JP2009528376A - 選択的ｖｐａｃ２受容体ペプチドアゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明は、選択的にＶＰＡＣ２受容体を活性化し、糖尿病の治療に有用である、ペプチドの提供を含む。

Description

本発明は選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。
特に本発明は、環状である選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。

２型糖尿病又はインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は最も一般的な糖尿病であり、糖尿病に罹患する患者の９０％に影響を及ぼす。ＮＩＤＤＭにより、患者体内のβ細胞の機能が低下し、不十分なインスリン産生及び／又はインスリン感受性の減少に至る。ＮＩＤＤＭが制御されない場合、血液中グルコース量が過剰となり、高血糖をもたらす。時間の経過により更に深刻な合併症に至ることもあり、それにより腎臓機能不全、心血管障害、視覚の損失、下肢潰瘍化、神経障害及び虚血などが生じうる。ＮＩＤＤＭの治療法としては、様々な経口薬の使用のほかに、食事、運動及び体重管理の改善などが挙げられる。ＮＩＤＤＭに罹患する個人はまず、かかる経口薬を服用することにより、血糖値を制御できる。しかしながら、これらの処置では、ＮＩＤＤＭ患者において、生じるβ細胞の機能の進行性の損失は抑えられず、ゆえに疾患の後期段階における血糖値を十分に制御することができない。また、現在利用可能な薬物治療は、ＮＩＤＤＭ患者を、例えば低血糖症、胃腸障害、体液貯留、浮腫及び／又は体重増加などの副作用の危険にさらすこととなる。

下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）は、セクレチン及びグルカゴンと同じペプチドファミリーに属する。ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰは、ｃＡＭＰの媒介及び他のＣａ^２＋の媒介によるシグナル伝達経路を経て、３つのＧタンパク質共役受容体によって活性化する。これらの受容体は、ＰＡＣＡＰ嗜好性のタイプ１（ＰＡＣ１）受容体（Ｉｓｏｂｅ，ら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，１１０：２１３−２１７（２００３）；Ｏｇｉ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９６：１５１１−１５２１（１９９３））及び２つのＶＩＰ共有型のタイプ２受容体（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２１：６１９−６７０（２０００）；Ｈａｍｍａｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ，５０：２６５−２７０（１９９８）；Ｃｏｕｖｉｎｅａｕ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２４７５９−２４７６６（２００３）；Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９３：５４６−５５３（１９９３）；Ｌｕｔｚ，ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５８：１９７−２０３（１９９９）；Ａｄａｍｏｕ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０９：３８５−３９２（１９９５））として公知である。ＰＡＣＡＰのアナログのシリーズは、米国特許第６２４２５６３号公報及び国際公開第２０００／０５２６０号パンフレットに開示されている。

ＰＡＣＡＰは３つの受容体全てに対する同様な活性化能を有する一方で、ＶＩＰは選択的に２つのＶＰＡＣ受容体を活性化する（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。ＶＩＰ（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１０：４８１−４８４（１９８９））及びＰＡＣＡＰ（Ｆｉｌｉｐｓｓｏｎら、ＪＣＥＭ，８２：３０９３−３０９８（１９９７））は、両方とも、それらを静脈注射で提供したとき、ヒトのインスリン分泌を刺激するのみならず、グルカゴン分泌及び肝臓からのグルコース放出を増加させることが知られている。従って、ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰ刺激では、全体的な血糖症の改善には至らない。ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰによる多くの受容体の活性化は、神経、内分泌腺、心血管、生殖機能、筋肉及び免疫系に幅広い生理的影響を及ぼす（Ｇｏｚｅｓら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６：１０１９−１０３４（１９９９））。またＶＩＰにより誘導されたラットの下痢は、ＶＰＡＣ受容体のうちの１つ（ＶＰＡＣ１）のみにより媒介されることが示唆されている（Ｉｔｏら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２２：１１３９−１１５１（２００１）及びＴｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。ＶＰＡＣ１及びＰＡＣ１受容体はα細胞及び肝細胞において、発現し、従って肝臓からのグルコース放出をもたらす効果に関与するものと考えられる。

エキセンディン４は、Ｇｉｌａ Ｍｏｎｓｔｅｒ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ Ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に含まれる物質である（Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１）：７４０２−７４０５（１９９２））。それは３９アミノ酸からなるペプチドであり、グルコース依存性のインスリン分泌を促進する活性を有する。具体的なＰＥＧ化エキセンディン及びエキセンジンアゴニストペプチドは、国際公開第２０００／６６６２９号パンフレット中に記載されている。

直鎖状のＶＩＰアナログの構造及びタンパク質分解の解析から得られた情報が、環状ＶＩＰアナログ（Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ），３７：５７−６６（１９９５）及びＢｏｌｉｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１３：１０７−１１４（１９９６））の合成及び開発に用いられている。米国特許第５６７７４１９号公報及び欧州特許第０５３６７４１号公報（ホフマン・ラ・ロシュ社）は、喘息の治療に有用な、環状ＶＩＰアナログのシリーズを開示している。４つの被保護ペプチド断片からの環状ＶＩＰアナログの合成方法は、米国特許第６０８０８３７号公報；米国特許第６３１６５９３号公報；国際公開第９７／２９１２６号パンフレット（ホフマン・ラ・ロシュ社）に記載されている。また、１つの特定の環状ＶＩＰアナログ（ＲＯ １５−１３９２と命名）は、選択的ＶＰＡＣ２受容体アゴニストであることが示されている（Ｂｏｌｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１（２）：６２９−６３３（１９９７））。更に、環状ＶＩＰアナログが、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアンタゴニストの開発における出発物質として用いられている（Ｍｏｒｅｎｏら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２１：１５４３−１５４９（２０００））。

最近の研究では、ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドが、胃腸（ＧＩ）における副作用をもたらさず、グルカゴン放出及び肝臓グルコース放出を増加させずに、膵臓からのインスリン分泌を促進できることが示されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２））。ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドは最初は、ＶＩＰ及び／又はＰＡＣＡＰの修飾により同定された（例えばＸｉａら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．，２８１：６２９−６３３（１９９７）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２）；国際公開第０１／２３４２０号パンフレット；国際公開第２００４／００６８３９号パンフレットを参照）。

しかしながら現在までに報告されているＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの多くは効果、選択性及び安定性プロフィールに関して問題があり、それらの臨床的な使用可能性が限られている。更に、これらのペプチドの多くは、製剤中における当該ポリペプチドの安定性、並びにインビボでのこれらのポリペプチドの半減期が短いこと、などの問題から、商業的に利用するための候補としては不適当である。したがって、ＮＩＤＤＭ薬剤に関連する現在直面する課題を解決する、新規な治療方法が望まれている。

本発明は、ＶＰＡＣ２受容体に選択的であり、高い血糖値が示される場合にのみ膵臓からのインスリン分泌を誘導する、改良された化合物の提供に関する。本発明の化合物は、β細胞の機能を向上させると考えられるペプチドである。これらのペプチドは、ＧＩ副作用又はそれに対応する肝臓からのグルコース放出の増加を伴わずに、インスリン分泌を誘導する生理的効果を有し、更に公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、ペプチドの選択性、効力及び／又はインビボ安定性が全体的に向上している。

本発明は具体的には、直鎖状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して選択性、効力及び／又は安定性が増加している環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第１の態様は、以下に示すアミノ酸配列からなる環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第２の態様は、本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト及び１つ以上の薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び／又は賦形剤を含んでなる医薬組成物の提供に関する。

本発明の第３の態様は、薬剤として使用するための、本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第４の態様は、非インスリン依存性の糖尿病又はインスリン依存性の糖尿病の治療に、又は食物摂取の抑止に用いられる、環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。

本発明の第５の態様は、非インスリン依存性の糖尿病又はインスリン依存性の糖尿病の治療のための薬剤の製造のための、又は食物摂取の抑止のための、本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用の提供に関する。

本発明の更に別の態様では、有効量の本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを投与することを含んでなる、非インスリン依存性の糖尿病又はインスリン依存性の糖尿病の治療方法、又はかかる疾患の患者の食物摂取の抑止方法の提供に関する。

