JP2009533673A - 表面増強共鳴ラマン分光法 - Google Patents
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Abstract
標的分子とほぼ同じプラスモン吸収帯を有する凝集コロイドナノ粒子上にもたらされるサンプル100について表面増強共鳴ラマン分光法SERRSを実行する方法である。サンプルは、標的分子の指紋10を導き出すためのSERRSスペクトル12を得るために、プラスモンの吸収帯と一致する、第一の波長で照射されると共に、凝集16をモニタリングするためのSERSスペクトル14を得るために、ナノ粒子の凝集によってもたらされる吸収帯と一致する、第二の波長で照射される。
Description
本発明は、分子診断の分野における(生体)分子の検出での使用のための表面増強共鳴ラマン分光法(surface enhanced resonant Raman spectroscopy (SERRS))を実行するための方法及び装置に関する。
ラマン分光法は、カーボンの構造特徴化のための一般的な非破壊手段であり、分子による光のラマン散乱が、サンプルの化学組成及び分子構造についての情報を提供するために使用されてもよい。表面増強ラマン分光法(SERS)は、ある特別に用意されたメタル(金属)表面に吸収されているラマン活性分析(対象)物分子から非常に増強されたラマン信号をもたらすラマン分光法(RS)技術の一種である。入射レーザ光のフォトンは、単にバルクを通じて伝搬し、バルクからの信号は、表面の分析物からのいかなるラマン信号も抑え込むため、RSは表面研究に有効でない。他方で、SERSは表面選択的であると共に非常に感度がよく、その表面信号の選択度は、表面においてのみ表面増強(SE)機構(メカニズム)の存在から結果的にもたらされる。
文献に記載される増強の二つの主要な機構があり、それぞれ電磁増強及び化学増強である。電磁増強の効果は支配的になる傾向にあると共にメタル表面上の粗さ特性の存在に依存しており、粗さ特性は、入射励起放射の波長と比較すると小さく、数ナノメートルのオーダになる。
表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)は、粗くされたメタル表面で吸収される分子の高感度且つ選択的な検出及び識別のために使用され得る技術であり、共鳴ラマン分光法はSERSに更なる増強をもたらす。この場合、ラマン信号の増強は、特定の色素の吸収帯(バンド)に一致させるようにレーザ励起波長の選択によって達成される。共鳴ラマン効果は、当業者に知られている。
SERRSを使用すると、(上述の特定の色素によって)分子共鳴の感度を、表面増強ラマン散乱(SERS)の感度と組み合わせることが可能になるので、非常に低い濃度が測定され得る。本技術は例えば、病原体バクテリア(細菌)のデオキシリボ核酸(DNA)又は伝染病に含まれる蛋白質を識別するために分子診断において適用される。この場合、迅速且つ高感度の識別が、効果的な処理のために重要になり、光学的方法、特に蛍光分光法が、ある生体分子を識別するために広く使用されている。しかしながらSERRSは、散乱光が、複数の分析物の識別を可能にする急峻な分子固有の振動帯(帯域)から構成されるという特有の特徴を有しており、固い基板メタル表面で実行される表面増強共鳴ラマン分光法によるDNA識別は例えば、'100nm解像度による、色素標示されたDNAの近接場表面増強ラマン画像化(Near-Field Surface-enhanced Raman Imaging of Dye-Labelled DNA with 100-nm Resolution)'(Volker Dechert氏他, Anal. Chem., 70 (13), 2646-2650, 1998)から知られている。
しかしながら表面上の標的(ターゲット)分析物の吸着は、拡散のプロセスのために非常に遅くなる。それ故に本技術の更なる強化は、表面電荷の低減によって凝集させられるコロイドを使用して提案されており、結果として、隙間において高電界の領域がもたらされる。この目的のために、SERRS色素を、低減された(例えば銀)コロイドと組み合わせるラマン活性ナノ粒子が開発されており、凝集コロイドでの実験は、非常に有望な結果を示している(例えば、'非凝集ナノ粒子と凝集ナノ粒子とからの表面増強共鳴ラマン散乱の比較(A comparison of surface enhanced resonance Raman scattering from unaggregated and aggregated nano-particles)'(K. Faulds氏他, Anal. Chem., 2004, 76, 592-59)参照)。
