JP2009525341A - Vaccine delivery compositions and methods of use - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリエステルアミド(PEA)、ポリエステルウレタン(PEUR)、およびポリエステルウレア(PEU)、ならびに免疫刺激アジュバントを含む生分解性ポリマーに基づく、ヒトおよびその他の哺乳動物における様々な病原生物および腫瘍細胞に対する合成ワクチンを提供する。ワクチンは、TLRアゴニストなどの免疫刺激アジュバント、および生物または腫瘍細胞タンパク質由来のMHCクラスIもしくはクラスIIエピトープを含むタンパク質全体またはペプチド抗原が分散したポリマー粒子または分子の分散液として製剤化することができる。細胞内のメカニズムを介して、本発明の組成物中の抗原に特異的な、病原生物または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する方法も含まれる。The present invention relates to various pathogenic organisms and tumor cells in humans and other mammals based on biodegradable polymers including polyesteramide (PEA), polyesterurethane (PEUR), and polyesterurea (PEU), and immunostimulatory adjuvants. Synthetic vaccines against Vaccines can be formulated as immunostimulatory adjuvants such as TLR agonists and polymer particles or molecular dispersions in which whole proteins or peptide antigens containing MHC class I or class II epitopes derived from living or tumor cell proteins are dispersed. . Also included are methods of inducing an immune response against pathogenic organisms or tumor cells that are specific for an antigen in the compositions of the invention via intracellular mechanisms.
Description
発明の分野
本発明は、概して免疫原性組成物、特にMHC対立遺伝子に結合するワクチン送達組成物に関する。
FIELD OF THE INVENTION This invention relates generally to immunogenic compositions, particularly vaccine delivery compositions that bind to MHC alleles.
背景情報
ワクチンの開発および投与においては著しい進歩が遂げられているが、ワクチン製剤の有効性および安全性を増強する代替アプローチはまだ研究中である。組換えタンパク質、合成ペプチド、および多糖-ペプチド結合体などのサブユニットワクチンが新規ワクチン候補として現れつつある。しかし、弱毒病原体および不活化全微生物からなる伝統的ワクチンは、これらのサブユニットワクチンにはない、アジュバントとして作用することができる不純物および細菌成分を含む。したがって、単独型製剤として送達される高純度サブユニットワクチンの有効性は、強力なアジュバントの添加を必要とすることになる。
BACKGROUND INFORMATION Although significant progress has been made in vaccine development and administration, alternative approaches to enhance the efficacy and safety of vaccine formulations are still under investigation. Subunit vaccines such as recombinant proteins, synthetic peptides, and polysaccharide-peptide conjugates are emerging as new vaccine candidates. However, traditional vaccines consisting of attenuated pathogens and inactivated whole microorganisms contain impurities and bacterial components that can act as adjuvants that are not present in these subunit vaccines. Thus, the effectiveness of high purity subunit vaccines delivered as a stand-alone formulation will require the addition of a powerful adjuvant.
現在のところ、アルミニウム化合物が米国で唯一のヒトワクチン用にFDA認可されたアジュバントである。安全性記録は良好であるが、これらは比較的弱いアジュバントで、防御免疫に関連する抗体レベルを誘発するには複数の投与法を必要とすることが多い。したがって、アルミニウム化合物はサブユニットワクチンへの防御免疫応答誘導のためには理想的なアジュバントではないと考えられる。多くの候補アジュバントが現在研究中であるが、これらはヒトにおける毒性や抗原を取り込むための洗練された技術の必要性を含むいくつかの欠点がある。 At present, aluminum compounds are the only FDA-approved adjuvant for human vaccines in the United States. Although safety records are good, these are relatively weak adjuvants and often require multiple dosing regimens to elicit antibody levels associated with protective immunity. Thus, aluminum compounds are not considered ideal adjuvants for inducing a protective immune response to subunit vaccines. Many candidate adjuvants are currently under study, but these have several drawbacks, including toxicity in humans and the need for sophisticated techniques to incorporate antigens.
ワクチンにおけるペプチド抗原の使用は、哺乳動物および他の動物における免疫系、特に主要組織適合複合体(MHC)の操作の知識に基づいている。MHC分子は体内のほとんどの細胞によって合成され、提示される。MHCは特定の型のT細胞(例えば、細胞障害性T細胞)と協調的にはたらいて、体から「非自己」または外来ウイルスタンパク質を除去する。T細胞上の抗原受容体は、結合したペプチドおよびそれに隣接する溝を構成するアルファヘリックスの一部のモザイクであるエピトープを認識する。外来タンパク質の切断によりペプチド断片を生成した後、MHC分子がペプチド断片を提示することにより、抗原限定細胞障害性T細胞が「非自己」または外来ウイルスタンパク質を発現する細胞を探査することが可能となる。機能性T細胞は、T細胞が特異的である結合ペプチド抗原を含むMHC分子を認識した後、細胞障害性免疫応答を示すことになる。 The use of peptide antigens in vaccines is based on knowledge of the immune system, particularly the major histocompatibility complex (MHC), in mammals and other animals. MHC molecules are synthesized and presented by most cells in the body. MHC works in concert with certain types of T cells (eg, cytotoxic T cells) to remove “non-self” or foreign viral proteins from the body. The antigen receptor on T cells recognizes an epitope that is a mosaic of the part of the alpha helix that constitutes the bound peptide and the adjacent groove. After generating a peptide fragment by cleaving a foreign protein, the MHC molecule presents the peptide fragment, allowing antigen-restricted cytotoxic T cells to explore cells that express "non-self" or foreign viral proteins Become. A functional T cell will show a cytotoxic immune response after recognizing an MHC molecule containing a binding peptide antigen to which the T cell is specific.
外来性抗原は体外の細胞からの抗原である。例には、細菌、遊離ウイルス、酵母、原生動物、および毒素が含まれる。これらの外来性抗原は、食作用を通じて抗原提示細胞すなわちAPC(マクロファージ、樹状細胞、およびB-リンパ球)に入る。微生物は飲み込まれ、タンパク質抗原がプロテアーゼによって一連のペプチドに分解される。これらのペプチドは最終的にMHC-II分子の溝に結合し、APCの表面へと輸送される。次いで、T4-リンパ球はそれらのT細胞受容体(TCR)およびCD4分子によりペプチド/MHC-II複合体を認識することができる。MHCクラスIIのAPCによって提示されるペプチドは約10から約30アミノ酸、例えば、約12から約24アミノ酸の長さである(Marsh, S. G. E. et al. (2000) The HLA Facts Book, Academic Press, p. 58-59(非特許文献1))。活性化T4-リンパ球の効果器機能には、B細胞による抗体の産生およびマクロファージの殺微生物活性が含まれ、これらは細胞外または貪食された微生物が破壊される主なメカニズムである。 A foreign antigen is an antigen from a cell outside the body. Examples include bacteria, free viruses, yeast, protozoa, and toxins. These foreign antigens enter antigen presenting cells or APCs (macrophages, dendritic cells, and B-lymphocytes) through phagocytosis. Microorganisms are swallowed and protein antigens are broken down into a series of peptides by proteases. These peptides eventually bind to the groove of the MHC-II molecule and are transported to the surface of the APC. T4-lymphocytes can then recognize peptide / MHC-II complexes by their T cell receptor (TCR) and CD4 molecules. Peptides presented by MHC class II APCs are about 10 to about 30 amino acids in length, for example, about 12 to about 24 amino acids (Marsh, SGE et al. (2000) The HLA Facts Book, Academic Press, p. 58-59 (Non-Patent Document 1)). The effector functions of activated T4-lymphocytes include the production of antibodies by B cells and the microbicidal activity of macrophages, which are the main mechanisms by which extracellular or phagocytic microorganisms are destroyed.
ウイルス、細胞内細菌、および癌に対する体の主な防御の一つは、内因性感染細胞および腫瘍細胞の細胞障害性T-リンパ球すなわちCTLによる破壊である。これらのCTLは、細胞性免疫におけるT8-リンパ球由来の効果器細胞である。しかし、CTLになるためには、先天性T8-リンパ球はAPCによって産生されるサイトカインによって活性化されなければならない。このAPCと先天性T8-リンパ球との間の相互作用は主にリンパ節、リンパ小節、および脾臓で起こる。このプロセスは、感染細胞、腫瘍細胞、および死滅した感染および腫瘍細胞の残留物を飲み込み、分解する、樹状細胞およびマクロファージを含む。この様式で、罹患細胞からの内因性抗原はAPCに入ることができ、ここでプロテアーゼおよびペプチダーゼがタンパク質を約8から約10、おそらくは約8から約11、または約8から約12アミノ酸の長さの一連のペプチドに切断すると考えられる。ペプチドが結合したMHCクラスI分子はAPCの表面に現れ、そこで相補的形状のTCRおよびCD8分子を有する先天性T8-リンパ球によって認識されうる。このTCRによるペプチドエピトープの認識は、先天性T8-リンパ球を細胞性免疫機能について活性化するための第一のシグナルとして役立つ。一つの細胞はその表面上にエピトープが結合したMHC-I分子を250,000個も有すると考えられる。 One of the body's main defenses against viruses, intracellular bacteria, and cancer is the destruction of endogenous infected cells and tumor cells by cytotoxic T-lymphocytes or CTLs. These CTL are effector cells derived from T8-lymphocytes in cellular immunity. However, in order to become CTL, innate T8-lymphocytes must be activated by cytokines produced by APC. This interaction between APC and congenital T8-lymphocytes occurs primarily in the lymph nodes, lymph nodes, and spleen. This process includes dendritic cells and macrophages that engulf and degrade infected cells, tumor cells, and residues of dead infected and tumor cells. In this manner, endogenous antigens from diseased cells can enter the APC, where proteases and peptidases reduce the protein from about 8 to about 10, perhaps from about 8 to about 11, or from about 8 to about 12 amino acids. It is thought to cleave into a series of peptides. MHC class I molecules bound by the peptide appear on the surface of the APC where they can be recognized by innate T8-lymphocytes with complementary forms of TCR and CD8 molecules. Recognition of peptide epitopes by this TCR serves as a primary signal for activating innate T8-lymphocytes for cellular immune function. A cell is thought to have as many as 250,000 MHC-I molecules with epitopes bound on its surface.
過去10年の間に、Toll様受容体(TLR)を介した先天的な免疫学的経路の作用を誘発する、または遮断することによって機能するアジュバントにおいて、興味深い進展が見られた。TLRはショウジョウバエ(Drosophila)のToll受容体に相同なタンパク質のファミリーであり、それは病原に関連する分子パターンを認識し、それによって体が自己分子と非自己分子とを識別するのを助ける。ウイルス病原体に共通の物質は、病原体関連分子パターンとしてTLRによって認識される。例えば、Toll様受容体3(TLR-3)は二本鎖RNAのパターンを認識し、Toll様受容体4(TLR-4)はLPSのパターンを認識し、Toll様受容体7および8(TLR-7/8)は、ウイルスおよび細菌のRNAおよびDNAのアデノシンを含むパターンを認識し、ならびにToll様受容体9(TLR-9)は、細菌に多い一本鎖DNAの非メチル化CpG含有配列を認識する。TLRがそのようなパターン認識によって誘発される場合、炎症ならびに先天免疫応答および適応免疫応答の活性化につながる一連のシグナル伝達事象が起こる。関与する分子メカニズムが経験的に得られたアジュバントよりもより優れて定義されるレベルで免疫応答を活性化するために、様々なTLRによって認識される分子パターンを含む合成リガンドが使用されている。 During the past decade, interesting progress has been made in adjuvants that function by inducing or blocking the action of innate immunological pathways via Toll-like receptors (TLRs). TLRs are a family of proteins that are homologous to the Drosophila Toll receptor, which recognizes the molecular patterns associated with pathogenesis, thereby helping the body distinguish between self and non-self molecules. Substances common to viral pathogens are recognized by TLRs as pathogen-associated molecular patterns. For example, Toll-like receptor 3 (TLR-3) recognizes the pattern of double-stranded RNA, Toll-like receptor 4 (TLR-4) recognizes the pattern of LPS, and Toll-like receptors 7 and 8 (TLR -7/8) recognizes viral and bacterial RNA and DNA adenosine-containing patterns, and Toll-like receptor 9 (TLR-9) is an unmethylated CpG-containing sequence of single-stranded DNA common in bacteria Recognize When TLR is triggered by such pattern recognition, a series of signaling events occur that lead to inflammation and activation of innate and adaptive immune responses. Synthetic ligands containing molecular patterns recognized by various TLRs have been used to activate the immune response at a level that is better defined than the empirically derived molecular mechanisms involved.
当技術分野におけるこれらの進展にもかかわらず、不活性化病原体ではなくペプチド抗原を用いた新しいより優れたワクチン送達組成物、ならびにTLRアゴニストなどの新しいより優れたアジュバントが依然として必要とされている。個体において、MHCクラスIおよびクラスII対立遺伝子によって同定される病原生物に対する免疫応答を誘導するための、そのような組成物の製造法および使用法もまた必要である。 Despite these advances in the art, there remains a need for new and better vaccine delivery compositions using peptide antigens rather than inactivated pathogens, as well as new and better adjuvants such as TLR agonists. There is also a need for methods of making and using such compositions to induce an immune response against pathogenic organisms identified by MHC class I and class II alleles in an individual.
発明の概要
本発明は、特定のポリ(エステルアミド)(PEA)、ポリ(エステルウレタン)(PEUR)、およびポリ(エステルウレア)(PEU)ポリマーなどのポリマー鎖中にアミノ酸を含む生分解性ポリマーを用いて、ヒトおよびその他の哺乳動物における様々な病原生物に対する免疫応答を刺激するための、完全に合成的な、作製が容易なワクチン送達組成物を製剤化するために使用することができるという前提に基づいている。
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to biodegradable polymers comprising amino acids in the polymer chain, such as certain poly (ester amide) (PEA), poly (ester urethane) (PEUR), and poly (ester urea) (PEU) polymers. Can be used to formulate fully synthetic, easily made vaccine delivery compositions for stimulating immune responses against various pathogenic organisms in humans and other mammals Based on assumptions.
一つの態様において、本発明は5〜約30アミノ酸を含む少なくとも一つのMHCクラスIまたはクラスIIペプチド抗原の有効量およびアジュバントが分散されたポリマーの分散液の形状で投与するために製剤化したワクチン送達組成物を提供する。ポリマーは、以下の構造式(I)に記載の構造式を有するポリ(エステルアミド)(PEA)から選択される生分解性ポリマーの少なくとも一つまたは混合物を含む:
式中、nは約5〜約150の範囲であり;R1 は、α,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立して選択され;個々のn個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;かつR4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせ、(C2-C20)アルキレン、ならびに(C2-C20)アルケニレンからなる群より独立して選択される;
または、構造式IIIに記載の化学式を有するPEA:
式中、nは約5〜約150の範囲であり;mは約0.1〜0.9の範囲であり;pは約0.9〜0.1の範囲であり;式中、R1は、α,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立して選択され;各R2は独立して、水素、(C1-C12)アルキルもしくは(C6-C10)アリール、または保護基であり;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;かつR4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルである;
または、構造式(IV)に記載の化学式を有するポリ(エステルウレタン)(PEUR):
式中、nは約5〜約150の範囲であり;式中、R3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され;かつR6は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせより独立して選択される;
または、一般構造式(V)に記載の化学構造を有するPEURポリマー:
式中、nは約5〜約150の範囲であり;mは約0.1〜約0.9の範囲であり;pは約0.9〜約0.1の範囲であり;R2は、水素、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、もしくは保護基より独立して選択され;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、および構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択され;かつR6は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基の有効量、およびそれらの組み合わせより独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルもしくは(C2-C20)アルケニルである;
または、一般構造式(VI)に記載の化学式を有するポリ(エステルウレア)(PEU):
式中、nは約10〜約150であり;個々のn個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)より独立して選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせより独立して選択される;
または、構造式(VII)に記載の化学式を有するPEU:
式中、mは約0.1〜約1.0であり;pは約0.9〜約0.1であり;nは約10〜約150であり;各R2は独立して、水素、(C1-C12)アルキル、もしくは(C6-C10)アリールであり;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)より独立して選択され;各R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせより独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルもしくは(C2-C20)アルケニルである。
In one embodiment, the invention relates to a vaccine formulated for administration in the form of a dispersion of a polymer in which an effective amount of at least one MHC class I or class II peptide antigen comprising 5 to about 30 amino acids and an adjuvant is dispersed. A delivery composition is provided. The polymer comprises at least one or a mixture of biodegradable polymers selected from poly (ester amides) (PEA) having the structural formula set forth in the following structural formula (I):
Where n is in the range of about 5 to about 150; R 1 is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy)-(C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 ′-(alkanedioyldi Independently selected from residues of (oxy) dicinnamic acid or 4,4 '-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid, (C 2 -C 20 ) alkylene, or (C 2 -C 20 ) alkenylene R 3 in each n monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) Independently selected from the group consisting of aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20) alkenylene, a (C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, saturated or residues of unsaturated therapeutic diol, structural formula (II) 1,4: 3,6 - dianhydrohexitols bicyclic fragments, and combinations thereof, (C 2 -C 20) if alkylene, It is selected (C 2 -C 20) independently from the group consisting of alkenylene to;
Alternatively, PEA having the chemical formula described in Structural Formula III:
Where n is in the range of about 5 to about 150; m is in the range of about 0.1 to 0.9; p is in the range of about 0.9 to 0.1; where R 1 is α, ω-bis ( 4- carboxyphenoxy) - (C 1 -C 8) alkane, 3,3 '- (alkanedioyldioxy oil dioxy) Double cinnamic acid or 4,4' - (alkanedioyldioxy oil dioxy) Double cinnamic acid, ( C 2 -C 20 ) alkylene or (C 2 -C 20 ) alkenylene residues independently selected; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) alkyl or (C 6- C 10 ) aryl, or a protecting group; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) Independently selected from the group consisting of alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 − C 20) alkylene, (C 2 -C 20) alkenylene, (C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, also saturated Independently of the group consisting of residues of unsaturated therapeutic diols, or bicyclic fragments of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of structural formula (II), and combinations thereof And R 13 is independently (C 1 -C 20 ) alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl;
Alternatively, poly (ester urethane) having the chemical formula described in Structural Formula (IV) (PEUR):
Wherein n ranges from about 5 to about 150; wherein R 3 is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl , (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 -C 20 ) Alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, (C 2 -C 20 ) alkylene, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, 1,4: 3, of formula (II), Selected from the group consisting of bicyclic fragments of 6-dianhydrohexitol, and combinations thereof; and R 6 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, Selected independently from bicyclic fragments of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of general formula (II), and combinations thereof;
Alternatively, a PEUR polymer having the chemical structure described in the general structural formula (V):
Wherein, n in the range of from about 5 to about 0.99; m is in the range of from about 0.1 to about 0.9; p is in the range of from about 0.9 to about 0.1; R 2 is hydrogen, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, or independently selected from protecting groups; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 10) aryl (C 1 -C 20) alkyl, and - (selection CH 2) 2 S (CH 3 ) consisting essentially independently from the group R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, and 1, of structural formula (II) Selected from the group consisting of bicyclic fragments of 4: 3,6-dianhydrohexitol, and combinations thereof; and R 6 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene Or alkyloxy, 1,4: 3,6-dianch of general formula (II) Bicyclic fragment of Rohekishitoru, an effective amount of residues of saturated or unsaturated therapeutic diol, and are independently selected from combinations thereof; and R 13 is independently, (C 1 -C 20) Alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl;
Alternatively, poly (ester urea) (PEU) having the chemical formula described in general structural formula (VI):
Where n is from about 10 to about 150; R 3 in each n monomer is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) independently selected from alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20) alkenylene, (C 2 -C 8) alkyloxy (C 2 -C 20) alkylene, saturated or unsaturated residue of a therapeutic diol or structural formula, (II) A bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol, and combinations thereof;
Alternatively, PEU having the chemical formula described in Structural Formula (VII):
Wherein m is from about 0.1 to about 1.0; p is from about 0.9 to about 0.1; n is from about 10 to about 150; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) Alkyl or (C 6 -C 10 ) aryl; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2- C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); each R 4 is selected from (C 2- C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8 ) alkyloxy (C 2 -C 20 ) alkylene, the residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, structural formula (II ) of 1,4: 3,6-dianhydrohexitols bicyclic fragments, and are independently selected from combinations thereof; and R 13 is independently, (C 1 -C 20) alkyl or ( C 2 -C 20 ) alkenyl.
さらにもう一つの態様において、本発明は哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物に本発明のワクチン送達組成物を、クラスIまたはクラスIIペプチド抗原の有効量およびアジュバントが分散している、構造式IおよびIII〜VIIで記載されるポリマーの粒子または分子の分散液の形で投与することによる方法を提供する。本発明の組成物は哺乳動物の抗原提示細胞によって取り込まれて、哺乳動物において免疫応答を誘導する。 In yet another embodiment, the present invention is a method of inducing an immune response in a mammal, wherein the mammal is dispersed with an effective amount of a class I or class II peptide antigen and an adjuvant. Wherein the method is by administration in the form of a dispersion of particles or molecules of the polymers described by Structural Formulas I and III-VII. The composition of the present invention is taken up by mammalian antigen-presenting cells and induces an immune response in the mammal.
別の態様において、本発明はワクチンを哺乳動物に送達する方法であって、哺乳動物に本発明のワクチン送達組成物を、構造式IおよびIII〜VIIで記載されるポリマーの粒子または分子の分散液の形で投与することによる方法を提供する。クラスIまたはクラスIIペプチド抗原および免疫刺激アジュバントを哺乳動物に送達するために、少なくとも一つのクラスIまたはクラスIIペプチド抗原および免疫刺激アジュバントは組成物のポリマー中に分散しており、それは哺乳動物の抗原提示細胞によって取り込まれる。 In another embodiment, the present invention is a method of delivering a vaccine to a mammal, wherein the vaccine delivery composition of the present invention is delivered to a mammal by dispersing particles or molecules of the polymers described by structural formulas I and III-VII. Methods are provided by administration in liquid form. In order to deliver a class I or class II peptide antigen and immunostimulatory adjuvant to a mammal, at least one class I or class II peptide antigen and immunostimulatory adjuvant is dispersed in the polymer of the composition, which is It is taken up by antigen presenting cells.
発明の詳細な説明
本発明は、モノマーあたり少なくとも一つのアミノ酸を含む生分解性ポリマーを用いて、大量に再生可能で、安全(弱毒ウイルスを含まない)、安定、かつ輸送および保存のために凍結乾燥可能な、皮下もしくは筋肉内注射または粘膜投与用の合成ワクチン送達組成物を製造しうるとの発見に基づいている。用いるポリマーの構造特性により、ワクチン送達組成物はコピー数および局所密度が高い抗原およびアジュバントを提供する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION It is based on the discovery that desiccatable, synthetic vaccine delivery compositions for subcutaneous or intramuscular injection or mucosal administration can be produced. Depending on the structural properties of the polymers used, vaccine delivery compositions provide antigens and adjuvants with high copy number and local density.
一つの態様において、ポリマーを異なる特性を有するワクチン送達組成物に製剤化することができる。例えば、ポリマーは、アジュバント、およびポリマーデポーがインビボで生分解する際にAPCによって取り込まれ、MHCクラスIまたはクラスII対立遺伝子によって提示されるペプチド抗原または抗原ポリマー断片を放出する徐放性ポリマーデポーとして作用することができる。他の態様において、ポリマーはペプチド抗原およびアジュバントをAPCへと運び、ペプチド抗原およびアジュバントは提示のために細胞内で放出される。ポリマーは実際はポリマー-抗原結合体およびポリマーアジュバント結合体の食作用を誘導することにより、APCを刺激すると考えられる。 In one embodiment, the polymers can be formulated into vaccine delivery compositions with different properties. For example, polymers can be used as adjuvants and sustained release polymer depots that are taken up by APC when the polymer depot biodegrades in vivo and release peptide antigens or antigen polymer fragments presented by MHC class I or class II alleles. Can act. In other embodiments, the polymer carries the peptide antigen and adjuvant to the APC, and the peptide antigen and adjuvant are released intracellularly for presentation. The polymer is believed to stimulate APC by actually inducing phagocytosis of the polymer-antigen conjugate and polymer adjuvant conjugate.
さらにもう一つの態様において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物に本発明のワクチン送達組成物の有効量を投与することによる方法を提供し、この組成物は哺乳動物の抗原提示細胞によって取り込まれて、哺乳動物において免疫応答を誘導する。 In yet another aspect, the invention provides a method of inducing an immune response in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a vaccine delivery composition of the invention, the composition Are taken up by mammalian antigen-presenting cells and induce an immune response in the mammal.
ヒトの治療に加えて、本発明のワクチン送達組成物は、ペット(例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、およびフェレット)、家畜(例えば、ニワトリ、カモ、ブタ、ウマ、ラバ、乳牛および肉牛)および競走馬などの、様々な哺乳動物および鳥の患者の獣医学的治療における使用も意図される。 In addition to human therapy, the vaccine delivery compositions of the present invention can be used for pets (e.g., cats, dogs, rabbits, and ferrets), livestock (e.g., chickens, ducks, pigs, horses, mules, dairy cows and beef cattle) and races. Also contemplated for use in veterinary treatment of various mammalian and avian patients, such as horses.
直接送達されるか、またはインビボポリマーデポーから放出される、ポリマー粒子または分子は、抗原提示細胞(APC)によって容易に取り込まれるようなサイズに調節され、ポリマー粒子中に分散した、またはポリマー分子上の官能基に結合したペプチド抗原もしくはタンパク質抗原、およびアジュバントを含む。APCはペプチド/タンパク質抗原をMHC複合体を介して提示し、細胞障害性T細胞などのT細胞によって認識されて内因性免疫応答を発生および増強し、対応する、または類似の抗原を有する病原細胞の破壊を引き起こす。本発明のワクチン送達組成物において用いるポリマーは、ポリマーデポー、分子および粒子の生分解の速度を調節して、ペプチド/タンパク質抗原が抗原提示細胞と選択した期間持続的に接触するよう設計することができる。例えば、典型的には、ポリマーデポーは約24時間、約7日間、約30日間、もしくは約90日間、またはそれ以上から選択される期間にわたって分解することになる。適当な免疫応答を得るためにワクチンを繰り返し注射する必要のない、植え込み可能なワクチン送達組成物を提供するために、より長い期間が特に適している。 Polymer particles or molecules that are delivered directly or released from an in vivo polymer depot are sized to be readily taken up by antigen presenting cells (APCs), dispersed in polymer particles, or on polymer molecules A peptide antigen or protein antigen bound to the functional group of and an adjuvant. APC presents peptide / protein antigens via MHC complexes and is recognized by T cells such as cytotoxic T cells to generate and enhance endogenous immune responses, pathogenic cells with corresponding or similar antigens Cause destruction. The polymers used in the vaccine delivery compositions of the present invention can be designed to regulate the rate of biodegradation of polymer depots, molecules and particles so that peptide / protein antigens are in continuous contact with antigen presenting cells for a selected period of time. it can. For example, typically the polymer depot will degrade over a period selected from about 24 hours, about 7 days, about 30 days, or about 90 days, or longer. Longer periods are particularly suitable to provide an implantable vaccine delivery composition that does not require repeated injections of the vaccine to obtain a suitable immune response.
