JP2009528255A - 反復配列タンパク質とフィロケイ酸塩粘土とのナノコンポジットおよびその調製 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年8月22日に出願された米国特許仮出願第60/710,308号に対する優先権を主張するものである。
本発明は、反復配列タンパク質ポリマーと層状ケイ酸塩との組み合わせから生成されるナノコンポジットに関するものである。本発明はまた、こうしたナノコンポジット材料を合成する方法を提供するものである。
本発明においては、以下の定義を適用するものとする。
反復配列タンパク質ポリマー(RSPP)は、少なくとも1個の明確なドメインが配列全体を通じて2回以上の繰り返されるのであれば、どのような変性ポリペプチドであってもよい。
Ty[(An)x(B)b(A’n’)x’(B’)b’(A’’n’’)x’’]iT’y’
式中:TおよびT’はそれぞれ、約1〜約100個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列T’は、アミノ酸配列Tと同一または異なり;yおよびy’はそれぞれ、0〜1の整数であり、整数y’は、整数yと同一または異なり;A、A’およびA’’はそれぞれ、個々に約3〜約30個のアミノ酸を含む繰り返しアミノ酸配列単位であり、アミノ酸配列A’およびアミノ酸配列A’’は、アミノ酸配列Aと同一または異なり;n、n’およびn’’はそれぞれ、少なくとも2および250以下の整数であり;x、x’およびx’’はそれぞれ、0または少なくとも1の整数であり、整数はそれぞれ異なり、個々のアミノ酸配列繰り返し単位A、A’およびA’’においてアミノ酸が少なくとも30個になるように規定し、整数x’および整数x’’は、整数xと同一または異なり、x、x’およびx’’は、すべてが同時にゼロにはなり得ず;BおよびB’はそれぞれ、約4〜約50個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ配列B’は、アミノ酸配列Bと同一または異なり;bおよびb’はそれぞれ、0〜3の整数であり、整数b’は、整数bと同一または異なり;およびiは、1〜500の整数である。
本発明に好適な層状ケイ酸塩材料は、フィロケイ酸塩であり、しばしばスメクタイト粘土と呼ばれる。フィロケイ酸塩には、複層構造があり、層の厚さは、約3オングストロームから約10オングストロームである。二次元層はそれぞれ、八面体アルミナシートの両側に配置された2枚のシリカ四面体シートからなる。この複層は、陽イオンによって分離されている。多くのフィロケイ酸塩には、100g当たり20〜250mEqの陽イオン交換容量がある。
米国特許出願公開第2004/0180027A1号に記載されているように、組換え大腸菌株を発酵させ、単分散のSELP47Kを含む細胞ペーストを調製することで、単分散の絹−エラスチンタンパク質ポリマーであるSELP47Kを製造した。この細胞ペーストを氷冷水に浸し、ホモジナイズして細胞抽出物を製造する。この細胞抽出物とポリエチレンイミンおよび濾過助剤とを混合し、7℃で1時間静置する。ポリエチレンイミンを用いて、細胞片と相当量の大腸菌タンパク質とを沈殿させる。次いで、このSELP47K含有反応混合物を、ロータリードラムバキュームフィルター(Rotary Drum Vacuum Filter)(RVDF)を用いて濾過する。次いで、SELP47Kが沈殿する飽和度25%まで、濾過したSELP47K溶液と、硫酸アンモニウムとを混合する。沈殿させたSELP47Kおよび母液と濾過助剤とを混合し、RVDFを用いて再び濾過する。SELP47Kおよび濾過助剤を含むRVDFケークと冷水とを混合し、SELP47Kを溶解させる。この沈殿および可溶化ステップを繰り返し、SELP47Kの純度プロファイルを高める。次いで、SELP溶液の導電率が50μS/cm2になるまで、精製した単分散SELP47Kを水交換する。次いで、この単分散SELP溶液を10%wt/volまで濃縮し、ここで、凍結乾燥して、粉になった単分散SELP47Kタンパク質ポリマーを得る。適合性試験で必要になるまで、この材料を−70℃で保管した。
サクシニル化SELPを、室温で無水コハク酸(152mg)により処理した25%水性アセトニトリル(10mL)にSELP(0.7g)を溶かした溶液から調製した。反応の過程でpHを7〜8に維持するため、水酸化ナトリウム溶液(3M)を滴加した。3時間後、アリコートがニンヒドリンに対して非反応性であることが判明し、有効なアミノ官能基の誘導体化が示された。このサンプルを水に対して一晩透析(3×2L)し、ここにおいて、凍結乾燥して海綿状の白色の固体(0.62g)を得た。
