を黄色から白色の固体として得た。LCMS (10〜70) R_t = 3.62; [M+H⁺] 実測値311.3。

（実施例４）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ メチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート
攪拌した２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（４８０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の乾燥メタノール（８．２ｍＬ）溶液に、０℃で乾燥窒素下にて塩化チオニル（０．５３８ｍＬ、７．３８ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を放置して室温まで温め、約７時間攪拌した。さらなる塩化チオニル（０．３００ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌を続けた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を、飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮し、メチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（５７８ｍｇ）を淡黄色の固体として得た。HPLC (10〜70) R_t = 4.61; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ 2.57 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 7.82 (s, 1H), 7.87 (s, 1H)。

ステップＢ メチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート
メタノールと水との９：１混合物（計２５ｍＬ）中のメチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（５２３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、０℃で塩化アンモニウム（４０１ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。亜鉛（１．６３ｇ、２５ｍｍｏｌ）を１部ずつ加え、このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、セライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、このようにして得られた残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、メチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート（４５０ｍｇ）を黄色の油として得た。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ2.14 (s, 3H), 2.53 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.85 (br s, 2H), 6.48 (s, 1H), 7.72(s, 1H)。

ステップＣ メチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート
ジクロロメタン（３．６ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．４１３ｍＬ）中の３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸（６７０ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）およびメチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート（３９０ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（８２９ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、３％〜５％メタノールを含有するジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、メチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート（５６８ｍｇ、５９％収率）を得た。LCMS (10〜70) R_t = 4.55; [M+H⁺] 実測値530.4。

ステップＤ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
攪拌した１Ｍの水素化アルミニウムリチウムのＴＨＦ（１．５２ｍＬ、１．５２ｍｍｏｌ）溶液に、０℃でメチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート（４００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）と水（５ｍＬ）との１：１混合物を加え、２時間攪拌を続けた。ジクロロメタンを加え、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。５％メタノールを含有するジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルを得た。LCMS (10〜70) R_t = 3.94; [M+H⁺] 実測値502.5。

ステップＥ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に、０℃でジメチルスルホキシド（１２８μＬ、１．８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１５７μＬ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後に、三酸化硫黄ピリジン錯体（１４３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃での攪拌を１時間続けた。水を加え反応をクエンチし、層を分離した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５０ｍｇ、１００％収率）を得て、それをさらに精製せずに使用した。[M+H⁺] 実測値500.4。

ステップＦ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ジクロロメタンとメタノールとの１：１混合物（計３．０ｍＬ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド（１１２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３０分間攪拌した。トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１９１ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。酢酸を加え反応をクエンチし、混合物を減圧下で濃縮し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルを得て、それをさらに精製せずに使用した。LCMS (10〜70) R_t = 4.55; [M+H⁺] 実測値794.6。

ステップＧ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２３８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）懸濁液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１４７μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、次いで混合物を減圧下で濃縮した。分取−ＲＰ−ＨＰＬＣ（グラジエント：０．０５％ＴＦＡを含む水中で２〜５０％アセトニトリル）によって残渣を精製した。適切な画分を回収し、混合、凍結乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルをジトリフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ、９７％純度）として得た。LPLC (2〜90) R_t = 2.76; [M+H⁺] 実測値680.8。

（実施例５）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた２リットルの丸底フラスコに、４−ヨード−２，５−ジメチルアニリン（１００．０ｇ、０．４０５ｍｏｌ）（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｇｒｏｕｐ社、Ｍｉｌｌｂｕｒｙ、ＯＨから）を加えた。エタノール（１Ｌ）および固体炭酸カリウム（１６０ｇ、１．１５９ｍｏｌ）を加え、次いでニートの臭化ベンジル（１４０ｍＬ、１．１７９ｍｏｌ）を一度に加えた。このようにして得られた混合物を３０℃で約１８時間攪拌し、その時点でＨＰＬＣは９８％超の変換を示す。次いで、混合物を室温に冷却し、ヘキサン（１Ｌ）を加えた。この混合物を１５分間攪拌し、次いで濾紙で濾過し、固体を取り出し、濾過ケーキをヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄した。回転エバポレーターを使用して、濾液の容量を約５００ｍＬまでに減らし、濃塩酸（３０ｍＬ）を加えた。次いで残りの溶媒を、回転エバポレーターを使用して除去した。このようにして得られた残渣に、ヘキサン（５００ｍＬ）を加え、この混合物を約３０分攪拌し、その時点で易流動性のスラリーが形成された。スラリーを濾過し、濾過ケーキをヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン塩酸塩（１１５ｇ、６２％収率、９７．５％純度）を緑がかった色の固体として得た。

ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン塩酸塩を、３Ｌのフラスコに移し、トルエン（１Ｌ）および１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１Ｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を１時間攪拌し、次いで層を分離した。有機層を希釈したブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、溶媒を回転蒸発によって除去し、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン（８０ｇ）を半固体の濃厚な油として得た。（あるいはこのステップにおいて、ジクロロメタンをトルエンの代わりに使用することができる）。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ2.05 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 3.90 (s, 4H), 6.91 (s, 1H), 7.05-7.20 (m, 10H), 7.42(s, 1H); MS [M+H⁺] 実測値428。

ステップＢ ４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた１リットルの三つ口丸底フラスコに、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン（１５ｇ、３５ｍｍｏｌ）を加えた。トルエン（３００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約１５分間攪拌した。反応フラスコを乾燥窒素でパージし、約−２０℃に冷却し、ヘキサン中の１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム（３３ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を、添加漏斗によって１滴ずつ加えた。添加の間、反応混合物の内部温度を−１０℃未満に維持した。添加が完了したときに、このようにして得られた混合物を約−１５℃で１５分間攪拌した。次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ、１２９ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加え、その間内部反応温度を０℃未満に維持した。次いでこのようにして得られた混合物を−２０℃〜０℃で約１時間攪拌した。次いで１Ｍの塩酸水溶液（２００ｍＬ）を５分間にわたって加え、このようにして得られた混合物を１５分間攪拌した。次いで層を分離し、有機層を希釈したブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去し、４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩（１１．５ｇ、９０％収率、９５％純度）を濃厚な油として得て、静置すると固化した。生成物は、約３〜５％のデス−ヨード副生成物を含有した。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ2.42 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 4.25 (s, 4H), 6.82 (s, 1H), 7.10-7.30 (10H, m), 7.62(1H, s), 10.15 (1H, s); MS [M+H⁺] 実測値330.3。

ステップＣ ４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン
５００ｍＬの丸底フラスコに、４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩（１１．５ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）およびトルエン（１５０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を、塩が完全に溶解するまで攪拌した。次いで反応フラスコを乾燥窒素で５分間パージした。エチレングリコール（５．２５ｍＬ、９４．２ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（７６０ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を６０℃〜８０℃で約２０時間加熱した。次いで溶媒を、４０℃にてロータリーエバポレーターで（約４０分にわたって）ゆっくりと除去した。トルエン（１００ｍＬ）を残渣に加え、溶媒を再び４０℃にてロータリーエバポレーターゆっくり除去した。別の一定分量のトルエン（１００ｍＬ）を使用してこの処理を繰り返し、混合物を乾燥するまで蒸発させた。酢酸エチル（１５０ｍＬ）および飽和水性炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）を残渣に加え、層を分離した。有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、粗ジベンジル−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチル−フェニル）アミン（１１．４ｇ）を得た。

