JP2009527306A - 骨の移植、エンジニアリングおよび再生を目的としたフカン類の使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
<フカン類の入手>
本発明で使用するフカン類は、既述の方法(Blackら、J.Sci.Food Agric.、3巻、122〜129頁、1952年に準拠、または、Nishinoら、Carbohyd.Res.、186巻,119〜129頁、1989年に準拠)に従ってPheophyceae、即ち褐藻類(Ascophyllum nodosum)から抽出する。使用する低分子量フカン類(LMWF)は、既述の方法によって入手する。即ち、制御された加水分解とそれに続く透過性ゲルでの分取分画法もしくはサイズ排除(欧州特許第0403377号、または、ラジカル解重合(欧州特許第0846129号および欧州特許第1207891号)によって得られる。
ヒト骨芽細胞は、骨折整復術中の手術ブロックで回収した骨折片に由来する。骨サンプルは、血液の細胞成分が除去されるまで、PBSで洗浄する。骨栓を3〜4mmの立方体に切断した後、培養皿に静置する。培養培地(DMEM 40%ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)フンギゾン(2μg/ml))1滴を各外植片に配置し、培養皿のプラスチックに付着させる。次いで、当該培養皿をインキュベーター(37℃、空気(95%)/CO2(5%))に1〜2時間入れる。次いで、20%FCSを含むDMEM培養培地で当該外植片を覆う。この培地は、3日置きに交換する。細胞は、外植片から遊走し、培養6日目以降、培養皿にコロニーを形成し、4週間の培養後、集密が達成され、次いで、培養皿から外植片を取り出す。
初代継代培養の集密骨芽細胞を24穴皿に細胞10000個/mlの割合で接種した後、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補った10%のFCSを含むDMEM培地中で24時間インキュベートする。細胞の付着、伝播後、培養培地をフカン類(10μg/ml)含有もしくは非含有の10%のFCSを含むDMEM培地に取り替える。次いで、これらの培養培地を3日置きに交換する。培養21日目に、骨芽細胞分化を完了させるために、β−グリセロホスフェート(10mM)とアスコルビン酸2−リン酸塩(25mM)を添加する。培養8、15、30および45日後、マトリクスメタロプロテアーゼの分泌を検討するため、培養上清を取り出す。細胞は、細胞カウンティングのためにトリプシン処理するか、無水エタノール(−20℃)で固定する。固定によって、その後、形態および免疫細胞化学検査が可能になる。
生体材料は、骨梁間隙の清浄化と非コラーゲンタンパク質の除去によって得られるウシ由来の海綿骨網である。生体材料は、予め小断片に切断し(2mm×2mm)、これらの断片を無水エタノール中に48時間放置した後、37℃(空気/5%CO2)の培養インキュベーター内、DMEM中で24時間インキュベートする。骨生体材料は、培養培地中、フカン類(50μg/ml)の存在下または不在下で再水和させる。
フカン類を含浸可能または含浸不可能な骨生体材料を含有する24穴培養皿(細胞20000個/穴)に正常ヒト骨芽細胞を接種する。これらの移植片を、DMEM、ウシ胎仔血清(10%)、アスコルビン酸(50μg/ml)、インスリン(5μg/ml)およびトランスフェリン(5μg/ml)から成る「石灰化」培養培地中で維持する。実験期間中、この培養培地は、3日置きに取り替える。培養10または30日後、このように得られる移植片を培養皿から取り出し、固定し、組織検査および走査電子顕微鏡検査用に調製する。
この染色法は、核および細胞質の可視化を可能にする。固定後、細胞を前濾過GIEMSA染料(Merck)で2分間被覆する。過剰の染料は、蒸留水で連続洗浄することによって除去する。
この反応は、培養物中のミネラル沈着物の可視化を可能にする。これらの沈着物は、黒色部分として現れる。固定後の二次元培養物を蒸留水で洗浄し、次いで、硝酸銀溶液(5%)中で30分間インキュベートする。当該材料は、蒸留水による洗浄後、日光に曝露する。
前記細胞を、PBSで洗浄した後、緩衝液(Tris−HCl(0.05M)、pH=9.5、MgSO4(0.1%)、ナフチルリン酸塩(0.1%)、ファーストレッド(0.1%))中、周囲温度で1時間インキュベートする。上清を除去し、各穴を蒸留水で2〜3回洗浄する。アルカリホスファターゼ活性陽性部分は、褐色に見える。