ナノ粒子でSERRSが使用されるときに直面する一つの問題は、粒子の凝集プロセスの制御にある。凝集コロイドでのSERRS実験は、信号強度が時間と共に変化することを示している。信号強度は、凝集体の大きさに依存し、最大信号強度は、約1分後に得られ得ることが確認されている('SERRSによる、標示されたDNAの検出及び識別(Detection and identification of labelled DNA by SERRS)', D. Graham氏他, Biopolymers (Biospectroscopy) 2000, 57, 85-91)参照)。
それ故に本発明の目的は、凝集ナノ粒子を使用して表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)を実行するための方法を提供することにあり、ナノ粒子の凝集状態は、表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)の特定性、感度、及び再現性を増大させるようにモニタリングされ得る。
本発明によれば、標的分子を含むサンプルについて表面増強共鳴ラマン分光法を実行する方法であって、前記方法は、前記標的分子とほぼ同じプラスモン吸収帯を有する凝集コロイドを有するナノ粒子の表面上に前記サンプルをもたらすステップを有し、前記方法は、少なくとも二つの励起波長の放射線で前記サンプルを照射するステップと、結果としてもたらされるスペクトルを得るステップとを更に有する方法において、第一の励起波長は、前記プラスモン吸収帯と一致し、第二の励起波長は、前記ナノ粒子の凝集によってもたらされる前記吸収帯と一致する方法が提供される。
有利なことに、本方法は、コロイドの凝集状態時間経過をモニタリングするように、前記第二の励起波長の結果として異なる時間に得られるスペクトルを分析するステップを含む。このことは、吸収信号が特徴付けられることを可能にし、測定の再現性が確認(チェック)されることを可能にする。更に、第二の励起波長の結果として異なる時間に得られるスペクトルは、メタル表面で吸収すると共にSERRS標示物(ラベル)に影響を及ぼし得るサンプルにおける可能な他の分子(例えば異物)に関する情報を得るために使用され得る。
一つの実施例において、サンプルが、前記プラスモン吸収帯の範囲内の倍数波長で照射されてもよい。この場合、励起波長は、プラスモン吸収帯を通じてスキャン(走査)されてもよく、その結果として、様々な遷移に関する特定の情報を与え得るSERRS励起スペクトルがもたらされる。
このように本発明は、表面増強共鳴ラマン分光法の特定性、感度、及び再現性を増大させる方法を提供する。倍数波長方法を使用することによって、(信号強化を実現するために使用される)コロイドの凝集状態はモニタリングされることが可能になり、制御されると共に再現され得る測定方法に貢献する。モニタリングするステップは、再現性を確認するために使用され得る。これらのスペクトルを分析することによって、吸収信号は特徴付けられ得る。更に、倍数波長励起を使用することによって、独立したバックグラウンドが得られることは可能になり、これは、サンプルにおける(SERRS標示物以外の)可能な他の構成要素に関する情報をもたらす。他のアプローチ(手法)において、吸収帯を通じた励起波長がスキャンされ、対応するSERRSスペクトルが測定されると共に組み合わされながら、もっと特定された情報が得られることは可能である。
このことは、分子診断の分野における(生体)分子の超高感度検出に特に関連している。
本発明のこれら及び他の態様は、以下に記載された実施例から明らかであり、これらの実施例を参照して説明される。
本発明の実施例は、この場合、例示によってのみ記載され、添付図面を参照して記載されるであろう。