粗ジベンジル−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチル−フェニル）アミンを、エタノールと水との２：１混合物（計１５０ｍＬ）に溶解し、このようにして得られた混合物を乾燥窒素で５分間にわたりパージした。パラジウム炭素（２．３ｇ、１０重量％、約５０％水を含有）および固体炭酸水素ナトリウム（１．０ｇ）を加え、このようにして得られた混合物を、２５℃〜３０℃にて約１ａｔｍの水素で約８時間水素化した。次いで、混合物をセライトで濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、粗４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン（５．６ｇ、９２％収率）を濃厚な油として得た。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ2.05 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 3.7-3.9 (m, 4H), 3.95 (s, 4H), 5.59 (s, 1H), 6.72(s, 1H), 7.0-7.25 (m, 11H)。

ステップＤ Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド
５００ｍＬの丸底フラスコに粗４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン（５．６ｇ、２９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（７．６ｍＬ、４３．５ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し、次いで混合物を０℃に冷却した。次いで、塩化アクリロイル（２．３５ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を５分間にわたって１滴ずつ加えた。反応混合物を０℃〜５℃で１時間攪拌し、次いで水（５０ｍＬ）を加え、約３０分間攪拌を続け、その時点で微細固体が形成された。混合物を濾過し、固体を収集した。次いで、濾液の層を分離し、有機層を減圧下で乾燥するまで濃縮した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）を残渣に加え、易流動性のスラリーが生じるまでこの混合物を攪拌した。（上記の微細固体を回収するために使用したのと同じ漏斗を使用して）スラリーを濾過し、濾過ケーキをジクロロメタン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（３．１ｇ、９７％純度）を白色からオフホワイトの固体として得た。

次いで、上記からの濾液を乾燥するまで蒸発させ、メタノール（１０ｍＬ）を残渣に加えた。この混合物を１５分間攪拌し、次いで沈殿物を濾過によって回収し、メタノール（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（０．８ｇ、９５％純度）の２回目の収穫を得た。¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ2.10 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 3.85-4.10 (m, 4H), 5.60-6.40 (m, 3H), 5.59 (s, 1H),7.18 (s, 1H), 7.23 (s, 1H)。

ステップＥ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩
５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１．２ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（１．０ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（１０ｍＬ）およびジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。反応混合物を４５℃〜５０℃で約１８時間加熱し、次いで室温に冷却した。１Ｍの塩酸水溶液（１０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約３時間激しく攪拌した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約５分間攪拌した。次いで、層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、粗ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩（１．９ｇ）を得た。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ1.2-1.4 (m, 2H), 1.58-1.75 (m, 2H), 2.0-2.17 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.38 (s,3H), 2.41-2.50 (m, 4H), 2.5-2.75 (m, 2H), 4.31-4.42 (m, 1H), 7.10-7.35 (m, 9H),7.55 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 9.82 (s, 1H), 9.98 (s, 1H); MS [M+H⁺]実測値500.2。

ステップＦ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２Ｌの三つ口丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩（３８ｇ、７０ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（３３．６ｇ、９１ｍｍｏｌ）を加えた。ジクロロメタン（５００ｍＬ）およびメタノール（５００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を、乾燥窒素下にて室温で約３時間攪拌した。次いで反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、固体トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（４４．５ｇ、３８１ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって１部ずつ加えた。反応混合物を、０℃から室温に約２時間にわたってゆっくりと温め、次いで０℃に冷却した。飽和水性炭酸水素ナトリウム（５００ｍＬ）およびジクロロメタン（５００ｍＬ）を加えた。この混合物を完全に攪拌し、次いで層を分離した。有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、粗ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５５ｇ、８６％純度）を黄色の固体として得た。

粗生成物（３０ｇ）を、２％メタノールを含有するジクロロメタン（計１５０ｍＬ）に溶解し、２％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウムを含有するジクロロメタンを詰めて平衡化したシリカゲルカラム（３００ｇ）に充填した。生成物を、２％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（１Ｌ）を含有するジクロロメタン、４％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（１Ｌ）を含有するジクロロメタン、ならびに５％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（約３Ｌ）を含有するジクロロメタンを使用してカラムから溶出した。画分（２００ｍＬ）を回収し、９０％超の純度を有するそれらの画分を、混合し、減圧下で濃縮し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２１．６ｇ、９６．５％純度）を黄色がかった固体として得た。MS [M+H⁺] 実測値794.6。

ステップＧ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルフッ化水素酸塩
１Ｌの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２１．５ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し、次いでトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（８．８５ｍＬ、５４．２ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を２５℃で約４８時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、濃厚なペーストを得た。ジクロロメタン（１００ｍＬ）および酢酸エチル（２００ｍＬ）をペーストに加え、このようにして得られた混合物を３０分間攪拌した。このようにして得られたスラリーを、乾燥窒素下にてゆっくりと濾過し、濾過ケーキをジクロロメタンと酢酸エチルとの１：２混合物（計１００ｍＬ）で洗浄し、窒素下にて２時間乾燥し、次いで真空下にて一晩乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルをフッ化水素酸塩（２５ｇ、９６．９％純度）として得たが、これは硬質クレー様の固体であった。MS [M+H⁺] 実測値680.8。

ステップＨ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルフッ化水素酸塩（２５ｇ）を、移動相として１％トリフルオロ酢酸を含有する水中のアセトニトリルの１０％〜５０％混合物を使用した３つの等量のバッチで、６インチ逆相カラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ固相）によって精製した。９９％超の純度の画分を混合し、次いで１容の水で希釈した。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、混合物のｐＨが約７．５〜８．０となるまで固体炭酸水素ナトリウムを加えた。約５分以内に、白色スラリーが生じた。スラリーを３０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケーキを水（５００ｍＬ）で洗浄し、約４時間で空気乾燥し、次いで一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２ｇ、９９＋％純度）を半結晶質の遊離塩基として得た。

（実施例６）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
５００ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１７．０ｇ、５８ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（１３．１ｇ、５２．９ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（１５０ｍＬ）およびジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。反応混合物を５０℃〜５５℃で約２４時間加熱し、次いで室温に冷却した。溶媒の大部分をロータリーエバポレーターで除去し、濃厚なスラリーとした。エタノール（試薬グレード）を加え、約２００ｍＬの総容量とし、このようにして得られた混合物を８０℃に加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却した。このようにして得られた濃厚な白色スラリーを濾過し、エタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２３．８ｇ、約９８％純度）を白色固体として得た。

ステップＢ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
５００ｍＬ丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１５０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。２Ｍの塩酸水溶液（７５ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を３０℃で１時間攪拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えた。２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７５ｍＬ）を加え、ｐＨを調べ、次いで溶液のｐＨが９〜１０の範囲となるまでさらなる２Ｍの水酸化ナトリウムを加えた。層を分離し、有機層を希釈したブライン（７５ｍＬ；１：１ブライン／水）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２．５ｇ、約９８％純度）を得た。所望であれば、エタノール（３容のエタノール）でスラリーを形成し、スラリーを８０℃に加熱し、次いで室温にゆっくり冷却し、濾過によって単離することによって、この中間体の純度を増すことができる。

ステップＣ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチル−フェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（７．１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（５．８ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。メタノール（１００ｍＬ）を加え、スラリーを形成させ、この混合物を４５℃〜５０℃で窒素下にて１時間攪拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、トルエン（５０ｍＬ）を加え、溶媒を３５℃〜４５℃の範囲の温度にてロータリーエバポレーターで除去した。トルエン（５０ｍＬ）を残渣に加え、溶媒を除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２ｇ）を黄色からオレンジ色の固体として得た。

ステップＤ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
水素化フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（４．６ｇ）および２−メチルテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、固体が溶解するまで（約５分）攪拌し、次いで混合物を窒素でパージした。白金担持カーボン（９２０ｍｇ、５重量％、担持活性炭）を加え、混合物を５０ｐｓｉで６時間水素化した（Ｐａｒｒ ｓｈａｋｅｒ）。次いで、混合物をセライトで濾過し、セライトを２−メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液に、チオプロピル修飾シリカゲル（溶液の２０重量％、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）を加え、この混合物を２５℃〜３０℃で３時間攪拌した。次いで、混合物をセライトで濾過し、濃縮し、溶媒を除去した。残渣をメタノール（残渣１ｇ毎に５ｍＬ）に溶解し、次いでこのようにして得られた溶液を、激しく攪拌した飽和水性炭酸水素ナトリウムと水（残渣１ｇ毎に４０ｍＬ）との１：１混合物にゆっくり加えた。このようにして得られたオフホワイトのスラリーを２０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケーキを水（２０容）で洗浄し、３時間空気乾燥し、次いで室温で一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（８０％回収、約９６％純度）を得た。