細胞もしくは骨生体材料切片を、PBSで洗浄し、次に、CH3OH(80%)/H2O2(20%)溶液中で10分間インキュベートし、内在パーオキシダーゼを不活性化する。穴もしくは切片をPBSで洗浄し、次いで、非特異的抗原部位をブロックする(0.1%スキムミルク、10分)。洗浄後、当該材料をマウス抗ヒトコラーゲンIgG(Sigma、1/40th)とともに1時間インキュベートする。洗浄後、当該材料は、さらに、マウスIgG(1/60th)(Calbiochem)に対するパーオキシダーゼ標識ヤギ抗体とともにインキュベートする。洗浄後、3,3’−ジアミノベンジデン四塩酸塩(Sigma)との反応(15分、暗所)によって、I型コラーゲン含有部分のパーオキシダーゼ活性を検出する。
10および30日目に、骨生体材料を4%パラホルムアルデヒドで固定する。生体材料は、PBSで洗浄し、2%四酸化オスミウムで45分間後固定した後、カコジル酸ナトリウム浴で3回連続洗浄し、次いで、エタノール溶液から無水エタノールまでを使って脱水する。装置中、臨界点で、液体CO2によるアルコールの置換を実施する。走査電子顕微鏡検査によるサンプルの至適観察に必要な表面伝導層を得るために、真空下、陰極スプレー法によってサンプル表面の金被覆を実施する。
<二次元培養>
骨外植片由来細胞は、培養でその真の骨芽細胞表現型を獲得する前骨芽細胞であると考えられる。この最終分化は、増殖期、マトリクス合成期、ならびに、最後に成熟および石灰化期に相当する数期後に起こる。増殖期の終了は、集密後、三次元細胞外マトリクス中の成熟骨芽細胞から成る小結節の出現を特徴とする。I型コラーゲンの合成は、これらの小結節が形成される時点で最大に達し、次いで、急速に減少する。成熟期は、アルカリホスファターゼ(AP)の発現増加を特徴とし、当該発現は、石灰化期開始時に最高点に達する。次いで、骨芽細胞の最終分化とともに、APの発現が減少する。
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞の増殖を顕著に刺激する(30日目に+45%、45日目に+60%、図1参照)。
培養物中の骨芽細胞によるアルカリホスファターゼ(AP)の発現速度論によって、分化経路に沿った当該細胞の進行を評価することができる。培養物中のアルカリホスファターゼの出現は、骨芽細胞分化の開始を特徴付けているが、成熟骨芽細胞は、この酵素をもはや発現しない。
Von Kossa反応は、培養物中の骨芽細胞が分泌する細胞外マトリクスの石灰化状態の評価を可能にする(図4)。45日目の対照培養物中に、若干の石灰化小結節が検出される(図4c)が、これらの同小結節は、フカン類存在培養物中では、30日以降に認められる(図4b)。培養45日目では、多糖とともにインキュベートした骨芽細胞が発現する細胞外マトリクスは、事実上、完全に石灰化される(図4d)。
培養物中の骨芽細胞は、MMP−2およびMMP−13を発現する。MMP−2は、特に、培養開始時に発現されるが、MMP−13は、分化終了時に骨芽細胞によって発現される。当該培養物へのフカン類の添加は、骨芽細胞によるゼラチナーゼAの発現を明らかに減少させるが、MMP−13の誘導発現は、骨芽細胞系における当該細胞の分化促進の表れである。
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞系の分化を促進する。
[走査電子顕微鏡検査]
走査電子顕微鏡検査は、生体材料の高分子構造、さらに、骨芽細胞によるそのコロニー形成の観察することを可能にする。
骨芽細胞を接種しない生体材料を観察すると、フカン類前処理が、骨生体材料の限外構造を変化させないことを示している(図6a、6b)。
培養10日目、細胞は、フカン類を含浸した、または、含浸しない生体材料の表面に付着する。これらの細胞は、平坦な細胞体を有し、これが、コラーゲン網に付着し、ここから、細長い仮足が伸び、細胞外マトリクスへの付着を完成することができる(図7)。
骨生体材料のフカン類含浸は、細胞付着を変化させない。
Claims (20)
- 5000および100000g/molの間、特に10000および40000g/molの間の重量平均モル質量を有するフカン類を含み、骨再生活性を有する骨代用物。
- 前記フカン類が褐藻から得られることを特徴とする請求項1に記載の骨代用物。