粉状のクロイサイト(登録商標)(Cloisite(登録商標))Na+モンモリロナイト(MMT)フィロケイ酸塩(サザンクレイ(Southern Clay)、陽イオン交換容量[CEC]92meq/100g)を加え、水を脱イオン化し、0.1〜1.0wt%の懸濁液を得た。次いで、この水/MMT懸濁液を、プローブソニケーターを用いて約10分間超音波処理した。ゼータ電位を測定するために、粉状のSELPをMMT懸濁液にゆっくりと加えた。薄膜の調製の場合、SELPを脱イオン水に溶解し、5wt%の溶液を得てから、MMT懸濁液に加えた。次いで、この混合物をポリスチレン秤量皿にキャストして、数日間乾燥させた。その結果得られた膜は、フリースタンディングで光学的に透明であり、直径は約5cm、各膜における固形物の総量は、約100mgであった。ナノコンポジット材料におけるMMTの最終量は、乾燥重量ベースで0%、2%、4%、6%、8%および10%であった。
ゼータ電位
ナノコンポジットの液体溶媒混合物のゼータ電位の測定を、ZetaPALS装置(ブルックヘブンインスツルメンツ社(Brookhaven Instruments Corp.)、ニューヨーク)により室温で実施した。各MMT濃度での平均値を、10回の測定から得た。水懸濁液中で0.01wt%のMMTと0.1wt%のMMTとを一晩撹拌し、次いで、数日間沈降させた。次いで、ゼータ電位測定対象のサンプルを、沈降懸濁液の上清から取り出した。SELPまたはサクシニル化したSELP粉末を懸濁液に種々の量で加えた。ゼータ電位の結果は概して、相対濃度が同じであれば、0.01wt%懸濁液と0.1wt%懸濁液との両方で類似していた。
X線小角散乱プロファイルを、真空ビームパスを備えた、カメラ長1870mm、x線波長0.1366nmの国立シンクロトロン光源(National Synchrotron Light Source)の装置ビームラインX27Cと、Mar−CCD(電荷結合素子)大面積検出器(マーUSA(Mar USA)、イリノイ州エバンストン)とで収集した。広角散乱を、Rigaku(商標)の回転陽極を50kVで作動させて実施した。同装置は、スタットン(Statton(商標))カメラ(カメラ長73mm)を備え、イメージングプレートが真空下で支えられ、x線波長は0.15418nmであった。二次元パターンについては、Fit2Dソフトウェア(A.ハマースレイ(A.Hammersley)、欧州シンクロトロン放射光施設(European Synchrotron Radiation Facility))を用いて解析した。
透過電子顕微鏡法を、フィリップス(商標)(Philips(商標))CM200−FEG装置200kvで作動させて実施した。膜を断面寸法約25mm2に切り、Spurr(エレクトロンマイクロスコピーサイエンス(Electron Microscopy Sciences)、ペンシルベニア州ハットフィールド(Hatfield))エポキシに包埋し、室温で一晩硬化させた。ダイヤモンドナイフを備えたRMC PowerTome(商標)で室温にて、横断面に顕微鏡切片作成法を実施した。切片の厚さは、100〜150nmであった。
引っ張り強度試験を行うために、膜を約5×35mmの細片に切った。サンプル濃度ごとに5回の試験を行った。歪み0.25%での応力歪み曲線の傾きを用いて、弾性率を計算した。また、破断時伸び率、すなわち破断歪みを、パーセント値として測定した。
熱機械解析では、熱膨張係数(CTE)について、一定応力対温度曲線におけるサンプルの長さを、サンプルの元の長さで除した商の傾きとして測定した。この傾きは、ゴム状領域(>200℃)において温度範囲2℃にわたり測定したものである。
X線解析
図1bは、小角および広角領域における散乱曲線を示す。MMT粉末対照物に見られるような1.2nmに近い層間隔は存在しなかった。原子間(シート内)のMMT間隔に起因するピークおよびSELPの幅の広いピークについては、1nm−1を超える散乱ベクター(q)値として確認することができない。小角範囲(q<1nm−1)では、散乱プロファイルが非常に一様であり、こうしたより長い尺度でのピークに関する証拠は確認されない。
図2は、SELPナノコンポジットサンプルにおいて、横断面の厚さ150nmの2%、4%および8%MMTのTEM顕微鏡写真を示す。高倍率顕微鏡写真(2b、d、f)では、SELPマトリックスにおいてMMTが十分に分散しており、個々の厚さが1nmのMMTシートを確認することができる。また、MMTの密度も、数百ミクロンの長さに沿って上から下まで膜全体に極めて均一であるように見える(図2a、c、e)。