ステップＥ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩
２００ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］−メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（３．８ｇ、４．８ｍｍｏｌ）および２−メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し（約１５分）、次いでトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．９４ｍＬ、５．７６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２５℃で約２４時間攪拌した。この混合物に、飽和水性炭酸水素ナトリウムと水との１：１混合物（４０ｍＬ）および２−メチルテトラヒドロフランを加え、このようにして得られた混合物を固体が溶解するまで攪拌した（溶液のｐＨ約８）。層を分離し、有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を２−メチルテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、固形のＬ−酒石酸（６５０ｍｇ）を加えた。このようにして得られた混合物を２５℃〜３０℃で１８時間攪拌し、次いで濾紙で濾過した。濾過ケーキを２−メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）、イソプロパノール（１０ｍＬ）で洗浄し、直ちに真空下に置き、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩（３．７ｇ、＞９７％純度）を得た。

ステップＦ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩（３．５ｇ）およびメタノール（３５ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を１５分間攪拌した。飽和水性炭酸水素ナトリウムと水（７０ｍＬ）との１：１混合物を、５分にわたり加え、攪拌を２時間続けた。このようにして得られたオフホワイトスラリーを濾過し、濾過ケーキを水（２０ｍＬ）で洗浄し、２時間空気乾燥し、次いで一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２．３ｇ）を半結晶質の遊離塩基として得た。

ＪＥＯＬ ＥＣＸ−４００ＮＭＲ分光計を使用して周囲温度で、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（ＤＭＳＯ−ｄ_６約０．７５ｍＬ中に２２．２ｍｇ）の試料について、^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを得た。

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d₆), 主異性体, δ 9.64 (br, 1H), 9.54 (br s, 1H), 9.43 (s,1H), 8.67 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.03 (d, J = 1.9, 1H), 7.25-7.45 (m, 9H), 〜7.3(nd, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.2, 1.9, 1H), 6.79 (d, J = 8.2, 1H),5.15 (br, 1H), 4.53 (dd, J = 7.3, 4.7, 1H), 4.47 (m, 1H), 〜3.65 および 〜3.60 (AB対,2H), 2.68 (br m, 2H), 〜2.59 (nd, 4H), 2.44 (br t, J = 6.5, 2H), 2.20 (s, 3H), 〜2.17(br m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.73 (br, 2H), 1.44 (br q, J = 〜9.0, 2H).
¹H NMR(400 MHz, DMSO-d₆), 副異性体, δ 9.64 (br, 1H), 9.43 (s 1H), 9.26 (br d,J = 〜7.0, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.50 (br d, J = 〜7.0, 1H), 7.25-7.45 (m, 9H), 〜7.3(nd, 1H), 7.07 (s, 1H), 〜7.07 (nd, 1H), 6.95 (dd, J = 8.3, 1.8, 1H), 6.83 (d, J=8.3, 1H), 5.15 (br, 1H), 4.47 (m, 1H), 〜3.65 および 〜3.60 (AB対, 2H), 2.68 (br m,2H), 〜2.59 (nd, 2H), 2.44 (br t, J = 6.5, 2H), 2.20 (s, 3H), 〜2.17 (br m, 2H),2.14 (s, 3H), 1.73 (br, 2H), 1.44 (br q, J = 〜9.0, 2H).
¹³C NMR(100 MHz, DMSO-d₆), 主異性体, δ 170.0, 159.9, 153.9, 145.5, 139.3,137.6, 135.2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, 128.6, 128.2, 127.8,127.4, 127.2, 127.0, 126.1, 125.7, 125.6, 121.7, 118.6, 114.5, 71.4, 70.0,57.4, 53.9, 50.3, 50.1, 33.7, 30.7, 18.2, 17.5.
¹³C NMR(100 MHz, DMSO-d₆), 副異性体, δ 170.0, 163.4, 153.9, 147.8, 139.3,137,6, 135.7, 135.2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, 128.6, 128.2,127.8, 127.4, 127.2, 127.0, 126.1, 125.7, 123.0, 119.6, 115.6, 71.0, 70.0,57.3, 53.9, 50.3, 50.1, 33.7, 30.7, 18.2, 17.5。

^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、主要な異性体（約８２モルパーセント）および少量の異性体（約１８モルパーセント）の存在を示し、これは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｈ結合での回転障害から生じる回転異性体であると思われた。フェニル基は、主要な異性体においてカルボニル酸素に対してｓｙｎであり、少量の異性体においてはａｎｔｉであると考えられる。

（実施例７）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］−ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ ４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン
ジクロロメタンとメタノール（４００ｍＬ）との１：１混合物中の２，５−ジメチルアニリン（２０ｇ、１６５ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸水素ナトリウム（２０．８ｇ、２５０ｍｍｏｌ）およびジクロロヨウ素酸テトラメチルアンモニウム（Ｉ）（４４．７ｇ、１６５ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を室温で１時間攪拌し、次いで水（５００ｍＬ）を加えた。有機層を取り出し、５％水性チオ硫酸ナトリウム（５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下にて濃縮し、４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン（３９．６ｇ、９８％収率）を得た。生成物をさらに精製せずに使用した。

ステップＢ Ｎ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド
４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン（３７．２ｇ、１５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（２５．４ｇ、３０２ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、塩化アクリオリル（１２．３ｍＬ、１５１ｍｍｏｌ）を２５分にわたってゆっくり加えた。このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌し、次いで濾過した。濾液の容量を約１００ｍＬまでに減らし、沈殿物が形成された。沈殿物を濾過、乾燥し、水（１Ｌ）で洗浄し、次いで再び乾燥し、Ｎ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（４２．９８ｇ、９５％純度、９０％収率）を得た。生成物をさらに精製せずに使用した。

ステップＣ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとイソプロパノール（７００ｍＬ）との６：１ｖ／ｖ混合物中のＮ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（３２．２ｇ、１０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（３６．３ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を５０℃で２４時間、次いで８０℃で２４時間加熱した。次いで反応混合物を室温に冷却し、真空下にて濃縮した。残渣をジクロロメタン（１Ｌ）に溶解し、この溶液を１Ｎの塩酸水溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。エタノール（４００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を真空下にて約４００ｍＬの容量まで濃縮し、その時点で沈殿物が形成された。沈殿物を濾過、乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５９．６ｇ、８４％純度、７９％収率）を得た。m/z: [M+H⁺] C₂₉H₃₂IN₃O₃計算値598.49; 実測値598.5。

ステップＤ ４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとメタノール（６００ｍＬ）との５：１ｖ／ｖ混合物中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５６ｇ、９４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（４９ｍＬ、２８１ｍｍｏｌ）、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン（３．９ｇ、９．４ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．１ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を一酸化炭素でパージし、次いで一酸化炭素雰囲気下にて７０℃〜８０℃で一晩攪拌した（バルーン圧力）。反応混合物を真空下にて濃縮し、残渣をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解した。この混合物を１Ｎの塩酸水溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、次いで真空下にて濃縮した。残渣をエタノールと混合し（エタノール対残渣、約５：１ｖ／ｗ）、すべての固形物が溶解するまで混合物を加熱した。この溶液を室温にゆっくりと冷却し、このようにして得られた沈殿物を濾過によって単離し、４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル（４７．３ｇ、９７％純度、９２％収率）を得た。m/z: [M+H⁺] C₃₁H₃₅N₃O₅計算値530.63; 実測値530.4。