本発明は、粘膜により伝播される病原体を含む、様々な病原体に対する免疫応答を誘導するために、生分解性ポリマーによる送達技術を用いる。組成物は、抗原がそれ自体弱い免疫原性である場合でさえ、激しい免疫応答を提供する。本明細書に記載のワクチン送達組成物の個々の成分および方法は公知であったが、そのような組み合わせが抗原の効率を、成分を別々に用いた場合に得られるレベルを超えて増強すると思われること、およびさらにいくつかの場合にはワクチン送達組成物を調製する際に用いるポリマーによって追加のアジュバントの必要性がなくなると思われることは予想外かつ驚くことであった。 The present invention uses biodegradable polymer delivery techniques to induce immune responses against a variety of pathogens, including those transmitted by the mucosa. The composition provides a vigorous immune response even when the antigen is itself weakly immunogenic. Although the individual components and methods of the vaccine delivery compositions described herein were known, such a combination appears to enhance the efficiency of the antigen beyond the levels obtained when the components are used separately. It was unexpected and surprising that, in some cases, the polymer used in preparing the vaccine delivery composition would eliminate the need for additional adjuvants.
本発明は、本明細書の病原体のいずれかに対する免疫応答を提供するために広く適用することができるが、本明細書においてはインフルエンザウイルスおよびHIVに言及することにより本発明を例示する。 Although the present invention can be widely applied to provide an immune response against any of the pathogens herein, the present invention is exemplified herein by reference to influenza viruses and HIV.
本発明の方法は、細胞性免疫、および/または液性抗体応答を提供する。したがって、本発明の方法は、抗体、ヘルパーT細胞活性およびT細胞の細胞障害活性を誘導しうるウイルス、細菌、真菌および寄生生物病原体由来の抗原を含む、細胞性および/または液性免疫応答が望まれる任意の抗原と共に使用されることになる。したがって、本明細書において用いられる「免疫応答」とは、用いるペプチド/タンパク質抗原に特異的な抗体の産生、ヘルパーT細胞活性またはT細胞の細胞障害活性を意味する。そのような抗原には、ヒトおよび動物病原体によりコードされるものが含まれるが、それらに限定されるわけではなく、構造または非構造タンパク質、多糖-ペプチド結合体、またはDNAのいずれかに対応しうる。 The methods of the invention provide cellular immunity and / or humoral antibody responses. Thus, the methods of the present invention provide a cellular and / or humoral immune response comprising antibodies, helper T cell activity and antigens from viruses, bacteria, fungi and parasite pathogens that can induce T cell cytotoxic activity. It will be used with any desired antigen. Thus, “immune response” as used herein refers to the production of antibodies specific to the peptide / protein antigen used, helper T cell activity or T cell cytotoxic activity. Such antigens include, but are not limited to, those encoded by human and animal pathogens and correspond to either structural or nonstructural proteins, polysaccharide-peptide conjugates, or DNA. sell.
例えば、本発明は、HSV-1およびHSV-2糖タンパク質gB、gDおよびgHなどの単純疱疹ウイルス(HSV)1型および2型由来のタンパク質;水痘-帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)およびCMV gBおよびgHを含むサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原;ならびにHHV6およびHHV7などの他のヒト疱疹ウイルス由来の抗原を含む、疱疹ウイルスファミリーからの広範なタンパク質に対する免疫応答を刺激するために使用されることになる。(例えば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード成分の総説については、Chee et al., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169;様々なHSV-1コードタンパク質の議論については、McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574;HSV-1およびHSV-2 gBおよびgDタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の議論については、米国特許第5,171,568号;EBVゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定については、Baer et al., Nature (1984) 310:207-211;およびVZVの総説については、Davison and Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816参照されたい。)
For example, the invention relates to herpes simplex virus (HSV)
A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、デルタ型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)およびG型肝炎ウイルス(HGV)を含む、肝炎ウイルスファミリーからの抗原は、本明細書に記載の技術において都合よく用いることもできる。例として、HCVのウイルスゲノム配列は、配列を得るための方法と同じく公知である。例えば、国際公開公報第89/04669号;同第90/11089号;および同第90/14436号を参照されたい。HCVゲノムは、E1(Eとしても知られている)およびE2(E2/NSIとしても知られている)ならびにN末端ヌクレオカプシドタンパク質(「コア」と呼ぶ)を含むいくつかのウイルスタンパク質をコードする(E1およびE2を含むHCVタンパク質の議論については、Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388参照)。これらのタンパク質、ならびにその抗原断片はそれぞれ、本発明の方法において使用されることになる。同様に、HDVからのδ抗原の配列も公知で(例えば、米国特許第5,378,814号参照)、この抗原も本発明の方法において都合よく用いることができる。加えて、コア抗原、表面抗原、sAg、ならびに前表面配列、pre-S1およびpre-S2(以前はpre-Sと呼ばれていた)、ならびにsAg/pre-S1、sAg/pre-S2、sAg/pre-S1/pre-S2、およびpre-S1/pre-S2などの前述の組み合わせなどのHBV由来の抗原も、本明細書において使用されることになる。例えば、HBV構造の議論については、“HBV Vaccines-from the laboratory to license: a case study”in Mackett, M. and Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176;ならびに米国特許第4,722,840号、第5,098,704号、第5,324,513号(その全体が参照により本明細書に組み入れられる);Beames et al., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64:3319-3330;およびZhou et al., J. Virol. (1991) 65:5457-5464を参照されたい。 Including hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis delta virus (HDV), hepatitis E virus (HEV) and hepatitis G virus (HGV), Antigens from the hepatitis virus family can also be conveniently used in the techniques described herein. As an example, the viral genome sequence of HCV is known as well as the method for obtaining the sequence. See, for example, WO 89/04669; 90/11089; and 90/14436. The HCV genome encodes several viral proteins including E1 (also known as E) and E2 (also known as E2 / NSI) and the N-terminal nucleocapsid protein (referred to as the `` core '') ( For a discussion of HCV proteins including E1 and E2, see Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388). Each of these proteins, as well as antigen fragments thereof, will be used in the methods of the present invention. Similarly, the sequence of the δ antigen from HDV is also known (see, eg, US Pat. No. 5,378,814), and this antigen can also be conveniently used in the methods of the present invention. In addition, core antigen, surface antigen, sAg, and front surface sequences, pre-S1 and pre-S2 (previously called pre-S), and sAg / pre-S1, sAg / pre-S2, sAg Antigens derived from HBV such as the aforementioned combinations such as / pre-S1 / pre-S2 and pre-S1 / pre-S2 will also be used herein. For example, for discussion of HBV structure, see “HBV Vaccines-from the laboratory to license: a case study” in Mackett, M. and Williamson, JD, Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176; and US Pat. No. 4,722,840. 5,098,704, 5,324,513 (incorporated herein by reference in its entirety); Beames et al., J. Virol. (1995) 69: 6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol. 1990) 64: 3319-3330; and Zhou et al., J. Virol. (1991) 65: 5457-5464.
特にピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルスなど);カリチウイルス科;トガウイルス科(例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど);フラビウイルス科;コロナウイルス科;レオウイルス科;ビルナウイルス科;ラブドウイルス科(例えば、狂犬病ウイルスなど);フィロウイルス科;パラミクソウイルス科(例えば、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど);オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルスA、BおよびC型など);ブンヤウイルス科;アレナウイルス科;レトロウイルス科(例えば、単離ウイルスHIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMNからの抗原を含むが、それらに限定されるわけではない、HTLV-I;HTLV-II;HIV-I(HTLV-III LAV、ARV、hTLRなどとしても知られている));HIV-1CM235、HIV-1US4;HIV-2;サル免疫不全症候群ウイルス(SIV)のメンバーからのタンパク質などであるが、それらに限定されるわけではない、他のウイルス由来の抗原も本発明の方法において使用されることになる。加えて、抗原はヒトパピローマウイルス(HPV)およびダニ媒介性脳炎ウイルス由来であってもよい。これらおよび他のウイルスの記載については、例えば、Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988);Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)を参照されたい。 In particular, Picornaviridae (eg, poliovirus); Caliciviridae; Togaviridae (eg, rubella virus, dengue virus, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Virnaviridae; Rhabdoviridae (For example, rabies virus); Filoviridae; Paramyxoviridae (for example, mumps virus, measles virus, respiratory syncytial virus); Orthomyxoviridae (for example, influenza viruses A, B and C) ); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (eg, including, but not limited to, antigens from isolated viruses HIV IIIb , HIV SF2 , HIV LAV , HIV LAI , HIV MN , HTLV -I; HTLV-II; HIV- I (HTLV-III LAV, ARV, also known as such hTLR)); HIV-1 CM235 , HIV-1 US4; HIV-2 Although such proteins from members of simian immunodeficiency syndrome virus (SIV), but are not limited to, also to be used in the methods of the present invention antigens from other viruses. In addition, the antigen may be derived from human papillomavirus (HPV) and tick-borne encephalitis virus. For descriptions of these and other viruses, see, for example, Virology, 3rd Edition (WK Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (BN Fields and DM Knipe, eds. 1991).
特に、HIVの様々な遺伝子サブタイプのメンバーを含む、前述のHIV単離ウイルスのいずれかからのエンベロープタンパク質が公知で、報告されており(様々なHIV単離ウイルスのエンベロープ配列の比較については、例えば、Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex. (1992);Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, N.Mex.: Los Alamos National Laboratory;およびModrow et al., J. Virol. (1987) 61:570-578を参照されたい)、これらの単離ウイルスのいずれか由来の抗原は本発明の方法において使用されることになる。具体的には、gp120のV3ループ由来で、配列RIQRGPGRAFVTIGK(SEQ ID NO:1)を有する、合成ペプチド、R15K(Nehete et al. Antiviral Res. (2002) 56:233-251)は、本発明の組成物および方法において用いられることになる。さらに、本発明は、gp160およびgp41などの様々なエンベロープタンパク質、p24gagおよびp55gagなどのgag抗原、ならびにpol領域由来のタンパク質のいずれかを含む、様々なHIV単離ウイルスのいずれか由来の他の免疫原性タンパク質にも同等に適用可能である。さらに、HIVタンパク質からの様々なエピトープを保持する本発明の組成物の複数のエピトープカクテルが想定される。例えば、gp120およびgp41からの6つの保存ペプチドがウイルス量を減少させ、アカゲザル/SHIVモデルにおいて伝播を防止することが明らかにされている:
。本発明の組成物および方法において出願者らが試験した抗原のアミノ酸配列はIFPGKRTIVAGQRGR(SEQ ID NO:8)であり、ここですべてのアミノ酸は天然、L-アミノ酸である。
In particular, envelope proteins from any of the aforementioned HIV isolated viruses, including members of the various gene subtypes of HIV, are known and reported (for comparison of the envelope sequences of various HIV isolated viruses, see For example, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex. (1992); Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, N. Mex .: Los Alamos National Laboratory; and Modrow et al., J. Virol. (1987) 61: 570-578), antigens from any of these isolated viruses will be used in the methods of the invention. Specifically, a synthetic peptide, R15K (Nehete et al. Antiviral Res. (2002) 56: 233-251), derived from the V3 loop of gp120 and having the sequence RIQRGPGRAFVTIGK (SEQ ID NO: 1) It will be used in compositions and methods. Furthermore, the present invention relates to other immunizations from any of a variety of HIV-isolated viruses, including any of various envelope proteins such as gp160 and gp41, gag antigens such as p24gag and p55gag, and proteins from the pol region. It is equally applicable to protogenic proteins. In addition, multiple epitope cocktails of the compositions of the invention that carry various epitopes from HIV proteins are envisioned. For example, six conserved peptides from gp120 and gp41 have been shown to reduce viral load and prevent transmission in the rhesus monkey / SHIV model:
. The amino acid sequence of the antigen that we tested in the compositions and methods of the present invention is IFPGKRTIVAGQRGR (SEQ ID NO: 8), where all amino acids are naturally occurring L-amino acids.
上で説明したように、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用となるウイルスのもう1つの例である。具体的には、A型インフルエンザのエンベロープ糖タンパク質HAおよびNAは、核タンパク質および基質タンパク質と同様、免疫応答を生成するために特に興味深い。A型インフルエンザの多数のHAサブタイプが同定されている (Kawaoka et al., Virology (1990) 12:759-767; Webster et al., “Antigenic variation among type A influenza viruses,”p. 127-168 P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York)。したがって、任意のこれら単離体に由来するタンパク質もまた、本明細書に記載の免疫化技術において使用可能である。特に、本発明のワクチン送達組成物および方法において、HAの13アミノ酸保存配列を用いることができる。現行のワクチン製剤で用いられるH3株において、このアミノ酸配列は
であり、H5株においては主に
である。さらに、本発明のワクチン送達組成物および方法において、単量体または三量体の形状でのHA全体を用いることができる。特に、ワクチン製剤に用いるトリインフルエンザのH5N1株は以下の通りである。
同じH5N1株の核タンパク質(NP)配列は以下の通りである。
同じH5N1株のNPと、基質タンパク質(M2e)の細胞外ドメインとの融合もタンパク質抗原として本発明のワクチン組成物に用いることができる。
As explained above, influenza virus is another example of a virus that makes the present invention particularly useful. Specifically, influenza A envelope glycoproteins HA and NA are of particular interest for generating immune responses, as well as nuclear and substrate proteins. A number of HA subtypes of influenza A have been identified (Kawaoka et al., Virology (1990) 12: 759-767; Webster et al., “Antigenic variation among type A influenza viruses,” p. 127-168 P. Palese and DW Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York). Thus, proteins from any of these isolates can also be used in the immunization techniques described herein. In particular, a 13 amino acid conserved sequence of HA can be used in the vaccine delivery compositions and methods of the invention. In the H3 strain used in the current vaccine formulation, this amino acid sequence is
In H5 stock,
It is. Furthermore, whole HA in monomeric or trimer form can be used in the vaccine delivery compositions and methods of the invention. In particular, the H5N1 strain of avian influenza used in vaccine preparations is as follows.
The nucleoprotein (NP) sequence of the same H5N1 strain is as follows.
Fusion of the same H5N1 strain NP and the extracellular domain of the substrate protein (M2e) can also be used as a protein antigen in the vaccine composition of the present invention.
本明細書に記載の方法は、髄膜炎菌(Meningococcus) A、BおよびC、B型インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)(HIB)、ならびにピロリ菌(Helicobacter pylori)を含むが、それらに限定されるわけではない、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎を引き起こす生物、および他の病原生物由来のものなどの、多くの細菌抗原と共に使用されることにもなる。寄生生物抗原の例には、マラリアおよびライム病の原因となる生物由来のものが含まれる。 Methods described herein include, but are not limited to, Meningococcus A, B and C, Hemophilus influenza (HIB), and Helicobacter pylori It will also be used with many bacterial antigens such as those from diphtheria, cholera, tuberculosis, tetanus, whooping cough, meningitis and other pathogenic organisms. Examples of parasitic antigens include those derived from organisms that cause malaria and Lyme disease.
さらに、本明細書に記載の方法は、様々な悪性癌を治療する手段も提供する。本発明は、一連の癌に対する免疫応答を提供するために広く適用することができるが、本明細書においては黒色腫およびヒトパピローマウイルスにより誘発される子宮頸癌に言及することにより本発明を例示する。 Furthermore, the methods described herein also provide a means of treating various malignant cancers. Although the present invention can be widely applied to provide an immune response against a range of cancers, the present invention is exemplified herein by reference to cervical cancer induced by melanoma and human papillomavirus. .
例えば、本発明の組成物は、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカーなどの問題の癌に特異的な特定のタンパク質に対する液性および細胞性免疫応答の両方を開始するために用いることもできる。そのような腫瘍抗原には特に、MAGE 1、2、3、4、などを含む様々なMAGE(黒色腫関連抗原E)のいずれか(Boon, T. Scientific American (March 1993):82-89);様々なチロシナーゼのいずれか;MART 1(T細胞によって認識される黒色腫抗原)、突然変異体ras;突然変異体p53;p97黒色腫抗原;CEA(癌胎児抗原)が含まれる。本発明の組成物および組成物において有用な他の黒色腫ペプチド抗原には下記が含まれる:
*GP100は黒色腫関連ME20抗原とも呼ばれる。
For example, the compositions of the invention can be used to initiate both humoral and cellular immune responses against specific proteins specific for the cancer in question, such as activated oncogenes, fetal antigens, or activation markers. You can also. Such tumor antigens, in particular, any of a variety of MAGEs (melanoma-associated antigen E) including
* GP100 is also called melanoma-associated ME20 antigen.
腫瘍誘導ウイルス由来の抗原などの異種抗原を発現する悪性癌は、本発明のワクチン送達組成物のさらなる標的である。ヒトパピローマウイルス(HPV)株は子宮頸癌を引き起こすことがあり、ペプチド抗原またはタンパク質抗原に対する細胞障害性T細胞免疫応答は特に興味深い。特に、E6およびE7癌遺伝子と、以下の配列との融合タンパク質も本発明のワクチン送達組成物に用いることができる。
Malignant cancers that express a heterologous antigen, such as an antigen derived from a tumor-inducing virus, are a further target of the vaccine delivery composition of the present invention. Human papillomavirus (HPV) strains can cause cervical cancer and cytotoxic T cell immune responses to peptide or protein antigens are of particular interest. In particular, fusion proteins of E6 and E7 oncogenes with the following sequences can also be used in the vaccine delivery composition of the present invention.
本発明を広範な疾患を予防または治療するために用いうることは容易に明らかとなる。 It will be readily apparent that the present invention can be used to prevent or treat a wide range of diseases.
本発明のワクチン送達組成物中のポリマー内に分散したペプチド/タンパク質抗原は任意の適当な長さを有することができるが、ペプチド制限Tリンパ球によって認識される8から約30アミノ酸のペプチド抗原セグメントを組み込んでもよい。具体的には、対応するクラスIペプチド制限細胞障害性T細胞によって認識されるペプチド抗原セグメントは、8から約12アミノ酸、例えば、9から約11アミノ酸を含み、対応するクラスIIペプチド制限ヘルパーT細胞によって認識されるペプチド抗原セグメントは、8から約30アミノ酸、例えば、約12から約24アミノ酸を含む。 The peptide / protein antigen dispersed within the polymer in the vaccine delivery composition of the invention can have any suitable length, but a peptide antigen segment of 8 to about 30 amino acids recognized by peptide-restricted T lymphocytes. May be incorporated. Specifically, the peptide antigen segment recognized by the corresponding class I peptide-restricted cytotoxic T cell comprises 8 to about 12 amino acids, such as 9 to about 11 amino acids, and the corresponding class II peptide-restricted helper T cell The peptide antigen segment recognized by comprises from 8 to about 30 amino acids, for example from about 12 to about 24 amino acids.
自然のT細胞性免疫はMHC分子(APCの表面上の)によるペプチドエピトープの提示を介してはたらくが、MHCはペプチド付加物、特にグリコール-ペプチドおよび脂肪-ペプチドを提示することができ、ここでペプチド部分がMHCによって保持されて糖または脂質部分をT細胞に提示する。いくつかの腫瘍は糖誘導体化タンパク質または脂肪誘導体化タンパク質を過剰発現し、これらの糖または脂肪誘導体化ペプチド断片は、いくつかの場合には、強力なT細胞エピトープでありうるため、前述の考えは癌ワクチン学において特に適切である。さらに、そのようなT細胞エピトープの脂質は糖脂質でありうる。 Natural T-cell immunity works through the presentation of peptide epitopes by MHC molecules (on the surface of the APC), but MHC can present peptide adducts, especially glycol-peptides and fat-peptides, where The peptide moiety is retained by the MHC and presents sugar or lipid moieties to T cells. Some tumors overexpress glycated or fat derivatized proteins, and these sugar or fat derivatized peptide fragments may in some cases be potent T cell epitopes, Is particularly suitable in cancer vaccination. Furthermore, the lipid of such a T cell epitope can be a glycolipid.
通常のペプチド単独提示とは異なり、これらの場合にはT細胞認識はペプチド上の糖または脂質基が主体であり、そういうわけでMHCに高い親和性で結合するが、腫瘍タンパク質由来ではなく、さらに腫瘍関連糖または脂質分子が合成的に共有結合している、短い合成ペプチドがペプチド抗原としてうまく用いられている。天然の腫瘍細胞系統に対する人工的T細胞エピトープ構築に対するこのアプローチは、最近Franco et al., J. Exp. Med (2004) 199(5):707-716により採用された。したがって、合成ペプチド誘導体、およびペプチド様物質でさえも、本発明のペプチド抗原と置き換わり、ワクチン送達組成物に対する説明および特許請求の範囲において使用される「ペプチド抗原」という用語に包含され、ペプチド側鎖および非ペプチド抗原をT細胞に提示するためのプラットフォームを形成する高親和性MHC結合リガンドとして作用することができる。 Unlike normal peptide-only presentation, in these cases T-cell recognition is mainly based on the sugar or lipid group on the peptide, which is why it binds to MHC with high affinity, but is not derived from a tumor protein. Short synthetic peptides, in which tumor-associated sugars or lipid molecules are covalently bound synthetically, have been successfully used as peptide antigens. This approach to artificial T cell epitope construction for natural tumor cell lines was recently adopted by Franco et al., J. Exp. Med (2004) 199 (5): 707-716. Thus, synthetic peptide derivatives, and even peptidomimetics, replace the peptide antigens of the present invention and are encompassed by the term “peptide antigen” used in the description and claims for vaccine delivery compositions, and peptide side chains And can act as a high affinity MHC binding ligand that forms a platform for presenting non-peptide antigens to T cells.
したがって、本明細書において用いられる「ペプチド抗原」なる用語は、ペプチド、全体的にペプチド誘導体(分枝ペプチドなど)およびペプチドの共有結合ヘテロ(糖-および脂肪-および糖脂肪-など)誘導体を意味する。特異的抗体または特異的Tリンパ球によって特に結合されるそのような材料の断片を含むことも意図される。 Thus, as used herein, the term “peptide antigen” refers to peptides, generally peptide derivatives (such as branched peptides), and covalent hetero (such as sugar- and fat- and sugar-fat-) derivatives of peptides. To do. It is also intended to include fragments of such materials that are specifically bound by specific antibodies or specific T lymphocytes.
ペプチド抗原は、当技術分野において公知の任意の技術を用いて合成することができる。ペプチド抗原は、「ペプチド様物質」も含みうる。ペプチド類縁体は、鋳型ペプチドと類似の特性を有する非ペプチド生物活性薬剤として、製薬産業において一般に用いられている。これらの型の非ペプチド化合物は「ペプチド様物質(peptide mimetics)」または「ペプチド様物質(peptidomimetics)」と呼ばれる。Fauchere, J. (1986) Adv. Bioactive agent Res., 15:29;Veber and Freidinger (1985) TINS p. 392;およびEvans et al. (1987) J. Med. Chem., 30:1229;通常はコンピューター分子モデリングによって開発される。一般に、ペプチド様物質は典型的ポリペプチド(すなわち、生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド)と構造的に類似であるが、当技術分野において公知で、下記の参照文献にさらに記載されている方法により、--CH2NH--、--CH2S--、CH2-CH2--、--CH=CH--(シスおよびトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、および--CH2SO--からなる群より選択される結合で任意に置き換えられた一つまたは複数のペプチドを有する:Spatola, A.F. in“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins,”B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983);Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, “Peptide Backbone Modifications”(一般的総説);Morley, J.S., Trends. Pharm. Sci., (1980) pp. 463-468(一般的総説);Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1979) 14:177-185(--CH2NH--、CH2CH2--);Spatola, A.F. et al., Life Sci., (1986) 38:1243-1249(--CH2-S--);Harm, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314(--CH=CH--、シスおよびトランス);Almquist, R.G. et al., J. Med. Chem., (1980) 23:2533(--COCH2--);Jennings-Whie, C. et al., Tetrahedron Lett., (1982) 23:2533(--COCH2--);Szelke, M. et al., European Appln., EP 45665 (1982) CA:97:39405 (1982)(--CH(OH)CH2--);Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett., (1983) 24:4401-4404(--C(OH)CH2--);およびHruby, V.J., Life Sci., (1982) 31:189-199(-CH2-S-)。そのようなペプチド様物質は、例えば、より経済的な製造、より高い安定性、薬理特性増強(半減期、吸収、効力、有効性など)、特異性変更(例えば、広域生物活性)、抗原性低下などを含む、ポリペプチド態様に比べて有意な利点を有すると考えられる。 Peptide antigens can be synthesized using any technique known in the art. Peptide antigens can also include “peptide-like substances”. Peptide analogs are commonly used in the pharmaceutical industry as non-peptide bioactive agents with properties similar to template peptides. These types of non-peptide compounds are referred to as “peptide mimetics” or “peptidomimetics”. Fauchere, J. (1986) Adv. Bioactive agent Res., 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS p. 392; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem., 30: 1229; Developed by computer molecular modeling. In general, peptidomimetics are structurally similar to typical polypeptides (i.e., polypeptides having biochemical properties or pharmacological activity), but are known in the art and further described in the references below. by the method are, - CH 2 NH -, - CH 2 S -, CH 2 -CH 2 -, - CH = CH - ( cis and trans), - COCH 2 -, - Having one or more peptides optionally substituted with a bond selected from the group consisting of CH (OH) CH 2- , and --CH 2 SO--: Spatola, AF in “Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, “B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, AF, Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3,“ Peptide Backbone Modifications (General Review); Morley, JS, Trends. Pharm. Sci., (1980) pp. 463-468 (General Review); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. , (1979) 14: 177-185 (--CH 2 NH--, CH 2 CH 2- ); Spatola, AF et al., L ife Sci., (1986) 38 : 1243-1249 (-CH 2 -S--); Harm, MM, J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH = CH-- Almquist, RG et al., J. Med. Chem., (1980) 23: 2533 (--COCH 2- ); Jennings-Whie, C. et al., Tetrahedron Lett., ( 1982) 23: 2533 (-. . COCH 2 -); Szelke, M. et al, European Appln, EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (- CH (OH) CH 2 - Holladay, MW et al., Tetrahedron Lett., (1983) 24: 4401-4404 (--C (OH) CH 2- ); and Hruby, VJ, Life Sci., (1982) 31: 189- 199 (-CH 2 -S-). Such peptidomimetics include, for example, more economical manufacturing, higher stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorption, potency, efficacy, etc.), specificity changes (e.g. broad spectrum biological activity), antigenicity It is believed to have significant advantages over polypeptide aspects, including reduction.
加えて、ペプチド内の一つまたは複数のアミノ酸の置換(例えば、L-リジンの代わりにD-リジン)を用いて、より安定なペプチドおよび内因性プロテアーゼに抵抗性のペプチドを生成してもよい。または、例えば、生分解性ポリマーに共有結合している合成ペプチド抗原をD-アミノ酸から調製することもでき、これらはインベルソペプチドと呼ばれる。ペプチドが天然ペプチド配列の反対方向に配列される場合、これはレトロペプチドと呼ばれる。一般に、D-アミノ酸から調製したペプチドは酵素加水分解に対して非常に安定である。レトロ-インベルソまたは部分的レトロ-インベルソペプチドについて生物活性が保存されている多くの例が報告されている(米国特許第6,261,569 B1およびその中の引用文献;B. Fromme et al., Endocrinology (2003) 144:3262-3269。 In addition, substitution of one or more amino acids within the peptide (e.g., D-lysine instead of L-lysine) may be used to generate more stable peptides and peptides resistant to endogenous proteases. . Alternatively, for example, synthetic peptide antigens covalently attached to biodegradable polymers can be prepared from D-amino acids, which are called inverso peptides. If the peptide is arranged in the opposite direction of the native peptide sequence, it is called a retropeptide. In general, peptides prepared from D-amino acids are very stable to enzymatic hydrolysis. Many examples of conserved biological activity have been reported for retro-inverso or partially retro-inverso peptides (US Pat. No. 6,261,569 B1 and references cited therein; B. Fromme et al., Endocrinology (2003). 144: 3262-3269.
ペプチド抗原に加えて、本発明のワクチン送達組成物にタンパク質全体を用いることができる。ペプチド抗原は一般的に分子量10,000ダルトン未満のペプチドとして定義される。タンパク質は一つまたは複数のペプチド抗原鎖からなる巨大な高分子である。 In addition to peptide antigens, whole proteins can be used in the vaccine delivery compositions of the invention. Peptide antigens are generally defined as peptides with a molecular weight of less than 10,000 daltons. Proteins are large macromolecules composed of one or more peptide antigen chains.