バックグラウンドにより、及び上記説明のように、化合物が適切な光源によって照射されるとき、反射されたフォトンの大多数は、入射光と同じエネルギ(周波数)で放射される(レイリ散乱(Rayleigh scattering))。しかしながら、少数のフォトンは、結局'ラマン散乱'として知られている現象をもたらす変化したエネルギレベルで出てくる。フォトンが、入射光に対してエネルギを獲得する(反(アンチ)ストークスシフト(anti-Stokes shift))と共に喪失する(ストークスシフト(Stokes shift))非弾性散乱は、サンプル化合物内の化学的な部分と個々のフォトンとの間の振動相互作用によって引き起こされる。二つの化合物が同じラマン応答を表示することはないので、ラマン分光法は、歴史的に見て、化学構造を教示するための有用な分析ツールであった。
ラマン散乱は常に、検出のための専用且つ高感度の測定器を必要とする、弱い信号作用(効果)と見なされているが、その信号検出は、二つの特定の修正(変形)によってかなり増強され得る。最初に、関心化合物の、フラクタル(次元分裂図形)的に粗なメタル(通常、金又は銀)との密接な関連性が、結果的に、メタル表面プラスモン(SERS)によって媒介される5乃至6桁の大きさの信号増幅をもたらす。この表面増強に加えて、励起波長が、プラスモン帯と、関連する化合物との両方で共振する場合、更なる信号増幅は可能になる。この'共振'増強は、更なる3乃至4桁の大きさについてラマン強度に寄与する。この相乗効果的な増強(SERRS)は、ラマン分光法を蛍光の感度範囲(レンジ)及びそれよりも上にする。
しかしながら、広範囲のスペクトルオーバラップと制限されたパレット(limited palette)とを伴う蛍光と異なり、SERRSスペクトルは、高いスペクトル解像度がもたらされる、狭いピーク帯域(バンド)幅を有しており、いかなる化合物に対しても固有になる。それ故に、広範囲の数の固有の標示は可能になり、結果的に高多重特性がもたらされる。
SERRSは、凝集コロイドを使用して更に増強されることが可能であり、例えば、SERRS色素は、縮減されたコロイド(例えば、銀)に加えられ、凝集は、凝集剤、例えばスペルミン(spermine)、塩化リチウム(LiCl)、及び塩化ナトリウム(NaCl)によって実現され得る。図面の図1aを参照すると、非凝集ナノ粒子の電子吸収スペクトルは、(この場合、約400nmにおいて)単一の帯域を示している。他方、粒子が凝集している場合、第二の赤方偏移吸収帯が(この場合、約700nmにおいて)出現するが、図1bに示されるように、約400nmの帯域は減少させられる。
要するに、それ故にSERS信号は、励起によって電子吸収帯に得られ得る。色素が表面上に吸収される場合、色素の極吸収帯及び(凝集又は非凝集)ナノ粒子の吸収帯並びにSERRS信号が検出され得る。凝集粒子の場合、6倍(ファクタ)の単一粒子の値と比較して、信号強度における増大が得られ得る。
ここで、サンプル100の倍数波長励起によって凝集ナノ粒子においてSERSとSERRSとを組み合わせることが提案される(図面の図2a及び2b参照)。
1.第一の励起波長
は、色素及びナノ粒子の吸収帯と一致する。このことは、大きな増強を伴うSERRS信号の検出(ステップ12)をもたらす。この信号は、関心(生体)分子の指紋(識別特徴(フィンガープリント))を得る(ステップ10)ために使用されるであろう。
2.第二の励起波長
は、ナノ粒子の凝集によって引き起こされる赤方偏移吸収帯と一致する。このことは、SERS信号の検出(ステップ14)をもたらす。
2.第二の励起波長
このように、図2bは、倍数波長励起、SERRS及びSERS信号の検出、並びに引き出され得る、対応する情報の概略図である。提案されたサンプルは、色素標示を伴う凝集コロイド及び関心生体分子(SERRS標示)を含む。
SERS信号が(時間に渡って)モニタリングされる場合、凝集状態は評価され得る(ステップ16)。赤方偏移吸収帯の強度が凝集の程度に依存するため、信号の強度は凝集の程度に依存する。凝集がない場合、吸収、それ故にSERS信号はモニタリングされ得ない。図2cに記載のように、信号強度は、少なくとも一つの波長においてモニタリングされる。結果としてもたらされる
スペクトルは、メタル表面部において吸収するサンプルにおける他の可能な分子を観測するために、独立のバックグラウンドスペクトルとして同時に使用され得る。
代わりに、図2dに記載のように、凝集状態を評価するために、凝集ナノ粒子による(伝達(伝播)測定における)吸収信号は、遅れずに後続され得る。しかしながら、SERS分析が使用されると、スペクトルは、表面上に吸収される粒子の種類に関する情報ももたらし得る。繰り返すと、結果としてもたらされる