本発明の更なる態様は、非インスリン依存性の糖尿病又はインスリン依存性の糖尿病を治療するための、又は食物摂取を抑止するための、本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを含有する医薬組成物の提供に関する。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストよりも選択性、効果及び／又は安定性が強化されている。特に、Ｃキャッピング配列としての、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端配列又はこのＣ末端配列の変異型の付加により、意外なことにＶＰＡＣ２受容体選択性が増加し、またタンパク質分解に対する安定性が増加した。特に、環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは小さい／中間のサイズの直鎖状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して立体配座の変化が制限され、そのため、環状ペプチドは直鎖状ペプチドと比較して、立体配座の変化の許容可能性が少ないことを特徴とする。環化によって、直鎖状ペプチドの立体配座の可変性が制限され、それにより受容体への結合能が強化され、選択性が増加し、直鎖状ペプチドと比較してタンパク分解に対する安定度及び生物学的利用能が向上する。

本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはＰＥＧ化されていてもよい。ＰＥＧ化とは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの特定の残基を、１分子以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体と共有結合させることを指す。例えば、ＰＥＧ分子をペプチドアゴニストのリジンアミノ酸に結合させてもよい。

用語「ＶＰＡＣ２」は、本発明のアゴニストが活性化する具体的な受容体（Ｌｕｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５８：１９７−２０３（１９９９）、Ａｄａｍｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０９：３８５−３９２（１９９５））を指す用語として用いる。この用語はまた、本発明のアゴニストを指す用語として用いる。

本発明の「選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」は、選択的にＶＰＡＣ２受容体を活性化し、インスリン分泌を誘導するペプチドのことを指す。好ましくは、選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列は、天然及び／又は非天然の２８アミノ酸及びＣ末端延長部分からなる。

「選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」とは、ペプチド鎖の２つのアミノ酸の側鎖間での共有結合によって環化している、選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを指す。共有結合は例えばラクタム架橋又はジスルフィド架橋でもよい。

本明細書中で使用される用語「ラクタム架橋」とは、共有結合（特にアミド結合）であって、ペプチドアゴニストの１つのアミノ酸の側鎖アミノ末端を、ペプチドアゴニストの他のアミノ酸の側鎖カルボキシ末端に結合させることを意味する。ラクタム架橋は、Ｘａａ_ｎ残基の側鎖と、Ｘａａ_ｎ＋４残基の側鎖との共有結合により形成される（式中、ｎは１〜２８である）。ラクタム架橋は、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ又はＤａｂ残基の側鎖アミノ末端と、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシ末端との共有結合により形成されうる。Ｐ４０３はラクタム架橋を有するが、それは位置２１におけるＯｒｎ残基の側鎖アミノ末端と、位置２５におけるＧｌｕ残基の側鎖カルボキシ末端との共有結合により形成される。

本明細書中で使用される用語「ジスルフィド架橋」とは、ペプチドアゴニストの１つのアミノ酸の側鎖末端上の硫黄原子と、ペプチドアゴニストの他のアミノ酸の側鎖末端上の硫黄原子とで形成される共有結合を意味する。ジスルフィド架橋は、Ｘａａ_ｎ残基の側鎖と、Ｘａａ_ｎ＋４残基の側鎖との共有結合により形成される（式中、ｎは１〜２８である）。ジスルフィド架橋は、１つのＣｙｓ又はｈＣ残基の側鎖と、他のＣｙｓ又はｈＣ残基の側鎖との共有結合により形成されうる。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｃ末端延長部分を有する。本発明の「Ｃ端末延長部分」は、１〜１３の天然若しくは非天然のアミノ酸配列を含んでなり、ペプチド結合を介してＣ末端延長部分のＮ末端が上記配列のＣ末端と結合している。Ｃ末端延長部分のいかなるＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）残基もＰＥＧ分子と共有結合してもよく、及び／又はＣ末端延長部分のカルボキシ末端アミノ酸にＰＥＧ分子が共有結合していてもよい。Ｐ４０３のＣ末端延長部分は、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７）である。

Ｃ末端延長部分に関する、本発明で用いられる「結合する」の用語には、ペプチド配列のＣ末端にアミノ酸若しくは化学基が直接付加若しくは結合することが包含される。

本発明の選択的な環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｎ末端修飾を有する。Ｐ４０３のＮ末端修飾は、ヘキサノイル基の付加である。次に、Ｎ末端修飾の他の例について説明する。

本明細書で用いられる「Ｎ末端修飾」の用語には、ペプチドのＮ末端にアミノ酸若しくは化学基が直接付加若しくは結合して化学基を形成することが包含され、それによりペプチドのＮ末端に窒素原子が導入される。

Ｎ末端修飾には、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列への１つ以上の天然又は非天然アミノ酸の付加が包含されてもよく、好ましくは１０アミノ酸以下であり、最も好ましくは１アミノ酸の付加である。Ｎ末端に付加させることができる天然アミノ酸としては、メチオニン及びイソロイシンが挙げられる。Ｎ末端に付加する修飾アミノ酸としてＤ−ヒスチジンを用いてもよい。あるいは、以下のアミノ酸をＮ末端に付加してもよい：
配列番号５：Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）。
好ましくは、当該Ｎ末端に付加させるいずれのアミノ酸も、ペプチド結合で当該Ｎ末端と結合する。

本発明の用語「結合する」には、Ｎ末端修飾に関して用いる場合、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストのＮ末端に直接アミノ酸若しくは化学基を付加若しくは結合させることが包含される。上記のＮ末端修飾の付加は、ペプチド結合を形成させる通常の結合条件下で実施できる。

ペプチドアゴニストのＮ末端にアルキル基（Ｒ）（好ましくはＣ_１−Ｃ_１６アルキル基）を付加して修飾し、（Ｒ）ＮＨ−を形成させてもよい。

あるいは、ペプチドアゴニストのＮ末端に式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１の基を付加して修飾し、式Ｒ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨ−のアミドを形成させてもよい。式Ｒ^１ＣＯＯＨの有機酸と反応させて式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１基を付加してもよい。アシル化反応を使用したアミノ酸配列のＮ末端への修飾は、従来技術において、公知である（例えばＧｏｚｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２７３：１６１−１６７（１９９５）を参照）。式−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１基の添加によりＮ末端において、尿素基又はカルバメート基が形成される（国際公開第２００４／００６８３９号、国際公開第０１／２３２４０号パンフレットを参照）。また、ピログルタミン酸又は６−アミノヘキサン酸を付加することによりＮ末端を修飾してもよい。

ペプチドアゴニストのＮ末端に式−ＳＯ_２Ｒ^５の基を付加して修飾し、Ｎ末端でスルフォンアミド基を形成させてもよい。

ペプチドアゴニストのＮ末端をコハク無水物と反応させて修飾し、Ｎ末端でスクシニミド基を形成させてもよい。スクシニミド基によりペプチドのＮ末端に窒素原子が組み込まれる。

あるいは、メチオニンスルホキシド、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸又は−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加によりＮ末端を修飾してもよい。−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加はグアニド化修飾であり、それによりＮ末端アミノ酸の末端ＮＨ_２が−ＮＨＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２となる。

Ｎ末端修飾及びＣ末端延長部分を含む本発明の大部分の配列中には、標準的な１文字又は３文字表記で表される２０の天然アミノ酸が含まれる。本発明で使用する他の略語は、以下のとおり定義される。
Ｃ６＝ヘキサノイル、
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸、
ＯＭｅ＝メトキシ、
Ｎｌｅ＝ノルロイシン、
Ｏｒｎ＝オルニチン、
Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）＝ε−（３’−メルカプトプロピオニル）−リジン、
Ｋ（Ｗ）＝ε−（Ｌ−トリプトフィル）−リジン、
Ｄａｂ＝ジアミノブチル酸、
ｈＣ＝ホモシステイン、
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、