後に哺乳動物被験体に投与するために、選択したペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントを生分解性ポリマーと結合させる。本発明のワクチン送達組成物は、静脈内、粘膜、筋肉内、または皮下送達のために調製することができる。例えば、本明細書に記載の方法において有用なポリマーには、本明細書に記載のPEA、PEURおよびPEUポリマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらのポリマーは様々な分子量で作成することができ、所与の抗原と共に用いるための適当な分子量は当業者によって容易に決定される。したがって、例えば、適当な分子量は約5,000から約300,000、例えば、約5,000から約250,000、または約75,000から約200,000、または約100,000から約150,000程度であると思われる。 The selected peptide / protein antigen and adjuvant are combined with the biodegradable polymer for later administration to a mammalian subject. The vaccine delivery compositions of the present invention can be prepared for intravenous, mucosal, intramuscular, or subcutaneous delivery. For example, polymers useful in the methods described herein include, but are not limited to, PEA, PEUR, and PEU polymers described herein. These polymers can be made with various molecular weights, and the appropriate molecular weight for use with a given antigen is readily determined by one skilled in the art. Thus, for example, a suitable molecular weight would be about 5,000 to about 300,000, such as about 5,000 to about 250,000, or about 75,000 to about 200,000, or about 100,000 to about 150,000.
本発明のワクチン送達組成物は、ペプチド/タンパク質抗原に対する免疫応答、特に細胞性免疫応答を、抗原の送達を増大する、サイトカイン産生を刺激する、および/または抗原提示細胞を刺激することにより増強することができるアジュバントを含む。アジュバントは、それをペプチド/タンパク質抗原と共にポリマー基質中に分散することにより、例えば、アジュバントを抗原に結合させることにより、投与することができる。または、アジュバントは本発明のワクチン送達組成物と同時に、例えば、同じ組成物中または別の組成物中で投与することもできる。例えば、アジュバントは本発明のワクチン送達組成物の前または後に投与することもできる。さらにまたは、アジュバントもしくはアジュバント抗原は同時送達のために本明細書に記載のポリマー中に分散(例えば化学的結合)させることもできる。そのようなアジュバントには下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない:(1)水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩(ミョウバン);(2)例えば(a)Model 110Yミクロ流体化装置(Microfluidics, Newton, Mass.)などのミクロ流体化装置を用いてミクロン未満の粒子に製剤化した、5%スクアレン、0.5% Tween 80(商標)、および0.5%Span(商標)85を含み、任意に様々な量のMTP-PBを含む、MF59(国際公開公報第90/14837)、(b)ミクロン未満の乳濁液にミクロ流体化したか、またはより大きい粒径の乳濁液を生成するためにボルテックスにかけた、10%スクアレン、0.4% Tween 80(商標)、5%プルロニック-ブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含む、SAF、および(c)2%スクアレン、0.2% Tween 80(商標)、ならびにモノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群より一つまたは複数の細菌細胞壁成分、好ましくはMPL+CWS(登録商標Detox)を含む、Ribi(商標)アジュバント組成物(RAS)(Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)などの水中油乳濁液製剤(ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含む、または含まない);(3)Stimulon(商標)(Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)などのサポニンアジュバントを用いてもよく、またはISCOM(免疫刺激複合体)などのそれらから生成した粒子;(4)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA);(5)インターロイキン(IL-1、IL-2など)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)などのサイトカイン;(6)コレラトキシン(CT)、百日咳毒素(PT)、または大腸菌熱不安定毒素(LT)などの細菌ADP-リボシル化トキシンの解毒変異体、特にLT-K63(63位の野生型アミノ酸がリジンで置換されている)LT-R72(72位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換されている)、CT-S109(109位の野生型アミノ酸がセリンで置換されている)、およびPT-K9/G129(9位の野生型アミノ酸がリジンで置換され、129位がグリシンで置換されている)(例えば、国際公開公報第93/13202号および同第92/19265号参照);および(7)細胞性および液性免疫応答を増強するための、サポニンの精製型であるQS21およびリポ多糖(LPS)の非毒性誘導体である3D-モノホスホリルリピドA(MPL)(Moore, et al., Vaccine. 1999 Jun 4;17(20-21):2517-27)。
The vaccine delivery composition of the present invention enhances an immune response against a peptide / protein antigen, particularly a cellular immune response, by increasing antigen delivery, stimulating cytokine production, and / or stimulating antigen presenting cells. An adjuvant that can. An adjuvant can be administered by dispersing it with a peptide / protein antigen in a polymer matrix, eg, by linking the adjuvant to the antigen. Alternatively, the adjuvant can be administered at the same time as the vaccine delivery composition of the invention, for example, in the same composition or in another composition. For example, the adjuvant can be administered before or after the vaccine delivery composition of the invention. Additionally or alternatively, an adjuvant or adjuvant antigen can be dispersed (eg, chemically conjugated) in the polymers described herein for simultaneous delivery. Such adjuvants include, but are not limited to: (1) aluminum salts such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate (alum); (2) eg (a)
本発明のワクチン送達組成物の有効性を増強するための特に望ましい免疫刺激アジュバントは、免疫刺激薬物(すなわち低分子)、ポリマー、脂質、脂質/糖、脂質/塩、糖、塩、および生物学的製剤であり、その例を以下の表1でタイプごとに並べる。本明細書で使用される「生物学的製剤」という用語は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド(DNA、RNA、cDNAなど)、ポリペプチド(すなわちペプチドまたはタンパク質アジュバント)、ならびにタンパク質を含む。 Particularly desirable immunostimulatory adjuvants for enhancing the effectiveness of the vaccine delivery compositions of the present invention are immunostimulatory drugs (ie, small molecules), polymers, lipids, lipid / sugars, lipid / salts, sugars, salts, and biology. Examples are listed in Table 1 below by type. The term “biological product” as used herein includes oligonucleotides and polynucleotides (DNA, RNA, cDNA, etc.), polypeptides (ie, peptide or protein adjuvants), and proteins.
(表1)
(Table 1)
Toll様受容体(TLR)アゴニストは表1に列挙した免疫刺激アジュバントの中にあり、それは特異的な免疫刺激アジュバントである。TLRアゴニストは、多くは合成されたものであるが、TLRファミリーの特定のメンバーによって認識される分子パターンを含み、かつ対応する免疫応答を活性化する特定のアジュバントリガンドである。本明細書に記載されるように、PEA、PEUR、およびPEUの分子および粒子に基づく本発明のワクチン送達組成物は、抗原提示細胞(APC)(樹状細胞を含む)によって効率よく取り込まれ(貪食され)、そこで取り込まれたペプチド/タンパク質抗原はこれらの細胞の内部で、すなわち細胞内で処理される。従って、本発明の組成物および方法に用いるのに好ましいTLRアゴニストは、細胞内で機能するTLR-7、TLR-8、およびTLR-9などの受容体を標的とするようなものである。例えば、TLR-7およびTLR-8によって認識されるTLRアゴニストは、イミキモドおよびSM360320などの特定の薬物、またはそれらのアデノシンおよび8-ヒドロキシアデニンプロドラッグに基づく低分子リガンドを含む(J. Lee et al. PNAS (2006) 103(6):1828-1823 and A. Kurimoto et al. Chem Pharm. Bull. (2004) 53(3):466-469)。TLR-7アゴニストであるイミキモドは、特に表在型基底細胞癌、光線性角化症、性器いぼ、および黒色腫の治療に用いられる(A. Gupta, et al. J. Cutan. Med. Surg. (2004) 8(5):338-352)。TLR-9アゴニストは、非メチル化CpGセグメントを含み、かつTh-2免疫応答を誘発せずにTh-1応答を誘発する約20残基のデオキシリボヌクレオチドを含む(G. Haker et al. Immunology (2002) 105:245-251)。 Toll-like receptor (TLR) agonists are among the immunostimulatory adjuvants listed in Table 1, which are specific immunostimulatory adjuvants. TLR agonists are specific adjuvant ligands, many of which are synthesized but contain a molecular pattern recognized by specific members of the TLR family and activate the corresponding immune response. As described herein, vaccine delivery compositions of the invention based on PEA, PEUR, and PEU molecules and particles are efficiently taken up by antigen presenting cells (APCs), including dendritic cells ( Peptide / protein antigens that have been phagocytosed and taken up therein are processed inside these cells, ie intracellularly. Accordingly, preferred TLR agonists for use in the compositions and methods of the invention are those that target receptors such as TLR-7, TLR-8, and TLR-9 that function intracellularly. For example, TLR agonists recognized by TLR-7 and TLR-8 include certain drugs such as imiquimod and SM360320, or small molecule ligands based on their adenosine and 8-hydroxyadenine prodrugs (J. Lee et al. PNAS (2006) 103 (6): 1828-1823 and A. Kurimoto et al. Chem Pharm. Bull. (2004) 53 (3): 466-469). Imiquimod, a TLR-7 agonist, is used specifically for the treatment of superficial basal cell carcinoma, actinic keratosis, genital warts, and melanoma (A. Gupta, et al. J. Cutan. Med. Surg. (2004) 8 (5): 338-352). TLR-9 agonists contain unmethylated CpG segments and contain about 20 residues of deoxyribonucleotides that elicit a Th-1 response without eliciting a Th-2 immune response (G. Haker et al. Immunology ( 2002) 105: 245-251).
補体ドメイン3(C3d)またはCD40-リガンド(CD40L)は、B細胞および濾胞樹状細胞の補体受容体2に結合し、抗原特異的抗体産生の増強をもたらすことによって適応免疫を増強する生物学的製剤アジュバントの例である。以下に記載するように、ワクチン調製のための本発明の一段階法を用いて、タンパク質またはポリペプチド免疫原性アジュバントを本発明の組成物に取り込むことができる。
Complement domain 3 (C3d) or CD40-ligand (CD40L) enhances adaptive immunity by binding to complement
本発明の実施における使用に適したポリマーは、ペプチド/タンパク質抗原、アジュバント、または抗原-アジュバント結合体のそれぞれがポリマーに結合すること、またはその中に分散することを可能にする官能基を有する。例えば、カルボキシル基を有するポリマーはアミノ部分と容易に反応し、それにより、生じたアミド基を介してペプチドもしくはタンパク質またはペプチドアジュバントもしくはタンパク質アジュバントをポリマーに共有結合することができる。本明細書に記載するとおり、生分解性ポリマーおよびペプチドまたはアジュバントは、ペプチド/タンパク質抗原および/またはアジュバントを生分解性ポリマーに共有結合させるために用いることができる多くの相補的官能基を含みうる。 Polymers suitable for use in the practice of the present invention have functional groups that allow each of the peptide / protein antigens, adjuvants, or antigen-adjuvant conjugates to be bound to or dispersed within the polymer. For example, a polymer having a carboxyl group readily reacts with an amino moiety, thereby allowing a peptide or protein or peptide adjuvant or protein adjuvant to be covalently attached to the polymer via the resulting amide group. As described herein, biodegradable polymers and peptides or adjuvants can include a number of complementary functional groups that can be used to covalently attach peptide / protein antigens and / or adjuvants to biodegradable polymers. .
本発明のワクチン送達組成物中のポリマーは、ポリマーの生分解の間そのような薬剤を含む粒子またはポリマー分子をゆっくりと放出しながら、個体の免疫細胞がペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントと相互作用して免疫プロセスに影響を与えるのに十分な期間、ペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントを注射部位で維持することによって、インプラント部位での内因性免疫プロセスにおいて積極的な役割を有する。脆弱な生物学的製剤のペプチド/タンパク質抗原をよりゆっくり生分解するポリマーによって保護して、抗原の半減期および持続性を増大させる。 The polymer in the vaccine delivery composition of the present invention allows an individual's immune cells to interact with peptide / protein antigens and adjuvants while slowly releasing particles or polymer molecules containing such agents during polymer biodegradation. By maintaining the peptide / protein antigen and adjuvant at the injection site for a period sufficient to affect the immune process, it has an active role in the endogenous immune process at the implant site. Fragile biopharmaceutical peptide / protein antigens are protected by slower biodegrading polymers to increase the half-life and persistence of the antigen.
ポリマー自体も、ポリマー-抗原-アジュバント組成物の食作用の刺激によって、APCへの抗原の送達における積極的な役割を有しうる。加えて、本明細書に開示するポリマー(例えば、構造式(IおよびIII〜VIII)を有するもの)は、酵素分解後必須アミノ酸を提供し、一方他の分解産物は脂肪酸および糖類が代謝される様式で無害に代謝される。抗原およびアジュバントを含むポリマーの取り込みは安全であり、APCは生存したままで正常に機能し、これらのポリマー分解産物を代謝/排出しうることが試験によって明らかにされている。その結果、本発明のワクチン送達組成物は注射自体による外傷以外は被験体にとって注射部位および全身の両方で実質的に非炎症性である。さらに、APCによるポリマーの能動的取り込みの場合、ポリマーは抗原のアジュバントとして機能することもある。 The polymer itself may also have a positive role in delivering antigen to APC by stimulating the phagocytosis of the polymer-antigen-adjuvant composition. In addition, the polymers disclosed herein (eg, those having structural formulas (I and III-VIII)) provide essential amino acids after enzymatic degradation, while other degradation products metabolize fatty acids and sugars. Metabolized harmlessly in a manner. Studies have shown that the uptake of polymers including antigens and adjuvants is safe and that APCs remain alive and function normally and can metabolize / exclude these polymer degradation products. As a result, the vaccine delivery composition of the present invention is substantially non-inflammatory both at the injection site and throughout the body for the subject other than trauma from the injection itself. Furthermore, in the case of active uptake of the polymer by APC, the polymer may function as an adjuvant for the antigen.
本発明の生体適合性ワクチン送達組成物を形成する際に有用な生分解性ポリマーには、モノマーあたり少なくとも一つの非アミノ酸部分に結合した少なくとも一つのアミノ酸を含むものが含まれる。本明細書において用いられる「非アミノ酸部分」なる用語は様々な化学部分を含むが、特に本明細書に記載のアミノ酸誘導体およびペプチド様物質を除外する。さらに、少なくとも一つのアミノ酸を含むポリマーには、そのように特記されない限り、天然ポリペプチドを含むポリアミノ酸セグメントを含めることを意図しない。ある態様において、モノマー中の2つの隣接アミノ酸の間に非アミノ酸を配置する。別の態様において、非アミノ酸部分は疎水性である。ポリマーはブロックコポリマーであってもよい。 Biodegradable polymers useful in forming the biocompatible vaccine delivery composition of the present invention include those comprising at least one amino acid linked to at least one non-amino acid moiety per monomer. As used herein, the term “non-amino acid moiety” includes various chemical moieties, but specifically excludes the amino acid derivatives and peptidomimetics described herein. Further, a polymer comprising at least one amino acid is not intended to include a polyamino acid segment comprising a natural polypeptide, unless so specified. In certain embodiments, a non-amino acid is placed between two adjacent amino acids in the monomer. In another embodiment, the non-amino acid moiety is hydrophobic. The polymer may be a block copolymer.
本発明の組成物および方法に用いるために好ましい生分解性ポリマーは、主鎖上に組込み官能基またはPEAまたはPEUR骨格を有するポリエステルアミド(PEA)およびポリエステルウレタン(PEUR)で、これらの組込み官能基は他の化学物質と反応し、追加の官能基を組み込んでPEAまたはPEURの官能性をさらに拡大することができる。したがって、例えばポリマーは、ペプチド/タンパク質抗原、アジュバント、およびその他の作用物質と、事前の修飾の必要性無しに反応する、または水への溶解性を増加させるための親水性構造を有するPEGなどのその他の分子と反応する準備ができている。 Preferred biodegradable polymers for use in the compositions and methods of the present invention are polyester amides (PEA) and polyester urethanes (PEUR) with embedded functional groups or PEA or PEUR backbones on the backbone, and these embedded functional groups. Can react with other chemicals and incorporate additional functional groups to further extend the functionality of PEA or PEUR. Thus, for example, the polymer can react with peptide / protein antigens, adjuvants, and other agents without the need for prior modification, or PEG with a hydrophilic structure to increase solubility in water, etc. Ready to react with other molecules.
加えて、本発明のワクチン送達組成物において用いるポリマーは、食塩水(PBS)媒体中で試験した場合、加水分解を示さないが、キモトリプシンすなわちCTなどの酵素水溶液中では、均質な侵食挙動が観察されている。 In addition, the polymers used in the vaccine delivery compositions of the present invention show no hydrolysis when tested in saline (PBS) medium, but a homogeneous erosion behavior is observed in aqueous enzyme solutions such as chymotrypsin or CT. Has been.
一つの態様において、本発明のワクチン送達組成物は生分解性ポリマーとして、以下の少なくとも一つまたは混合物を含む:
構造式(I)に記載の化学式を有するPEA:
式中、nは約5から約150の範囲であり;R1はα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立に選択され;個々のn個のモノマーにおけるR3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立に選択され;かつR4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和または不飽和治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびその組み合わせ、(C2-C20)アルキレン、ならびに(C2-C20)アルケニレンからなる群より独立に選択される;
または構造式(III)で記載される化学式を有するPEA:
式中、nは約5から約150の範囲であり、mは約0.1から0.9の範囲であり:pは約0.9から0.1の範囲であり;R1はα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立に選択され;R2はそれぞれ独立に水素、(C1-C12)アルキルもしくは(C6-C10)アリールまたは保護基であり;個々のm個のモノマーにおけるR3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立に選択され;かつR4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和もしくは不飽和治療的ジオールの残基または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびその組み合わせからなる群より独立に選択され;かつR13は独立して(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルである;
またはポリマーは構造式(IV)で記載される化学式を有するPEUR:
式中、nは約5から約150の範囲であり;R3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立に選択され;R4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片;およびその組み合わせからなる群より選択され、かつR6は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびその組み合わせから独立に選択される;
または、ポリマーは一般構造式(V)で記載される化学構造を有するPEUR:
式中、nは約5から約150の範囲であり、mは約0.1から約0.9の範囲であり:pは約0.9から約0.1の範囲であり;R2は水素、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、または保護基から独立に選択され;個々のm個のモノマーにおけるR3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキルおよび-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立に選択され;R4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療的ジオールの残基および構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、ならびにその組み合わせからなる群より選択され;かつR6は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、飽和または不飽和治療的ジオールの残基の有効量、およびその組み合わせから独立に選択され;かつR13は独立して(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルであり;かつR13は独立して(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルであり、例えば(C3-C6)アルキルまたは(C3-C6)アルケニルである;
または、一般構造式(VI)で記載される化学式を有するPEU:
式中、nは約10から約150であり;個々のn個のモノマーにおけるR3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキルおよび-(CH2)2S(CH3)から独立に選択され;R4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和もしくは不飽和治療的ジオールの残基;または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から独立に選択される;
または、構造式(VII)で記載される化学式を有するPEU:
式中、mは約0.1から約1.0であり;pは約0.9から約0.1であり;nは約10から約150であり;R2はそれぞれ独立に水素、(C1-C12)アルキルまたは(C6-C10)アリールであり;個々のm個のモノマーにおけるR3は水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキルおよび-(CH2)2S(CH3)から独立に選択され;R4はそれぞれ(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和または不飽和治療的ジオールの残基;構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびその組み合わせから独立に選択され;かつR13は独立して(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルであり、例えば(C3-C6)アルキルまたは(C3-C6)アルケニルである。
In one embodiment, the vaccine delivery composition of the invention comprises at least one or a mixture of the following as a biodegradable polymer:
PEA having the chemical formula described in Structural Formula (I):
Where n ranges from about 5 to about 150; R 1 is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy)-(C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 ′-(alkanedioyldioxy Independently selected from residues of dicinnamic acid or 4,4 ′-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid, (C 2 -C 20 ) alkylene, or (C 2 -C 20 ) alkenylene; R 3 in each n monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and-(CH 2 ) 2 S (CH 3 ); independently selected from the group consisting of; and R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, ( C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, structural formula (II) 1,4: 3,6- dianhydrohexitols of the two cyclic fragments, and combinations thereof, (C 2 -C 20) alkylene, and (C 2 -C 20) A It is independently selected from the group consisting of Keniren;
Or PEA having the chemical formula described by Structural Formula (III):
Where n is in the range of about 5 to about 150, m is in the range of about 0.1 to 0.9: p is in the range of about 0.9 to 0.1; R 1 is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy )-(C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 ′-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid or 4,4 ′-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid, (C 2 -C 20 ) alkylene, or (C 2 -C 20 ) alkenylene residues independently selected; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) alkyl or (C 6 -C 10 ) aryl or a protecting group R 3 in each m monomer is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl Independently selected from the group consisting of (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, a saturated or unsaturated Residue or structural formula of sum therapeutic diol (II) 1,4: 3,6- dianhydrohexitols bicyclic fragments, and are independently selected from the group consisting of a combination thereof; and R 13 is independently (C 1 -C 20 ) alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl;
Or the polymer has a PEUR having the chemical formula described by Structural Formula (IV):
Where n ranges from about 5 to about 150; R 3 is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and independently selected from the group consisting of-(CH 2 ) 2 S (CH 3 ); R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) Alkenylene or alkyloxy, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, a bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of structural formula (II); and combinations thereof And R 6 is selected from the group (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of the general formula (II) Independently selected from bicyclic fragments, and combinations thereof;
Alternatively, the polymer has a chemical structure described by the general structural formula (V):
Where n is in the range of about 5 to about 150, m is in the range of about 0.1 to about 0.9; p is in the range of about 0.9 to about 0.1; R 2 is hydrogen, (C 6 -C 10 ) Aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, or independently selected from protecting groups; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 10) aryl (C 1 -C 20) alkyl and - (CH 2) 2 S are independently selected from the group consisting of (CH 3); R 4 is ( C 2 -C 20) alkylene, of (C 2 -C 20) alkenylene or alkyloxy, residues and structure of a saturated or unsaturated therapeutic diol (II) 1,4: 3,6- dianhydrohexitols Selected from the group consisting of a bicyclic fragment of: and combinations thereof; and R 6 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, 1,4 of general formula (II) : Bicyclic of 3,6-dianhydrohexitol Piece, an effective amount of residues of saturated or unsaturated therapeutic diol, and are independently selected from combinations thereof; and R 13 is independently (C 1 -C 20) alkyl or (C 2 -C 20) alkenyl And R 13 is independently (C 1 -C 20 ) alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl, such as (C 3 -C 6 ) alkyl or (C 3 -C 6 ) alkenyl;
Or a PEU having the chemical formula described by the general structural formula (VI):
Where n is from about 10 to about 150; R 3 in each n monomer is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) Independently selected from alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8 ) alkyloxy (C 2 -C 20 ) alkylene, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol; or 1,4: 3,6 of structural formula (II) Independently selected from bicyclic fragments of dianhydrohexitol;
Or PEU having the chemical formula described by Structural Formula (VII):
Wherein m is from about 0.1 to about 1.0; p is from about 0.9 to about 0.1; n is from about 10 to about 150; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) alkyl or (C 6 -C 10 ) aryl; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, Independently selected from (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8 ) alkyloxy (C 2 -C 20 ) alkylene, residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol; 1,4: 3,6-dianne of structural formula (II) Independently selected from bicyclic fragments of hydrohexitol, and combinations thereof; and R 13 is independently (C 1 -C 20 ) alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl, for example (C 3 -C 6) alkyl or (C 3 -C 6) alkenyl.
例えば、本発明の粒子送達組成物において用いるPEAポリマーの一つの代替態様において、少なくとも一つのR1はα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、または4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸の残基であり、かつR4は一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片である。もう一つの代替態様において、PEAポリマーにおけるR1はα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)(C1-C8)アルカン、3,3'--(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、または4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸の残基のいずれかである。さらにもう一つの代替態様において、PEAポリマーにおいてR1は残基1,3-ビス(4-カルボキシフェノキシ)プロパン(CPP)などのα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸または4,4'-(アジポイルジオキシ)二ケイ皮酸であり、かつR4はDASなどの一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片である。
For example, in one alternative embodiment of the PEA polymer used in the particle delivery composition of the present invention, at least one R 1 is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy)-(C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 '-(Alkanedioyldioxy) dicinnamic acid or 4,4'-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid residue, and R 4 is 1,4 of the general formula (II) : Bicyclic fragment of 3,6-dianhydrohexitol. In another alternative embodiment, R 1 in the PEA polymer is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy) (C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 ′-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid Or a residue of 4,4 ′-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid. In yet another alternative embodiment, in the PEA polymer, R 1 is an α, ω-bis (4-carboxyphenoxy) (C 1 -C 8 ) such as the
PEURポリマーの一つの代替態様において、R4の少なくとも一つは1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール(DAS)などの、1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトール(式(II))の二環式断片であり;またはR6は1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール(DAS)などの、1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片である。PEURポリマーのさらなる代替態様において、R4および/またはR6は1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール(DAS)などの、1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片である。 In one alternative embodiment of the PEUR polymer, at least one of R 4 is 1,4: 3,6-dianhydrohexitol (formula (II), such as 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol (DAS). )); Or R 6 is a bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol, such as 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol (DAS) is there. In a further alternative embodiment of the PEUR polymer, R 4 and / or R 6 is a bicyclic 1,4: 3,6-dianhydrohexitol, such as 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol (DAS) It is a fragment.
これらのPEUポリマーは、様々な薬学的および生物学的活性薬剤をヒトおよび他の哺乳動物に送達するための、本発明のワクチン送達組成物を調製するために有用な高分子量ポリマーとして作成することができる。本発明のPEUは、ポリマー鎖中に加水分解により切断可能なエステル基およびα-アミノ酸を含む非毒性天然モノマーを組み込む。PEUの最終生分解産物はα-アミノ酸(生物学的であろうとなかろうと)、ジオール、およびCO2である。PEAおよびPEURとは対照的に、本発明のPEUは結晶または半結晶であり、完全に合成的製剤を可能にする有利な機械的、化学的および生分解特性を有し、したがって結晶および半結晶ポリマー粒子、例えばナノ粒子を製造するのが容易である。 These PEU polymers should be made as high molecular weight polymers useful for preparing the vaccine delivery compositions of the present invention for the delivery of various pharmaceutically and biologically active agents to humans and other mammals. Can do. The PEU of the present invention incorporates non-toxic natural monomers containing ester groups and α-amino acids cleavable by hydrolysis into the polymer chain. The final biodegradation products of PEU are α-amino acids (whether biological or not), diols, and CO 2 . In contrast to PEA and PEUR, the PEU of the present invention is crystalline or semi-crystalline and has advantageous mechanical, chemical and biodegradable properties that allow for fully synthetic formulations, and thus crystalline and semi-crystalline It is easy to produce polymer particles, for example nanoparticles.
例えば、本発明のワクチン送達組成物において用いるPEUポリマーは高い機械的強度を有し、PEUポリマーの表面侵食は生理的条件で存在する、加水分解酵素などの酵素によって触媒されうる。 For example, the PEU polymer used in the vaccine delivery composition of the present invention has high mechanical strength, and surface erosion of the PEU polymer can be catalyzed by enzymes such as hydrolases that exist at physiological conditions.
PEUポリマーの一つの代替態様において、少なくとも一つのR1は1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール(DAS)などの1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片である。 In one alternative embodiment of the PEU polymer, at least one R 1 is a bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol, such as 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol (DAS). is there.
本発明の実施における使用に適した保護基には、当技術分野において公知のt-ブチルおよび他の保護基が含まれる。適当な1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片は、D-グルシトール、D-マンニトール、およびL-イジトールなどの糖アルコール由来でありうる。 Suitable protecting groups for use in the practice of the present invention include t-butyl and other protecting groups known in the art. Suitable bicyclic fragments of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol can be derived from sugar alcohols such as D-glucitol, D-mannitol, and L-iditol.