膜引張試験では、2GPaのSELP単独対照膜の弾性率(図3a)と50Mpaを超える引っ張り強度(データなし)とが示された。MMT濃度が上昇すると、添加量4〜6%まで弾性率が3GPa程度へと上昇した。弾性率は、MMT添加量が4〜6%を上回ると低下した。4%MMTでは、膜の弾性率は上昇したものの、膜は脆化し、破断時伸び率、すなわち破断歪みは、0%MMTの0.044(4.4%)から、4%MMTでは0.012(1.2%)に低下した。
示差走査熱量測定(DSC)によれば、MMTを加えてもSELPガラス転移に大きな変化はなかった。Tgは、MMTの量に関わりなく180℃近くにとどまり、この値は、絹とエラスチンとの乾燥膜およびファイバーから測定したTgと同様の水準である。
熱機械解析(TMA)を用いて、ゴム状領域(>200℃)の熱膨張係数(CTE)を判定した。CTEは、MMT量が増加すると低下し、SELP単独の対照物では94×10−3℃−1であったが、8%MMTを添加すると49×10−3℃−1にまで低下した(図3b)。DSCでは、Tg変化についての証拠は確認されなかったが、ガラス状領域とゴム状領域とにおけるサンプル長対温度曲線の傾きの交差から測定すると、サンプルがガラス挙動からゴム挙動へ移行する温度は、MMT濃度の上昇に伴い大きく上昇することが確認された。この温度は、SELPでは193℃であったが、10%MMT/SELPサンプルでは213℃に上昇した。
図4は、SELP/MMTの種々の重量比におけるゼータ電位のプロットを示す。純粋なMMT懸濁液とSELP溶液とのゼータ電位をそれぞれ、SELP/MMTの相対濃度0.0001と10000とにおける対数線形プロットにプロットしている。水に加えた濃度0.1wt%のナトリウムMMTのゼータ電位は、−42mV(サザン(Southern))(商標)クレイNa+、92meq/100g)である。光散乱から測定した大きさの対数正規分布の中央値で見たMMTシートの大きさは、90nmであった。SELPをより高い濃度で懸濁液に加えても、SELP/MMTの重量比が約1になるまで、MMTシートの有効径および表面電荷は、ほとんど変わりがない。表面電荷の大きさは、SELPをMMTに吸収させると小さくなり、ゼータ電位はゼロに向かい、次いで、SELP/MMTの重量比8:1で中性になる。この系のゼータ電位は、タンパク質の正電荷全体が小さい(886個の全残基のうち正電荷を帯びたリジンはわずか13個)ため、SELPを継続的加えても正電荷領域にはならない。SELP溶液(0.5〜1wt%)のゼータ電位を測定すると、+3mVであった。この剥離型複合材料のSELP/MMT重量比は、10:1〜50:1まで幅があるが、図4において、MMT電荷は、こうした比率で吸収タンパク質によって中性になることが確認できる。
Claims (24)
- 少なくとも1種類の反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とを含む、ナノコンポジット。
- 前記反復配列タンパク質ポリマーの式が:
Ty[(An)x(B)b(A’n’)x’(B’)b’(A’’n’’)x’’]iT’y’を含み、
式中:
TおよびT’はそれぞれ、約1〜約100個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列T’は、前記アミノ酸配列Tと同一または異なり;
yおよびy’はそれぞれ、0〜1の整数であり、前記整数y’は、前記整数yと同一または異なり;
A、A’およびA’’はそれぞれ、個々に約3〜約30個のアミノ酸を含む繰り返し配列単位であり、前記アミノ酸配列A’および前記アミノ酸配列A’’は、前記アミノ酸配列Aと同一または異なり;
n、n’およびn’’は、少なくとも2であり、なおかつ250以下の整数であり;
x、x’およびx’’はそれぞれ、0または少なくとも1の整数であり、各整数は、異なり、個々の繰り返し配列単位A、A’およびA’’においてアミノ酸が少なくとも30個になるように規定し、前記整数x’および前記整数x’’は、前記整数xと同一または異なり;
BおよびB’はそれぞれ、約4〜約50個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ配列B’は、前記アミノ酸配列Bと同一または異なり;
bおよびb’はそれぞれ、0〜3の整数であり、前記整数b’は、前記整数bと同一または異なり;