＝ラクタム架橋又はジスルフィド架橋

ＶＩＰは、２８アミノ酸を有する、単一配列として天然に存在する物質である。しかしながら、ＰＡＣＡＰは、アミド化されたカルボキシル基を有する、３８アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）又は２７アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−２７）のいずれかとして存在する（Ｍｉｙａｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１７０：６４３−６４８（１９９０）。ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ−２７及びＰＡＣＡＰ−３８の配列は以下の通りである。

本明細書の用語「天然アミノ酸」とは、ヒト遺伝暗号によってコードされる２０のアミノ酸（すなわち２０の標準的なアミノ酸）を意味する。これらの２０のアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。

「非天然アミノ酸」の例としては、合成アミノ酸及び体内で修飾されたアミノ酸が挙げられる。これらには、Ｄ−アミノ酸、アルギニン様アミノ酸（例えばホモアルギニン）、及び側鎖に余分のメチレン基を有する他のアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、修飾アミノ酸（例えばノルロイシン、リジンの側鎖アミンをイソプロピル基で修飾した（イソプロピル）リジンなど）が挙げられる。またオルニチン、アミノイソ酪酸及び２−アミノブタン酸などのアミノ酸も包含される。

本発明の用語「選択的」とは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが、他の公知の受容体よりもＶＰＡＣ２受容体との高い選択性を有することを指す。選択性の程度は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＶＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率、又は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率により算出される。なお、結合アフィニティは実施例４にて後述するとおりに算出される。

「インスリン分泌活性」とは、高いグルコース濃度に応答してインスリン分泌を促進する能力のことを指し、これにより細胞によるグルコース取り込みが開始され、血漿中グルコース濃度が減少する。インスリン分泌性活性は公知の方法で評価することができ、例えばＶＰＡＣ２受容体結合活性又は受容体活性化（例えばインスリノーマ細胞系又は小島によるインスリン分泌）を測定する試験、静脈グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、腹膜内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）、並びに経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）など）が挙げられる。インスリン分泌性活性は、ヒトの場合はインスリン濃度又はＣ−ペプチド濃度を測定することによって、日常的に測定する。本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはインスリン分泌を活性化させる。

本発明の「インビトロ効果」とは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＶＰＡＣ２受容体を活性化するペプチドの能力の基準のことを指す。インビトロ効果は「ＥＣ_５０」として表し、それは単一の用量反応実験において、活性上昇の最大に対して５０％の結果を生じさせる化合物の有効濃度を意味する。本発明の場合、インビトロ効果は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ及びＡｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎの２つの異なるアッセイを使用して算出する。これらのアッセイの詳細は実施例３及び５を参照。これらのアッセイは異なる方法で実施されるものの、得られる結果は通常２つのアッセイ間における相関関係を示す。

「血漿中半減期」という用語は、循環する当該分子の半分が血漿中でクリアランスされるまでにかかる時間のことを指す。あるいは「除去半減期」の用語を用いることもある。血漿中半減期又は除去半減期に関して「延長された」又は「長期化された」というときは、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期が、同じ条件下における参照分子（例えば非ＰＥＧ化形態のペプチド又は天然ペプチド）のそれと比較して統計学的に有意に増加していることを意味する。当業者であれば、半減期は派生パラメータであり、クリアランス及び分布体積の関数であることを認識する。

クリアランスとは、薬を除去する生体の能力の基準のことを指す。例えば薬剤の修飾によりクリアランスが低下した場合、半減期は長期化すると考えられる。しかしながらこの相互関係は、分布量に変化がない場合にのみ正確なものとなる。
対数直線の両末端の半減期（ｔ_１／２）、クリアランス（Ｃ）及び分配される体積（Ｖ）の関係は、以下の近似方程式で表される：

クリアランスとはどれくらいの薬剤が除去されたかを指し示すものではなく、むしろ当該除去によって、薬剤から完全に解放されるべき生体液（例えば血液かプラズマ）の量のことを指す。クリアランスは単位時間あたりの体積として表される。

本発明で用いる「配列同一性（％）」とは、配列のアラインメントを取ったとき、それらが同様の位置又は領域において、同様のアミノ酸である（同一か若しくは保存的に置換されている場合）ことを示す場合に用い、その場合、同一若しくは保存的に置換されているアミノ酸とは、元となるタンパク質と比較して、当該タンパク質の活性又は機能を変えないアミノ酸のことを指す。例えば、各々少なくとも８５％の相同性を有する２つのアミノ酸配列とは、最適なアラインメントで最高３つのギャップを許容した場合、同様の位置において、少なくとも８５％同様（同一若しくは保存的に置換された残基）であることを指すが、但しギャップに関しては、合計１５以下のアミノ酸残基が影響を受ける。

本発明の配列同一性（％）の算出に使用する参照ペプチドを以下に示す。

配列同一性（％）は、本発明に包含されるペプチドとＰ５７（配列番号６）などの参照ペプチドとの間における異なる残基の数を決定し、その数を、参照ペプチドのアミノ酸数（例えばＰ５７では３９アミノ酸）で除算し、その結果に１００を乗算し、更に１００からその結果の数を減算することにより算出できる。例えば、Ｐ５７と４つのアミノ酸が異なる３９アミノ酸を有する配列は、９０％（例えば１００−（（４／３９）×１００））の配列同一性を有する。３９のアミノ酸より長い配列の場合、Ｐ５７配列と異なる残基の数は、上記の算出に供される３９アミノ酸を超える分のアミノ酸を含む。例えば、４１アミノ酸を有し、Ｐ５７配列の３９アミノ酸とは４つのアミノ酸が異なり、Ｐ５７配列に存在しないアミノ酸がカルボキシ末端に２つ添加されている場合、Ｐ５７と異なるアミノ酸は合計６つとなる。すなわち、この配列は８４％（例えば１００−（（６／３９）×１００））の配列同一性（％）を有する。配列同一性の程度は公知の方法を使用して算出してもよい（例えば、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０（１９８３）及びＭｙｅｒｓ Ｅ．及びＭｉｌｌｅｒ Ｗ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）を参照）。相同性の程度を算出する際に使用できる１つのプログラムとしてはＭｅｇＡｌｉｇｎリップマン−ピアソンの１ペア方法（デフォルトパラメータを使用する）が挙げられ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍの一部としてＤＮＡｓｔａｒ Ｉｎｃ社，１１２８，Ｓｅｌｆｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１５，ＵＳＡから入手できる。使用できる他のプログラムとしてはＣｌｕｓｔａｌ Ｗが挙げられる。これはＴｈｏｍｐｓｏｎらが開発した、ＤＮＡ又はタンパク質配列の多数配列アラインメントパッケージである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２、（２２）：４６７３−４６８０、１９９４）。このツールは関連する配列の異種間比較を実行し、配列の保存性を解析するのに有用である。Ｃｌｕｓｔａｌ ＷはＤＮＡ又はタンパク質のための多目的用の多数配列アラインメントプログラムである。これは異なる配列における、生物学的に有意義な多数の配列のアラインメントを生じさせる。選択された配列中に存在する、最高にマッチする部分を算出し、相同性、類似性及び相違が視覚可能となるようにそれらを整列させる。進化上の関係は、Ｃｌａｄｏｇｒａｍｓ又はＰｈｙｌｏｇｒａｍｓを観察することにより解析できる。

本発明に係る選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列はＶＰＡＣ２受容体に対して選択的であり、好ましくはＰ５７（配列番号６）と６０％〜７０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜８０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜９０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９７％、９０％〜９５％又は９５％〜９７％の配列同一性を有する。Ｐ４０３は、Ｐ５７と８５％の配列同一性を有する。