例えば、1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール(イソソルビド、DAS)は、1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片として用いるために特に適している。 For example, 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol (isosorbide, DAS) is particularly suitable for use as a bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol.
一つの代替態様において、少なくとも一つのnモノマーにおけるR3はCH2Phであり、合成に用いるα-アミノ酸はL-フェニルアラニンである。モノマー中のR3が-CH2-CH(CH3)2である代替態様において、ポリマーはα-アミノ酸、ロイシンを含む。R3を変えることにより、他のα-アミノ酸、例えば、グリシン(R3が-Hである場合)、プロリン(R3がエチレンアミドである場合);アラニン(R3が-CH3である場合)、バリン(R3が-CH(CH3)2である場合)、イソロイシン(R3が-CH(CH3)-CH2-CH3である場合)、フェニルアラニン(R3が-CH2-C6H5である場合);リジン(R3が-(CH2)4-NH2である場合);またはメチオニン(R3が-(CH2)2S(CH3)である場合)を用いることもできる。 In one alternative embodiment, R 3 in at least one n monomer is CH 2 Ph and the α-amino acid used in the synthesis is L-phenylalanine. In an alternative embodiment where R 3 in the monomer is —CH 2 —CH (CH 3 ) 2 , the polymer comprises the α-amino acid, leucine. By varying the R 3, other α- amino acids, for example, (when R 3 is -H) glycine, (if R 3 is ethylene amide) proline; If alanine (R 3 is -CH 3 ), Valine (when R 3 is —CH (CH 3 ) 2 ), isoleucine (when R 3 is —CH (CH 3 ) —CH 2 —CH 3 ), phenylalanine (R 3 is —CH 2 — C 6 H 5 ); lysine (when R 3 is — (CH 2 ) 4 —NH 2 ); or methionine (when R 3 is — (CH 2 ) 2 S (CH 3 )). It can also be used.
ポリマーが式IまたはIII〜VIIのPEA、PEURまたはPEUであるさらなる態様において、R3の少なくとも一つはさらに-(CH2)3-であることができ、R3の少なくとも一つは環化して下記の構造式で記載される化学構造を形成する。
R3が-(CH2)3である場合、ピロリジン-2-カルボン酸(プロリン)に類似のα-イミノ酸を用いる。
In further embodiments where the polymer is PEA, PEUR or PEU of Formula I or III-VII, at least one of R 3 can further be — (CH 2 ) 3 —, and at least one of R 3 is cyclized. The chemical structure described by the following structural formula is formed.
When R 3 is — (CH 2 ) 3 , an α-imino acid similar to pyrrolidine-2-carboxylic acid (proline) is used.
PEA、PEURおよびPEUは、実質的に酵素作用により生分解する生分解性ポリマーであり、したがって分散されたペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントを経時的に放出する。これらのポリマーの構造的特性によって、本発明のワクチン送達組成物はペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントを安定に負荷する一方で、その三次元構造を保存し、したがって生物活性を保存する。 PEA, PEUR, and PEU are biodegradable polymers that biodegrade substantially enzymatically and thus release dispersed peptide / protein antigens and adjuvants over time. Due to the structural properties of these polymers, the vaccine delivery compositions of the present invention stably load peptide / protein antigens and adjuvants while preserving their three-dimensional structure and thus preserving biological activity.
本明細書において用いられる「アミノ酸」および「α-アミノ酸」なる用語は、アミノ基、カルボキシル基および本明細書において定義するR3基などの側鎖R基を含む化合物を意味する。本明細書において用いられる「生物学的α-アミノ酸」なる用語は、合成に用いるアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、またはその混合物から選択されることを意味する。 As used herein, the terms “amino acid” and “α-amino acid” mean a compound containing an amino group, a carboxyl group, and a side chain R group such as the R 3 group as defined herein. The term “biological α-amino acid” as used herein means that the amino acid used for synthesis is selected from phenylalanine, leucine, glycine, alanine, valine, isoleucine, methionine, proline, or mixtures thereof. .
本発明を実施する際に有用なPEA、PEURおよびPEUポリマーにおいて、一つのポリマー分子中で複数の異なるα-アミノ酸を用いることができる。これらのポリマーは反復単位ごとに少なくとも2つの異なるアミノ酸を含んでいてもよく、一つのポリマー分子は分子のサイズに応じてポリマー分子中に複数の異なるα-アミノ酸を含んでいてもよい。一つの代替態様において、本発明のポリマーの作成において用いるα-アミノ酸の少なくとも一つは生物学的α-アミノ酸である。 In PEA, PEUR and PEU polymers useful in practicing the present invention, multiple different α-amino acids can be used in a single polymer molecule. These polymers may contain at least two different amino acids per repeating unit, and one polymer molecule may contain multiple different α-amino acids in the polymer molecule depending on the size of the molecule. In one alternative embodiment, at least one of the α-amino acids used in making the polymer of the present invention is a biological α-amino acid.
例えば、R3がCH2Phである場合、合成に用いる生物学的α-アミノ酸はL-フェニルアラニンである。R3がCH2-CH(CH3)2である代替態様において、ポリマーは生物学的α-アミノ酸、L-ロイシンを含む。本明細書に記載のコモノマー中のR3を変えることにより、他の生物学的α-アミノ酸、例えば、グリシン(R3がHである場合)、アラニン(R3がCH3である場合)、バリン(R3がCH(CH3)2である場合)、イソロイシン(R3がCH(CH3)-CH2-CH3である場合)、フェニルアラニン(R3がCH2-C6H5である場合)、またはメチオニン(R3が-(CH2)2S(CH3)である場合)、およびその混合物を用いることもできる。2-ピロリジンカルボン酸(プロリン)におけるようなR3が-(CH2)3-である場合、生物学的α-イミノ酸を用いることができる。さらにもう一つの代替態様において、本発明のワクチン送達組成物優に含まれる様々なα-アミノ酸はすべて、本明細書に記載の生物学的α-アミノ酸である。 For example, when R 3 is CH 2 Ph, the biological α-amino acid used in the synthesis is L-phenylalanine. In an alternative embodiment where R 3 is CH 2 —CH (CH 3 ) 2 , the polymer comprises a biological α-amino acid, L-leucine. By varying R 3 in the comonomers described herein, other biological α-amino acids such as glycine (when R 3 is H), alanine (when R 3 is CH 3 ), Valine (when R 3 is CH (CH 3 ) 2 ), isoleucine (when R 3 is CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 ), phenylalanine (R 3 is CH 2 -C 6 H 5 In some cases), or methionine (when R 3 is — (CH 2 ) 2 S (CH 3 )), and mixtures thereof. When R 3 is — (CH 2 ) 3 — as in 2-pyrrolidinecarboxylic acid (proline), biological α-imino acids can be used. In yet another alternative embodiment, the various α-amino acids included in the vaccine delivery composition of the present invention are all biological α-amino acids as described herein.
ポリマー分子はリンカーを介してそれに結合されている、または分子間のクロスリンカーに組み込まれているペプチド/タンパク質抗原を有していてもよい。例えば、一つの態様において、ポリマーは構造式VIXを有するポリマー-抗原結合体に含まれる:
式中、n、m、p、R1、R3、およびR4は前述のとおりであり、R5は-O-、-S-、および-NR8-からなる群より選択され、ここでR8はHまたは(C1-C8)アルキルであり;かつR7はペプチド/タンパク質抗原である。
The polymer molecule may have a peptide / protein antigen attached to it via a linker or incorporated into an intermolecular crosslinker. For example, in one embodiment, the polymer is included in a polymer-antigen conjugate having the structural formula VIX:
Wherein n, m, p, R 1 , R 3 , and R 4 are as described above, and R 5 is selected from the group consisting of —O—, —S—, and —NR 8 —, wherein R 8 is H or (C 1 -C 8 ) alkyl; and R 7 is a peptide / protein antigen.
さらにもう一つの態様において、構造式(IX)のポリマーの二分子を架橋して-R5-R7-R5-結合体を提供することができる。もう一つの態様において、下記の構造式Xに示すとおり、ペプチド/タンパク質抗原は構造式IVの一つのポリマー分子の二つの部分に-R5-R7-R5-結合体を通じて共有結合し、R5は-O-、-S-、および-NR8-からなる群より独立に選択され、ここでR8はHまたは(C1-C8)アルキルであり;かつR7はペプチド/タンパク質抗原である。
In yet another embodiment, two molecules of the polymer of structural formula (IX) can be cross-linked to provide a —R 5 —R 7 —R 5 — conjugate. In another embodiment, the peptide / protein antigen is covalently attached through a —R 5 —R 7 —R 5 — conjugate to two parts of one polymer molecule of formula IV, as shown in Structural Formula X below: R 5 is independently selected from the group consisting of —O—, —S—, and —NR 8 —, wherein R 8 is H or (C 1 -C 8 ) alkyl; and R 7 is a peptide / protein It is an antigen.
または、下記の構造式(XI)に示すとおり、リンカーである-X-Y-を構造式(VIII)の分子中のR5とペプチド/タンパク質抗原R7との間に挿入することができ、ここでXは(C1-C18)アルキレン、置換アルキレン、(C3-C8)シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、O、N、およびSの群より選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5〜6員複素環系、置換複素環、(C2-C18)アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、C6およびC10アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アリールアルキニル、置換アリールアルキニル、アリールアルケニル、置換アリールアルケニル、アリールアルキニル、置換アリールアルキニルからなる群より選択され、ここで置換基はH、F、Cl、Br、I、(C1-C6)アルキル、-CN、-NO2、-OH、-O(C1-C4)アルキル、-S(C1-C6)アルキル、-S[(=O)(C1-C6)アルキル]、-S[(O2)(C1-C6)アルキル]、-C[(=O)(C1-C6)アルキル]、CF3、-O[(CO)-(C1-C6)アルキル]、-S(O2)[N(R9R10)]、-NH[(C=O)(C1-C6)アルキル]、-NH(C=O)N(R9R10)、-N(R9R10)の群より選択され;ここでR9およびR10は独立にHまたは(C1-C6)アルキルであり;かつYは-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O2)-、-NR8-、-C(=O)-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NR8C(=O)-、-C(=O)NR8-、-NR8C(=O)NR8-、-NR8C(=O)NR8-、および-NR8C(=S)NR8-からなる群より選択される。
Alternatively, as shown in the following structural formula (XI), a linker -XY- can be inserted between R 5 and peptide / protein antigen R 7 in the molecule of structural formula (VIII), where X contains 1 to 3 heteroatoms selected from the group of (C 1 -C 18 ) alkylene, substituted alkylene, (C 3 -C 8 ) cycloalkylene, substituted cycloalkylene, O, N, and S 6-membered heterocyclic ring system, substituted heterocycle, (C 2 -C 18) alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, C 6 and C 10 aryl, substituted aryl, heteroaryl, substituted heteroaryl, alkylaryl, substituted alkyl Selected from the group consisting of aryl, arylalkynyl, substituted arylalkynyl, arylalkenyl, substituted arylalkenyl, arylalkynyl, substituted arylalkynyl, wherein the substituents are H, F, Cl, Br, I, (C 1 -C 6 ) alkyl, -CN, -NO 2 , -OH, -O (C 1 -C 4 ) alkyl, -S (C 1 -C 6 ) alkyl, -S [(= O) (C 1 -C 6 ) alkyl], -S [(O 2 ) (C 1 -C 6 ) alkyl], -C [(= O) (C 1 -C 6 ) alkyl], CF 3 , -O [(CO)-( C 1 -C 6) alkyl], - S (O 2) [N (R 9 R 10)], - NH [(C = O) (C 1 -C 6) alkyl], - NH (C = O ) Selected from the group of N (R 9 R 10 ), —N (R 9 R 10 ); wherein R 9 and R 10 are independently H or (C 1 -C 6 ) alkyl; and Y is —O -, - S -, - SS -, - S (O) -, - S (O 2) -, - NR 8 -, - C (= O) -, - OC (= O) -, - C (= O) O -, - OC ( = O) NH -, - NR 8 C (= O) -, - C (= O) NR 8 -, - NR 8 C (= O) NR 8 -, - NR 8 C (= O) NR 8 -, and -NR 8 C (= S) NR 8 - is selected from the group consisting of.
もう一つの態様において、一つのペプチド/タンパク質抗原の二つの部分は-R5-R7-Y-X-R5-架橋を通じて生物活性薬剤に共有結合する(式XII):
式中、Xは(C1-C18)アルキレン、置換アルキレン、(C3-C8)シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、O、N、およびSの群より選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5-6員複素環系、置換複素環、(C2-C18)アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、(C6-C10)アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アリールアルキニル、置換アリールアルキニル、アリールアルケニル、置換アリールアルケニル、アリールアルキニル、置換アリールアルキニルからなる群より選択され、ここで置換基はH、F、Cl、Br、I、(C1-C6)アルキル、-CN、-NO2、-OH、-O(C1-C6)アルキル、-S(C1-C6)アルキル、-S[(=O)(C1-C6)アルキル]、-S[(O2)(C1-C6)アルキル]、-C[(=O)(C1-C6)アルキル]、CF3、-O[(CO)-(C1-C6)アルキル]、-S(O2)[N(R9R10)]、-NH[(C=O)(C1-C6)アルキル]、-NH(C=O)N(R9R10)(ここでR9およびR10は独立にHまたは(C1-C6)アルキルである)、および-N(R11R12)(ここでR11およびR12は(C2-C20)アルキレンおよび(C2-C20)アルケニレンから独立に選択される)からなる群より選択される。
In another embodiment, the two portions of one peptide / protein antigen are covalently attached to the bioactive agent through a —R 5 —R 7 —YXR 5 — bridge (Formula XII):
Wherein X is 1 to 3 heteroatoms selected from the group of (C 1 -C 18 ) alkylene, substituted alkylene, (C 3 -C 8 ) cycloalkylene, substituted cycloalkylene, O, N, and S 5- to 6-membered heterocyclic ring system containing, substituted heterocycle, (C 2 -C 18) alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, (C 6 -C 10) aryl, substituted aryl, heteroaryl, substituted heteroaryl, Selected from the group consisting of alkylaryl, substituted alkylaryl, arylalkynyl, substituted arylalkynyl, arylalkenyl, substituted arylalkenyl, arylalkynyl, substituted arylalkynyl, wherein the substituents are H, F, Cl, Br, I, ( C 1 -C 6 ) alkyl, -CN, -NO 2 , -OH, -O (C 1 -C 6 ) alkyl, -S (C 1 -C 6 ) alkyl, -S [(= O) (C 1 -C 6 ) alkyl], -S [(O 2 ) (C 1 -C 6 ) alkyl], -C [(= O) (C 1 -C 6 ) alkyl], CF 3 , -O [(CO)-(C 1 -C 6 ) alkyl], -S (O 2 ) [N (R 9 R 10 )], -NH [(C = O) (C 1 -C 6 ) alkyl ], -NH (C = O) N (R 9 R 10 ), wherein R 9 and R 10 are independently H or (C 1 -C 6 ) alkyl, and -N (R 11 R 12 ) Wherein R 11 and R 12 are selected from the group consisting of (C 2 -C 20 ) alkylene and (C 2 -C 20 ) alkenylene, independently selected.
さらにもう一つの態様において、4分子のポリマーは共に連結しており、4分子のうちの2分子だけはR7を持たず、架橋して一つの-R5-X-R5-結合体を提供する。 In yet another embodiment, the four molecules of the polymer are linked together and only two of the four molecules do not have R 7 and are cross-linked to provide a single -R 5 -XR 5 -conjugate. .
「アリール」なる用語は、本明細書における構造式に関して、フェニル基または少なくとも一つの環が芳香族である、約9から10個の環原子を有するオルト縮合二環式炭素環基を示すために用いる。特定の態様において、一つまたは複数の環原子は一つまたは複数のニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル、またはトリフルオロメトキシで置換することができる。アリールの例には、フェニル、ナフチル、およびニトロフェニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。 The term “aryl” in relation to structural formulas herein refers to a phenyl group or an ortho-fused bicyclic carbocyclic group having about 9 to 10 ring atoms, where at least one ring is aromatic. Use. In certain embodiments, one or more ring atoms can be substituted with one or more nitro, cyano, halo, trifluoromethyl, or trifluoromethoxy. Examples of aryl include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, and nitrophenyl.
「アルケニレン」なる用語は、本明細書における構造式に関して、主鎖または側鎖に少なくとも一つの不飽和結合を含む、二価分枝または非分枝炭化水素鎖を意味するために用いる。 The term “alkenylene” is used with respect to the structural formulas herein to mean a divalent branched or unbranched hydrocarbon chain containing at least one unsaturated bond in the main chain or side chain.
本明細書において用いられる「治療的ジオール」とは、合成的に生成されようと、天然(例えば、内因性)であろうと、ヒトなどの哺乳動物に投与した場合、治療的または対症的様式でその哺乳動物個体の生物学的プロセスに影響を及ぼす、任意のジオール分子を意味する。 As used herein, "therapeutic diol" refers to a therapeutic or symptomatic manner when administered to a mammal, such as a human, whether produced synthetically or naturally (e.g., endogenous). By any diol molecule that affects the biological process of the mammalian individual.
本明細書において用いられる「治療的ジオールの残基」なる用語は、本明細書に記載の治療的ジオールの一部を意味し、この部分はジオールの2個のヒドロキシル基は除外する。その「残基」を含む対応する治療的ジオールをポリマー組成物の合成において用いる。治療的ジオールの残基は、組成物を作成するために選択したPEA、PEURまたはPEUポリマーの特性(これらの特性は当技術分野において公知で、本明細書に記載のとおりである)に応じて制御された様式での生分解によりポリマーの主鎖から放出された後、インビボで(またはpH、水性媒体などの類似の条件下で)対応するジオールに再構成される。 As used herein, the term “residue of a therapeutic diol” refers to a portion of the therapeutic diol described herein, which excludes the two hydroxyl groups of the diol. The corresponding therapeutic diol containing that “residue” is used in the synthesis of the polymer composition. The residue of the therapeutic diol depends on the properties of the PEA, PEUR, or PEU polymer selected to make the composition (these properties are known in the art and are described herein). After release from the polymer backbone by biodegradation in a controlled manner, it is reconstituted in vivo (or under similar conditions such as pH, aqueous medium, etc.) to the corresponding diol.
本発明の組成物において用いるPEA、PEURおよびPEUポリマーは汎用性であるため、ポリマー主鎖中に組み込まれる治療的ジオールの量は、ポリマーの構築ブロックの比率を変えることによって制御することができる。例えば、PEAの組成に応じて、17β-エストラジオールの40重量%までの負荷を達成することができる。17β-エストラジオールの様々な負荷比を有する三つの異なる規則的直鎖PEAを以下のスキーム1に例示する。
同様に、PEURおよびPEUへの治療的ジオールの負荷も、ポリマーの複数の構築ブロックの量を変えることにより変動させることができる。
Since the PEA, PEUR and PEU polymers used in the compositions of the present invention are versatile, the amount of therapeutic diol incorporated into the polymer backbone can be controlled by varying the ratio of the polymer building blocks. For example, depending on the composition of PEA, a loading of up to 40% by weight of 17β-estradiol can be achieved. Three different regular linear PEAs with various loading ratios of 17β-estradiol are illustrated in
Similarly, the loading of therapeutic diols on PEUR and PEU can also be varied by changing the amount of multiple building blocks of the polymer.
加えて、4-アンドロステン-3,17ジオール(4-アンドロステンジオール)、5-アンドロステン-3,17ジオール(5-アンドロステンジオール)、19-ノル5-アンドロステン-3,17ジオール(19-ノルアンドロステンジオール)などのテストステロンまたはコレステロールに基づく合成ステロイド性ジオールは、本発明のPEAおよびPEURポリマーの主鎖に組み込むのに適している。さらに、本発明のワクチン送達組成物の調製において用いるのに適した治療的ジオール化合物には、例えば、アミカシン;アンホテリシンB;アピサイクリン;アプラマイシン;アルベカシン;アジダムフェニコール;バンベルマイシン;ブチロシン;カルボマイシン;セフピラミド;クロラムフェニコール;クロルテトラサイクリン;クリンダマイシン;クロモサイクリン;デメクロサイクリン;ジアチモスルホン;ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン;ジリスロマイシン;ドキシサイクリン;エリスロマイシン;フォーチミシン;ゲンタマイシン;グルコスルホン ソラスルホン;グアメサイクリン;イセパマイシン;ジョサマイシン;カナマイシン;ロイコマイシン;リンコマイシン;ルセンソマイシン;ライムサイクリン;メクロサイクリン;メタサイクリン;ミクロノマイシン;ミデカマイシン;ミノサイクリン;ムピロシン;ナタマイシン;ネオマイシン;ネチルマイシン;オレアンドマイシン;オキシテトラサイクリン;パロマイシン;ピパサイクリン;ポドフィリニック酸2-エチルヒドラジン;プリマイシン;リボスタマイシン;リファミド;リファンピン;ラファマイシンSV;リファペンチン;リファキシミン;リストセチン;ロキタマイシン;ロリテトラサイクリン;ラサラマイシン;ロキシスロマイシン;サンサイクリン;シソマイシン;スペクチノマイシン;スピラマイシン;ストレプトマイシン;テイコプラニン;テトラサイクリン;チアンフェニコール;テイオストレプトン;トブラマイシン;トロスペクトマイシン;ツベラクチノマイシン;バンコマイシン;カンジシジン;クロルフェネシン;デルモスタチン;フィリピン;フンギクロミン;カナマイシン;ロイコマイシン;リンコマイシン;ルブセンソマイシン;ライムサイクリン;メクロサイクリン;メタサイクリン;ミクロノマイシン;ミデカマイシン;ミノサイクリン;ムピロシン;ナタマイシン;ネオマイシン;ネチルマイシン;オレアンドマイシン;オキシテトラサイクリン;パラモマイシン;ピパサイクリン;ポドフィリニック酸2-エチルヒドラジン;プリイシン;リボスタマイジン;リファミド;リファンピン;リファマイシンSV;リファペンチン;リファキシミン;リストセチン;ロキタマイシン;ロリテトラサイクリン;ラサラマイシン;ロキシスロマイシン;サンサイクリン;シソマイシン;スペクチノマイシン;スピラマイシン;ストレプトン;オトブラマイシン;トロスペクトマイシン;ツベラクチノマイシン;バンコマイシン;カンジシジン;クロルフェネシン;デルモスタチン;フィリピン;フンギクロミン;メパルチシン;マイスタチン;オリゴマイシン;エリマイシンA;ツベルシジン;6-アザウリジン;アクラシノマイシン;アンシタビン;アントラマイシン;アザシタジン;ブレオマイシン カルビシン;カルジノフィリンA;クロロゾトシン;クロモムシン;ドキシフルリジン;エノシタビン;エピルビシン;ゲムシタビン;マンノムスチン;メノガリル;アトルバシ プラバスタチン;クラリスロマイシン;ロイプロリン;パクリタキセル;ミトブロニトール;ミトラクトール;モピダモール;ノガラマイシン;オリボマイシン;ペプロマイシン;ピラルビシン;プレドニムスチン;プロマイシン;ラニムスチン;ツベルシジン;ビネシン;ゾルビシン;クメタロール;ジクマロール;ビスクマセタートエチル;エチリジンジクマロール;イロプロスト;タプロステン;チオクロマロール;アミプリロース;ロムルチド;シロリムス(ラパマイシン);タクロリムス;サリチルアルコール;ブロモサリゲニン;ジタゾール;フェプラジノール;ゲンチシン酸;グルカメタシン;オルサラジン;S-アデノシルメチオニン;アジスロマイシン;サルメテロール;ブデソニド;アルブテアル;インジナビル;フルバスタチン;ストレプトゾシン;ドキソルビシン;ダウノルビシン;プリカマイシン;イダルビシン;ペントスタチン;メトキサントロン;シタラビン;フルダラビンホスファート;フロキシウリジン;クラドリイン;カペシタビエン;ドセタキセル;エトポシド;トポテカン;ビンブラスチン;テニポシドなどが含まれる。治療的ジオールは飽和または不飽和ジオールのいずれかであるように選択することができる。 In addition, 4-androstene-3,17 diol (4-androstene diol), 5-androstene-3,17 diol (5-androstene diol), 19-nor 5-androstene-3,17 diol ( Synthetic steroidal diols based on testosterone or cholesterol (such as 19-norandrostenediol) are suitable for incorporation into the backbone of the PEA and PEUR polymers of the present invention. In addition, therapeutic diol compounds suitable for use in preparing the vaccine delivery compositions of the present invention include, for example, amikacin; amphotericin B; apycyclin; Carbomycin; cefpyramide; chloramphenicol; chlortetracycline; clindamycin; chromocycline; demeclocycline; diathimosulfone; dibekacin, dihydrostreptomycin; dirithromycin; doxycycline; erythromycin; Cyclin; isepamicin; josamycin; kanamycin; leucomycin; lincomycin; lucensomycin; lime cyclin; Cyclin; metacycline; micronomycin; midecamycin; minocycline; mupirocin; natamycin; netilmycin; oleandomycin; oxytetracycline; paromycin; pipacyclinic acid: 2-ethylhydrazine podophyllic acid; Rafamycin SV; rifapentine; rifaximin; ristocetin; roquitamycin; loritetracycline; lasalamycin; roxithromycin; sancycline; sisomycin; ; Trospectomycin; Tuberactinomycin; Ban Candycidin; Chlorphenesin; Delmostatin; Philippines; Fungichromin; Kanamycin; Leucomycin; Lincomycin; Lubusenomycin; Limecycline; Meclocycline; Metacycline; Micronomycin; Midecamycin; Minocycline; Oxytetracycline; paramomycin; pipetacycline; 2-ethylhydrazine podophyllic acid; pricin; ribostamidine; rifamid; Thromycin; sancycline; sisomycin; spectinomycin Spiramycin; Strepton; Otobramycin; Trospectomycin; Tubercactinomycin; Vancomycin; Candicidin; Chlorphenesine; Delmostatin; Philippines; Fungichromin; Meparticin; Aclacinomycin; Ancitabine; Anthramycin; Azacitadine; Bleomycin Carbicin; Cardinophilin A; Chlorozotocin; Cromomcine; Doxyfluridine; Enocitabine; Mopidamol; nogaramycin; olivomycin; peploma Icine; Pirarubicin; Prednimustine; Puromycin; Ranimustine; Tubercidin; Vinesin; Zorubicin; Coumarol; Dicoumarol; Biscumacetate ethyl; Ethylidine dicoumarol; Iloprost; Taprosten; Salicyl alcohol; bromosaligenin; ditazole; feprazinol; gentisic acid; glucamethacin; olsalazine; Methoxantrone; cytarabine; fludarabine phosphor Toxic; Furoxiuridine; Cladridin; Capecitabien; Docetaxel; Etoposide; Topotecan; Vinblastine; Teniposide. The therapeutic diol can be selected to be either a saturated or unsaturated diol.
本明細書における分子量および多分散性をポリスチレン標準を用いてのゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)により調べる。特に、数および重量平均分子量(MnおよびMw)を、例えば、高圧液体クロマトグラフィポンプ、Waters 486 UV検出器およびWaters 2410示差屈折率検出器を備えたModel 510ゲル浸透クロマトグラフィ(Water Associates, Inc., Milford, MA)を用いて調べる。テトラヒドロフラン(THF)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)またはN,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)を溶離剤として用いる(1.0mL/分)。狭い分子量分布を有するポリスチレンまたはポリ(メタクリル酸メチル)標準を較正用に用いた。 The molecular weight and polydispersity herein are examined by gel permeation chromatography (GPC) using polystyrene standards. In particular, the number and weight average molecular weight (M n and M w ) were measured using, for example, a Model 510 gel permeation chromatography (Water Associates, Inc., equipped with a high pressure liquid chromatography pump, a Waters 486 UV detector and a Waters 2410 differential refractive index detector. , Milford, MA). Tetrahydrofuran (THF), N, N-dimethylformamide (DMF) or N, N-dimethylacetamide (DMAc) is used as eluent (1.0 mL / min). A polystyrene or poly (methyl methacrylate) standard with a narrow molecular weight distribution was used for calibration.