スペクトルは、メタル表面部において吸収するサンプルにおける可能な他の分子に関する情報を得るために、独立のバックグラウンドスペクトルとして同時に使用され得る。
このように通常、倍数波長励起方法の他の態様は、励起
によって得られるSERS信号が、メタル表面部において吸収するサンプルにおける可能な他の分子を観測するために使用され得る独立のバックグラウンド信号を発生させるために使用され得ることにある。このことは、本方法の精度を向上させる。
吸収帯を通じて励起波長をスキャンするステップは、倍数波長励起方法の他の態様を目的とし得る。このことは、様々な遷移に関する特定の情報をもたらし得るSERRS励起スペクトルを結果としてもたらす。SERRSスペクトルは、波長をスキャンすることによって変化するであろう。共振増強は、異なる励起波長における異なる分子振動に対して固有(特徴的)となるため、このことは、単一の波長における励起と比較して、標的分子を検出するのに増大したスペクトルの特定性をもたらす。このことは、固い基板メタル表面部での実験及びナノ粒子コロイド凝集において適用可能であり、図3a及び3bに記載される。スペクトルを測定する代わりに、特別に選択された波長において情報は評価され得る。
本願は、SERRSによるDNAの細菌(バクテリア)検出のような分子診断に適用され得る。他の適用は、合成(複合)媒体における分析物検出において、若しくは体液における薬物モニタリングのように合成媒体における分析物濃度をモニタリングするステップにおいて、又は化学分析プロセスにおいて理解され得る。
本発明の保護範囲は上述の実施例に限定されるものではなく、当業者が特許請求の範囲からはずれることなく多くの代わりの実施例を設計することができることは注目されるべきである。請求項において、括弧の間に置かれる請求項の参照番号は、いずれも当該請求項の保護範囲を限定するものではない。単語"有する"は、請求項に記述される構成要素以外に構成要素又はステップの存在を排除するものではない。構成要素の冠詞は、複数の構成要素を排除するものではなく、その逆も同様である。本発明は、いくつかの独特な構成要素を有するハードウエアによって、及び適切にプログラミングされたコンピュータによって実現可能である。いくつかの手段を列挙する装置の請求項において、いくつかのこれらの手段は、ハードウエアの一つ及び同じ構成要素によって具現化されることが可能である。ある手段が相互に異なる従属請求項において再び引用されるという事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使われ得ないことを示すものではないということに過ぎない。
Claims (6)
- 標的分子を含むサンプルについて表面増強共鳴ラマン分光法を実行する方法であって、前記方法は、前記標的分子とほぼ同じプラスモン吸収帯を有する凝集コロイドを有するナノ粒子の表面上に前記サンプルをもたらすステップを有し、前記方法は、少なくとも二つの励起波長の放射線で前記サンプルを照射するステップと、結果としてもたらされるスペクトルを得るステップとを更に有する方法において、第一の励起波長は、前記プラスモン吸収帯と一致し、第二の励起波長は、前記ナノ粒子の凝集によってもたらされる前記吸収帯と一致する方法。
- 前記コロイドの前記凝集状態時間経過をモニタリングするように、前記第二の波長の結果として異なる時間に得られる前記スペクトルを分析するステップを更に含む請求項1に記載の方法。
- 前記第二の励起波長の結果として異なる時間に得られる前記スペクトルは、独立のバックグラウンド信号を生成するために使用される請求項1に記載の方法。
- 前記分子の指紋が、前記第一の励起波長の結果として得られる前記スペクトルから導き出される請求項1に記載の方法。
- 前記第二の励起波長の結果として得られる前記スペクトルは、前記表面増強ラマン分光信号強度スペクトル又は各々の異なる時間における前記コロイドの凝集状態の前記吸収信号を有する請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、前記プラスモン吸収帯の範囲内の倍数波長で照射される請求項1に記載の方法。
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