本発明の用語「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコール分子を意味する。その典型的な形態においては、ＰＥＧは末端にヒドロキシル基を有する直鎖状ポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ（式中、ｎは約８〜約４０００）で表される。末端の水素原子は保護基（例えばアルキル基又はアルカノール基）で置換されてもよい。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基、好ましくは末端ヒドロキシ基を有する。このヒドロキシ基を活性化し、ペプチドと反応させるのが好ましい。多くのＰＥＧ派生物が従来技術において公知である（例えば米国特許第５４４５０９０号、第５９００４６１号、第５９３２４６２号、第６４３６３８６号、第６４４８３６９号、第６４３７０２５号、第６４４８３６９号、第６４９５６５９号、第６５１５１００号及び第６５１４４９１号、並びにＺａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５、１９９５を参照）。ＰＥＧ分子は好ましくは５００〜１００，０００Ｄａの分子量である。ＰＥＧは直鎖状又は分岐状でもよく、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはペプチドに結合する１、２又は３個のＰＥＧ分子を有してもよい。１又は２個のＰＥＧ分子が、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト１分子あたり存在するのがより好ましい。ＰＥＧ分子の両端をホモ若しくはヘテロ官能化し、２つ以上のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを架橋してもよいことが更に考察される。

本発明においては、ＰＥＧ分子を、Ｐ４０３のＬｙｓ残基に共有結合させることが可能である。ペプチドアゴニスト中のどのＬｙｓ残基をＫ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）で置換してもよく、それらを更にＰＥＧ化してもよい。Ｋ（Ｗ）はＬｙｓ残基の側鎖に結合したＴｒｐ残基であり、それはＰＥＧ分子をＴｒｐ残基に共有結合させることによりＰＥＧ化することができる。あるいは、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）基をＰＥＧ化してＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２Ｓ−ＰＥＧ）を形成させてもよい。

本発明の用語「ＰＥＧ化」とは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに、上記の通り１つ以上のＰＥＧ分子が共有結合することを意味する。

野生型ＶＩＰの位置８のアスパラギン酸から位置２６のイソロイシンの領域はαへリックス構造をとる。ペプチドにおけるヘリックス構造の増加によりその効力及び選択性が強化され、同時に酵素分解からの保護が強化される。Ｃ末端延長部分（例えばＥｘｅｎｄｉｎ−４延長部分）の使用により、ペプチドのヘリシティを強化することができる。更に、へリックス表面上の２つのアミノ酸側鎖を結合している共有結合（例えばラクタム架橋）を導入することによってもペプチドのヘリシティを強化することができる。

タンパク質のＰＥＧ化により、治療用にペプチド又はタンパク質を使用することに付随する、多数の薬理学的、及び毒物学的／免疫学的な課題が解決できる。しかしながら、個々のペプチドによっては、ＰＥＧ化されたペプチドの形態が、非ＰＥＧ化されたペプチドの形態と比較して生物活性が顕著に損なわれる場合もありうるかもしれない。

ＰＥＧ化されたタンパク質の生物活性は、
ｉ）ＰＥＧ分子のサイズ、
ｉｉ）個々の結合部位、
ｉｉｉ）修飾の程度、
ｉｖ）逆結合条件、
ｖ）結合にリンカーが用いられるか、あるいはポリマーが直接結合する、
ｖｉ）有害な副生成物の生成、
ｖｉｉ）活性化ポリマーによる損害、又は
ｖｉｉｉ）電荷の維持などの因子により影響を受けうる。例えば、サイトカインのＰＥＧ化により、ＰＥＧ化による効果が示される。採用するカップリング反応によっては、サイトカインのポリマー修飾により生物活性の劇的な減少につながりうる（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｅ．，ら、（１９９８）、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｈｅｍ．６８：１−１８）。ＰＥＧ化ペプチドの生物活性の維持は、タンパク質の場合よりも多くの課題を含む。ペプチドはタンパク質より小分子であるため、ＰＥＧ化による修飾は生物活性により大きな影響を及ぼすことが考えられる。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、１分子のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合により修飾することができ、タンパク質分解及び腎クリアランスが遅延化し、薬物動態学的プロフィールを改善することが可能となる。ＰＥＧ化によりＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの見かけのサイズが増加し、そのため腎臓濾過が減少し、生体内における分布が変化する。ＰＥＧ化により、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の抗原性エピトープが保護され、それにより網内系クリアランス及び免疫系による認識が低減し、更にタンパク質分解酵素（例えばＤＰＰ−ＩＶ）による分解が低減する。

小さい、生物学的な活性を有するＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに対するＰＥＧの分子共有結合により、例えば固有の２次構造や生理活性に必要な立体構造を不安定化し、生物活性を減少させて、アゴニストの治療的使用を不能にするような悪影響がアゴニストに及ぶ危険性を増加させることが考えられる。しかしながら、驚くべきことに、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＰＥＧ化により、非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、生物学的活性を有する、長期の半減期及び低いクリアランスを特徴とするＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の潜在的なＰＥＧ化部位を決定するため、セリンのスキャニングを実施した。Ｓｅｒ残基をペプチドの特定の部位で置換し、Ｓｅｒ修飾されたペプチドに関し、それによる効果及び選択性を試験する。あるＳｅｒ置換による薬剤の効果に対する影響が最小であり、当該Ｓｅｒ修飾ペプチドがＶＰＡＣ２受容体に選択的である場合、そのＳｅｒ残基を更にＣｙｓ又はＬｙｓ残基で置換し、その部分を直接的又は間接的なＰＥＧ化部位として用いる。間接的な残基のＰＥＧ化とは、ＰＥＧ化部位の残基と結合する化学基又は残基をＰＥＧ化することを指す。Ｌｙｓの間接的なＰＥＧ化としては、Ｋ（Ｗ）及びＫ（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＳＨ）のＰＥＧ化が挙げられる。

本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、１分子のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体に共有結合させることが可能である。ＰＥＧ化により選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期が長期化され、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０又は２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の除去半減期を有するＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、好ましくは２００ｍＬ／ｈ／ｋｇ以下、好ましくは１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０ｍＬ／ｈ／ｋｇ以下、最も好ましくは５０、４０又は２０ｍＬ／ｈ／ｋｇ未満のクリアランス値を示す。

本発明にはまた、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのペプチド配列のＣ末端に特定のアミノ酸を添加することによりペプチドが保護され、また活性、選択性及び／又は薬理的効果を強化できるという発見が包含される。例えば、これらのＣ末端延長部分はペプチドの螺旋構造を安定させ、酵素の裂開を受け易いＣ末端付近の部位を安定化させることができる。更にまた、本願明細書に開示されるＣ末端延長部分のペプチドの多くが、ＶＰＡＣ２受容体に対して選択的であり、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ及び他の公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストより強力である。好ましいＣ末端延長部分の例としては、エキセンディン４の延長部分ペプチド：ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳである。このエキセンディン４のＣ末端延長部分は、Ｐ４０３のＣ末端延長部分である。エキセンディン４は、Ｇｉｌａ Ｍｏｎｓｔｅｒ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ Ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に含まれる物質である（Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１）：７４０２−７４０５（１９９２））。Ｃ末端延長部分の他の例としては、ヘロデルミン（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）及びヘロスペクチン（ｈｅｌｏｓｐｅｃｔｉｎ）のＣ末端配列である。ヘロデルミン及びヘロスペクチンはＧｉｌａ Ｍｏｎｓｔｅｒの唾液中にも含有される。

更に、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＮ末端修飾により、薬理効果の強化及び／又はＤＰＰ−ＩＶ裂開に対する安定性の強化が得られることを見出した。

ＶＩＰ及び幾つかの公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々な酵素による分解を受け易いため、短いインビボ半減期を示す。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの様々な酵素切断部位は後述する。切断部位はＶＩＰ（配列番号２）のアミノ酸部位との関連において、記載し、本願明細書に記載の配列にも適用できる。

酵素ジペプチジル−ペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によるペプチドアゴニストの分解は、位置２（ＶＩＰのＳｅｒ）及び位置３（ＶＩＰのアスパラギン酸）との間において、行われる。本発明のアゴニストへのＮ末端修飾の付加によって、この領域がＤＰＰ−ＩＶによる切断に対してより安定になる。ＤＰＰ−ＩＶによる切断に対する安定性を改善できるＮ末端修飾の例としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル基、フェニルアセチル基、ベンゾイル基、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル基、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２の付加が挙げられる。