ステップＥ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチル−フェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル（４９．８ｇ、９３．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、水素化アルミニウムリチウム（１０．７ｇ、２８１．７ｍｍｏｌ）を１部ずつ加えた（１０×１．０７ｇ）。このようにして得られた混合物を３時間攪拌し、次いで水（１０．７ｍＬ）、次いで１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１０．７ｍＬ）およびさらなる水（３２．１ｍＬ）を加えた。この混合物を一晩攪拌し、次いで濾過した。有機層を真空下にて濃縮し、残渣を酢酸エチルと混合した（酢酸エチル対残渣、約５：１ｖ／ｗ）。この混合物をすべての固形物が溶解するまで加熱し、次いで溶液を室温に冷却した。このようにして得られた沈殿物を濾過し、乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２４．６ｇ、９５％純度、４７．５％収率）を得た。この材料をさらに精製せずに使用した。m/z: [M+H⁺] C₃₀H₃₅N₃O₄計算値502.62; 実測値502.5。

ステップＦ ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）およびジメチルスルホキシド（５．６ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、三酸化硫黄ピリジン錯体（８．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、次いで水（３００ｍＬ）を加えた。有機層を取り出し、１Ｎの塩酸水溶液（３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルを含有するこのようにして得られた溶液を、さらに精製せずに使用した。m/z: [M+H⁺] C₃₀H₃₃N₃O₄計算値500.60; 実測値500.4。

（実施例８）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態Ｉの調製
アセトニトリル（２ｍｌ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５５ｍｇ）のスラリーを調製し、周囲温度で２日間攪拌した。溶媒を濾過によって除去し、固体を周囲温度で乾燥し、形態Ｉ（５０ｍｇ）を得た。この結晶性遊離塩基の形態のＰＸＲＤ、ＤＳＣおよびＴＧＡスペクトルを図１、４および７に各々示す。

（実施例９）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩの調製
イソプロパノール（２ｍｌ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（４６ｍｇ）のスラリーを調製し、周囲温度で２日間攪拌した。溶媒を濾過によって除去し、固体を周囲温度で乾燥し、形態ＩＩ（４３ｍｇ）を得た。この結晶性遊離塩基の形態のＰＸＲＤ、ＤＳＣおよびＴＧＡスペクトルを図２、５および８に各々示す。

（実施例１０）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩＩの調製
エタノール（２ｍｌ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５４ｍｇ）のスラリーを調製し、周囲温度で２日間攪拌した。溶媒を濾過によって除去し、固体を周囲温度で乾燥し、形態ＩＩＩ（４８ｍｇ）を得た。この結晶性遊離塩基の形態のＰＸＲＤ、ＤＳＣおよびＴＧＡスペクトルを図３、６および９に各々示す。

（実施例１１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩの種結晶の調製
半結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５００ｍｇ）をメタノール（５０ｍｌ）に溶解し、曇点に達するまで水を加えた。このように得られた混合物を２５℃で３時間攪拌し、このように得られた結晶体を濾過によって単離し、結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（４２０ｍｇ）の形態ＩＩを得た。

（実施例１２）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩの結晶化
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた３Ｌの三つ口丸底フラスコに、半結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１４ｇ）およびメタノール（１．４Ｌ）を加えた。水（５００ｍＬ）を一度に加え、次いで曇点に達するまでさらなる水（２００ｍＬ）をゆっくりと加えた。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩ（５０ｍｇ）の種結晶を加え、このようにして得られた混合物を２５℃で３時間攪拌し、その時点で易流動性のスラリーが生じた。水（３００ｍＬ）を１５分間にわたり加え、このようにして得られた混合物を２５℃で一晩攪拌した。次いで混合物を濾過し、濾過ケーキを水（１００ｍＬ）で洗浄し、約２時間空気乾燥し、次いで真空下にて室温で４８時間乾燥し、結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩ（１２．５ｇ、９９．６％純度）を得た。

（実施例１３）
粉末Ｘ線回折
粉末Ｘ線回折図形を、１．５４２Å（４５ｋＶ、４０ｍＡ）のＣｕ Ｋα照射を使用して、Ｐｅｌｔｉｅｒ固体検出器を備えたＴｈｅｒｍｏ ＡＲＬ Ｘ線回折計Ｍｏｄｅｌ Ｘ’ＴＲＡ（Ｔｈｅｒｍｏ ＡＲＬ ＳＡ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で得た。分析は典型的には、２θ角度の２〜４０°の範囲にわたって、ポイント毎に０．０３°のステップサイズで２°／分の走査速度で行った。測定の前に、形態ＩＩを３０秒間軽く手で粉砕し、粒径を縮小させた。機械的粒径縮小は形態ＩおよびＩＩＩでは行わなかった。分析のために機器のトップローディング式の試料カップに適合するように設計された特注の石英製試料パンに、試料を静かに充填した。機器を、±０．０２°の２θ角度内でケイ素金属標準物質に対して毎週較正した。結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩについての代表的な生の未処理ＰＸＲＤパターンを、各々図１、２および３に示す。

さらに、バックグラウンド除去および平滑化を含めたプロファイルフィッティング機能を使用して、各形態についての下記の２θピーク位置を得た。

形態Ｉ：８．３±０．３；１０．７±０．３；１２．２±０．３；１３．５±０．３；１４．５±０．３；１５．２±０．３；１７．７±０．３；１８．２±０．３；１９．６±０．３；２０．７±０．３；２１．７±０．３および２３．２±０．３。

形態ＩＩ：８．４±０．３；１０．４±０．３；１０．７±０．３；１１．９±０．３；１２．３±０．３；１２．６±０．３；１３．４±０．３；１３．６±０．３；１４．３±０．３；１４．７±０．３；１５．３±０．３；１６．８±０．３；１７．１±０．３；１７．８±０．３；１８．２±０．３；１８．７±０．３；１９．２±０．３；１９．８±０．３；２０．７±０．３；２１．６±０．３；２２．３±０．３；２２．５±０．３および２３．２±０．３。

形態ＩＩＩ：８．５±０．３；１０．５±０．３；１１．３±０．３；１２．１±０．３；１２．８±０．３；１３．６±０．３；１４．２±０．３；１５．５±０．３；１６．６±０．３；１７．１±０．３；１８．１±０．３；１９．２±０．３；２１．０±０．３；２１．８±０．３；２２．６±０．３；２３．３±０．３および２４．５±０．３。

（実施例１４）
示差走査熱量測定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｎａｌｙｓｔ制御器を備えたＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ Ｑ−１００モジュールを使用して行った。ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを使用してデータを回収し分析した。ふたの付いたアルミニウムパン中に、約１ｍｇの試料を正確に秤量した。周囲温度から約３００℃まで５℃／分の直線的加熱傾斜を使用して試料を評価した。使用中にＤＳＣセルを乾燥窒素でパージした。結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩの試料についての代表的ＤＳＣトレースを、各々図４、５および６に示す。図５は、結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩが、約１４３℃の融点で優れた熱安定性を有することを示す。

（実施例１５）
熱重量分析
熱重量分析（ＴＧＡ）を、高分解能のＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ Ｑ−５００モジュールを使用して行った。ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを使用してデータを回収し分析した。約１０ｍｇの重量の試料を白金パン上に置き、周囲温度から３００℃まで高分解能の加熱速度で走査した。使用中に天秤および炉チャンバーを、窒素流でパージした。結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩの試料についての代表的ＴＧＡトレースを、各々図７、８および９において示す。