本明細書において用いられる「アミノ酸」および「α-アミノ酸」なる用語は、アミノ基、カルボキシル基および本明細書において定義するR3基などの側鎖R基を含む化合物を意味する。本明細書において用いられる「生物学的α-アミノ酸」なる用語は、合成に用いるアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、またはその混合物から選択されることを意味する。 As used herein, the terms “amino acid” and “α-amino acid” mean a compound containing an amino group, a carboxyl group, and a side chain R group such as the R 3 group as defined herein. The term “biological α-amino acid” as used herein means that the amino acid used for synthesis is selected from phenylalanine, leucine, glycine, alanine, valine, isoleucine, methionine, proline, or mixtures thereof. .
一般式中にα-アミノ酸を含む構造式(I)および(III〜VII)のポリマーの製造法は当技術分野において公知である。例えば、R4がα-アミノ酸に組み込まれている構造式(I)のポリマーの態様について、ポリマー合成のために、例えば、側鎖R3を含むα-アミノ酸をジオールHO-R4-OHと縮合することにより、側鎖R3を有するα-アミノ酸をエステル化を通してビス-α,ω-ジアミンに変換することができる。その結果、反応性α,ω-アミノ基を有するジエステルモノマーが生じる。次いで、ビス-α,ω-ジアミンはセバシン酸などの二酸、またはそのビス-活性エステル、もしくはビス-塩化アシルとの重縮合反応に入り、エステルとアミド結合の両方を有する最終ポリマー(PEA)を得る。または、PEURについては、二酸の代わりに、R6は上で定義されており、R13は独立にニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシの一つまたは複数で置換されていてもよい(C6-C10)アリールである、式(XII)のジカルボン酸誘導体を用いる。
Methods for preparing polymers of structural formulas (I) and (III-VII) containing α-amino acids in the general formula are known in the art. For example, for an embodiment of a polymer of structural formula (I) where R 4 is incorporated into an α-amino acid, for polymer synthesis, for example, an α-amino acid containing a side chain R 3 may be combined with the diol HO-R 4 —OH. By condensation, an α-amino acid having a side chain R 3 can be converted to bis-α, ω-diamine through esterification. The result is a diester monomer having a reactive α, ω-amino group. The bis-α, ω-diamine then enters a polycondensation reaction with a diacid such as sebacic acid, or its bis-active ester, or bis-acyl chloride, to give a final polymer (PEA) having both ester and amide linkages. Get. Or, for PEUR, instead of diacid, R 6 is defined above and R 13 is independently substituted with one or more of nitro, cyano, halo, trifluoromethyl or trifluoromethoxy. The dicarboxylic acid derivative of formula (XII), which may be (C 6 -C 10 ) aryl, is used.
特に、
かつ/または(b)R4は-CH2-CH=CH-CH2-である、上で開示した構造式(I)の生分解性ポリマーとして有用な不飽和ポリ(エステル-アミド)(UPEA)の合成を記載する。(a)が存在し、(b)が存在しない場合、(I)におけるR4は-C4H8-または-C6H12-である。(a)が存在せず、(b)が存在する場合、(I)におけるR1は-C4H8-または-C8H16-である。
In particular,
And / or (b) an unsaturated poly (ester-amide) (UPEA) useful as a biodegradable polymer of structural formula (I) disclosed above, wherein R 4 is —CH 2 —CH═CH—CH 2 —. ) Is described. When (a) is present and (b) is not present, R 4 in (I) is —C 4 H 8 — or —C 6 H 12 —. When (a) is not present and (b) is present, R 1 in (I) is —C 4 H 8 — or —C 8 H 16 —.
UPEAは(1)R4中に少なくとも一つの二重結合を含むビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩と飽和ジカルボン酸のジ-p-ニトロフェニルエステル、または(2)R4中に二重結合を含まないビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩と不飽和ジカルボン酸のジニトロフェニルエステル、または(3)R4中に少なくとも一つの二重結合を含むビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩と不飽和ジカルボン酸のジニトロフェニルエステルのいずれかの溶液重縮合により調製することができる。 UPEA is (1) a di-p-toluenesulfonate of a bis (alpha-amino acid) diester containing at least one double bond in R 4 and a di-p-nitrophenyl ester of a saturated dicarboxylic acid, or (2) bis no double bonds in R 4 (alpha - amino acid) di -p- dinitrophenyl ester toluenesulfonate and unsaturated dicarboxylic acids diester or (3), at least one double bond in R 4 Can be prepared by solution polycondensation of either di-p-toluenesulfonate of a bis (alpha-amino acid) diester containing dinitrophenyl ester of an unsaturated dicarboxylic acid.
p-トルエンスルホン酸の塩は、アミノ酸残基を含むポリマーを合成する際に使用されることが公知である。ビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルのアリールスルホン酸塩は再結晶を通じて容易に精製され、後処理の間、アミノ基を非反応性のアンモニウムトシラートとするため、遊離塩基の代わりにアリールスルホン酸塩を用いる。重縮合反応において、求核性のアミノ基はトリエチルアミンなどの有機塩基の添加を通して容易に現れ、したがってポリマー生成物が高収率で得られる。 It is known that p-toluenesulfonic acid salts are used in the synthesis of polymers containing amino acid residues. The aryl sulfonate salt of the bis (alpha-amino acid) diester is easily purified through recrystallization, and the amino group is converted to a non-reactive ammonium tosylate during workup, so the aryl sulfonate salt can be used instead of the free base. Use. In the polycondensation reaction, the nucleophilic amino group is readily revealed through the addition of an organic base such as triethylamine, and thus the polymer product is obtained in high yield.
不飽和ジカルボン酸のジ-p-ニトロフェニルエステルは、p-ニトロフェノールおよび不飽和ジカルボン酸塩化物から、例えば、トリエチルアミンおよびp-ニトロフェノールをアセトン中に溶解し、不飽和ジカルボン酸塩化物を-78℃で撹拌しながら滴下し、水に注いで生成物を沈澱させることにより合成することができる。この目的に適した酸塩化物には、フマル酸、マレイン酸、メサコン酸、シトラコン酸、グルタコン酸、イタコン酸、エテニル-ブタン二酸および2-プロペニル-ブタン二酸塩化物が含まれる。 Di-p-nitrophenyl ester of unsaturated dicarboxylic acid can be obtained from p-nitrophenol and unsaturated dicarboxylic acid chloride by, for example, dissolving triethylamine and p-nitrophenol in acetone, It can be synthesized by dripping with stirring at 78 ° C. and pouring into water to precipitate the product. Suitable acid chlorides for this purpose include fumaric acid, maleic acid, mesaconic acid, citraconic acid, glutaconic acid, itaconic acid, ethenyl-butanedioic acid and 2-propenyl-butanedioic acid chloride.
ビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルのジアリールスルホン酸塩は、トルエン中のアルファ-アミノ酸、p-アリールスルホン酸(例えば、p-トルエンスルホン酸一水和物)、および飽和または不飽和ジオールを混合し、水の発生が最小になるまで加熱還流し、次いで冷却することにより、調製することができる。この目的のために有用な不飽和ジオールには、例えば、2-ブテン-1,3-ジオールおよび1,18-オクタデカ-9-エン-ジオールが含まれる。 A diaryl sulfonate salt of a bis (alpha-amino acid) diester mixes an alpha-amino acid in toluene, p-aryl sulfonic acid (e.g., p-toluenesulfonic acid monohydrate), and a saturated or unsaturated diol, It can be prepared by heating to reflux until the generation of water is minimized and then cooling. Useful unsaturated diols for this purpose include, for example, 2-butene-1,3-diol and 1,18-octadeca-9-ene-diol.
ジカルボン酸の飽和ジ-p-ニトロフェニルエステルおよびビス(アルファ-アミノ酸)ジエステルの飽和ジ-p-トルエンスルホン酸塩は、米国特許第6,503,538 B1号に記載のとおりに調製することができる。 Saturated di-p-nitrophenyl esters of dicarboxylic acids and saturated di-p-toluenesulfonates of bis (alpha-amino acid) diesters can be prepared as described in US Pat. No. 6,503,538 B1.
上で開示した構造式(I)の生分解性ポリマーとして有用な不飽和ポリ(エステル-アミド)(UPEA)の合成をここで記載する。構造式(I)を有するUPEAは、米国特許第6,503,538号の(III)のR4および/または第6,503,538号の(V)のR1が前述の(C2-C20)アルケニレンである以外は、米国特許第6,503,538 B1号の化合物(VII)と類似の様式で調製することができる。反応は、例えば、無水トリエチルアミンを無水N,N-ジメチルアセトアミド中の前記第6,503,538号の(III)および(IV)ならびに前記第6,503,538号の(V)の混合物中に室温で加え、次いで温度を80℃まで上げて16時間撹拌し、次いで反応溶液を室温まで冷却し、エタノールで希釈し、水に注ぎ、ポリマーを分離し、分離したポリマーを水で洗浄し、減圧下、約30℃で乾燥し、次いでp-ニトロフェノールおよびp-トルエンスルホン酸塩についての試験結果が陰性となるまで精製することにより実施する。好ましい反応物(IV)はリジンベンジルエステルのp-トルエンスルホン酸塩で、ベンジルエステル保護基を好ましくは(II)から除去して生分解性を付与するが、水素化分解は所望の二重結合を飽和すると思われるため、これは米国特許第6,503,538号の実施例22のように水素化分解によって除去すべきではなく、それよりもベンジルエステル基を不飽和を保存すると思われる方法により酸基に変換すべきである。または、リジン反応物(IV)を、最終生成物において不飽和を保護しながら容易に除去することができる、ベンジル以外の保護基で保護することもでき、例えば、リジン反応物をt-ブチルで保護することもでき(すなわち、反応物はリジンのt-ブチルエステルでありうる)、t-ブチルは生成物(II)を酸で処理することにより、不飽和を保存しつつHに変換することができる。 The synthesis of unsaturated poly (ester-amide) (UPEA) useful as a biodegradable polymer of structural formula (I) disclosed above is now described. UPEA having the structural formula (I) is the same except that R 4 of (III) of US Pat. No. 6,503,538 and / or R 1 of (V) of 6,503,538 is the above-mentioned (C 2 -C 20 ) alkenylene. Can be prepared in a similar manner to compound (VII) of US Pat. No. 6,503,538 B1. The reaction is performed, for example, by adding anhydrous triethylamine into a mixture of said 6,503,538 (III) and (IV) and said 6,503,538 (V) in anhydrous N, N-dimethylacetamide at room temperature, The reaction solution is cooled to room temperature, diluted with ethanol, poured into water, the polymer is separated, the separated polymer is washed with water and dried at about 30 ° C. under reduced pressure. This is followed by purification until the test results for p-nitrophenol and p-toluenesulfonate are negative. The preferred reactant (IV) is p-toluenesulfonate of lysine benzyl ester, preferably removing the benzyl ester protecting group from (II) to confer biodegradability, but hydrogenolysis is the desired double bond. This should not be removed by hydrogenolysis as in Example 22 of US Pat.No. 6,503,538; rather, the benzyl ester group is converted to the acid group by a method that appears to preserve unsaturation. Should be converted. Alternatively, the lysine reactant (IV) can be protected with a protecting group other than benzyl, which can be easily removed while protecting the unsaturation in the final product, eg, the lysine reactant with t-butyl. Can also be protected (i.e., the reactant can be a t-butyl ester of lysine), which can be converted to H while preserving unsaturation by treating the product (II) with an acid. Can do.
構造式(I)を有する化合物の実用例は、第6,503,538号の実施例1における(III)をビス(L-フェニルアラニン)2-ブテン-1,4-ジエステルのp-トルエンスルホン酸塩で置換することにより、または第6,503,538号の実施例1における(V)をフマル酸ジ-p-ニトロフェニルで置換することにより、または第6,503,538号の実施例1におけるIIIをL-フェニルアラニン2-ブテン-1,3-ジエステルのp-トルエンスルホン酸塩で置換することにより、また第6,503,538号の実施例1における(V)をフマル酸デ-p-ニトロフェニルで置換することにより提供される。 A practical example of a compound having the structural formula (I) is to replace (III) in Example 1 of 6,503,538 with p-toluenesulfonate of bis (L-phenylalanine) 2-butene-1,4-diester Or by substituting (V) in Example 1 of 6,503,538 with di-p-nitrophenyl fumarate or III in Example 1 of 6,503,538 for L-phenylalanine 2-butene-1, Provided by substitution with the p-toluenesulfonate of 3-diester and by substituting (V) in Example 1 of 6,503,538 with de-p-nitrophenyl fumarate.
構造式(I)または(III)のいずれかを有する不飽和ポリマーにおいて、以下があてはまる:アミノキシル基、例えば、4-アミノTEMPOを、縮合剤としてカルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドを用いて結合することができる。本明細書に記載のペプチド/タンパク質抗原、アジュバントおよびペプチド抗原/アジュバント結合体を、二重結合官能基を介して結合することができる。ポリ(エチレングリコール)ジアクリラートに結合することにより親水性を付与することができる。 In unsaturated polymers having either structural formula (I) or (III) the following is true: coupling an aminoxyl group, for example 4-amino TEMPO, using carbonyldiimidazole or a suitable carbodiimide as condensing agent. Can do. The peptide / protein antigens, adjuvants and peptide antigen / adjuvant conjugates described herein can be attached via a double bond functional group. Hydrophilicity can be imparted by bonding to poly (ethylene glycol) diacrylate.
さらにもう一つの局面において、本発明のワクチン送達系の生成における使用が企図されるポリマーには、米国特許第5,516,881号;第6,476,204号;第6,503,538号;ならびに米国特許出願第10/096,435号;第10/101,408号;第10/143,572号;および第10/194,965号に示されるものが含まれ;これらそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。 In yet another aspect, polymers contemplated for use in generating the vaccine delivery system of the invention include US Pat. Nos. 5,516,881; 6,476,204; 6,503,538; and US Patent Application No. 10 / 096,435; 10 / 101,408; 10 / 143,572; and 10 / 194,965, the entire contents of each of which are hereby incorporated by reference.
生分解性PEA、PEURおよびPEUポリマーおよびコポリマーは、モノマーあたり2個までのアミノ酸、ポリマー分子あたり複数のアミノ酸を含んでいてもよく、好ましくは10,000から125,000の範囲の重量平均分子量を有し;これらのポリマーおよびコポリマーは典型的には、標準的粘度測定法により測定して、25℃で0.3から4.0の範囲、例えば、0.5から3.5の範囲の固有の粘度を有する。 Biodegradable PEA, PEUR and PEU polymers and copolymers may contain up to 2 amino acids per monomer, multiple amino acids per polymer molecule, and preferably have a weight average molecular weight in the range of 10,000 to 125,000; The polymers and copolymers typically have an intrinsic viscosity at 25 ° C. in the range of 0.3 to 4.0, for example in the range of 0.5 to 3.5, as measured by standard viscometry.
本発明の実施における使用が企図されるPEAおよびPEURポリマーは、当技術分野において周知の様々な方法によって合成することができる。例えば、トリブチルスズ(IV)触媒はポリ(ε-カプロラクトン)、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)などのポリエステルを生成するために一般的に用いられる。しかし、本発明の実施における使用に適したポリマーを生成するために、広範な触媒を用いうることが理解される。 PEA and PEUR polymers contemplated for use in the practice of the present invention can be synthesized by a variety of methods well known in the art. For example, tributyltin (IV) catalysts are commonly used to produce polyesters such as poly (ε-caprolactone), poly (glycolide), poly (lactide) and the like. However, it is understood that a wide range of catalysts can be used to produce polymers suitable for use in the practice of the present invention.
使用が企図されるそのようなポリ(カプロラクトン)は以下の例示的構造式(XIV)を有する。
Such poly (caprolactone) contemplated for use has the following exemplary structural formula (XIV):
使用が企図されるポリ(グリコリド)は以下の例示的構造式(XV)を有する。
A poly (glycolide) contemplated for use has the following exemplary structural formula (XV):
使用が企図されるポリ(ラクチド)は、以下の例示的な構造式(XVI)を有する。
Poly (lactides) contemplated for use have the following exemplary structural formula (XVI):
アミノキシル部分を含む適当なポリ(ラクチド-コ-ε-カプロラクトン)の例示的合成を以下に示す。第一工程は、構造式(XVII)のポリマーを形成するために第一スズオクトアートを触媒として用いた、ベンジルアルコール存在下でのラクチドとε-カプロラクトンとの共重合を含む。
An exemplary synthesis of a suitable poly (lactide-co-ε-caprolactone) containing an aminoxyl moiety is shown below. The first step involves copolymerization of lactide and ε-caprolactone in the presence of benzyl alcohol using stannous octoate as a catalyst to form a polymer of structural formula (XVII).
次に、ヒドロキシ末端ポリマー鎖を無水マレイン酸でキャップして、以下の構造式(XVIII)を有するポリマー鎖を形成する。
The hydroxy-terminated polymer chain is then capped with maleic anhydride to form a polymer chain having the following structural formula (XVIII):
この時点で、4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシをカルボキシル末端基と反応させて、4-アミノ基とカルボン酸末端基との間の反応により生じるアミド結合を介してアミノキシル部分をコポリマーに共有結合させることができる。または、マレイン酸キャップコポリマーにポリアクリル酸を接木して、後にさらなるアミノキシル基を結合するための追加のカルボン酸部分を提供することもできる。 At this point, an amide bond formed by reacting 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy with a carboxyl end group and reacting between the 4-amino group and the carboxylic acid end group The aminoxyl moiety can be covalently attached to the copolymer via Alternatively, polyacrylic acid can be grafted onto the maleic acid cap copolymer to provide additional carboxylic acid moieties for subsequent attachment of additional aminoxyl groups.
PEUのための構造式(VII)を有する不飽和ポリマーにおいて、以下があてはまる:アミノ置換アミノキシル(N-オキシド)基を有する基、例えば、4-アミノTEMPOを、縮合剤としてカルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドを用いて結合することができる。本明細書に記載の追加の生物活性薬剤を、二重結合を介して任意に結合することができる。 In the unsaturated polymer having the structural formula (VII) for PEU the following applies: a group having an amino-substituted aminoxyl (N-oxide) group, for example 4-amino TEMPO, carbonyldiimidazole as condensing agent or suitable Bonding can be performed using carbodiimide. Additional bioactive agents described herein can optionally be linked via a double bond.
例えば、構造式(VI)を有する本発明の高分子量半結晶PEUを、下記の反応スキーム(2)に示すとおり、クロロホルム/水系においてビス-求電子モノマーとしてホスゲンを用いることにより層間で調製することができる。
L-リジンエステルを含み、構造式(VII)を有するコポリ(エステルウレア)(PEU)の合成を類似のスキーム(3)によって実施することができる:
例えば、トルエン中ホスゲン(ClCOCl)(高毒性)の20%溶液(市販されている(Fluka Chemie, GMBH, Buchs, Switzerland)をジホスゲン(クロロギ酸トリクロロメチル)またはトリホスゲン(ビス(トリクロロメチル)カーボネート)のいずれかで置き換えることができる。ホスゲン、ジホスゲン、またはトリホスゲンの代わりに毒性の低いカルボニルジイミダゾールをビス-求電子モノマーとして用いることもできる。
For example, the high molecular weight semicrystalline PEU of the present invention having the structural formula (VI) can be prepared between layers by using phosgene as a bis-electrophilic monomer in a chloroform / water system, as shown in Reaction Scheme (2) below. Can do.
The synthesis of a copoly (ester urea) (PEU) containing L-lysine ester and having the structural formula (VII) can be carried out by a similar scheme (3):
For example, a 20% solution of phosgene (ClCOCl) (highly toxic) in toluene (commercially available (Fluka Chemie, GMBH, Buchs, Switzerland) with diphosgene (trichloromethyl chloroformate) or triphosgene (bis (trichloromethyl) carbonate) The less toxic carbonyldiimidazole can be used as the bis-electrophilic monomer instead of phosgene, diphosgene or triphosgene.
PEU合成の一般法
高分子量のPEUを得るためには、モノマーの冷却溶液を用いる必要がある。例えば、水150ml中のビス(α-アミノ酸)-α,ω-アルキレンジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩の懸濁液に、無水炭酸ナトリウムを加え、室温で約30分間撹拌し、約2〜0℃に冷却して第一溶液を生成する。並行して、クロロホルム中のホスゲンの第二溶液を約15〜10℃に冷却する。第一溶液を層間重縮合のための反応器に入れ、第二溶液を一度に速やかに加え、約15分間激しく撹拌する。次いで、クロロホルム層を分離し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過することができる。得られた溶液をさらなる使用のために保存することができる。
General method of PEU synthesis To obtain high molecular weight PEU, it is necessary to use a cooled solution of the monomer. For example, to a suspension of bis (α-amino acid) -α, ω-alkylene diester di-p-toluenesulfonate in 150 ml of water, anhydrous sodium carbonate is added and stirred at room temperature for about 30 minutes, about 2 minutes. Cool to ~ 0 ° C to form a first solution. In parallel, a second solution of phosgene in chloroform is cooled to about 15-10 ° C. The first solution is placed in a reactor for interlayer polycondensation and the second solution is added quickly at once and stirred vigorously for about 15 minutes. The chloroform layer can then be separated, dried over anhydrous Na 2 SO 4 and filtered. The resulting solution can be stored for further use.
作成したすべての例示的PEUポリマーはクロロホルム溶液として得、これらの溶液は保存中安定である。しかし、いくつかのポリマー、例えば、1-Phe-4は分離後クロロホルムに不溶となる。この問題を克服するために、ポリマーを平滑な疎水性表面上にキャストし、クロロホルムを蒸発乾固させることにより、クロロホルム溶液から分離することができる。得られたPEUのそれ以上の精製は必要ない。この方法によって得られる例示的PEUの収率および特徴づけを、本明細書の表2にまとめている。 All exemplary PEU polymers made were obtained as chloroform solutions, which are stable during storage. However, some polymers, such as 1-Phe-4, become insoluble in chloroform after separation. To overcome this problem, the polymer can be separated from the chloroform solution by casting on a smooth hydrophobic surface and evaporating the chloroform to dryness. No further purification of the resulting PEU is necessary. The yield and characterization of exemplary PEUs obtained by this method are summarized in Table 2 herein.
多孔性PEU調製の一般法
一般式中にα-アミノ酸を含むPEUポリマーの調製法を記載する。例えば、式(I)または(II)のポリマーの態様のために、α-アミノ酸をビス-(α-アミノ酸)-α,ω-ジオール-ジエステルモノマーに、例えば、α-アミノ酸をジオールHO-R1-OHと縮合することにより変換することができる。その結果、エステル結合が形成される。次いで、炭酸の酸塩化物(ホスゲン、ジホスゲン、トリホスゲン)がビス-(α-アミノ酸)-アルキレンジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩との重縮合反応に入り、エステルおよび尿素結合の両方を有する最終ポリマーを得る。
General method for preparing porous PEU A method for preparing a PEU polymer containing an α-amino acid in the general formula is described. For example, for embodiments of the polymer of formula (I) or (II), the α-amino acid is a bis- (α-amino acid) -α, ω-diol-diester monomer, for example the α-amino acid is a diol HO-R Can be converted by condensation with 1- OH. As a result, an ester bond is formed. Carbonic acid chlorides (phosgene, diphosgene, triphosgene) then enter the polycondensation reaction of the bis- (α-amino acid) -alkylene diester with di-p-toluenesulfonate and have both ester and urea linkages The final polymer is obtained.
不飽和PEUを、R1に少なくとも一つの二重結合を含む、ビス-(α-アミノ酸)-アルキレンジエステルのジ-p-トルエンスルホン酸塩の層間溶液縮合により調製することができる。この目的のために有用な不飽和ジオールには、例えば、2-ブテン-1,4-ジオールおよび1,18-オクタデカ-9-エン-ジオールが含まれる。不飽和モノマーを反応前にアルカリ性水溶液、例えば、水酸化ナトリウム溶液に溶解することができる。次いで、水溶液を、等モル量の単量体、二量体または三量体ホスゲンを含む有機溶媒層、例えば、クロロホルムと共に、外部冷却下で激しく撹拌することができる。発熱反応が速やかに進行し、(ほとんどの場合)有機溶媒中に溶解したままのポリマーを得る。有機層を水で数回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させことができる。約75%〜85%の収率の不飽和PEUを減圧下、例えば、約45℃で乾燥することができる。 Unsaturated PEUs can be prepared by interlayer solution condensation of di-p-toluenesulfonates of bis- (α-amino acids) -alkylene diesters containing at least one double bond in R 1 Useful unsaturated diols for this purpose include, for example, 2-butene-1,4-diol and 1,18-octadeca-9-ene-diol. Unsaturated monomers can be dissolved in an alkaline aqueous solution, such as sodium hydroxide solution, before the reaction. The aqueous solution can then be vigorously stirred under external cooling with an organic solvent layer containing an equimolar amount of monomer, dimer or trimer phosgene, eg, chloroform. The exothermic reaction proceeds rapidly and (in most cases) a polymer remains dissolved in the organic solvent. The organic layer can be washed several times with water, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated. About 75% to 85% yield of unsaturated PEU can be dried under reduced pressure, for example, at about 45 ° C.
多孔性で、強い材料である、1-L-Leu-4および1-L-Leu-6などのL-Leuを基本とするPEUを、下記の一般法を用いて作成することができる。そのような方法は、L-Pheを基本とするPEUに適用すると、多孔性で、強い材料の生成において成功率が低くなる。 PEUs based on L-Leu such as 1-L-Leu-4 and 1-L-Leu-6, which are porous and strong materials, can be made using the following general method. Such a method, when applied to a PEU based on L-Phe, is less successful in producing porous and strong materials.
層間重縮合の直後に得られる、クロロホルム中のPEUの反応溶液または乳濁液(約100mL)を、ガラスビーカー、好ましくはビーカー壁へのPEUの付着を減らすためにジメチルジクロルシランで疎水性としたビーカー中の約80℃〜85℃の水1,000mLに撹拌しながら滴下する。ポリマー溶液を水中で小さい液滴に分散させ、クロロホルムをやや激しく蒸発させる。クロロホルムが蒸発するにつれ、徐々に、小さい液滴は一緒になって緻密なタール様の塊になり、これは粘着性のゴム様生成物に変換される。このゴム様生成物をビーカーから取り出し、疎水性化した円柱状ガラス試験管に入れ、これを約24時間サーモスタットで約80℃に制御する。次いで、試験管をサーモスタットから取り出し、室温まで冷却し、割ってポリマーを得る。得られた多孔性の棒を減圧乾燥器に入れ、約80℃で約24時間減圧乾燥する。加えて、多孔性ポリマー材料を得るために当技術分野において公知の任意の方法も用いることができる。 The reaction solution or emulsion (about 100 mL) of PEU in chloroform, obtained immediately after interlayer polycondensation, is made hydrophobic with dimethyldichlorosilane to reduce the adhesion of PEU to the glass beaker, preferably the beaker wall. Add dropwise to 1,000 mL of water at about 80 ° C. to 85 ° C. in a beaker with stirring. Disperse the polymer solution into small droplets in water and evaporate chloroform a little vigorously. As the chloroform evaporates, gradually the small droplets come together into a dense tar-like mass that is converted to a sticky rubber-like product. The rubber-like product is removed from the beaker and placed in a hydrophobicized cylindrical glass test tube which is controlled at about 80 ° C. with a thermostat for about 24 hours. The test tube is then removed from the thermostat, cooled to room temperature, and broken to obtain the polymer. The obtained porous stick is put into a vacuum dryer and dried under reduced pressure at about 80 ° C. for about 24 hours. In addition, any method known in the art to obtain a porous polymer material can be used.