- 生体材料を含む請求項1および2のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 前記生体材料が、チタン、コラーゲン、除タンパクおよび/または脱灰骨、サンゴ、リン酸カルシウムセラミック、ヒドロキシアパタイト、ベータ−リン酸三カルシウムおよび生体活性ガラス類から成る群より選択される1種類以上の材料を含むことを特徴とする請求項1ないし3のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 線維芽細胞増殖因子類(FGF類)、トランスフォーミング増殖因子類(TGF類)、インスリン増殖因子類I(IGF類)、血小板由来増殖因子類(PDGF類)、骨形成タンパク質類(BMP類)および血管内皮細胞増殖因子類(VEGF類)から成る群より選択される1種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項1ないし4のいずれか一項に記載の骨代用物。
- インターロイキン1、インターロイキン4、インターロイキン6、腫瘍壊死因子アルファ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージコロニー刺激因子から成る群より選択される1種類以上のサイトカイン類も含むことを特徴とする請求項1ないし5のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 前記生体材料の表面が前記フカン類を含むコーティングを有することを特徴とする請求項1ないし6のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類も含むことを特徴とする請求項1ないし8のいずれか一項に記載の骨代用物。
- 前記生体材料の表面を、前記フカン類を含むコーティングで覆うことを特徴とする請求項7に記載の骨代用物の調製方法。
- 前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項8に記載の骨代用物の調製方法。
- 骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類と共に請求項1ないし8のいずれか一項に記載の骨代用物のコロニー形成を実施することを特徴とする請求項9に記載の骨代用物の調製方法。
- 骨髄、骨または骨膜に由来する前記骨形成細胞類を、5000および100000g/molの間、特に10000および40000g/molの間の重量平均モル質量のフカン類を含む培養培地中で培養することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 5000および100000g/molの間、特に10000および40000g/molの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類から成る群より選択される細胞型用の培養培地。
- 線維芽細胞増殖因子類(FGF類)、トランスフォーミング増殖因子類(TGF類)、インスリン増殖因子類I(IGF類)、血小板由来増殖因子類(PDGF類)、骨形成タンパク質類(BMP類)および血管内皮細胞増殖因子類(VEGF類)から成る群より選択される1種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項14に記載の培養培地。
- 細胞を請求項15または16に記載の培養培地中で培養することを特徴とする、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
- 細胞を請求項1ないし9のいずれか一項に記載の骨代用物上で培養することを特徴とする骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
- 5000および100000g/molの間、特に10000および40000g/molの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨再生活性を有する医療用具。
- 線維芽細胞増殖因子類(FGF類)、トランスフォーミング増殖因子類(TGF類)、インスリン増殖因子類I(IGF類)、血小板由来増殖因子類(PDGF類)、骨形成タンパク質類(BMP類)および血管内皮細胞増殖因子類(VEGF類)から成る群より選択される1種類以上の増殖因子類を含む請求項18に記載の医療用具。
- 請求項1ないし9の一項に記載の骨代用物を含む請求項18または請求項19に記載の医療用具。
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