（実施例１６）
動的吸湿評価
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩの手で粉砕した試料について、ＶＴＩ大気微量天秤ＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ社、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ３３０１６）を使用して動的吸湿（ＤＭＳ）評価（吸湿−脱離プロファイルとしても知られている）を行った。約１０ｍｇの大きさの試料を使用し、分析の開始時に湿度を周囲値に設定した。典型的ＤＭＳ分析は、３種の走査で構成された。５％ＲＨ／ステップの走査速度で、周囲値〜２％相対湿度（ＲＨ）、２％ＲＨ〜９０％ＲＨ、９０％ＲＨ〜５％ＲＨ。塊を２分毎に測定し、試料の固まりが５連続点について０．０１％まで安定的であった場合ＲＨを次の値（＋／−５％ＲＨ）に変化させた。形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩについての代表的ＤＭＳトレースを、各々図１０、１１および１２に示す。

図１１のＤＭＳトレースは、形態ＩＩが、適度な（＜５％）吸湿性を有する可逆的な吸着／脱離プロファイルを有することを示す。形態ＩＩは、４０％ＲＨ〜７５％ＲＨの湿度範囲で約０．３重量％のわずかな重量増加を有した。可逆的な吸湿／脱離プロファイルは、形態ＩＩが許容できる吸湿性を有し、潮解性でないことを示す。

（実施例１７）
ヒトＭ_１、Ｍ_２、Ｍ_３およびＭ_４ムスカリン受容体を発現している細胞からの細胞培養および膜調製
クローン化されたヒトｈＭ_１、ｈＭ_２、ｈＭ_３およびｈＭ_４ムスカリン受容体サブタイプを各々安定的に発現しているＣＨＯ細胞株を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン２５０μｇ／ｍＬを添加したＨａｍｓ Ｆ−１２培地中でほぼ集密的にまで増殖させた。細胞を５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター中で増殖させ、ｄＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡによって浮遊させた。細胞を５分の６５０×ｇでの遠心分離によって回収し、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存するか、または使用するために膜を直ちに調製した。膜調製のために、細胞ペレットを溶解緩衝液中で再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−２１００組織破壊器（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＡＧ社；２０秒×２破裂）でホモジナイズした。粗膜を、４０，０００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。次いで、膜ペレットを再懸濁緩衝液で再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊器で再びホモジナイズした。Lowryら、１９５１年、Journal of Biochemistry、１９３号、２６５頁に記載されている方法によって膜懸濁液のタンパク質濃度を決定した。すべての膜を−８０℃にて一定分量で凍結保存するか、または直ちに使用した。一定分量の調製したｈＭ_５受容体膜を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）から直接購入し、使用するまで−８０℃で保存した。

（実施例１８）
ムスカリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイ
クローン化されたムスカリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて１００μＬの総アッセイ容量で行った。ｈＭ_１、ｈＭ_２、ｈＭ_３、ｈＭ_４またはｈＭ_５ムスカリン性サブタイプのいずれかを安定的に発現しているＣＨＯ細胞膜を、下記の特定の標的タンパク質濃度（μｇ／ウェル）にアッセイ緩衝液で希釈した。同様のシグナル（ｃｐｍ）を得るために、ｈＭ_１では１０μｇ、ｈＭ_２では１０〜１５μｇ、ｈＭ_３では１０〜２０μｇ、ｈＭ_４では１０〜２０μｇ、およびｈＭ_５では１０〜１２μｇであった。アッセイプレートへの添加の前に、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊器を使用して膜を短時間ホモジナイズした（１０秒）。Ｌ−［Ｎ−メチル−^３Ｈ］スコポラミンメチルクロリド（［^３Ｈ］−ＮＭＳ）（ＴＲＫ６６６、８４．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．００１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の濃度で使用して、放射性リガンドのＫ_Ｄ値を決定するための飽和結合研究を行った。１ｎＭおよび１１の異なる試験化合物濃度の［^３Ｈ］−ＮＭＳを用いて、試験化合物のＫ_ｉ値を決定するための置換アッセイを行った。最初に試験化合物を、希釈用緩衝液中で４００μＭの濃度まで溶解し、次いで希釈用緩衝液（５×）で１０ｐＭ〜１００μＭの範囲の最終濃度まで段階希釈した。添加順序およびアッセイプレートの容量は、下記の通りであった。放射性リガンド２５μＬ、希釈した試験化合物２５μＬ、および膜５０μＬ。アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ中で前処理したＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で急速に濾過することによって結合反応を終了させた。フィルタプレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で３度すすぎ、結合していない放射能を除去した。次いで、プレートを空気乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）５０μＬを各ウェルに加えた。次いで、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で計数した。結合データを、１サイト競合モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で非線形回帰分析によって分析した。試験化合物についてのＫ_ｉ値を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng Y；Prusoff WH.（１９７３年）Biochemical Pharmacology、２２（２３）号：３０９９〜１０８頁）を使用して、放射性リガンドの観察されたＩＣ_５０値およびＫ_Ｄ値から計算した。Ｋ_ｉ値をｐＫ_ｉ値に変換し、相乗平均および９５％信頼区間を決定した。次いで、これらの要約統計量をデータ報告のためにＫ_ｉ値に戻した。

このアッセイにおいて、より低いＫ_ｉ値は、試験化合物が試験した受容体に対して高い結合親和性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、Ｍ_１、Ｍ_２、Ｍ_３、Ｍ_４およびＭ_５ムスカリン受容体サブタイプについて１０ｎＭ未満のＫ_ｉ値を有することが見出された。

（実施例１９）
ヒトβ_１、β_２またはβ_３アドレナリン受容体を発現している細胞からの細胞培養および膜調製
クローン化されたヒトβ_１およびβ_２アドレナリン受容体を安定的に発現しているヒト胎児腎（ＨＥＫ−２９３）細胞株、またはクローン化されたヒトβ_３アドレナリン受容体を安定的に発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、ジェネテシン５００μｇ／ｍＬの存在下にてＤＭＥＭまたは１０％ＦＢＳを含むＨａｍｓ Ｆ−１２培地中で、ほぼ集密的にまで増殖させた。細胞単層を、ＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡで浮遊させた。細胞を、１，０００ｒｐｍの遠心分離によってペレットにし、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存するか、または使用するために膜を直ちに調製した。β_１およびβ_２受容体を発現している膜の調製のために、細胞ペレットを、溶解緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃）で再懸濁し、氷上のタイトフィット型のＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザー（３０ストローク）を使用してホモジナイズした。よりプロテアーゼ感受性であるβ_３受容体を発現している膜については、細胞ペレットを、５０ｍＬ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）当たり１錠の「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ ｗｉｔｈ ２ｍＭ ＥＤＴＡ」を添加した溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを２０，０００×ｇで遠心分離し、このようにして得られたペレットを、上記のように再懸濁および遠心分離によって溶解緩衝液で一度洗浄した。次いで、最終的なペレットを、氷冷の結合アッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁した。Lowryら、１９５１年、Journal of Biological Chemistry、１９３号、２６５頁；およびBradford、Analytical Biochemistry、１９７６年、７２号、２４８〜５４頁に記載されている方法によって、膜懸濁液のタンパク質濃度を決定した。すべての膜を一定分量で−８０℃にて凍結保存するか、または直ちに使用した。