前述の方法により調製した高分子量多孔性PEUの特性は表2にまとめる結果となった。 The properties of the high molecular weight porous PEU prepared by the method described above are summarized in Table 2.
(表2)式(VI)および(VII)のPEUポリマーの特性
*一般式(VI)のPEUで、
1-L-Leu-4:R4=(CH2)4、R3=i-C4H9
1-L-Leu-6:R4=(CH2)6、R3=i-C4H9
1-L-Phe-6:R4=(CH2)6、R3=-CH2-C6H5
1-L-Leu-DAS:R4=1,4:3,6-ジアンヒドロソルビトール、R3=i-C4H
a)粘性低下をDMF中25℃、濃度0.5g/dLで測定した。
b)GPC測定をDMF、(PMMA)中で実施した。
c)DSC測定からの第二の加熱曲線から得たTg(加熱速度10℃/分)
d)GPC測定をDMAc、(PS)中で実施した。
(Table 2) Properties of PEU polymers of formula (VI) and (VII)
* In PEU of general formula (VI)
1-L-Leu-4: R 4 = (CH 2 ) 4 , R 3 = iC 4 H 9
1-L-Leu-6: R 4 = (CH 2 ) 6 , R 3 = iC 4 H 9
1-L-Phe-6: R 4 = (CH 2 ) 6 , R 3 = -CH 2 -C 6 H 5
1-L-Leu-DAS: R 4 = 1,4: 3,6-dianhydrosorbitol, R 3 = iC 4 H
a) Viscosity reduction was measured in DMF at 25 ° C. at a concentration of 0.5 g / dL.
b) GPC measurements were performed in DMF, (PMMA).
c) Tg obtained from the second heating curve from DSC measurement (
d) GPC measurements were performed in DMAc, (PS).
例示的合成PEUの引張り強さを測定し、結果を表3にまとめている。引張り強さの測定はダンベル型PEUフィルム(4×1.6cm)を用いて行った。このフィルムはクロロホルム溶液からキャストした平均厚さ0.125mmのもので、Nexygen FMソフトウェア(Amtek, Largo, FL)を用いるPCを組み込んだ引張り強さ測定器(Chatillon TDC200)上、クロスヘッド速度60mm/分で、引張り試験にかけた。本明細書において示す例は以下の機械的特性を有すると予想することができる:
1. 約30℃から約90℃の範囲、例えば、約35℃から約70℃の範囲のガラス転移温度;
2. 平均厚さ約1.6cmのポリマーのフィルムは、約20Mpaから約150Mpa、例えば、約25Mpaから約60Mpaの降伏時の引張り応力を有する;
3. 平均厚さ約1.6cmのポリマーのフィルムは、約10%から約200%、例えば、約50%から約150%の伸びパーセントを有する;および
4. 平均厚さ約1.6cmのポリマーのフィルムは、約500MPaから約2000MPaの範囲のヤング率を有する。以下の表2にこの型の例示的PEUの特性をまとめている。
The tensile strength of exemplary synthetic PEUs was measured and the results are summarized in Table 3. Tensile strength was measured using a dumbbell-type PEU film (4 × 1.6 cm). This film is cast from chloroform solution and has an average thickness of 0.125mm, on a tensile strength measuring instrument (Chatillon TDC200) incorporating a PC using Nexygen FM software (Amtek, Largo, FL), with a crosshead speed of 60mm / min. And subjected to a tensile test. The examples presented herein can be expected to have the following mechanical properties:
1. a glass transition temperature in the range of about 30 ° C. to about 90 ° C., for example in the range of about 35 ° C. to about 70 ° C .;
2. A polymer film having an average thickness of about 1.6 cm has a tensile stress at yield of about 20 Mpa to about 150 Mpa, such as about 25 Mpa to about 60 Mpa;
3. A polymer film having an average thickness of about 1.6 cm has a percent elongation of about 10% to about 200%, such as about 50% to about 150%; and
4. A polymer film having an average thickness of about 1.6 cm has a Young's modulus in the range of about 500 MPa to about 2000 MPa. Table 2 below summarizes the characteristics of this type of exemplary PEU.
(表3)PEUの機械的特性
(Table 3) Mechanical properties of PEU
本発明のワクチン送達組成物の様々な成分は広範な比率で存在しうる。例えば、ポリマー反復単位:抗原は典型的には1:50から50:1、例えば、1:10から10:1、約1:3から3:1、または約1:1の比率で用いる。しかし、特定の抗原の特定のポリマーへの組込みが難しく、かつ特定の抗原が低い免疫原性を有する場合などの、特定の目的のためには他の比率がより適当であることもあり、その場合、より高い相対量のペプチド/タンパク質抗原が必要とされる。 The various components of the vaccine delivery composition of the present invention can be present in a wide range of ratios. For example, polymer repeat units: antigen are typically used in a ratio of 1:50 to 50: 1, such as 1:10 to 10: 1, about 1: 3 to 3: 1, or about 1: 1. However, other ratios may be more appropriate for specific purposes, such as when it is difficult to incorporate a specific antigen into a specific polymer and the specific antigen has low immunogenicity. In some cases, higher relative amounts of peptide / protein antigens are required.
特定の態様において、本明細書に記載の本発明のワクチン送達組成物は、当技術分野において公知で、本明細書に記載のいくつかの技術を用いて、粒子内に物理的に組み込んだ(分散した)、または任意にリンカーを用いてポリマー官能基に結合した、ペプチド/タンパク質抗原-アジュバント結合体、または抗原とアジュバントを含む粒子として提供することができる。粒子はAPCによる取り込みのためにサイズ調節し、例えば、約10ナノメートルから約1000ミクロンの範囲、または約10ナノメートルから約10ミクロンの範囲の平均直径を有する。任意に、粒子はそれらの生分解の制御を助けるためにポリマーの薄い被膜をさらに含むこともできる。典型的にはそのような粒子はポリマー分子あたり約5から約150のペプチド/タンパク質抗原を含む。 In certain embodiments, the vaccine delivery compositions of the invention described herein are physically incorporated into particles using a number of techniques known in the art and described herein ( It can be provided as a peptide / protein antigen-adjuvant conjugate or particles comprising an antigen and an adjuvant, dispersed), or optionally linked to a polymer functional group using a linker. The particles are sized for uptake by APC, for example having an average diameter in the range of about 10 nanometers to about 1000 microns, or in the range of about 10 nanometers to about 10 microns. Optionally, the particles can further comprise a thin film of polymer to help control their biodegradation. Typically, such particles contain about 5 to about 150 peptide / protein antigens per polymer molecule.
本発明のワクチン送達組成物において用いるPEA、PEUR、およびPEUポリマーは、表面で酵素作用により生分解する。したがって、ポリマー、例えばその粒子は抗原およびアジュバントを制御された放出速度で被験体に投与し、その速度は特有で、長期間にわたって一定である。 The PEA, PEUR, and PEU polymers used in the vaccine delivery composition of the present invention biodegrade enzymatically on the surface. Thus, the polymer, eg, the particle, administers antigen and adjuvant to the subject at a controlled release rate, which is unique and constant over time.
本明細書において用いられるとおり、本発明のワクチン送達組成物中のポリマーを説明するために用いる「生分解性」とは、ポリマーが体の正常な機能において無害な生成物に分解されうることを意味する。一つの態様において、ワクチン送達組成物全体は生分解性である。好ましい生分解性ポリマーは生分解性を提供する加水分解可能なエステル結合を有し、典型的には鎖の末端は主にアミノ基である。 As used herein, “biodegradable” as used to describe a polymer in the vaccine delivery composition of the present invention means that the polymer can be broken down into harmless products in the normal functioning of the body. means. In one embodiment, the entire vaccine delivery composition is biodegradable. Preferred biodegradable polymers have hydrolyzable ester linkages that provide biodegradability, and typically the chain ends are predominantly amino groups.
本明細書において用いられる「分散(された)」とは、本明細書に開示されているペプチド/タンパク質抗原またはアジュバントがポリマー中に分散、混合、溶解、ホモジナイズ、および/または共有結合されている(「分散」または負荷されている)ことを意味し、このポリマーは粒子に形成されていても、いなくてもよい。 As used herein, “dispersed” refers to a peptide / protein antigen or adjuvant disclosed herein dispersed, mixed, dissolved, homogenized, and / or covalently bound in a polymer. ("Dispersed" or loaded), meaning that the polymer may or may not be formed into particles.
ペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントはポリマー担体への化学結合なしにポリマー基質中に分散させることができるが、抗原および/または抗原-アジュバント結合体は生分解性ポリマーに種々の適当な官能基を介して共有結合しうることも企図される。例えば、生分解性ポリマーがポリエステルである場合、鎖末端カルボキシル基を用いて、ヒドロキシ、アミノ、チオなどの、抗原またはアジュバントの相補的部分と反応させることができる。種々の適当な試薬および反応条件が、例えば、March's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, (2001);およびComprehensive Organic Transformations, Second Edition, Larock (1999)に開示されている。 Peptide / protein antigens and adjuvants can be dispersed in a polymer matrix without chemical linkage to the polymer carrier, whereas antigens and / or antigen-adjuvant conjugates can be attached to the biodegradable polymer via a variety of suitable functional groups. It is also contemplated that it can be covalently linked. For example, if the biodegradable polymer is a polyester, chain end carboxyl groups can be used to react with the complementary portion of an antigen or adjuvant, such as hydroxy, amino, thio, and the like. A variety of suitable reagents and reaction conditions are disclosed, for example, in March's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, (2001); and Comprehensive Organic Transformations, Second Edition, Larock (1999).
他の態様において、抗原および/またはアジュバントを構造(I)または(III〜VII)のポリマーのいずれかにアミド、エステル、エーテル、アミノ、ケトン、チオエーテル、スルフィニル、スルホニル、ジスルフィド結合を通じて結合することができる。そのような結合は適当に官能基を有する出発原料から、当技術分野において公知の合成法を用いて形成することができる。 In other embodiments, the antigen and / or adjuvant may be conjugated to either the polymer of structure (I) or (III-VII) through an amide, ester, ether, amino, ketone, thioether, sulfinyl, sulfonyl, disulfide bond. it can. Such bonds can be formed from starting materials having suitable functional groups using synthetic methods known in the art.
例えば、一つの態様において、ポリマーをペプチド/タンパク質抗原またはアジュバントにポリマーの末端または側鎖カルボキシル基(例えば、COOH)を介して結合することができる。具体的には、構造III、VおよびVIIの化合物をペプチド/タンパク質抗原のアミノ官能基またはヒドロキシル官能基と反応させて、それぞれアミド結合またはカルボン酸エステル結合を介して結合されたペプチド/タンパク質抗原を有する生分解性ポリマーを提供することができる。もう一つの態様において、ポリマーのカルボキシル基をハロゲン化アシル、酸無水物/「混合」無水物、または活性エステルに変換することができる。他の態様において、ポリマー分子の遊離-NH2末端をアシル化して、ペプチド/タンパク質抗原が、ポリマーの遊離末端ではなく、ポリマーのカルボキシル基を介してのみ結合することを確実にすることができる。例えば、本明細書に記載の本発明のワクチン送達組成物を、N-末端の遊離アミノ基が、例えば、無水物RCOOCOR(R=(C1-C24)アルキル)でアシル化されているPEA、PEUR、またはPEUから調製して、生物活性薬剤がポリマーの遊離末端ではなく、ポリマーのカルボキシル基を介してのみ結合することを確実にすることができる。 For example, in one embodiment, the polymer can be attached to the peptide / protein antigen or adjuvant via the terminal or side chain carboxyl group of the polymer (eg, COOH). Specifically, compounds of structures III, V and VII are reacted with amino or hydroxyl functional groups of peptide / protein antigens to produce peptide / protein antigens linked via amide bonds or carboxylic ester bonds, respectively. A biodegradable polymer can be provided. In another embodiment, the carboxyl group of the polymer can be converted to an acyl halide, acid anhydride / “mixed” anhydride, or active ester. In other embodiments, the free-NH 2 terminus of the polymer molecule can be acylated to ensure that the peptide / protein antigen is attached only through the carboxyl group of the polymer, not the free terminus of the polymer. For example, a vaccine delivery composition of the invention as described herein can be prepared using a PEA in which the N-terminal free amino group is acylated, for example, with an anhydride RCOOCOR (R = (C 1 -C 24 ) alkyl). , PEUR, or PEU can be used to ensure that the bioactive agent is attached only through the carboxyl group of the polymer, not the free end of the polymer.
または、ペプチド/タンパク質抗原またはアジュバントをポリマーに、例えば、構造式(VIII〜XI)に記載のリンカー分子を介して結合させてもよい。事実、生分解性ポリマーの表面の疎水性を改善するため、生分解性ポリマーの酵素活性化への到達しやすさを改善するため、および生分解性ポリマーの放出特性を改善するため、リンカーを用いてペプチド/タンパク質抗原および/またはアジュバントを生分解性ポリマーに間接的に結合してもよい。特定の態様において、リンカー化合物には、約44から約10,000、好ましくは44から2000の分子量(Mw)を有するポリ(エチレングリコール);セリンなどのアミノ酸;1から100の反復単位を有するポリペプチド;および任意の他の適当な低分子量ポリマーが含まれる。リンカーは典型的にはペプチド/タンパク質抗原をポリマーから、約5オングストロームから約200オングストロームだけ分離する。 Alternatively, the peptide / protein antigen or adjuvant may be attached to the polymer via, for example, a linker molecule described in Structural Formulas (VIII-XI). In fact, to improve the surface hydrophobicity of the biodegradable polymer, improve the accessibility of the biodegradable polymer to enzyme activation, and improve the release characteristics of the biodegradable polymer The peptide / protein antigen and / or adjuvant may be used to indirectly bind the biodegradable polymer. In certain embodiments, the linker compound comprises a poly (ethylene glycol) having a molecular weight (Mw) of about 44 to about 10,000, preferably 44 to 2000; an amino acid such as serine; a polypeptide having 1 to 100 repeat units; And any other suitable low molecular weight polymer. The linker typically separates the peptide / protein antigen from the polymer by about 5 angstroms to about 200 angstroms.
さらなる態様において、リンカーは式W-A-Qの二価の基であり、ここでAは(C1-C24)アルキル、(C2-C24)アルケニル、(C2-C24)アルキニル、(C3-C8)シクロアルキル、または(C6-C10)アリールであり、かつWおよびQはそれぞれ独立に-N(R)C(=O)-、-C(=O)N(R)-、-OC(=O)-、-C(=O)O、-O-、-S-、-S(O)、-S(O)2-、-S-S-、-N(R)-、-C(=O)-であり、ここでRはそれぞれ独立にHまたは(C1-C6)アルキルである。 In a further embodiment, the linker is a divalent group of formula WAQ, where A is (C 1 -C 24 ) alkyl, (C 2 -C 24 ) alkenyl, (C 2 -C 24 ) alkynyl, (C 3 -C 8 ) cycloalkyl, or (C 6 -C 10 ) aryl, and W and Q are each independently -N (R) C (= O)-, -C (= O) N (R)- , -OC (= O)-, -C (= O) O, -O-, -S-, -S (O), -S (O) 2- , -SS-, -N (R)-, —C (═O) —, wherein each R is independently H or (C 1 -C 6 ) alkyl.
前述のリンカーを説明するために用いられる「アルキル」なる用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ヘキシルなどを含む、直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。 The term “alkyl” used to describe the aforementioned linkers is straight or branched chain, including methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-hexyl, and the like. A hydrocarbon group is meant.
本明細書において用いられるとおり、リンカーを説明するために用いられる「アルケニル」とは、一つまたは複数の二重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。 As used herein, “alkenyl” as used to describe a linker refers to a straight or branched chain hydrocarbon group having one or more double bonds.
本明細書において用いられるとおり、リンカーを説明するために用いられる「アルキニル」とは、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。 As used herein, “alkynyl” as used to describe a linker refers to a straight or branched chain hydrocarbon group having at least one carbon-carbon triple bond.
本明細書において用いられるとおり、リンカーを説明するために用いられる「アリール」とは、6から14個までの範囲の炭素原子を有する芳香族基を意味する。 As used herein, “aryl” as used to describe a linker means an aromatic group having in the range of 6 to 14 carbon atoms.
特定の態様において、リンカーは約2から約25までのアミノ酸を有するポリペプチドであってもよい。使用が企図される適当なペプチドには、ポリ-L-リジン、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ-L-アスパラギン酸、ポリ-L-ヒスチジン、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-トレオニン、ポリ-L-チロシン、ポリ-L-ロイシン、ポリ-L-リジン-L-フェニルアラニン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン-L-チロシンなどが含まれる。 In certain embodiments, the linker may be a polypeptide having from about 2 to about 25 amino acids. Suitable peptides contemplated for use include poly-L-lysine, poly-L-glutamic acid, poly-L-aspartic acid, poly-L-histidine, poly-L-ornithine, poly-L-threonine, poly- L-tyrosine, poly-L-leucine, poly-L-lysine-L-phenylalanine, poly-L-arginine, poly-L-lysine-L-tyrosine and the like are included.
一つの態様において、ペプチド/タンパク質抗原はポリマーを共有結合により架橋することができ、すなわち、抗原は複数のポリマー分子に結合している。この共有結合による架橋は追加のポリマー-抗原リンカーを用いて、または用いずに行うことができる。 In one embodiment, the peptide / protein antigen can covalently crosslink the polymer, i.e., the antigen is attached to multiple polymer molecules. This covalent cross-linking can be performed with or without an additional polymer-antigen linker.
ペプチド/タンパク質抗原分子は、一つの高分子の二つの部分の間の共有結合により分子間架橋を形成することもできる。 Peptide / protein antigen molecules can also form intermolecular bridges by covalent bonds between two parts of one macromolecule.
直鎖ポリマーペプチド結合体は、抗原主鎖上の求核剤の可能性がある部分を保護し、ポリマーまたはポリマーリンカー作成物に結合する一つの反応性基だけを残すことにより調製する。脱保護は当技術分野において周知のペプチドの脱保護(例えば、BocおよびFmoc化学)に従って行う。 Linear polymer peptide conjugates are prepared by protecting the potential portion of the nucleophile on the antigen backbone and leaving only one reactive group attached to the polymer or polymer linker construct. Deprotection is performed according to peptide deprotection well known in the art (eg, Boc and Fmoc chemistry).
本発明の一つの態様において、ペプチド抗原はレトロ-インベルソまたは部分レトロ-インベルソペプチドとして提示される。 In one embodiment of the invention, the peptide antigen is presented as a retro-inverso or partial retro-inverso peptide.
他の態様において、ペプチド/タンパク質抗原を基質中でポリマーの光架橋可能なものと混合し、架橋後、材料を貪食可能なサイズ、すなわち0.1〜10μmに分散(粉砕)する。 In other embodiments, the peptide / protein antigen is mixed with a photocrosslinkable polymer in a substrate and after crosslinking, the material is dispersed (ground) to a phagocytic size, ie 0.1-10 μm.
リンカーはまずポリマーまたはペプチド/タンパク質抗原もしくはアジュバントに結合することができる。合成中、リンカーは非保護型、または当業者には周知の様々な保護基を用いた保護型のいずれかでありうる。保護リンカーの場合、リンカーの非保護末端をまずポリマーまたはペプチド/タンパク質抗原に結合することができる。次いで、保護基をPd/H2水素化分解、緩和な酸もしくは塩基加水分解、または任意の他の当技術分野において公知の一般的脱保護法を用いて脱保護することができる。次いで、脱保護したリンカーをペプチド/タンパク質抗原、アジュバント、またはアジュバント-抗原結合体に結合することができる。 The linker can first be attached to the polymer or peptide / protein antigen or adjuvant. During synthesis, the linker can be either unprotected or protected using various protecting groups well known to those skilled in the art. In the case of a protected linker, the unprotected end of the linker can first be attached to the polymer or peptide / protein antigen. The protecting group can then be deprotected using Pd / H 2 hydrogenolysis, mild acid or base hydrolysis, or any other common deprotection method known in the art. The deprotected linker can then be attached to the peptide / protein antigen, adjuvant, or adjuvant-antigen conjugate.
本発明の生分解性ポリマーの例示的合成(結合する分子はアミノキシルである)を以下に示す。ポリエステルをアミノ置換N-オキシドフリーラジカル(アミノキシル)を有する基、例えば、4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシと、N,N'-カルボニルジイミダゾール存在下で反応させて、ポリエステルの鎖末端のカルボン酸部分をアミノ置換アミノキシル含有基へのアミド結合に置き換えることができ、したがってアミノ部分がポリマーのカルボキシル基のカルボニル残基の炭素に共有結合する。N,N'-カルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドはポリエステルの鎖末端のカルボキシル基におけるヒドロキシル部分をアミノキシル、例えば、4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシと反応することになる中間体生成物の部分に変換する。アミノキシル反応物は典型的には反応物:ポリエステルを1:1から100:1の範囲のモル比で用いる。N,N'-カルボニルジイミダゾール:アミノキシルのモル比は好ましくは約1:1である。 An exemplary synthesis of the biodegradable polymer of the present invention (the molecule attached is aminoxyl) is shown below. Polyesters in the presence of groups with amino-substituted N-oxide free radicals (aminoxyl), for example 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy and N, N′-carbonyldiimidazole The reaction can replace the carboxylic acid moiety at the chain end of the polyester with an amide bond to an amino-substituted aminoxyl-containing group, so that the amino moiety is covalently bonded to the carbon of the carbonyl residue of the carboxyl group of the polymer. N, N'-carbonyldiimidazole or a suitable carbodiimide reacts the hydroxyl moiety in the carboxyl group at the chain end of the polyester with an aminoxyl, for example 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy Convert to the portion of the intermediate product that will be. Aminoxyl reactants typically use reactant: polyester in a molar ratio ranging from 1: 1 to 100: 1. The molar ratio of N, N′-carbonyldiimidazole: aminoxyl is preferably about 1: 1.
典型的反応は以下の通りである。ポリエステルを反応溶媒に溶解し、反応を溶解に用いた温度で容易に実施する。反応溶媒はポリエステルが溶解するいかなるものであってもよい。ポリエステルがポリグリコール酸またはポリ(グリコリド-L-ラクチド)(グリコール酸のL-乳酸に対するモノマーモル比が50:50よりも大きい)である場合、115℃から130℃の高度に精製した(純度99.9+%)ジメチルスルホキシドまたは室温のジメチルスルホキシド(DMSO)がポリエステルを適当に溶解する。ポリエステルがポリ-L-乳酸、ポリ-DL-乳酸またはポリ(グリコリド-L-ラクチド)(グリコール酸のL-乳酸に対するモノマーモル比が50:50以下)である場合、室温から50℃のテトラヒドロフラン、塩化メチレンおよびクロロホルムがポリエステルを適当に溶解する。 A typical reaction is as follows. The polyester is dissolved in the reaction solvent and the reaction is easily carried out at the temperature used for dissolution. The reaction solvent may be any solvent that dissolves the polyester. When the polyester is polyglycolic acid or poly (glycolide-L-lactide) (the molar ratio of glycolic acid to L-lactic acid is greater than 50:50), it is highly purified from 115 ° C to 130 ° C (purity 99.9+ %) Dimethyl sulfoxide or room temperature dimethyl sulfoxide (DMSO) suitably dissolves the polyester. When the polyester is poly-L-lactic acid, poly-DL-lactic acid or poly (glycolide-L-lactide) (monomer molar ratio of glycolic acid to L-lactic acid is not more than 50:50), Methylene and chloroform properly dissolve the polyester.
ポリマー/抗原結合
一つの態様において、本明細書に記載の本発明のワクチン送達組成物を調製するために用いるポリマーは、ポリマーに直接結合している少なくとも一つのペプチド/タンパク質抗原を有する。ポリマーの残基は一つまたは複数のペプチド/タンパク質抗原の残基に結合することができる。例えば、ポリマーの一つの残基をペプチド/タンパク質抗原の一つの残基に直接結合することができる。ポリマーおよびペプチド/タンパク質抗原はそれぞれ一つの空き原子価を有することができる。または、複数のペプチド/タンパク質抗原、多数のペプチド/タンパク質抗原、または異なる病原生物からのペプチド/タンパク質抗原の混合物をポリマーに直接結合することができる。しかし、それぞれのペプチド/タンパク質抗原の残基は対応するポリマーの残基に結合させうるため、一つまたは複数のペプチド/タンパク質抗原の残基の数はポリマーの残基上の空き原子価の数に対応しうる。
Polymer / antigen binding In one embodiment, the polymer used to prepare the vaccine delivery compositions of the invention described herein has at least one peptide / protein antigen directly attached to the polymer. Residues of the polymer can be linked to residues of one or more peptide / protein antigens. For example, one residue of the polymer can be directly linked to one residue of the peptide / protein antigen. Each polymer and peptide / protein antigen can have one free valence. Alternatively, multiple peptide / protein antigens, multiple peptide / protein antigens, or a mixture of peptide / protein antigens from different pathogenic organisms can be directly attached to the polymer. However, since each peptide / protein antigen residue can be bound to a corresponding polymer residue, the number of residues in one or more peptide / protein antigens is the number of free valences on the polymer residue. It can correspond to.
本明細書において用いられる「ポリマーの残基」とは、一つまたは複数の空き原子価を有するポリマーの基を意味する。基をペプチド/タンパク質原の残基に結合した場合、生物活性は実質的に保持されるとの条件で、本発明のポリマー(例えば、ポリマー主鎖または側鎖上)の任意の合成的に可能な一つの原子、複数の原子、または官能基を除去して、空き原子価を提供することができる。加えて、基をペプチド/タンパク質抗原の残基に結合した場合、生物活性は実質的に保持されるとの条件で、任意の合成的に可能な官能基(例えば、カルボキシル)をポリマー(例えば、ポリマー主鎖または側鎖上)に作って、空き原子価を提供することもできる。所望の結合に基づき、当業者であれば、当技術分野において公知の方法を用いて、本発明のポリマーから誘導しうる適当な官能基を有する出発原料を選択することができる。 As used herein, “polymer residue” means a group of a polymer having one or more vacant valences. Any synthetically possible polymer of the present invention (eg, on the polymer backbone or side chain) provided that the group is attached to the residue of the peptide / protein base, biological activity is substantially retained. Single atoms, multiple atoms, or functional groups can be removed to provide a free valence. In addition, any synthetically possible functional group (e.g. carboxyl) can be attached to a polymer (e.g. Can be made on the polymer backbone or side chain) to provide free valence. Based on the desired linkage, one skilled in the art can select starting materials having suitable functional groups that can be derived from the polymers of the present invention using methods known in the art.
本明細書において用いられる「構造式(*)の化合物の残基」とは、一つまたは複数の空き原子価を有する、本明細書に記載の式(I)および(III〜VII)のポリマーの化合物の基を意味する。基をペプチド/タンパク質抗原の残基に結合した場合、生物活性は実質的に保持されるとの条件で、化合物(例えば、ポリマー主鎖または側鎖上)の任意の合成的に可能な一つの原子、複数の原子、または官能基を除去して、空き原子価を提供することができる。加えて、基をペプチド/タンパク質抗原の残基に結合した場合、生物活性は実質的に保持されるとの条件で、任意の合成的に可能な官能基(例えば、カルボキシル)を式(I)および(III〜VII)の化合物(例えば、ポリマー主鎖または側鎖上)に作って、空き原子価を提供することもできる。望まれる結合に基づき、当業者であれば、当技術分野において公知の方法を用いて、式(I)および(III〜VII)の化合物から誘導しうる適当な官能基を有する出発原料を選択することができる。 As used herein, “residue of compound of structural formula (*)” is a polymer of formula (I) and (III-VII) as described herein having one or more vacant valences Means a group of the compound. If the group is attached to a residue of a peptide / protein antigen, the biological activity is substantially retained, provided that any synthetically possible one of the compounds (eg, on the polymer backbone or side chain) An atom, multiple atoms, or functional group can be removed to provide a free valence. In addition, any synthetically possible functional group (e.g., carboxyl) can be represented by formula (I) provided that the biological activity is substantially retained when the group is attached to a peptide / protein antigen residue. And (III-VII) compounds (e.g., on the polymer backbone or side chain) to provide free valence. Based on the bond desired, one skilled in the art will select starting materials having appropriate functional groups that can be derived from compounds of formulas (I) and (III-VII) using methods known in the art. be able to.