野生型ＶＩＰ中のキモトリプシン切断部位は、アミノ酸１０と１１（チロシン及びトレオニン）の間、及びアミノ酸２２と２３（チロシン及びロイシン）の間に存在する。Ｔｙｒ（ＯＭｅ）でチロシンを置換することにより、１０−１１の部位における安定性を増加させることができる。ラクタム架橋（例えば位置２１及び２５でアミノ酸の側鎖を結合する）により、２２−２３の部位の裂開が保護されうる。

野生型ＶＩＰ中のトリプシン切断部位は、アミノ酸位置１２と１３の間に存在する。特定のアミノ酸置換（例えば位置１２におけるオルニチン）によって、この部位でのペプチド切断に対する感受性が減少することもある。

野生型ＶＩＰ、及び公知の多数のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストにおいては、塩基性アミノ酸である位置１４と１５の間、及び位置２０と２１の間に切断部位が存在する。本発明の選択的な環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、これらの部位が置換されているため、インビボでのタンパク質分解に対する安定性が改善されている。これらの部位の好ましい置換により、トリプシン様酵素（トリプシンを含む）によるペプチド切断に対する感受性が減少する。好適な例としては、位置１５のアミノイソ酪酸、及び位置２１のオルニチンによる置換により安定性が向上する。

切断部位はまた、野生型ＶＩＰのアミノ酸位置２５と２６の間にも存在する。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の、アミノ酸位置２７、２８及び２９を含む領域もまた酵素分解を受け易い。Ｃ末端延長部分の付加によって、ペプチドアゴニストが神経エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）に対してより安定になることもありえ、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性が向上することもありえる。この領域はまたトリプシン様の酵素による攻撃を受け易い。それが生じる場合には、ペプチドアゴニストは更なるカルボキシプチダーゼ活性によりそのＣ末端延長部分を喪失し、当該ペプチドが不活性な形態となりうる。この領域の裂開に対する耐性は、オルニチンで位置２７及び／又は２８のアミノ酸を置換することによって強化することができる。

選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々なペプチダーゼによる分解抵抗性を有するが、それ以外にも、本発明の選択的な環状ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストは、公知の幾つかのペプチドと比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性を有し、薬理効果が強化され、及び／又は安定性が向上したペプチドであるという側面を有する。

好ましくは、本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは２ｎＭ未満のＥＣ_５０値を示す。好ましくは、ＥＣ_５０値は１ｎＭ未満である。更に好ましくは、ＥＣ_５０値は０．５ｎＭ未満である。最も好ましくは、ＥＣ_５０値は０．１ｎＭ未満である。

好ましくは、本発明のアゴニストは、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１受容体の場合と比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する親和性が少なくとも５０倍高い選択性比率として表される。好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも１００倍高い。更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも２００倍高い。より更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも５００倍高い。より更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも１０００倍高い。

本発明で用いられる「選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」にはまた、本願明細書に記載の当該アゴニストの薬理学的に許容できる塩が包含される。本発明の選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは多くの酸性基、塩基性基及びそれらの両方の官能基を有するため、多くの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれとも反応して塩を形成する。酸性付加塩の形成に通常使用される酸としては、塩酸、臭化水素、ヨウ素化水素、硫酸、リン酸などの無機酸、並びにｐ−トルエンスルホン酸、メタン硫酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸が挙げられる。かかる塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、モノリン酸水素塩、リン酸二水素円、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸、フマル酸エステル、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、キシレンスルホン酸塩などが挙げられる。

塩基付加塩としては、無機塩基（例えばアンモニウム、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩など）に由来するものが挙げられる。本発明の塩の調製に有用なかかる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、好ましくは医薬組成物として製剤化される。標準的な製剤技術として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載の方法を採用してもよい。本発明に係る選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、頬側、局所、経口、経真皮、鼻腔内、肺内投与用に製剤化してもよく、又は非経口投与用に製剤化してもよい。

非経口投与としては、例えば筋肉内、静脈内、皮下、皮内、腹膜内投与などの全身投与が挙げられる。選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを、医薬組成物の一部として、薬理学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤との組み合わせで患者に投与し、ＮＩＤＤＭ又は以下に記載するような障害を治療できる。当該医薬組成物は溶液状であってもよく、又は、非経口投与する場合には、環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液、又は二価の金属陽イオン（例えば亜鉛）と錯体を形成した環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液としてもよい。適切な薬剤担体は、ペプチド又はペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含有してもよい。非経口投与用の適切な薬剤担体としては、例えば滅菌した水、生理的食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍＬでベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ハンクス溶液）、乳酸リンガー液などが挙げられる。適切な賦形剤の若干の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。

本発明の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、その血漿中濃度が長期間有効な濃度範囲内に維持されるように製剤化してもよい。ペプチド薬の有効な経口輸送を妨げる主な障害としては、酸及び酵素によるペプチドの分解による弱い生物学的利用能、上皮膜による弱い吸収、及び消化管の酸性ｐＨ環境への暴露後のペプチドの不溶性化が挙げられる。本発明に包含される当該ペプチドを経口輸送する様々なシステムが公知である。例えば、環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストをマイクロカプセル中に封入し、更に経口輸送することが可能である。例えば、環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、充填材として市販されている、生物学的適合性を有する、生物分解性ポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−ＣＯＯＨ及びオリーブ油から構成されるマイクロカプセルに封入できる（Ｊｏｓｅｐｈら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３：１３１９−１３２８（２０００）を参照）。他のタイプのマイクロカプセル技術はまた、ＡｌｋｅｒｍｅｓからＭｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）及びＰｒｏｌｅａｓｅ（登録商標）などの市販の生物分解性ポリマーを利用して実施できる。Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）ポリマーは、いずれかのラクチド異性体から調製できる。ラクチド：グリコリド比率は０：１００〜１００：０の間で変化させることができ、幅広い範囲のポリマー特性とすることができる。これにより、数週から数か月にわたる融食作用時間を有する輸送システム及びインプラント可能手段の設計が可能となる。またＥｍｉｓｐｈｅｒｅが、ペプチド及びタンパク質の経口輸送技術に関する記事を多数報告している。例えば、Ｌｅｏｎｅ−ｂａｙらの国際公開第９５／２８８３８号が挙げられ、そこでは修飾アミノ酸を含有する特異的な担体により吸収を促進する技術に関して開示している。