iは、1〜100の整数である、請求項1に記載のナノコンポジット。 - 前記フィロケイ酸塩が、モンモリロナイト、ベントナイト、ヘクトライト、サポナイト、ベイデライト、アタパルガイトおよびスチーブンサイトから選択される、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤をさらに含む、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 前記可塑剤が、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体(derivaties)、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテート、ポリアルキレングリコール、多糖類、二糖類および単糖類から選択される、請求項4に記載のナノコンポジット。
- 前記可塑剤が、ポリエチレングリコールまたはトレハロースであり、前記タンパク質架橋剤は、グルタルアルデヒドである、請求項4に記載のナノコンポジット。
- 前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの材料特性と比較した場合、少なくとも1つの材料特性が変化した、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 前記変化した少なくとも1つの材料特性が、引っ張り強度、弾性率、形態および熱膨張係数から選択される、請求項7に記載のナノコンポジット。
- 層剥離形態である、請求項8に記載のナノコンポジット。
- 全体的に均一な形態である、請求項8に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットの前記弾性率が、前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの前記弾性率を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%および少なくとも90%上回る、請求項8に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットの前記膨張係数が、フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの熱膨張係数よりも小さい、請求項8に記載のナノコンポジット。
- 前記反復配列タンパク質ポリマーを加えていない前記フィロケイ酸塩のゼータ電位と比較した場合、前記ナノコンポジットのゼータ電位が変化している、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 可塑剤を含む前記ナノコンポジットであって、前記ナノコンポジットが、可塑剤なしのナノコンポジットの破断時伸び率と比較した場合、破断時伸び率が大きい、請求項5に記載のナノコンポジット。
- 反復配列絹−エラスチンタンパク質ポリマーまたはその誘導体とフィロケイ酸塩粘土とを含む、ナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項15に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項15に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項2に記載のナノコンポジット。
- 前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項15に記載のナノコンポジット。
- ナノコンポジットを製造する方法であって:
少なくとも1種類の反復配列タンパク質ポリマーを選択することと;
フィロケイ酸塩を選択することと;
前記フィロケイ酸塩を水性液体に加えて、懸濁液を作製することと;
前記少なくとも1種類の反復配列タンパク質ポリマーと前記懸濁液とを混合することと;
前記懸濁液と混合した前記少なくとも1種類の反復配列タンパク質ポリマーを乾燥させることとを含む、方法。 - 前記懸濁液と混合した前記少なくとも1種類の反復配列タンパク質ポリマーは、何らかの表面にキャストする、請求項18に記載の方法。
- 可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤を加えることをさらに含む、請求項18に記載の方法。
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