例えば、ペプチド/タンパク質抗原の残基を構造式(I)および(III〜VII)の化合物の残基に、アミド(例えば、-N(R)C(=O)-または-C(=O)N(R)-)、エステル(例えば、-OC(=O)-または-C(=O)O-)、エーテル(例えば、-O-)、アミノ(例えば、-N(R)-)、ケトン(例えば、-C(=O)-)、チオエーテル(例えば、-S-)、スルフィニル(例えば、-S(O)-)、スルホニル(例えば、-S(O)2-)、ジスルフィド(例えば、-S-S-)、または直接(例えば、C-C結合)結合を通じて結合することができ、ここでRはそれぞれ独立にHまたは(C1-C6)アルキルである。そのような結合は、当技術分野において公知の合成法を用いて、適当な官能基を有する出発原料から形成することができる。望まれる結合に基づき、当業者であれば、当技術分野において公知の方法を用いて、構造式(I)および(III〜VII)のいずれか一つの化合物の残基から、およびペプチド/タンパク質抗原またはアジュバントの所与の残基から誘導しうる適当な官能基を有する出発原料を選択することができる。ペプチド/タンパク質抗原またはアジュバントの残基は構造式(I)および(III〜VII)のいずれか一つの化合物の残基における任意の合成的に可能な位置に結合することができる。加えて、本発明は、構造式(I)および(III〜VII)のいずれか一つの化合物に直接結合しているペプチド/タンパク質抗原またはアジュバント生物活性薬剤の複数の残基を有する化合物も提供する。 For example, the residue of a peptide / protein antigen is replaced with the residue of a compound of structural formula (I) and (III-VII) with an amide (e.g. -N (R) C (= O)-or -C (= O) N (R)-), ester (e.g. -OC (= O)-or -C (= O) O-), ether (e.g. -O-), amino (e.g. -N (R)-), Ketone (e.g. -C (= O)-), thioether (e.g. -S-), sulfinyl (e.g. -S (O)-), sulfonyl (e.g. -S (O) 2- ), disulfide (e.g. , -SS-), or a direct (eg CC bond) bond, wherein each R is independently H or (C 1 -C 6 ) alkyl. Such bonds can be formed from starting materials having appropriate functional groups using synthetic methods known in the art. Based on the desired binding, one skilled in the art can use methods known in the art from the residues of any one compound of structural formulas (I) and (III-VII) and peptide / protein antigens. Alternatively, starting materials can be selected that have appropriate functional groups that can be derived from a given residue of the adjuvant. The residue of the peptide / protein antigen or adjuvant can be attached at any synthetically possible position in the residue of any one compound of structural formulas (I) and (III-VII). In addition, the present invention also provides compounds having multiple residues of peptide / protein antigens or adjuvant bioactive agents that are directly linked to any one of structural formulas (I) and (III-VII) .
ポリマー分子に結合しうるペプチド/タンパク質抗原の数は典型的にはポリマーの分子量に依存しうる。例えば、nが約5から約150、好ましくは約5から約70である、構造式(I)または(III)の化合物に対しては、ペプチド/タンパク質抗原をポリマーの末端基と反応させることにより、約150までのペプチド/タンパク質抗原(すなわち、その残基)をポリマー(すなわち、その残基)に直接結合することができる。不飽和ポリマーにおいて、ペプチド/タンパク質抗原をポリマーの二重(または三重)結合と反応させることもできる。 The number of peptide / protein antigens that can bind to a polymer molecule typically can depend on the molecular weight of the polymer. For example, for compounds of structural formula (I) or (III) where n is from about 5 to about 150, preferably from about 5 to about 70, by reacting the peptide / protein antigen with a terminal group of the polymer Up to about 150 peptide / protein antigens (ie, residues thereof) can be directly attached to the polymer (ie, residues thereof). In unsaturated polymers, peptide / protein antigens can also be reacted with polymer double (or triple) bonds.
本明細書に記載のPEA、PEURおよびPEUポリマーは容易に水分を吸収し(ポリマーフィルム上で5から25重量%の水分吸収)、親水性分子がそれらを通って容易に拡散できるようにする。この特徴により、PEA、PEURおよびPEUポリマーは放出速度を制御するための粒子のオーバーコーティングとして用いるのに適している。水分吸収はポリマー、およびそのようなポリマーを基剤とするワクチン送達組成物のバイオアベイラビリティも増強する。加えて、PEA、PEURおよびPEUポリマーの親水性により、インビボで送達される場合に粒子は、特にインビボの温度で粘着性となり、凝集する。したがって、ポリマー粒子を、皮下針または無針注射などにより、局所送達のために皮下または筋肉内に注射すると、自然にポリマーデポーを形成する。体内循環をさせないサイズの、約1ミクロンから約100ミクロンの範囲の平均直径を有する粒子が、インビボでそのようなポリマーデポーを形成するのに適している。または、経口投与の場合、胃腸管ははるかに大きい粒子、例えば、平均直径約1ミクロンから約1000ミクロンまでの微小粒子を耐容することができる。 The PEA, PEUR and PEU polymers described herein readily absorb moisture (5 to 25 wt% moisture absorption on the polymer film) and allow hydrophilic molecules to diffuse easily through them. This feature makes PEA, PEUR and PEU polymers suitable for use as particle overcoating to control the release rate. Water absorption also enhances the bioavailability of polymers and vaccine delivery compositions based on such polymers. In addition, due to the hydrophilic nature of PEA, PEUR and PEU polymers, the particles become sticky and aggregate, especially at in vivo temperatures, when delivered in vivo. Thus, polymer particles spontaneously form polymer depots when injected subcutaneously or intramuscularly for local delivery, such as by hypodermic or needleless injection. Particles with an average diameter in the range of about 1 micron to about 100 microns that are sized not to circulate in the body are suitable for forming such polymer depots in vivo. Alternatively, for oral administration, the gastrointestinal tract can tolerate much larger particles, eg, microparticles having an average diameter of about 1 micron to about 1000 microns.
例えば、典型的には、ポリマーデポーは約24時間、約7日間、約30日間、もしくは約90日間、またはそれ以上から選択される期間にわたって分解することになる。適当な免疫応答を得るためにワクチンを繰り返し注射する必要のない、植え込み可能なワクチン送達組成物を提供するために、より長い期間が特に適している。 For example, typically the polymer depot will degrade over a period selected from about 24 hours, about 7 days, about 30 days, or about 90 days, or longer. Longer periods are particularly suitable to provide an implantable vaccine delivery composition that does not require repeated injections of the vaccine to obtain a suitable immune response.
組換え型タンパク質抗原またはペプチド抗原の調製
単細胞生物における、ペプチドおよびタンパク質抗原を含む異種ポリペプチドの組換え体産生技術は当技術分野で公知であり、本出願において詳細な説明は記載していない。例えば、本発明の実施において使用されるペプチド抗原、ペプチドまたはタンパク質アジュバント、および融合タンパク質の調製は、標準的組換えDNA法を用いて行うことができる。好ましくは、所望のアフィニティーペプチドをコードするヌクレオチド配列をまず合成し、次にHisタグをコードするヌクレオチド配列に連結する。
Preparation of recombinant protein or peptide antigens Techniques for recombinant production of heterologous polypeptides, including peptide and protein antigens, in unicellular organisms are known in the art and are not described in detail in this application. For example, the preparation of peptide antigens, peptide or protein adjuvants, and fusion proteins used in the practice of the present invention can be performed using standard recombinant DNA methods. Preferably, the nucleotide sequence encoding the desired affinity peptide is first synthesized and then linked to the nucleotide sequence encoding the His tag.
このように得られたハイブリッド遺伝子を、標準的方法を用いてプラスミドpDS8/RBSII、SphI;pDS5/RBSII、3A+5A;pDS78/RBSII;pDS56/RBSII、またはその他の市販のもしくは一般に入手可能なプラスミドなどの発現ベクターに組み込むことができる。必要な方法論の大部分は、技術分野の状況を説明する、Maniatis et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 2005において認められる。 The hybrid gene thus obtained is transformed into plasmids pDS8 / RBSII, SphI; pDS5 / RBSII, 3A + 5A; pDS78 / RBSII; pDS56 / RBSII, or other commercially available or commonly available plasmids using standard methods. And can be incorporated into an expression vector. Most of the required methodologies can be found in Maniatis et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 2005, which describes the state of the art.
本発明の融合タンパク質の発現法もまた、上記のManiatisらによって記載されている。それらは以下の手順を包含している:(a) ハイブリッド遺伝子が発現制御配列に機能的に連結された発現ベクターによる、適切な宿主生物、例えば大腸菌(E. coli)の形質転換;(b) 適切な増殖条件下での形質転換宿主生物の培養;ならびに(c) 宿主生物からの所望の融合タンパク質の抽出および単離。使用可能な宿主生物には大腸菌および枯草菌(B. subtilis)の株などのグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌が含まれるがこれらに限定されない。大腸菌のM15株は特に好ましい。使用可能なその他の大腸菌株には、例えば大腸菌294(ATCC No. 3144)、大腸菌RR1(ATCC No. 31343)、および大腸菌W3110(ATCC No. 27325)が含まれる。 The expression method of the fusion protein of the present invention is also described by Maniatis et al. They include the following procedures: (a) transformation of an appropriate host organism, eg, E. coli, with an expression vector in which the hybrid gene is operably linked to expression control sequences; (b) Culturing the transformed host organism under appropriate growth conditions; and (c) extracting and isolating the desired fusion protein from the host organism. Host organisms that can be used include, but are not limited to, gram negative and gram positive bacteria, such as E. coli and B. subtilis strains. The M15 strain of E. coli is particularly preferred. Other E. coli strains that can be used include, for example, E. coli 294 (ATCC No. 3144), E. coli RR1 (ATCC No. 31343), and E. coli W3110 (ATCC No. 27325).
ペプチド抗原またはタンパク質抗原およびアジュバントを組換え型細胞溶解物から選択的に捕捉するための3種類の方法
大量の抗原およびアジュバントを組換え遺伝子技術によって産生するために、タンパク質に対するコード領域を人工遺伝子に組み込み、これを、細菌中、通常は大腸菌中で、または、宿主昆虫細胞中で複製するバキュロウイルスなどのウイルス中で、複製および発現させる。本明細書に記載されるペプチド/タンパク質抗原およびペプチドまたはタンパク質アジュバントの発現のために、異なる単細胞生物で同じものを用いることができる。どの方法を用いても、発現されたタンパク質の多数のコピーを含む最終的な細胞コロニーを、細胞内容物を放出するために溶解する必要がある。別の態様において、ペプチド/タンパク質抗原またはペプチドもしくはタンパク質アジュバントに富む細胞抽出物または細胞溶解物の画分は、当技術分野で周知の方法を用いて形成することができる。その後のワクチン構築物への組み込みのために、次に過剰発現した抗原および/またはアジュバントを、細胞溶解物、抽出物、またはそれらに富む画分から選択的に除去しなければならない。
Three methods for the selective capture of peptide or protein antigens and adjuvants from recombinant cell lysates In order to produce large quantities of antigens and adjuvants by recombinant gene technology, the coding region for the protein is made into an artificial gene. It is replicated and expressed in bacteria, usually in E. coli, or in viruses such as baculovirus that replicate in host insect cells. The same can be used in different unicellular organisms for expression of the peptide / protein antigens and peptide or protein adjuvants described herein. Whatever method is used, the final cell colony containing multiple copies of the expressed protein needs to be lysed to release the cell contents. In another embodiment, the fraction of cell extract or cell lysate enriched in peptide / protein antigen or peptide or protein adjuvant can be formed using methods well known in the art. The overexpressed antigen and / or adjuvant must then be selectively removed from cell lysates, extracts, or enriched fractions for subsequent incorporation into vaccine constructs.
本発明の方法による細胞溶解物からの標的ペプチド/タンパク質分子の選択的捕捉に関して、3種類の方法を本明細書で記載する。構造式IIIおよびIVのPEAおよびPEURポリマーをそれぞれ用いて標的ペプチド/タンパク質分子を捕捉し、かつ同時にワクチン調製物のコアを形成する。新鮮な溶解物、細胞抽出物、またはそれらに富む画分とポリマーとを直接混合し、それにより抗原-ポリマー複合体の形成がもたらされる。含まれるプロセスには、以下を含む溶液または分散物をともに接触させる工程が必要である。1) 抗原をコードするDNA配列を含む少なくとも一つの組換えベクターを含む単細胞生物によって発現される、少なくとも一つのクラスIまたはクラスIIペプチド抗原またはタンパク質全体の抗原、ならびに2) ペプチド/タンパク質抗原が特異的に結合するアフィニティーリガンドが付着する、式(I)および(III〜VII)に記載の化学式を有するポリマーの少なくとも一つまたは混合物を含む生分解性の合成ポリマー。接触工程は、ポリマー、アフィニティーリガンド、およびペプチド/タンパク質抗原を取り込む複合体が形成される本明細書に記載の条件下で行われる。任意で、溶液または分散物は、同じまたは異なる単細胞生物によってペプチドまたはタンパク質アジュバントをコードするDNA配列から発現されるペプチドまたはタンパク質アジュバントを含むこともできる 。 Three methods are described herein for selective capture of target peptide / protein molecules from cell lysates by the methods of the invention. PEA and PEUR polymers of structural formulas III and IV are used to capture the target peptide / protein molecule and at the same time form the core of the vaccine preparation. The polymer is directly mixed with fresh lysate, cell extract, or rich fraction thereof, resulting in the formation of an antigen-polymer complex. The process involved involves contacting the solution or dispersion together, including: 1) at least one class I or class II peptide antigen or whole protein antigen expressed by a unicellular organism containing at least one recombinant vector containing the DNA sequence encoding the antigen, and 2) specific peptide / protein antigen A biodegradable synthetic polymer comprising at least one or a mixture of polymers having the chemical formulas according to formulas (I) and (III-VII) to which an affinity ligand that binds thereto is attached. The contacting step is performed under the conditions described herein, where a complex that incorporates the polymer, affinity ligand, and peptide / protein antigen is formed. Optionally, the solution or dispersion can also include a peptide or protein adjuvant expressed from a DNA sequence encoding the peptide or protein adjuvant by the same or different unicellular organisms.
任意で、ペプチドまたはタンパク質アジュバント-ポリマー複合体を同様に形成することができる。これらのPEAおよびPEURポリマーの各反復単位上にタンパク質捕捉箇所が存在するので、ペプチド抗原-ポリマー複合体、および/またはアジュバント-ポリマー複合体の分子は、サイズろ過によって残りの液体媒体(例えば細胞溶解物)中のタンパク質および他の化合物から除去できるような十分な高分子量を有する。 Optionally, peptide or protein adjuvant-polymer complexes can be formed as well. Because there is a protein capture site on each repeat unit of these PEA and PEUR polymers, the molecules of the peptide antigen-polymer complex and / or adjuvant-polymer complex can be separated by size filtration into the remaining liquid medium (eg, cell lysis). A high molecular weight that can be removed from proteins and other compounds.
オリゴマー化
この方法を用いて、オリゴマーを自然に形成する抗原タンパク質を捕捉してもよい。一例として、A型インフルエンザウイルスに由来する、ヘマグルチニン(HA)の機能的三量体およびノイラミニダーゼ(NA)の四量体が挙げられる。
Oligomerization This method may be used to capture antigenic proteins that naturally form oligomers. An example is a functional trimer of hemagglutinin (HA) and a tetramer of neuraminidase (NA) derived from influenza A virus.
予め調製された標的抗原プロモーターをポリマーの反復単位に結合する。抗原タンパク質のオリゴマー化を促進するバッチ条件下で、プロモーター-ポリマー複合体を溶解物と混合する。得られたオリゴマー-ポリマー複合体を、サイズろ過によって残りのろ液から除去する。オリゴマー化技術による本発明のワクチン送達組成物の調製についてのより完全な説明は、2006年1月31日出願の米国特許出願第11/345,021号に含まれる。 A pre-prepared target antigen promoter is attached to the repeat unit of the polymer. The promoter-polymer complex is mixed with the lysate under batch conditions that promote oligomerization of the antigen protein. The resulting oligomer-polymer complex is removed from the remaining filtrate by size filtration. A more complete description of the preparation of vaccine delivery compositions of the present invention by oligomerization techniques is contained in US patent application Ser. No. 11 / 345,021, filed Jan. 31, 2006.
抗体(Ab)認識
本方法を用いて、抗原タンパク質を捕捉し、それに対するヒト化モノクローナル抗体分子またはその活性断片(MAbまたはFAb)を例えば本明細書に記載のように予め調製することができる。
Antibody (Ab) Recognition Using this method, antigenic proteins can be captured and humanized monoclonal antibody molecules or active fragments thereof (MAbs or FAbs) against them can be pre-prepared, eg, as described herein.
標的抗原に対する予め調製されたMAbまたはFAb分子は、アミド結合もしくはシステイン-マレイミド結合形成を用いて直接的に、またはプロテインAもしくはプロテインGなどのポリマー結合性Ab結合タンパク質ドメインを介して間接的にポリマーの反復単位に結合される。抗体結合を促進するバッチ条件下でAb-ポリマー複合体を溶解物と混合する。得られた抗原-Ab-ポリマー複合体を、サイズろ過によって残りのろ液から取り出す。 Pre-prepared MAb or FAb molecules against the target antigen are polymerized directly using amide bonds or cysteine-maleimide bond formation, or indirectly through polymer-bound Ab-binding protein domains such as protein A or protein G Combined with the repeating unit. The Ab-polymer conjugate is mixed with the lysate under batch conditions that promote antibody binding. The resulting antigen-Ab-polymer complex is removed from the remaining filtrate by size filtration.
金属アフィニティー複合体形成
以下のように(A)イミダゾール誘導体、または(B)ニトリロ三酢酸(NTA)またはイミノ二酢酸(IDA)などのNTA誘導体などの適切な金属アフィニティーリガンドで、予めポリマー反復単位の機能付与が行われる。
Metal Affinity Complex Formation As previously described, the polymer repeat unit of the polymer repeat unit is pre-treated with an appropriate metal affinity ligand such as (A) an imidazole derivative or (B) an NTA derivative such as nitrilotriacetic acid (NTA) or iminodiacetic acid (IDA). Functions are added.
ポリマー-アフィニティーリガンド連結
アフィニティーリガンドは、多種多様な適切な官能基を介して生分解性ポリマーに直接結合される。例えば、生分解性ポリマーがポリエステルである場合、カルボキシル基鎖末端を用いて、アフィニティーリガンド上の相補的部分(例えば、金属アフィニティーリガンドNTAまたはIDA上の一つまたは複数の遊離アミノ基)と反応させることができる。例えば以下において、多種多様な適切な試薬および反応条件が開示されている:March 's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, (2001);およびComprehensive Organic Transformations, Second Edition, Larock (1999)。
Polymer-affinity ligand linkage Affinity ligands are directly attached to the biodegradable polymer via a wide variety of suitable functional groups. For example, if the biodegradable polymer is a polyester, the carboxyl group chain ends are used to react with a complementary moiety on the affinity ligand (eg, one or more free amino groups on the metal affinity ligand NTA or IDA) be able to. For example, a wide variety of suitable reagents and reaction conditions are disclosed below: March 's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, (2001); and Comprehensive Organic Transformations, Second Edition, Larock ( 1999).
その他の態様において、アフィニティーリガンドは、遊離アミド、エステル、エーテル、アミノ、ケトン、チオエーテル、スルフィニル、スルホニル、ジスルフィド結合を介して、構造(I)または(III〜VII)のポリマーのいずれかに連結することができる。当技術分野で公知の合成方法を用いて、適切に機能付与された開始材料からそのような結合を形成することができる。例えば一つの態様において、ポリマーの末端カルボキシル基またはペンダントカルボキシル基(例えばCOOH)を介して、ポリマーを金属アフィニティーリガンドに連結させることができる。具体的には、本発明の方法で使用される金属アフィニティーリガンドを、構造式III、V、およびVIIにより記載されるようなポリマーのアミノ官能基またはヒドロキシル官能基を有するポリマーと反応させることができるが、その一方で、金属アフィニティー複合体を介してポリマーに非共有結合的に付着したペプチド抗原を有する生分解性ポリマーを提供するために、金属遷移イオンとの配位複合体を形成するための遊離結合部位およびペプチド抗原の金属結合アミノ酸をそのままにしておく。もう一つの態様において、ポリマーのカルボキシル基をハロゲン化アシル、酸無水物/「混合」無水物、または活性エステルに変換することができる。その他の態様において、アフィニティーリガンドがポリマーのカルボキシル基のみを介して付着し、ポリマーの遊離端には付着しないことを確実にするために、ポリマー分子の遊離-NH2末端をアシル化することができる。例えば、抗原タンパク質またはペプチド抗原がポリマーのカルボキシル基に形成されたアフィニティー複合体のみを介して付着するがポリマーの遊離端には付着しないことを確実にするために、本明細書に記載の本発明のワクチン送達組成物をPEA、PEUR、またはPEUから調製することができ、ここで、N末端遊離アミノ基は例えば無水RCOOCOR(式中、R = (C1-C24)アルキルである)でアシル化されている。 In other embodiments, the affinity ligand is linked to either the polymer of structure (I) or (III-VII) via a free amide, ester, ether, amino, ketone, thioether, sulfinyl, sulfonyl, disulfide bond. be able to. Such bonds can be formed from appropriately functionalized starting materials using synthetic methods known in the art. For example, in one embodiment, the polymer can be linked to the metal affinity ligand via a terminal carboxyl group or pendant carboxyl group (eg, COOH) of the polymer. Specifically, the metal affinity ligand used in the method of the present invention can be reacted with a polymer having an amino or hydroxyl functionality of the polymer as described by structural formulas III, V, and VII. On the other hand, to form a coordination complex with a metal transition ion to provide a biodegradable polymer having a peptide antigen non-covalently attached to the polymer via a metal affinity complex. The free binding site and the metal binding amino acids of the peptide antigen are left intact. In another embodiment, the carboxyl group of the polymer can be converted to an acyl halide, acid anhydride / “mixed” anhydride, or active ester. In other embodiments, the free-NH 2 end of the polymer molecule can be acylated to ensure that the affinity ligand is attached only through the carboxyl group of the polymer and not the free end of the polymer. . For example, to ensure that an antigenic protein or peptide antigen is attached only through an affinity complex formed at the carboxyl group of the polymer, but not at the free end of the polymer, the invention described herein. Vaccine delivery compositions can be prepared from PEA, PEUR, or PEU, where the N-terminal free amino group is acylated with, for example, anhydrous RCOOCOR where R = (C 1 -C 24 ) alkyl It has become.
例えば、一態様において、側鎖保護リジン(例えば、OBu-Lys)は、構造式III、IV、またはVIIのPEA、PEUR、またはPEUポリマーの反復単位上の活性化カルボキシレートに、アミド結合を介して結合する。脱保護に続いて、これらリジン残基の遊離ε-アミノ基を、2-イミダゾールカルボキシアルデヒドなどの金属アフィニティーリガンドと反応させることによって修飾する。 For example, in one embodiment, the side chain protected lysine (e.g., OBu-Lys) is attached via an amide bond to an activated carboxylate on the repeat unit of the PEA, PEUR, or PEU polymer of structural formula III, IV, or VII. And combine. Following deprotection, the free ε-amino group of these lysine residues is modified by reacting with a metal affinity ligand such as 2-imidazole carboxaldehyde.
次に、Fe2+、Cu2+、またはNi2+より選択される遷移金属(TM)を、例えば2-イミダゾールカルボキシアルデヒドなどの金属アフィニティーリガンドに結合させる。得られたTM誘導体化ポリマーを、6×ヒスチジン付加を有する遺伝子発現タンパク質に結合したTM(II)を介して生物機能付与する。 Next, a transition metal (TM) selected from Fe 2+ , Cu 2+ , or Ni 2+ is bound to a metal affinity ligand such as 2-imidazole carboxaldehyde. The resulting TM derivatized polymer is imparted with biological function via TM (II) coupled to a gene expression protein with 6 × histidine addition.
形成された金属アフィニティー複合体の強度は、使用されるペプチドおよびイオンのHisおよびTrpの数によって変化する。本発明の実施において使用した金属イオンは、ニッケル(Ni2+)、銅(Cu2+)、亜鉛(Zn2+)、およびコバルト(Co2+)である。一般に、ペプチド抗原またはペプチド抗原を組み込んでいる融合タンパク質の金属イオンへの結合の強度は、以下の順で低下する:Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Zn2+。 The strength of the metal affinity complex formed varies with the number of peptides and ions His and Trp used. The metal ions used in the practice of the present invention are nickel (Ni 2+ ), copper (Cu 2+ ), zinc (Zn 2+ ), and cobalt (Co 2+ ). In general, the strength of binding of a peptide antigen or fusion protein incorporating a peptide antigen to a metal ion decreases in the following order: Cu 2+ > Ni 2+ > Co 2+ > Zn 2+ .
本発明のワクチン送達組成物調製法における使用に適した金属アフィニティーリガンドには、ニトリロ三酢酸(NTA)およびイミノ二酢酸(IDA)が含まれる。NTAは、安定度定数109〜1014で様々な遷移金属に結合することが公知の、四座(tetra-dentate)金属アフィニティーリガンドである。ポリマー中の利用可能な官能基にNTAが接合した後も、その内部に複数の遊離金属配位部位が存在し続けるために、安定度定数は高いままである。イミノ二酢酸(IDA)を金属アフィニティーリガンドとして使用する場合、ポリマーへの結合後も、金属イオンが配位されうる二座キレート化部分は遊離状態のままである。金属イオン上の遊離配位部位が次に遊離してペプチド抗原中の金属結合アミノ酸に結合するように、これらの結合金属アフィニティーリガンドを介して様々な金属イオンを配位させることができる。本発明の方法で使用する柔軟なポリマー鎖に沿って遊離官能基が位置しているので、ペプチド抗原表面上の結合部位に対して最良の位置に金属イオンを配置することができる。その結果、形成された金属アフィニティー複合体を介して、ペプチド抗原をポリマーに、非共有結合的ではあるが固く結合させることができる。 Metal affinity ligands suitable for use in the vaccine delivery composition preparation methods of the invention include nitrilotriacetic acid (NTA) and iminodiacetic acid (IDA). NTA is a tetra-dentate metal affinity ligand known to bind to various transition metals with stability constants from 10 9 to 10 14 . Even after NTA is conjugated to an available functional group in the polymer, the stability constant remains high due to the presence of multiple free metal coordination sites within it. When iminodiacetic acid (IDA) is used as the metal affinity ligand, the bidentate chelating moiety to which the metal ion can be coordinated remains free after binding to the polymer. Various metal ions can be coordinated through these bound metal affinity ligands so that free coordination sites on the metal ions are then released and bound to metal-bound amino acids in the peptide antigen. Since free functional groups are located along the flexible polymer chain used in the method of the present invention, the metal ion can be placed in the best position with respect to the binding site on the surface of the peptide antigen. As a result, the peptide antigen can be non-covalently but tightly bound to the polymer via the formed metal affinity complex.