本願明細書に記載の環状ＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、多種の疾患及び症状に罹患する患者の治療に使用できる。本発明に包含されるアゴニストは、ＶＰＡＣ２受容体と呼ばれる受容体において、それらの生物学的効果を及ぼす。ゆえに、ＶＰＡＣ２受容体刺激に、又はＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの投与に有利に反応する疾患及び／又は症状の患者は、本発明の環状ＶＰＡＣ２アゴニストにより治療されることができる。これらの患者は、ＶＰＡＣ２アゴニストによる処理を必要とする、又はＶＰＡＣ２受容体刺激を必要とすると称される。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは糖尿病（１型及び２型糖尿病（インスリン非依存性真性糖尿病又はＮＩＤＤＭ）を含む）の治療に使用できる。例えばＮＩＤＤＭが進行する危険性を有する患者に対して、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストを用いて予防的処置を行ってもよい。かかる処置により、糖尿病及び糖尿病の合併症の発症を遅延させることも可能となる。本発明のアゴニストで治療できるその他の患者としては、耐糖能異常（ＩＧＴ）（Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５，１９９９）、又は空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：７９６，１９９１）の患者、体重が身長及び体格に関して正常体重約２５％重い患者、インスリン非依存性糖尿病に罹患する１人以上の親を有する患者、妊娠糖尿病に罹患する患者、及び内因性インスリン分泌の減少から生じるような代謝障害を有する患者などが挙げられる。選択的な環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを用いて、耐糖能異常を有する患者の症状のＮＩＤＤＭへの発展の防止、膵臓β−細胞の悪化の防止、β−細胞増殖の誘導、β−細胞機能の改善、休止中のβ−細胞の活性化、β−細胞への細胞分化、β−細胞複製の刺激及びβ−細胞アポトーシスの阻害などが可能となる。本発明の方法において、本発明のアゴニストを使用して治療若しくは予防できる疾患及び症状としては：若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４３：４０，１９９４）、成人の潜在性自己免疫疾患（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｄ．１１：２９９，１９９４）、妊娠糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０：１９７，１９９１）、代謝性エックス症候群、異脂肪血症、高血糖、高インスリン血症、高トリグリセリド血症及びインスリン抵抗などが挙げられる。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、糖尿病の第２の原因の治療にも使用できる（Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２（Ｓｕｐｐ．ｌ）：Ｓ５，１９９９）。かかる第２の原因としては、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、クロム親和性細胞腫及び薬物性糖尿病が挙げられる。糖尿病を誘導しうる薬剤としては、限定されないがピリミニル、ニコチン酸、グルココルチコイド、フェニトイン、甲状腺ホルモン、β−アドレナリン作動薬、α−インターフェロン及びＨＩＶ感染治療薬などが挙げられる。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、食物摂取の抑制及び肥満の治療に効果的である。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、アテローム硬化型疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ濃度、高血圧、原発性肺高血圧症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病及び冠状動脈疾患を含む）、脳血管疾患及び末梢性血管疾患などの障害の予防若しくは治療、並びに狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌及び過形成の治療、男性及び女性の生殖障害、性的障害、潰瘍、睡眠障害、脂質及び炭水化物の代謝障害、体内時計の機能不全、成長障害、エネルギーホメオスタシスの障害、自己免疫疾患などの免疫疾患（例えば全身エリテマトーデス）、並びに急性及び慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び感染性ショックなどの治療に効果的である。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、例えば脂質蓄積細胞への細胞分化、インスリン感受性及び血糖値の調節に関連する生理的障害の治療に有用である。それらは例えば膵臓β細胞の不全、インスリン分泌腫瘍の形成及び／又は自己免疫低血糖症（インスリンに対する自己抗体、インスリン受容体に対する自己抗体若しくは膵臓β細胞を活性化する自己抗体による）、アテローム動脈硬化性斑、炎症性反応、発癌、過形成、脂肪細胞遺伝子発現、脂肪細胞分化、膵臓β細胞質量の減少、インスリン分泌、インスリンに対する組織感度、脂肪肉腫細胞増殖、多嚢胞性卵巣の疾患、慢性無排卵、高アンドロゲン症、プロゲステロン産生、ステロイド合成、細胞内の酸化還元ポテンシャル及び酸化ストレスの形成をもたらすマクロファージの分化、ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）産生、γグルタミルペプチド転移酵素、カタラーゼ、血漿中トリグリセリド、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール濃度の上昇などが関与する。

更に、本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは喘息の治療（Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ３７：５７−６６（１９９５）、米国特許第５６７７４１９号、ポリペプチドＲ３ＰＯがモルモット気管平滑筋を弛緩させる活性を有することを示す）、低血圧誘導（ＶＩＰは喘息の患者における低血圧、心搏急速及びほてりを誘導する（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ７：２７９−２８０（１９８６）、Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ ２：１２２５−１２２７（１９８３））、男性の生殖器障害の治療（Ｓｉｏｗら、Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．４３、（１）：６７−７１、１９９９、抗アポトーシス／神経保護薬としての使用（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２０７−１２（１９９８））、虚血の間の心臓保護（Ｋａｌｆｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１２６８（２）：９５２−８（１９９４）、Ｄａｓ，ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２９７−３０８（１９９８））、体内時計及びそれに関連する障害の調節（Ｈａｍａｒら、Ｃｅｌｌ １０９：４９７−５０８（２００２）、Ｓｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１５７５−８０，（２０００））、及び抗潰瘍薬としての使用（Ｔｕｎｃｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：３０９−２２，（１９９８））に供することができる。

選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、ＶＰＡＣ２受容体刺激を必要とする患者に投与したとき、許容できない副作用を引き起こすことなく、所望の治療的及び／又は予防的効果をもたらす量のことを指す。「所望の治療効果」とは、以下のうちの１つ以上のものを指す：１）疾患又は症状に関連する徴候の改善、２）疾患又は症状に関連する徴候の発症の遅延、３）治療を行わない場合と比較した寿命の長期化、及び４）治療を行わない場合と比較した生活の質の改善。例えば、ＮＩＤＤＭの治療用の環状ＶＰＡＣ２アゴニストの「有効量」とは、治療を行わない場合よりも血液グルコース濃度がより顕著に制御される量のことを指し、それにより、結果的に糖尿病による合併症（例えば網膜症、神経障害又は腎臓病）の発症が遅延される。ＮＩＤＤＭの予防用の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、処置を行わない場合と比較して、抗血糖剤（例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジン）による治療が必要となる高血糖の発症を遅延させる量のことを指す。

患者に投与される選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」はまた、疾患のタイプ及び重症度、並びに患者の特徴（例えば健康状態、年齢、性別、体重及び薬剤に対する許容度）に依存する。患者の血液グルコースの正常化に効果的な選択的環状ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストの投与量は、限定されないが、患者の性別、体重及び年齢、血糖値の制御不能の重症度、投与経路及び生物学的利用能、ペプチドの薬物動態プロフィール、薬効及び製剤化のタイプなどの多くの要因に依存する。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの典型的な投与量範囲は、約１μｇ／日〜約５０００μｇ／日である。好ましくは、投与量は約１μｇ／日〜約２５００μｇ／日、好ましくは約１μｇ／日〜約１０００μｇ／日である。更に好ましくは、投与量は約５μｇ／日〜約１００μｇ／日である。更に好ましくは、投与量は約１０μｇ／日〜約５０μｇ／日である。最も好ましくは、投与量は約２０μｇ／日である。

「患者」とは哺乳類であり、好ましくはヒトであるが、それ以外の動物、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。

本発明の選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、固相ペプチド合成などの標準的な方法を用いて調製できる。例えば、ペプチド合成装置としてＲａｉｎｉｎ−ＰＴＩ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （トゥーソン，ＡＺ）などが市販されている。固相合成用の試薬は、例えばＧｌｙｃｏｐｅｐ社（シカゴ、ＩＬ）から市販されている。固相ペプチド合成装置を製造業者の指示に従って使用し、干渉基を保護し、反応させるアミノ酸を保護し、カップリングさせ、デカップリングさせ、未反応アミノ酸をキャッピングすることができる。

典型的には、α−Ｎ保護されたアミノ酸と、樹脂上で伸長するペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸を、室温で、不活性溶媒（ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン又はメチレンクロライド）中で、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドや１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下でカップリングさせる。α−Ｎ保護基を、トリフルオロ酢酸又はピペリジンなどの試薬を使用して、得られるペプチド樹脂から除去し、更にペプチド鎖に付加させる次の所望のＮ保護アミノ酸を用いてカップリング反応を反復する。適切なアミン保護基は公知であり、例えばＧｒｅｅｎ及びＷｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１に記載されている。例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）基及びフルオロエニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基が挙げられる。

選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、適切な側鎖保護基を有するｔ−ブトキシカルボニル−又はフルオロエニルメトキシカルボニル−α−アミノ酸を使用する標準的な自動固相合成プロトコルを使用して合成できる。合成終了後、標準的なフッ化水素又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた側鎖の同時脱保護方法を用いて固相担体からペプチドを分離させる。更に粗ペプチドを、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムによる逆相クロマトグラフィを使用して、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配により精製する。アセトニトリルを除去するため、０．１％のＴＦＡ、アセトニトリル及び水を含有する溶液からペプチドを凍結乾燥させる。分析用逆相クロマトグラフィにより純度を検定できる。質量分析によりペプチドのアイデンティティを解析できる。中性ｐＨの水性バッファ中にペプチドを溶解させることができる。