（実施例２０）
ヒトβ_１、β_２およびβ_３アドレナリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイ
アッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡ）中にヒトβ_１、β_２またはβ_３アドレナリン受容体を含有する膜タンパク質１０〜１５μｇを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート中で１００μＬの総アッセイ容量で結合アッセイを行った。β_１およびβ_２受容体について［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（ＮＥＴ−７２０、１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、および０．０１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の１０または１１の異なる濃度での［^１２５Ｉ］−（−）−ヨードシアノピンドロール（ＮＥＸ−１８９、２２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、放射性リガンドのＫ_ｄ値を決定するための飽和結合研究を行った。１０ｐＭ〜１０μＭの範囲の１０または１１の異なる濃度の試験化合物について、１ｎＭの［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール、および０．５ｎＭの［^１２５Ｉ］−（−）−ヨードシアノピンドロールを用いて、試験化合物のＫ_ｉ値を決定するための置換アッセイを行った。非特異的結合を、１０μＭのプロプラノロールの存在下にて決定した。アッセイを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、０．３％ポリエチレンイミンで予浸した、β_１およびβ_２受容体のためのＧＦ／Ｂ、またはβ_３受容体のためのＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタプレート（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で急激に濾過することによって結合反応を終了させた。フィルタプレートを濾過緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、４℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ）で３度洗浄し、結合していない放射能を除去した。次いで、プレートを乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション流体（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）５０μＬを加え、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）でプレートを計数した。結合データを、１サイト競合のための３パラメーターモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて非線形回帰分析によって分析した。１０μＭのプロプラノロールの存在下にて決定するように、曲線最小を非特異的結合についての値に固定した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng Y、およびPrusoff WH.、Biochemical Pharmacology、１９７３年、２２号、２３号、３０９９〜１０８頁）を使用して、放射性リガンドの観察されたＩＣ_５０値およびＫ_ｄ値から、試験化合物についてのＫ_ｉ値を計算した。

このアッセイにおいて、より低いＫ_ｉ値は、試験化合物が、試験した受容体に対して高い結合親和性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、β_２アドレナリン受容体については１０ｎＭ未満のＫ_ｉ値、ならびにβ_１およびβ_３アドレナリン受容体については１０００ｎＭ超のＫ_ｉ値を有することが見出された。

（実施例２１）
ムスカリン受容体サブタイプに対する拮抗作用の機能アッセイ
アッセイＡ ｃＡＭＰ蓄積のアゴニスト媒介性阻害の遮断
このアッセイにおいて、ｈＭ_２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞における、試験化合物がフォルスコリン媒介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害を遮断する能力を測定することによって、ｈＭ_２受容体に対するアンタゴニストとしての試験化合物の機能的有効性を決定した。メーカーの指示に従って、^１２５Ｉ−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ ＳＭＰ００４Ｂ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。上記の細胞培養および膜調製の節で記載したように、細胞をｄＰＢＳで一度すすぎ、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）で浮遊させた。離れた細胞を、ｄＰＢＳ５０ｍＬ中で６５０×ｇの遠心分離によって５分間２度洗浄した。次いで、細胞ペレットをｄＰＢＳ１０ｍＬ中で再懸濁させ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ１ Ｄｕａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で細胞を計数した。細胞を６５０×ｇで再び５分間遠心分離し、１．６×１０^６〜２．８×１０^６細胞／ｍＬのアッセイ濃度まで刺激緩衝液中で再懸濁した。

試験化合物を最初に、希釈用緩衝液（ＢＳＡ（０．１％）１ｍｇ／ｍＬを添加したｄＰＢＳ）で４００μＭの濃度まで溶解し、次いで希釈用緩衝液で１００μＭ〜０．１ｎＭの範囲の最終的なモル濃度まで段階希釈した。オキソトレモリンを同様に希釈した。

アデニル酸シクラーゼ活性のオキソトレモリン阻害を測定するために、フォルスコリン２５μＬ（ｄＰＢＳに希釈して２５μＭの最終濃度）、希釈したオキソトレモリン２５μＬ、および細胞５０μＬを、アゴニストアッセイウェルに加えた。オキソトレモリン阻害性アデニル酸シクラーゼ活性を遮断する試験化合物の能力を測定するために、フォルスコリンおよびオキソトレモリン２５μＬ（各々２５μＭおよび５μＭの最終濃度、ｄＰＢＳ中に希釈）、希釈した試験化合物２５μＬ、および細胞５０μＬを、残りのアッセイウェルに加えた。

反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、氷冷の検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止した。プレートを密封し、室温で一晩インキュベートし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で翌朝計数した。メーカーの利用者マニュアルに記載されているように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察した計数に基づいて、生成したｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）を計算した。非線形回帰（１サイト競合式）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によってデータを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を使用して、各々、Ｋ_Ｄおよび［Ｌ］として、オキソトレモリン濃度反応曲線のＥＣ_５０とオキソトレモリンアッセイ濃度とを使用して、Ｋ_ｏｂｓを計算した。

このアッセイにおいて、より低いＫ_ｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、ｈＭ_２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞における、フォルスコリン媒介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫ_ｏｂｓ値を有することが見出された。

アッセイＢ アゴニスト媒介性［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断
この機能アッセイにおいて、ｈＭ_２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞において、オキソトレモリンによって刺激される［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を遮断する試験化合物の能力を測定することによって、試験化合物のｈＭ_２受容体のアンタゴニストとしての機能的有効性を決定した。

使用時に、凍結した膜を解凍し、次いでウェル毎にタンパク質５〜１０μｇの最終的標的組織濃度でアッセイ緩衝液中に希釈した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−２１００組織破壊器を使用して膜を短時間ホモジナイズして、次いでアッセイプレートに加えた。

各実験において、アゴニストであるオキソトレモリンによる［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の刺激に対するＥＣ_９０値（９０％最大反応のための有効濃度）を決定した。

オキソトレモリンによって刺激される［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を阻害する試験化合物の能力を決定するために、下記を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．４ｎＭ）を含むアッセイ緩衝液２５μＬ、オキソトレモリン（ＥＣ_９０）２５μＬおよびＧＤＰ（３ｕＭ）、希釈した試験化合物２５μＬおよびｈＭ_２受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜２５μＬ。次いで、アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６ウェルハーベスターを使用して、アッセイプレートを、１％ＢＳＡで前処理したＧＦ／Ｂフィルターで濾過した。プレートを氷冷の洗浄緩衝液で３秒間３度洗浄し、次いで空気乾燥または真空乾燥した。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０シンチレーション液体（５０μＬ）を各ウェルに加え、各プレートを密封し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で放射能を計数した。非線形回帰（１サイト競合式）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によって、データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を使用して、各々、Ｋ_Ｄおよび［Ｌ］、リガンド濃度として、試験化合物の濃度反応曲線のＩＣ_５０値とアッセイにおけるオキソトレモリン濃度とを使用してＫ_ｏｂｓを計算した。

このアッセイにおいてより低いＫ_ｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、ｈＭ_２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるオキソトレモリンによって刺激される［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫ_ｏｂｓ値を有することが見出された。

アッセイＣ ＦＬＩＰＲアッセイを介したアゴニスト媒介性カルシウム放出の遮断
この機能アッセイにおいて、試験化合物が細胞内カルシウムのアゴニスト媒介性増加を阻害する能力を測定することによって、ｈＭ_１、ｈＭ_３およびｃＭ_５受容体のアンタゴニストとしての試験化合物の機能的有効性を決定した。

アッセイを行う前夜に、受容体を安定的に発現しているＣＨＯ細胞を、９６ウェルＦＬＩＰＲプレートに播いた。Ｃｅｌｌｗａｓｈ（ＭＴＸ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、ＦＬＩＰＲ緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムを含有しないハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭの塩化カルシウム、２．５ｍＭのプロベネシド）で、播いた細胞を２度洗浄し、増殖培地を除去した。洗浄後、各ウェルはＦＬＩＰＲ緩衝液５０μＬを含有した。次いで細胞を、５０μＬ／ウェルの４μＭのＦＬＵＯ−４ＡＭ（２×溶液を作製した）と共に、５％二酸化炭素下にて３７℃で４０分間インキュベートした。色素インキュベーション期間に続いて、細胞をＦＬＩＰＲ緩衝液で２度洗浄し、各ウェル中に５０μＬの最終容量とした。