また本発明のペプチドアゴニストは、真核生物及び原核細胞宿主を使用し、公知の組換え方法により調製してもよい。

ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの環化は溶液中で実施してもよく、又は固体支持体上で実施してもよい。固体支持体上での環化は、ペプチドの固相合成の直後に実施してもよい。この操作では、環化の際に共有結合するアミノ酸の選択的若しくは直交的保護が必要となる。

本発明の様々な好適な特徴及び実施形態を、以下の非限定的な実施例を参照しながら説明する。

＜実施例１＞：固相化ｔ−Ｂｏｃによる、選択的環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの調製
約０．５〜０．６ｇ（０．３８〜０．４５ｍｍｏｌｅ）のＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂を、標準的な６０ｍＬ反応容器中に添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を用いてダブルカップリングを実施した。以下の側鎖被保護アミノ酸（Ｂｏｃアミノ酸の２ｍｍｏｌｅカートリッジ）をＭｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（フィッシャーズ、ＩＮ）から購入し、合成に用いた。

Ａｒｇ−トシル（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）、Ａｓｐ−９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、Ｃｙｓ−ｐ−メチルベンジル（ｐ−ＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）、Ｈｉｓ−ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｌｙｓ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｏｒｎ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）、セリン−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２Ｂｒ−Ｚ）、Ｂｏｃ−セリン（ＯＢｚｌ）ＰＡＭ樹脂及びＭＢＨＡ樹脂。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、１．０Ｍのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／ＮＭＰ、及び１．０Ｍのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／ＮＭＰを、ＰＥ−アプライドバイオシステム（フォスターシティ、ＣＡ）から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）をＭａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）はＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。

対称性の無水物若しくはＨＯＢｔエステルを使用して、標準的なダブルカップリングを実施し、両方ともＤＣＣを使用して形成させた。合成終了後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を除去し、ペプチジル樹脂を、ＤＭＦ中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて、有機酸（例えばヘキサン酸）でキャッピングした。樹脂を更に、２０分間、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理した。Ｆｍｏｃ及びＦｍ保護基を選択的に除去し、ＤＩＥＡの存在下で、ＢＯＰでアスパラギン酸のカルボキシル基を活性化することにより環化を実施した。２４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。ＤＣＭで洗浄した後、樹脂をＴＥＦＬＯＮ製の反応容器へ移し、真空乾燥させた。

反応容器をＨＦ（フッ化水素）装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に取り付け、開裂反応を実施させた。ｇ／樹脂当たり１ｍＬのｍ−クレゾールを添加し、１０ｍＬのＨＦ（ＡＧＡ社製、インディアナポリス、ＩＮ）を予め冷却された容器中で凝縮させた。メチオニンが存在する場合は、樹脂ｇ当たり１ｍＬのＤＭＳを添加した。アイスバス中で１時間反応液を撹拌した。真空内でＨＦを除去した。エチルエーテル中に残余物を懸濁させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥又は逆相カラム上へ直接ロードした。

バッファＡ（０．１％のＴＦＡ／水）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（水）で、１０ｍＬ／分で１２０分、２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。

例えば、オルニチン残基とグルタミン酸残基を連結するラクタム架橋を有する環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｆｍｏｃ及びＦｍで、これらの残基の側鎖をそれぞれ選択的に保護することにより調製される。合成に使用する他の全てのアミノ酸は、標準的なベンジル側鎖で保護されているＢｏｃ−アミノ酸である。環化はペプチドの固相合成の直後に実施してもよい。

＜実施例２＞：固相ＦＭｏｃを用いた、選択的ＶＰＡＣ２受容体環状ペプチドアゴニストの調製
約１１４ｍｇ（５０ｍｍｏｌｅ）のＦＭＯＣＳｅｒ（ｔＢｕ）ＷＡＮＧ樹脂（ＧｌｙｃｏＰｅｐ社製、シカゴ、ＩＬ）を各反応容器に添加した。Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて合成を実施した。７５ｍｇ（５０μｍｏｌｅ）のＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ．テュービンゲン、ドイツ）を使用してＣ末端アミドを有するアナログを調製した。

以下のＦｍｏｃアミノ酸は、ＧｌｙｃｏＰｅｐ社（シカゴ、ＩＬ）及びＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（ラホーヤ、ＣＡ）から購入した：Ａｒｇ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ−β−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ａｓｐ−β−アリルエステル（アリル）、Ｇｌｕ−δ−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ−δ−アリルエステル（アリル）、Ｇｌｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ−アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、Ｏｒｎ−アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、セリン−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）。

溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）は、Ｍａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。

ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びピペリジン（Ｐｉｐ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）は、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。

全てのアミノ酸を、ＤＭＦで０．３Ｍとなるように溶解させた。２０％のＰｉｐ／ＤＭＦを使用して２０分間脱保護した後、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで活性化させてカップリングを３時間実施した。脱保護及びカップリングの後、各樹脂をＤＭＦで洗浄した。最後のカップリング及び脱保護の後、ペプチジル樹脂をＤＣＭで洗浄し、反応容器中で真空乾燥させた。Ｎ末端アシル化のため、４倍過剰の対応する酸の対称無水物をペプチド樹脂に添加した。ＤＣＭ中でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を活性化させ、対称無水物を調製した。４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。グループを保護しているＡｌｏｃ及びＡｌｌｙｌ基を選択的に除去し、ＤＩＥＡの存在下で、ＢＯＰでアスパラギン酸のカルボキシル基を活性化することにより環化を実施した。ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄した後、真空乾燥させた。

開裂反応液を、１０ｍＬのＴＦＡ中に０．２ｍＬのチオアニソール、０．２ｍＬのメタノール、０．４ｍＬのトリイソプロピルシランを含有する開裂カクテル（全てＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミルウォーキー、ＷＩから購入）と２時間混合させた。Ｃｙｓが配列中に存在する場合、２％のエタンジチオールを添加した。ＴＦＡ濾過液を４０ｍＬのエチルエーテルに添加した。沈殿物を２０００回転／分で２分遠心分離した。上澄みをデカントした。ペレットを４０ｍＬのエーテル中に再懸濁し、再度遠心分離し、再度デカントし、窒素下更に真空下において、乾燥させた。

各生成物の０．３〜０．６ｍｇを、１ｍＬ ０．１％のＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解させ、２０μＬをＨＰＬＣ分析に供した［０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８カラム、１ｍＬ／分、４５℃、２１４ｎＭ（０．２Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、グラジェント＝５０％のＢ〜９０％のＢ、３０分］。

バッファＡ（水の０．１％のＴＦＡ）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（水）で、１０ｍＬ／分で１２０分、２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。

例えば、オルニチン残基及びグルタミン酸残基を連結するラクタム架橋を有する環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ａｌｏｃ及びＡｌｌｙｌで、それぞれ、これらの残基の側鎖を選択的に保護することにより調製される。合成に使用する他の全てのアミノ酸は、標準的なｔ−ブチルで側鎖を保護されているＦｍｏｃ−アミノ酸である。環化は、ペプチドの固相合成の直後に固体支持体上で実施できる。

＜実施例３＞ヒトＶＰＡＣ２受容体のインビトロにおける効果：
アルファスクリーン：
細胞（安定にヒトのＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞）を、ＰＢＳで１回、培養フラスコで洗浄した。次に酵素フリーの分散バッファを用いて細胞をリンスした。分散させた細胞を回収した。次に細胞をスピンダウンし、刺激バッファで洗浄した。データポイントごとに、刺激バッファ中に懸濁させた５０，０００細胞を用いた。このバッファに、Ａｌｐｈａスクリーンアクセプタビーズを、当該刺激と共に添加した。この混合物を６０分間インキュベートした。溶解バッファ及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズを添加し、６０〜１２０分間インキュベートした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのシグナル（細胞内ｃＡＭＰ濃度を表す）を、適切な計測装置（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ）で測定した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのドナー及びアクセプタビーズを扱う処理は減光下で実施した。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。試験したペプチド濃度は、１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００１及び０．００００１ｎＭである。

ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ：
９６ウェルマイクロタイタープレート中で安定にヒトＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞系を、アッセイ前日に５０，０００細胞／ウェルで播種した。２００μＬの培地中で２４時間細胞をインキュベートした。実験日に培地を除去した。更に細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の指示に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。試験したペプチド濃度は、１０００、３００、１００、１０、１、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１及び０ｎＭである。

＜実施例４＞：選択性
結合試験：
安定なＶＰＡＣ２細胞系（実施例３を参照）、又はヒトＶＰＡＣ１又はＰＡＣ１でトランジェントにトランスフェクションした細胞から調製した細胞膜を用いた。フィルタ結合試験は、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２及びＰＡＣ１に関して、トレーサーとして、１２５Ｉ標識したＰＡＣＡＰ−２７を使用して実施した。

このアッセイに用いる溶液及び装置は以下の通りである。
前浸漬液：０．５％ポリエチレンアミン（／蒸留水）、
フィルタープレートのフラッシュ用バッファ：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、
ブロッキングバッファ：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．２％のプロテアーゼフリーのＢＳＡ、
アッセイバッファ：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のプロテアーゼフリーＢＳＡ、
希釈及び分析用プレート：ＰＳ−マイクロプレート、Ｕ型、
フィルタプレート：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＦＢ Ｏｐａｑｕｅ Ｐｌａｔｅ、１．０μＭ タイプＢグラスファイバーフィルター。

フィルタプレートの調製の際、減圧濾過によって事前に浸漬液を吸引除去した。２００μＬのフラッシュバッファを用いてプレートを２度洗浄した。２００μＬのブロッキングバッファをフィルタプレートに添加した。次にフィルタプレートを、室温で１時間、２００μＬの事前浸漬溶液でインキュベートした。

アッセイプレートを２５μＬのアッセイバッファ、アッセイバッファの中に懸濁した２５μＬ（２．５μｇ）の膜、アッセイバッファ中のアゴニスト２５μＬ、及びアッセイバッファ中のトレーサー（約４００００ｃｐｍ）２５μＬで満たした。満たされたプレートを振とうしながら１時間インキュベートした。

アッセイプレートからフィルタプレートへ移動させた。ブロッキングバッファを減圧濾過によって吸引除去し、フラッシュバッファで２回洗浄した。アッセイプレートからフィルタプレートへ９０μＬを移した。アッセイプレートから移した９０μＬを吸引し、２００μＬのフラッシュバッファで３回洗浄した。プラスチック製の支持体を除去した。６０℃で１時間乾燥させた。３０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを添加し、カウントした。

＜実施例５＞：ラットＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体におけるインビトロ効果：
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ：
市販のトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して、ラットＶＰＡＣ１又はＶＰＡＣ２受容体のＤＮＡで、ＣＨＯ−ＰＯ細胞をトランジェントにトランスフェクションした。９６ウェルプレートに１０，０００／ウェルの密度で細胞を播種し、２００ｍＬの培地で３日間インキュベートし、３日目にアッセイを実施した。

実験日に培地を除去した。更に細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の指示に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ_５０は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線により定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。試験したペプチド濃度は、１０００、３００、１００、１０、１、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１及び０ｎＭである。

＜実施例６＞：インビボアッセイ：
静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）：
標準的なウィスターラットを一晩絶食させ、実験前に麻酔した。血液サンプリング用カテーテルをラットに挿入した。通常グルコース投与の２４時間前にアゴニストを皮下投与した。血液サンプルを頸動脈から採取した。血液サンプルは、アゴニスト投与後のグルコース注入の直前に採血した。第一の採血の後、グルコース混合液を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。体重１ｋｇ当たりグルコース＋アゴニストを有する担体を合計１．５ｍＬ注入した（０．５ｇ／ｋｇ体重によるグルコース投与となる）。望ましい投与量を決定するため、ペプチド濃度をμｇ／ｋｇ単位で変化させた。グルコース投与の２、４、６及び１０分後に血液サンプルを採血した。アゴニストを含まない、グルコースのみを含む同じ担体を投与する群を対照動物群とした。幾つかの場合、グルコース投与後２０及び３０分における血液サンプルを採血した。アプロチニンを血液サンプルに添加（２５０〜５００ｋＩＵ／ｍＬ血液）した。次に標準的な方法を使用して血漿中のグルコース及びインスリンレベルを分析した。

アッセイでは、ＰＢＳ中の調製及び補正されたペプチドストックを使用した。通常、このストックは１００μＭストックとして前希釈する。しかしながら、約１ｍｇ／ｍＬでアゴニストを含有する、更に濃縮されたストックを用いた。それぞれの濃度を常時測定した。最大応答の変動性は、担体投与量の変動性に大部分起因する。プロトコルの詳細を以下に示す。

＜実施例７＞ラット血清における安定性試験：
ラット血清中におけるＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストペプチドの安定性を解析するため、ＣＨＯ−ＶＰＡＣ２細胞クローン＃６（９６ウェルプレート／５０，０００細胞／ウェル、１日インキュベート）、ＰＢＳ １×（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μＭの分析用ストック液（上記）及び安楽死させた通常のウィスターラットから採取したラット血清、アプロチニン及びＤｉｓｃｏｖｅＲｘアッセイキットを準備した。ラット血清を使用前まで４℃で保存し、２週以内に用いた。

０日目に、９０μＬのラット血清及び１０μＬのペプチドストック液を混合し、１０μＭペプチド／ラット血清の１００μＬアリコートを２本調製した。２５０ｋＩＵ アプロチニン／ｍＬを、これらのアリコートのうちの１つに添加した。アプロチニンを含有するアリコートを４℃で保存した。アプロチニンを含有しないアリコートを３７℃で保存した。アリコートを２４時間インキュベートした。

１日目に、０日目に調製したアリコートの２４時間のインキュベーション後、インキュベートバッファ（ＰＢＳ＋１．３ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのグルコース及び０．５ｍＭのＩＢＭＸを含有）を調製した。４℃及び３７℃アリコートにおいて、ペプチドごとに、血清中のペプチドを１１回の３倍連続希釈してプレートを作製した。４０００ｎＭを最大濃度とした。細胞を含むプレートをインキュベートバッファで２回洗浄し、細胞をウェルごとに１５分間、５０μＬのインキュベート培地でインキュベートした。第一のスクリーニングにより示された最大濃度を用いて、試験されるペプチドごとの４℃及び３７℃アリコートにおける、ペプチドの１１回の３倍連続希釈により調製したプレートの細胞へ、ウェル当たり５０μＬで溶液を移した（２回試験を実施）。この処理によりペプチド濃度が２倍に希釈される。室温で３０分間細胞をインキュベートした。上澄みを除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ抗体／抽出バッファを４０μＬ／ウェルで添加した。シェーカ（３００回転／分）で１時間、細胞をインキュベートした。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘキットを用いて通常の操作を行った。ｃＡＭＰスタンダードをカラム１２に添加した。ｃＡＭＰアッセイデータからＥＣ_５０値を測定した。残留している活性ペプチドの量を、条件ごとに式ＥＣ_{５０，４℃}／ＥＣ_{５０，３７℃}により推定した。

当業者であれば、本発明の範囲内における本発明の様々な修飾を容易に想起できるであろう。

Claims (8)

1. 以下の配列：
   

   

   で示されるアミノ酸配列からなる環状ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニスト。
2. 請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト並びに１以上の薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び賦形剤を含む、医薬組成物。
3. 薬剤としての使用のための請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
4. 非インスリン依存性糖尿病若しくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は食物摂取の抑制における使用のための、請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
5. 非インスリン依存性糖尿病若しくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は食物摂取の抑制のための薬剤の製造のための、請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用。
6. 有効量の請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを投与することを含む、必要とする患者の非インスリン依存性糖尿病若しくはインスリン依存性糖尿病を治療し、又は食物摂取を抑制する方法。
7. 非インスリン依存性糖尿病若しくはインスリン依存性糖尿病の治療、又は食物摂取の抑制のための、請求項１記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを含有する医薬組成物。
8. 実施例に関連して実質的に明細書に記載の環状ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。