オキソトレモリンについての細胞内Ｃａ^２＋放出の用量依存的な刺激を決定し、それによって試験化合物をＥＣ_９０濃度でのオキソトレモリン刺激に対して測定できた。細胞を最初に化合物希釈用緩衝液と共に２０分間インキュベートし、次いでオキソトレモリンを加えた。式ＥＣ_Ｆ＝（（Ｆ／１００−Ｆ）＾１／Ｈ）＊ＥＣ_５０と関連した下記のＦＬＩＰＲ測定およびデータ整理の節において詳しく述べる方法に従って、オキソトレモリンについてのＥＣ_９０値を作成した。ＥＣ_９０濃度のオキソトレモリンを試験アッセイプレートの各ウェルに加えて、３×ＥＣ_Ｆのオキソトレモリン濃度を、刺激プレートにおいて調製した。

ＦＬＩＰＲのために使用したパラメーターは、０．４秒の曝露長さ、０．５ワットのレーザー強度、４８８ｎｍの励起波長、および５５０ｎｍの放射波長であった。オキソトレモリンを加える前の１０秒間の蛍光の変化を測定することによってベースラインを決定した。オキソトレモリン刺激に続いて、ＦＬＩＰＲによって１．５分間０．５〜１秒毎に蛍光の変化を連続的に測定して、最大蛍光変化を得た。

蛍光変化を、各ウェルについて最大蛍光マイナスベースライン蛍光として表した。シグモイド用量反応についてのビルトインモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、非線形回帰による試験化合物濃度の対数に対して生データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng & Prusoff、１９７３年）に従って、Ｋ_ＤとしてオキソトレモリンＥＣ_５０値およびリガンド濃度についてのオキソトレモリンＥＣ_９０を使用して、ＰｒｉｓｍによってアンタゴニストＫ_ｏｂｓ値を決定した。

このアッセイにおいて、より低いＫ_ｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、ｈＭ_１、ｈＭ_３およびｃＭ_５受容体を安定的に発現しているＣＨＯ細胞におけるアゴニスト媒介性カルシウム放出の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫ_ｏｂｓ値を有することが見出された。

（実施例２２）
ヒトβ_１、β_２またはβ_３アドレナリン受容体を非相同的に発現しているＨＥＫ−２９３およびＣＨＯ細胞株における細胞全体ｃＡＭＰフラッシュプレートアッセイ
メーカーの指示に従って、［^１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。β_１およびβ_２受容体アゴニストの有効性（ＥＣ_５０）、受容体アゴニストの有効性（ＥＣ_５０）を示すために、クローン化されたヒトβ_１およびβ_２受容体を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１ ＨＥＫ−２９３細胞系を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ中でほぼ集密的にまで増殖させた。β_３受容体アゴニストの有効性（ＥＣ_５０）の決定のために、クローン化されたヒトまたはβ_３アドレナリン受容体を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン（２５０μｇ／ｍＬ）を添加したＨａｍｓ Ｆ−１２培地中でほぼ集密的にまで増殖させた。細胞をＰＢＳですすぎ、２ｍＭのＥＤＴＡまたはトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）を含有するｄＰＢＳ（ＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２を含有しないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）中で細胞を引き剥がした。Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターで細胞を計数した後、細胞を１，０００ｒｐｍの遠心分離によってペレットにし、室温まで予熱したＩＢＭＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｋｉｔ）を含有する刺激緩衝液中に１．６×１０^６〜２．８×１０^６細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁した。このアッセイにおいて１ウェル毎に約４０，０００〜８０，０００細胞を使用した。試験化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ−２０００中に０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈し、１００μＭ〜１ｐＭの範囲の１１の異なる濃度で試験した。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、［^１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含有する冷たい検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止させた。生成したｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）を、メーカーの利用者マニュアルに記載されるように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察された計数に基づいて計算した。シグモイド式によるＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によって、データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng YおよびPrusoff WH.、Biochemical Pharmacology、１９７３年、２２号、２３号、３０９９〜１０８頁）を使用して、ＥＣ_５０値を計算した。

このアッセイにおいて、より低いＥＣ_５０値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、β_２アドレナリン受容体については約１０ｎＭ未満のＥＣ_５０値、β_１アドレナリン受容体については約３０ｎＭのＥＣ_５０値、およびβ_３アドレナリン受容体については７００ｎＭ超のＥＣ_５０値を有することが見出された。

（実施例２３）
ヒトβ_２アドレナリン受容体を内因性発現する肺上皮細胞株の細胞全体のｃＡＭＰフラッシュプレートアッセイ
このアッセイにおいて、内因性レベルのβ_２アドレナリン受容体を発現している細胞株を使用して、試験化合物のアゴニストの有効性および固有活性を決定した。ヒト肺上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６０９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（January Bら、British Journal of Pharmacology、１９９８年、１２３、４、７０１〜１１頁）からの細胞を、完全無血清培地（エピネフリンおよびレチノイン酸を含有するＬＨＣ−９培地、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）中で７５〜９０％密集度まで増殖した。アッセイの前日に、培地を、ＬＨＣ−８（エピネフリンまたはレチノイン酸を含有せず、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）に切り換えた。メーカーの指示に従って［^１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。

アッセイの日に、細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡでかき落とすことによって浮遊させ、計数した。１，０００ｒｐｍの遠心分離によって細胞をペレットにし、６００，０００細胞／ｍＬの最終濃度で事前に３７℃に温めた刺激緩衝液中で再懸濁した。このアッセイにおいて、細胞を１００，０００〜１２０，０００細胞／ウェルの最終濃度で使用した。試験化合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ−２０００中のアッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡ）中に段階希釈した。試験化合物を、アッセイにおいて１０μＭ〜１０ｐＭの範囲の１１の異なる濃度で試験した。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、氷冷の検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートし、Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で翌朝計数した。メーカーの利用者マニュアルに記載されるように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察した計数に基づいて、反応物ｍＬ当たりの生成したｃＡＭＰの量を計算した。データを、シグモイド用量反応についての４−パラメーターモデルを使用したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で非線形回帰分析によって分析した。

このアッセイにおいて、より低いＥＣ_５０値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、完全β_２アゴニストであるイソプロテレノール（１．０）と比較して０．３超の固有活性値と共に、１０ｎＭ未満のＥＣ_５０値を有することが見出された。

（実施例２４）
気管支保護の有効性および持続時間を決定するためのアイントホーフェンアッセイ
このアッセイにおいて、モルモットを使用して試験化合物の気管支保護の有効性および持続時間を決定した。このアッセイは、Einthoven（１８９２年）Pfugers Arch. ５１号：３６７〜４４５頁；およびMohammedら（２０００年）Pulm Pharmacol Ther. １３（６）号：２８７〜９２頁に記載されている手順から派生した。このアッセイにおいて、通気圧の変化は気道抵抗の代替的測定値としての役割を果たす。試験化合物による前処理に続いて、プロプラノロールの存在下にて静脈内メタコリンに対する気管支収縮の用量反応曲線を使用してムスカリンアンタゴニストの有効性を決定した。同様に、ヒスタミンを使用してβ_２アゴニストの気管支保護の有効性を決定した。プロプラノロールの非存在下にてメタコリンを使用して、併せた気管支保護の有効性を決定した。

２５０〜４００ｇの体重の雄Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（Ｈａｒｌａｎ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してアッセイを行った。投与溶液５ｍＬを使用して全身曝露投与チャンバー（Ｒ＋Ｓ Ｍｏｌｄｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）において、試験化合物またはビヒクル（すなわち、滅菌水）を、１０分にわたって吸入（ＩＨ）により投与した。２２ｐｓｉの圧力のＢｉｏｂｌｅｎｄ（５％ＣＯ_２；２１％Ｏ_２；および７４％Ｎ_２の混合物）によって推進されるＬＣ Ｓｔａｒ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｓｅｔ（モデル２２Ｆ５１、ＰＡＲＩ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社、Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ、ＶＡ）から生じるエアロゾルに、動物を曝露させた。吸入による投与後様々な時点で肺機能を評価した。

アッセイの開始前７５分に、モルモットをケタミン（４３．７ｍｇ／ｋｇ）キシラジン（３．５ｍｇ／ｋｇ）／アセプロマジン（１．０５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋内（ＩＭ）注射で麻酔した。この混合物の追加用量（開始用量の５０％）を必要に応じて投与した。頸静脈および頸動脈を分離し、生理食塩水を充填したポリエチレンカテーテル（各々ｍｉｃｒｏ−ｒｅｎａｔｈａｎｅおよびＰＥ−５０、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でカニューレ処置した。頸動脈を圧力トランスデューサーに接続し、血圧測定を可能とし、メタコリンまたはヒスタミンの静脈注射のために頸静脈カニューレを使用した。次いで、気管を切開して取り除き、１４Ｇ針（＃ＮＥ−０１４、Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ社、Ｍｉａｍｉ Ｌａｋｅｓ、ＦＬ）でカニューレ処置した。カニューレ挿入が完了すると、２．５ｍＬの体積を超えない１ｍＬ／１００ｇ体重のストローク体積、毎分１００ストロークの速度で設定した人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ＭＡ）を使用して、モルモットに人工呼吸を施した。Ｂｉｏｐａｃ（ＴＳＤ１３７Ｃ）前置増幅器に接続したＢｉｏｐａｃトランスデューサーを使用して、気管カニューレ内の通気圧（ＶＰ）を測定した。加温パッドを使用して体温を３７℃に維持した。データ収集の開始前に、ペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）投与し、自発呼吸を抑制し、安定的なベースラインを得た。Ｂｉｏｐａｃ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）データ収集インターフェースでＶＰの変化を記録した。ベースライン値を少なくとも５分間収集し、その後モルモットを２倍増の用量の気管支収縮剤（メタコリンまたはヒスタミン）によってＩＶで非累積的に攻撃誘発した。メタコリンを気管支収縮剤として使用した場合、動物をプロプラノロール（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）で前処理し、試験化合物の抗ムスカリン作用を分離させた。メタコリンまたはヒスタミンに対する用量反応曲線の構築の３０分前にプロプラノロールを投与した。Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅデータ収集ソフトウェア（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、ＶＰの変化を記録した。研究の完了後、動物を安楽死させた。

ＶＰの変化を水のｃｍで測定した。ＶＰの変化（ｃｍ Ｈ_２Ｏ）＝ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後）−ピークベースライン圧力である。メタコリンまたはヒスタミンに対する用量反応曲線を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、４つのパラメーターロジスティック式に当てはめた。下記の式を使用した。

式中、Ｘは用量の対数であり、Ｙは反応である。ＹはＭｉｎで開始し、Ｓ字形で漸近的にＭａｘに達する。

準最大用量のメタコリンまたはヒスタミンに対する気管支収縮性反応の阻害率を、下記の式を使用して試験化合物の各用量で計算した。反応の阻害％＝１００−（（ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後、処理）−ピークベースライン圧力（処理）／（ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後、水）−ピークベースライン圧力（水）×１００）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅからの４つのパラメーターロジスティック式を使用して阻害曲線を当てはめた。ＩＤ_５０（気管支収縮性反応の５０％阻害を生じるために必要な用量）およびＥｍａｘ（最大阻害）もまた、必要に応じて推定した。

試験化合物の吸入後の異なる時点での気管支保護の程度を使用して、薬力学的半減期（ＰＤ Ｔ_１／２）を推定した。１相指数関数的減衰式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン４．００）を使用した非線形回帰当てはめを使用してＰＤ Ｔ_１／２を決定した。Ｙ＝スパン＊ｅｘｐ（−Ｋ＊Ｘ）＋プラトー；スパン＋プラトーで開始し、速度定数Ｋでのプラトーへ減衰する。ＰＤ Ｔ_１／２＝０．６９／Ｋ。プラトーを０に制限した。

投与後１．５時間で、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）は、メタコリンによって誘発される気管支収縮およびヒスタミンによって誘発される気管支収縮の両方について約５０μｇ／ｍＬ未満のＩＤ_５０を有することが見出された。

さらに、この化合物は、単一の準最大用量（１００μｇ／ｍＬ）として投与された場合、約７２時間までの有意な気管支保護を生じた。このアッセイにおいて、サルメテロール（３μｇ／ｍＬ、ＩＨ）（β_２アドレナリン受容体アゴニスト）は、６〜１４時間有意な気管支保護を示し、チオトロピウム（１０μｇ／ｍＬ）（ムスカリン受容体アンタゴニスト）は、７２時間を超えて有意な気管支保護を示した。

本発明を特定の態様またはその実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、または等価物で代用することができることは、当業者であれば理解されよう。さらに、引用される特許法および特許に関する規則で認められている限りは、本明細書において引用したすべての公開資料、特許および特許出願は、各書類が個別に本明細書において本明細書中に組み込まれているのと同一程度に参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の動的吸湿（ＤＭＳ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の動的吸湿（ＤＭＳ）トレースを示す。 ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態Ｉ、形態ＩＩおよび形態ＩＩＩ各々の動的吸湿（ＤＭＳ）トレースを示す。

Claims (29)

1. ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態。
2. 形態Ｉを有する、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
3. 形態ＩＩを有する、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
4. 形態ＩＩＩを有する、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
5. 約１７．７±０．３、１８．２±０．３、２１．７±０．３および２３．２±０．３の２θ値での回折ピークを有する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
6. 約２０．７±０．３、２１．６±０．３、２２．５±０．３および２３．２±０．３の２θ値での回折ピークを有する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
7. 約１５．５±０．３、１８．１±０．３、１９．２±０．３および２１．８±０．３の２θ値での回折ピークを有する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
8. ピーク位置が図１に示す図形のピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
9. ピーク位置が図２に示す図形のピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
10. ピーク位置が図３に示す図形のピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折図形を特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
11. 約１３２℃〜約１３８℃の範囲の最大吸熱的熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
12. 約１４２℃〜約１５０℃の範囲の最大吸熱的熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
13. 約１３４℃〜約１４０℃の範囲の最大吸熱的熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
14. 図４に示されるものと実質的に一致する示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
15. 図５に示されるものと実質的に一致する示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
16. 図６に示されるものと実質的に一致する示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
17. 微粉化形態である、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態。
18. 医薬として許容される担体と、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態とを含む医薬組成物。
19. （ａ）請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態と、
    （ｂ）ステロイド性抗炎症剤と、
    （ｃ）医薬として許容される担体と
    を含む医薬組成物。
20. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態を水性等張食塩水に溶解することによって調製され、約４〜約６の範囲のｐＨを有する等張食塩溶液。
21. （ａ）請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態と、
    （ｂ）ステロイド性抗炎症剤と
    を含む治療剤の組合せ。
22. 治療を必要としている患者に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む、肺障害を治療する方法。
23. 患者に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態の治療有効量を投与するステップを含む、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法。
24. 哺乳動物に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む、哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法。
25. 哺乳動物に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態を投与するステップを含む、哺乳動物においてムスカリン受容体をアンタゴナイズし、かつβ_２アドレナリン受容体をアゴナイズする方法。
26. （ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの希釈液溶液を提供するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）からの溶液にカウンター溶媒を加え、曇点を生じさせるステップと
    を含む、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態を調製する方法。
27. （ａ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの希釈液溶液を提供するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）からの溶液にカウンター溶媒を加え、曇点を生じさせステップと、
    （ｃ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基の形態の種結晶を加えるステップと
    を含む、請求項１に記載の結晶性遊離塩基の形態を調製するための方法。
28. 治療に使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態。
29. 肺障害の治療用の医薬の製造のための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結晶性遊離塩基の形態の使用。

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