抗原タンパク質、ペプチド抗原、またはペプチド抗原とHisタグとを含む融合ペプチド中の少なくとも一つのヒスチジン残基の存在は、抗原のポリマーへの結合に重要な要素である。しかしながら、本発明の方法および組成物に使用される短鎖ペプチド抗原とともに、存在するαアミノ基もまた役割を果たし、時として、ヒスチジン残基が存在しない場合で、特にシステインやトリプトファンなどの他の金属結合アミノ酸がペプチド抗原に存在して結合に寄与する場合、ペプチド抗原が付着されうる結合に寄与するヒスチジン基のpK値は中性の範囲内にあるため、ポリマーへのペプチド抗原の結合はpH値約7で生じることが予想される。しかし、個々のアミノ酸の実際のpK値は、隣接するアミノ酸残基の影響に強く依存して変動しうる。タンパク質の構造に応じて、アミノ酸のpK値を、理論的pK値から最大で1pH単位較正できることが様々な実験により示されている。したがって、pH値約8の反応液により結合の改善が達成されることが多い。 The presence of at least one histidine residue in an antigen protein, peptide antigen, or fusion peptide comprising a peptide antigen and a His tag is an important factor for binding of the antigen to the polymer. However, along with the short peptide antigens used in the methods and compositions of the present invention, the α-amino group present also plays a role, sometimes in the absence of histidine residues, especially in other cysteine and tryptophan such as cysteine and tryptophan. When a metal-bound amino acid is present in a peptide antigen and contributes to binding, the pK value of the histidine group that contributes to the bond to which the peptide antigen can be attached is in the neutral range, so the binding of the peptide antigen to the polymer is pH It is expected to occur at a value of about 7. However, the actual pK values of individual amino acids can vary depending strongly on the influence of adjacent amino acid residues. Depending on the structure of the protein, various experiments have shown that the pK value of an amino acid can be calibrated up to 1 pH unit from the theoretical pK value. Therefore, the improvement of the binding is often achieved by the reaction solution having a pH value of about 8.
金属配位複合体の形成の間に起こる相互作用におけるこれらの複雑性を除くと、ペプチド抗原またはペプチド抗原を組み込んでいる融合タンパク質中のヒスチジンまたはトリプトファンの数によって、使用すべき金属イオンの選択に関する一般的指針が提供され、これを以下の表4に示す。 Excluding these complications in the interactions that occur during the formation of metal coordination complexes, the choice of metal ion to be used depends on the number of histidine or tryptophan in the peptide antigen or fusion protein incorporating the peptide antigen. General guidance is provided and is shown in Table 4 below.
(表4)
ペプチド抗原中の金属結合AAの存在 適した金属イオン
HisまたはTrpなし 吸着なし
1つのHis Cu2+
2つ以上のHis Cu2+またはNi2+(より強力な吸着)
3〜10個のHisのクラスター Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+
数個のTrp、Hisなし Cu2+
(Table 4)
Presence of metal-bound AA in peptide antigens. Suitable metal ions.
No His or Trp No adsorption
1 His Cu 2+
2 or more His Cu 2+ or Ni 2+ (more powerful adsorption)
3 to 10 His clusters Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Co 2+
Several Trp, without His Cu 2+
pH、緩衝剤、およびイオン強度
反応液または分散物中の条件は、本発明の方法における金属アフィニティー複合体の形成に影響を与える。一般に、約8のpH値により、約6の低pHよりも強い結合が得られる。緩衝物質も結合に影響し、酢酸またはリン酸中で最も強い結合が生じ、アンモニウムまたはTris中で中程度の結合が生じ、クエン酸中で最も弱い結合が生じる。反応液中のイオン強度の制御も複合体形成に影響する。約0.1M〜約1.0Mの濃度範囲、例えば約0.5M〜約0.9Mの範囲のNaClを用いて、望ましくないタンパク質-タンパク質イオン相互作用を抑制してもよい。
pH, buffer, and ionic strength Conditions in the reaction solution or dispersion affect the formation of metal affinity complexes in the methods of the invention. In general, a pH value of about 8 results in stronger binding than a low pH of about 6. Buffers also affect binding, with strongest binding in acetic acid or phosphoric acid, moderate binding in ammonium or Tris, and weakest binding in citric acid. Control of ionic strength in the reaction solution also affects complex formation. NaCl in the concentration range of about 0.1M to about 1.0M, such as in the range of about 0.5M to about 0.9M, may be used to suppress unwanted protein-protein ion interactions.
同じく反応液または分散物中の金属イオンに結合するその他の物質の存在により、標的タンパク質の結合が阻害されることがある。例えば、特に金属イオンが銅である場合、高いイミダゾール濃度は金属複合体の結合特性に強く影響を及ぼす。同時に、反応液のpH値の低下により、細胞溶解物などの複合体混合物由来の利用可能なタンパク質抗原の吸着がより少なくなる。さらに、アフィニティー複合体によって荷電されないままのポリマーカルボキシ基と、タンパク質とのイオン相互作用を阻害するために、比較的高いイオン強度であるべきである。例えば、反応液または分散物中の約0.1M〜1.0MのNaCl、例えば0.5M〜約0.9MのNaClの存在は、反応液中の望ましくないタンパク質結合を阻害するのに十分である。 Similarly, the presence of other substances that bind to metal ions in the reaction solution or dispersion may inhibit target protein binding. For example, especially when the metal ion is copper, a high imidazole concentration strongly affects the binding properties of the metal complex. At the same time, lowering of the pH value of the reaction solution results in less adsorption of available protein antigens from complex mixtures such as cell lysates. Furthermore, it should have a relatively high ionic strength in order to inhibit ionic interactions between the protein and polymer carboxy groups that remain uncharged by the affinity complex. For example, the presence of about 0.1 M to 1.0 M NaCl, such as 0.5 M to about 0.9 M NaCl, in the reaction or dispersion is sufficient to inhibit undesired protein binding in the reaction.
好ましくは、ペプチド抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端に少なくとも一つのHisが存在し(すなわちHisタグ)、これは、金属アフィニティー複合体中の金属イオンに対するペプチド抗原の結合特異性の改善をもたらす。したがって、一態様において、結合特異性を確実にするためのタグとして、少なくとも1個〜約10個の隣接His残基、例えば約6個のHis残基が、アミノ末端およびカルボキシ末端の一方または両方に組み込まれる。Hisタグを追加する場合、Hisタグおよび金属キレート、例えばNi-NTA金属キレートを、最終ワクチン送達組成物中に残存させる。 Preferably, there is at least one His at the amino terminus or carboxy terminus of the peptide antigen (ie, His tag), which results in improved binding specificity of the peptide antigen for metal ions in the metal affinity complex. Thus, in one embodiment, at least 1 to about 10 adjacent His residues, such as about 6 His residues, are used as tags to ensure binding specificity, such as one or both of the amino terminus and the carboxy terminus. Incorporated into. If a His tag is added, a His tag and a metal chelate, such as a Ni-NTA metal chelate, is left in the final vaccine delivery composition.
本発明の方法で使用するペプチド抗原にHisタグを追加するかどうかにかかわらず、ペプチド抗原が最終産物中で金属配位複合体を介してポリマーに非共有結合するように、金属配位複合体およびポリマーはワクチン送達組成物中でペプチド抗原と共に残存する。したがって、Hisタグを有するまたは有さないペプチド抗原にポリマーを非共有結合的に連結する配位複合体が形成されたならば、反応液からワクチン産物を得るのに必要なのは、反応液または分散物中のその他の材料およびタンパク質から、ワクチン送達組成物を構成する複合体を分離することだけである。サイズ排除ろ過または遠心分離などの単純な手順および例えば当技術分野で公知かつ本明細書に記載のものなどの洗浄技術を、この目的のために使用することができる。 Regardless of whether a His tag is added to the peptide antigen used in the method of the present invention, the metal coordination complex is such that the peptide antigen is non-covalently bound to the polymer via the metal coordination complex in the final product. And the polymer remains with the peptide antigen in the vaccine delivery composition. Thus, once a coordination complex has been formed that non-covalently links the polymer to peptide antigens with or without a His tag, it is necessary to obtain a vaccine product from the reaction solution or dispersion. It is only the separation of the complex that makes up the vaccine delivery composition from the other materials and proteins in it. Simple procedures such as size exclusion filtration or centrifugation and washing techniques such as those known in the art and described herein can be used for this purpose.
例えば、以下のアフィニティーリガンド、N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸(アミノブチル、またはAB-NTA)を、アミド結合を介してポリマーの反復単位の活性化されたカルボキシレートに直接結合させることができる。
次に上述の遷移金属(TM)をキレート化NTAに結合させる。His含有タグ、例えば6×Hisタグを有する遺伝子発現ペプチド抗原と結合したTMを介した生物機能付与のために、得られたTM誘導体化ポリマーを細胞溶解物に接触させる。
For example, the following affinity ligand, N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid (aminobutyl, or AB-NTA) is converted to an activated carboxylate of the polymer repeating unit via an amide bond. Can be directly coupled.
Next, the transition metal (TM) is bound to the chelated NTA. The resulting TM derivatized polymer is contacted with a cell lysate for biofunctionalization via TM coupled to a gene-expressing peptide antigen having a His-containing tag, such as a 6 × His tag.
例えば、各6×Hisタグのうち2つのヒスチジンのみが優先的に遷移金属イオンの各キレート化箇所に結合するので、6×Hisでタグ付けしたペプチド抗原または全長抗原タンパク質とTM機能付与ポリマーとの間の複合体は、本明細書に記載の適切な金属アフィニティー複合体形成条件下で、架橋タンパク質-ポリマー複合体を作製することができる。溶解物の巨大分子に関して、化学量論により制御される範囲内の大きなサイズのこれらの架橋タンパク質-ポリマー複合体は、サイズ排除によるろ過を促進して、複合体を反応混合物中のその他のタンパク質および化合物と分離する。 For example, since only two histidines of each 6 × His tag preferentially bind to each chelation site of the transition metal ion, the peptide antigen or full-length antigen protein tagged with 6 × His and the TM function-imparting polymer The complex in between can create a cross-linked protein-polymer complex under the appropriate metal affinity complex formation conditions described herein. With respect to the lysate macromolecules, these large cross-linked protein-polymer complexes within the stoichiometrically controlled range facilitate filtration through size exclusion, making the complex compatible with other proteins in the reaction mixture and Separate with compound.
したがって、一つの態様において、本発明は、ポリマーと予め結合している金属アフィニティーリガンドと、ペプチド/タンパク質抗原、および任意でペプチドまたはタンパク質アジュバント中の金属結合アミノ酸、特にトリプトファン(Trp)およびヒスチジン(His)の遊離部位に特異的に結合する金属遷移イオンとの相互作用に基づく、ワクチン送達組成物を調製するための効率性の高い一段階法を提供する。典型的には、使用される金属イオンはNi2+であり、液体媒体から分離されるペプチド標的は、His含有タグ(例えば6×Hisタグ)が各ペプチド標的のカルボキシ末端に付着している融合タンパク質の形状である。 Thus, in one embodiment, the present invention relates to a metal affinity ligand pre-bound to a polymer, a peptide / protein antigen, and optionally a metal binding amino acid in a peptide or protein adjuvant, particularly tryptophan (Trp) and histidine (His ) Provides a highly efficient one-step method for preparing vaccine delivery compositions based on the interaction with metal transition ions that specifically bind to the free site. Typically, the metal ion used is Ni 2+ and the peptide target separated from the liquid medium is a fusion in which a His-containing tag (e.g. 6xHis tag) is attached to the carboxy terminus of each peptide target. The shape of the protein.
この態様において本発明の一段階法に使用するためには、当技術分野で公知の方法を用いて本明細書に記載のように金属アフィニティーリガンドをポリマーに付着させることによって、ポリマーを予め調製する。調製されたポリマーを分離のためにペプチド標的を含む溶液または分散物と接触させる前に、金属アフィニティーリガンドを金属イオンとともに予め負荷する。溶液または分散物は、His含有タグを有するペプチド抗原またはペプチドアジュバントを含む融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された一つまたは複数の単細胞生物の溶解物または抽出物であってもよい。または、溶液または分散物は、一つまたは複数の融合タンパク質に富む、そのような溶解物または抽出物の画分であってもよい。 In this embodiment, the polymer is pre-prepared for use in the one-step method of the present invention by attaching a metal affinity ligand to the polymer as described herein using methods known in the art. . Prior to contacting the prepared polymer with a solution or dispersion containing the peptide target for separation, the metal affinity ligand is preloaded with metal ions. The solution or dispersion may be a lysate or extract of one or more single cell organisms that have been genetically engineered to express a fusion protein comprising a peptide antigen having a His-containing tag or a peptide adjuvant. Alternatively, the solution or dispersion may be a fraction of such lysate or extract enriched in one or more fusion proteins.
これらの技術を用いて、ペプチドおよびタンパク質のアジュバントを同時にまたは別々に本発明のワクチン送達組成物に組み込むことができる。例えば、ペプチドまたはタンパク質のアジュバントを、ペプチドもしくはタンパク質のアジュバント、または特異的結合タグ(例えばHis含有タグ)が付着したペプチドもしくはタンパク質のアジュバントをコードする融合タンパク質をコードするDNA配列を含むベクターで形質転換した同じまたは別の単細胞生物によって発現させてもよい。この場合、接触させる溶液または分散物は、それぞれのペプチド標的分子が豊富に存在する細胞の溶解物または抽出物の画分を含んでいてもよい。アフィニティーリガンド(例えば本明細書に記載の適切な金属イオンを負荷した金属アフィニティーリガンド)が付着した、負荷したポリマーと接触させることにより、2つのペプチド標的のそれぞれの取り込みのためにアフィニティー複合体形状を分離する。 Using these techniques, peptide and protein adjuvants can be incorporated into the vaccine delivery compositions of the invention either simultaneously or separately. For example, transforming a peptide or protein adjuvant with a vector comprising a DNA sequence encoding a peptide or protein adjuvant, or a fusion protein encoding a peptide or protein adjuvant to which a specific binding tag (e.g., a His-containing tag) is attached. May be expressed by the same or another unicellular organism. In this case, the solution or dispersion to be contacted may comprise a lysate or extract fraction of cells rich in the respective peptide target molecule. By contacting the loaded polymer with an attached affinity ligand (e.g., a metal affinity ligand loaded with an appropriate metal ion as described herein), the affinity complex shape can be reduced for incorporation of each of the two peptide targets. To separate.
別の態様において、免疫刺激アジュバントは、薬剤、ポリマー、生物学的製剤などであっても液体媒体中に発現されないが、ポリマーの官能基または本明細書に記載のリンカーのいずれかでポリマーに予め付着している(アジュバントのこの態様においてアフィニティタグは必要ない)。次に、予め負荷されたポリマーと、発現された標的ペプチド抗原を含む発現細胞の溶解物、抽出物、またはそれらに富む画分とを接触させることにより、本発明のワクチン送達組成物が一段階で、すなわちポリマー(例えば免疫刺激アジュバントが付着した)、アフィニティーリガンド、金属イオン、およびペプチド抗原を組み込む複合体の形成によって形成される。またはさらに、好ましくは抗原含有アフィニティー複合体の形成および液体媒体中のその他の構成成分から組成物を分離した後に、免疫刺激アジュバントを(アフィニティー複合体への直接付着または封入なしで)ポリマー担体に負荷または基質化することができる。またはさらに、以下に記載されるように、組成物をポリマー粒子中に製剤化する場合、免疫刺激アジュバントを本発明のワクチン送達組成物に組み込むことができる。 In another embodiment, the immunostimulatory adjuvant is not expressed in a liquid medium, whether it is a drug, polymer, biologic, etc., but is pre-loaded into the polymer with either the polymer functional group or the linker described herein. Attached (no affinity tag is required in this embodiment of the adjuvant). The vaccine delivery composition of the present invention is then brought into one step by contacting the pre-loaded polymer with a lysate, extract or rich fraction of expressed cells containing the expressed target peptide antigen. In other words, formed by the formation of a complex that incorporates a polymer (eg, with an immunostimulatory adjuvant attached), an affinity ligand, a metal ion, and a peptide antigen. Alternatively or additionally, after the formation of the antigen-containing affinity complex and separation of the composition from other components in the liquid medium, the immunostimulatory adjuvant is loaded onto the polymer carrier (without direct attachment or encapsulation to the affinity complex) Or it can be made into a substrate. Alternatively or additionally, an immunostimulatory adjuvant can be incorporated into the vaccine delivery composition of the present invention when the composition is formulated in polymer particles, as described below.
上述の同じ一段階法を用いて、遊離金属結合アミノ酸を含む標的ペプチドまたはタンパク質(合成ペプチド抗原以外)を、標的ペプチドまたはタンパク質に十分に富む任意の液体の溶液または分散液から分離することができる。好ましくは、標的ペプチドまたはタンパク質はHis含有タグを含む融合タンパク質であり、標的ペプチドまたはタンパク質は、His含有タグ中の遊離の金属結合アミノ酸と特異的に結合するアフィニティーリガンドを予め付着させることによって調製された、本明細書に記載の標的ペプチドまたはタンパク質、アフィニティーリガンド、およびポリマーを含むアフィニティー複合体の形成によって、液体の溶液または分散液中のその他の内容物から分離される。標的ペプチドまたはタンパク質を選択的に結合する一段階法を使用して、当技術分野で周知の方法を用いて標的タンパク質に富む発現細胞の溶解物、抽出物、またはそれらの画分から標的を分離することができる(例えば Methods in Enzymology. Guide to Protein Purification, Vol. 182 (1990)およびProtein Purification Principles and Practice, Third Edition (1994))。ペプチドまたはタンパク質の生物学的活性の破壊を防ぐのに十分穏やかな条件を用いた方法によって、標的ペプチドまたはタンパク質をこのように得ることができる。 Using the same one-step method described above, target peptides or proteins (other than synthetic peptide antigens) containing free metal binding amino acids can be separated from any liquid solution or dispersion that is sufficiently enriched in the target peptide or protein. . Preferably, the target peptide or protein is a fusion protein comprising a His-containing tag, and the target peptide or protein is prepared by pre-attaching an affinity ligand that specifically binds to a free metal binding amino acid in the His-containing tag. In addition, it is separated from other contents in a liquid solution or dispersion by formation of an affinity complex comprising the target peptide or protein described herein, an affinity ligand, and a polymer. Use a one-step method to selectively bind target peptides or proteins to separate targets from lysates, extracts, or fractions of expressed cells rich in target proteins using methods well known in the art (Eg Methods in Enzymology. Guide to Protein Purification, Vol. 182 (1990) and Protein Purification Principles and Practice, Third Edition (1994)). The target peptide or protein can thus be obtained by methods using conditions that are mild enough to prevent disruption of the biological activity of the peptide or protein.
本発明のワクチン送達組成物は、発現したペプチド/タンパク質抗原およびアジュバントから一段階法によって作製されてもそうでなくても、ポリマー粒子として製剤化することができる。本発明のワクチン送達組成物において用いるのに適した粒子は、不混和性溶媒技術を用いて調製することができる。一般に、これらの方法は二つの不混和性液体の乳濁液調製を必要とする。一重乳濁液法を用いて、疎水性アジュバントおよびペプチド抗原、またはその結合体を組み込むポリマー粒子を調製することができる。一重乳濁液法において、まず粒子に組み込む分子を溶媒中のポリマーと混合し、次いで界面活性剤などの表面安定剤と共に水溶液中で乳化する。この様式で、疎水性アジュバント、ペプチド抗原、またはアジュバント/ペプチド抗原結合体を含むポリマー粒子を形成して、水溶液中に懸濁し、ここで粒子中の疎水性結合体は水溶液中に著しく溶出することなく安定であるが、そのような分子は筋組織などの体内組織内に溶出することになる。 The vaccine delivery compositions of the present invention can be formulated as polymer particles, whether or not made from the expressed peptide / protein antigen and adjuvant by a one-step method. Particles suitable for use in the vaccine delivery compositions of the present invention can be prepared using immiscible solvent techniques. In general, these methods require the preparation of an emulsion of two immiscible liquids. The single emulsion method can be used to prepare polymer particles that incorporate a hydrophobic adjuvant and a peptide antigen, or conjugate thereof. In the single emulsion method, the molecules incorporated into the particles are first mixed with the polymer in a solvent and then emulsified in an aqueous solution with a surface stabilizer such as a surfactant. In this manner, polymer particles containing a hydrophobic adjuvant, peptide antigen, or adjuvant / peptide antigen conjugate are formed and suspended in an aqueous solution, where the hydrophobic conjugate in the particle significantly elutes in the aqueous solution. Although not stable, such molecules will elute into body tissues such as muscle tissue.
合成ペプチド抗原を含むほとんどの生物製剤は親水性である。二重乳濁液法を用いて、中に液体または親水性アジュバントおよび/または抗原が分散されているポリマー粒子を調製することができる。二重乳濁液法において、まず水に溶解した液体または親水性アジュバントおよび/または抗原をポリマー溶液に乳化し、乳濁液全体を水に加えて再度乳化し、外側がポリマーコーティングされ、内部に液体アジュバント/ペプチド抗原を含む粒子を形成する。両方の乳化法において粒子の凝集を防ぐために界面活性剤を用いることができる。水に混和しないクロロホルムまたはジクロロメタン(DCM)をPEAおよびPEURポリマーの溶媒として用いるが、調製の後半で溶媒を当技術分野において公知の方法を用いて除去する。 Most biologics that contain synthetic peptide antigens are hydrophilic. The double emulsion method can be used to prepare polymer particles in which a liquid or hydrophilic adjuvant and / or antigen is dispersed. In the double emulsion method, first, a liquid or hydrophilic adjuvant and / or antigen dissolved in water is emulsified in a polymer solution, the entire emulsion is added to water and emulsified again, and the outside is polymer-coated, and the inside Form particles containing liquid adjuvant / peptide antigen. A surfactant can be used to prevent particle aggregation in both emulsification methods. Chloroform or dichloromethane (DCM) immiscible in water is used as a solvent for PEA and PEUR polymers, but the solvent is removed later in the preparation using methods known in the art.
しかし、水溶性が低い特定のペプチド抗原またはアジュバントに対しては、これら二つの乳濁液法は限界がある。この文脈において、「低い水溶性」とは、タキソールなどの真に親油性の薬物よりは疎水性が低いが、多くの生物製剤などの真に水溶性の薬物よりも親水性が低い活性薬剤を意味する。これらの型の中間体化合物は一重乳濁液粒子への高い負荷および安定な基質化のためには親水性が高すぎるが、二重乳濁液内の高い負荷および安定性のためには疎水性が高すぎる。そのような場合、ポリマー層をポリマーおよび水溶性が低い薬物でできた粒子上に、三回の乳化工程によりコーティングする。この方法では薬物負荷は比較的低くなる(約10重量%)が、構造安定性と制御された薬物放出速度が得られる。 However, these two emulsion methods have limitations for certain peptide antigens or adjuvants with low water solubility. In this context, “low water solubility” refers to an active agent that is less hydrophobic than a truly lipophilic drug such as taxol, but less hydrophilic than a truly water soluble drug such as many biologics. means. These types of intermediate compounds are too hydrophilic for high loading on single emulsion particles and stable substrateization, but hydrophobic for high loading and stability in double emulsions. Too high. In such a case, the polymer layer is coated on the particles made of the polymer and the drug with low water solubility by three emulsification steps. This method provides relatively low drug loading (about 10% by weight), but provides structural stability and controlled drug release rate.
第一の乳濁液は、活性薬剤をポリマー溶液に混合し、混合物を界面活性剤またはジ(ヘキサデカノイル)ホスファチジルコリン(DHPC;天然脂質の短鎖誘導体)などの脂質と共に水溶液中で乳化することにより調製する。この様式で、活性薬剤を含む粒子を生成し、水中に懸濁して、第一の乳濁液を生成する。第二の乳濁液は、第一の乳濁液をポリマー溶液中に加え、混合物を乳化することにより生成し、ポリマー溶液中で内部にポリマー/薬物粒子を含む水滴が生じる。水と界面活性剤または脂質は粒子を分離し、ポリマー溶液中に粒子を溶解する。次いで、第三の乳濁液を、第二の乳濁液を界面活性剤または脂質を含む水中に加え、混合物を乳化することにより生成し、水中に最終の粒子を得る。図1に例示するとおり、得られる粒子構造は中心にポリマーとペプチド抗原およびアジュバントからなる一つまたは複数の粒子を有し、これらは水および界面活性剤または脂質などの表面安定剤で取り囲まれ、純粋なポリマー殻で覆われることになる。表面安定剤および水はポリマーコーティング中の溶媒がコーティング内部の粒子と接触してそれらを溶解することを防止すると思われる。 The first emulsion mixes the active agent into the polymer solution and emulsifies the mixture in aqueous solution with a lipid such as a surfactant or di (hexadecanoyl) phosphatidylcholine (DHPC; a short chain derivative of natural lipids). Prepare by. In this manner, particles containing the active agent are produced and suspended in water to produce a first emulsion. The second emulsion is formed by adding the first emulsion into the polymer solution and emulsifying the mixture, resulting in water droplets containing polymer / drug particles inside the polymer solution. Water and surfactant or lipid separate the particles and dissolve the particles in the polymer solution. A third emulsion is then generated by adding the second emulsion into water containing a surfactant or lipid and emulsifying the mixture to obtain the final particles in water. As illustrated in FIG. 1, the resulting particle structure has in the center one or more particles consisting of a polymer and a peptide antigen and an adjuvant, which are surrounded by water and a surface stabilizer such as a surfactant or lipid, It will be covered with a pure polymer shell. The surface stabilizer and water appear to prevent the solvent in the polymer coating from contacting and dissolving the particles inside the coating.
三重乳濁液法によりペプチド抗原またはアジュバントなどの活性薬剤の負荷を高めるために、ポリマーコーティングせず、活性薬剤を水中に溶解せずに、水溶性が低い活性薬剤を第一の乳濁液中の表面安定剤でコーティングすることもできる。この第一の乳濁液において、水、表面安定剤および活性薬剤は、類似の体積、またはそれぞれ(1から3):(0.2から約2):1の範囲の体積比を有する。この場合、水を活性薬剤を溶解するためではなく、表面安定剤の助けと共に活性薬剤を保護するために用いる。次いで、二重および三重乳濁液を前述のとおりに調製する(図1)。 In order to increase the loading of active agents such as peptide antigens or adjuvants by the triple emulsion method, the active agent with low water solubility is not dissolved in the water without polymer coating, and the active agent with low water solubility is contained in the first emulsion. It can also be coated with other surface stabilizers. In this first emulsion, the water, surface stabilizer and active agent have similar volumes or volume ratios in the range of (1 to 3) :( 0.2 to about 2): 1, respectively. In this case, water is used not to dissolve the active agent but to protect the active agent with the aid of a surface stabilizer. Double and triple emulsions are then prepared as described above (FIG. 1).
多くの乳化技術は粒子の製造において用いる乳濁液を調製する際に役立つ。しかし、現在のところ好ましい乳濁液調製法は、水に混和しない溶媒の使用によるものである。乳化法はポリマーを溶媒で溶解する工程と、アジュバント/ペプチド抗原分子と混合する工程と、水に加える工程と、次いで混合器および/または超音波処理器で撹拌する工程とからなる。粒径は、撹拌速度ならびに/またはポリマー、アジュバント/ペプチド抗原分子、および表面安定剤の濃度を制御することにより制御することができる。コーティングの厚さは、第二の乳濁液と第三の乳濁液との比率を調節することで制御可能である。前述の粒子生成法のいずれにおいても、抗原ペプチドおよびアジュバントは、粒子生成後に粒子中のポリマーに結合することにより、粒子の表面上のコーティングを形成することができる。 Many emulsification techniques are useful in preparing emulsions for use in the production of particles. However, the presently preferred emulsion preparation method is by the use of a water-immiscible solvent. The emulsification method comprises a step of dissolving the polymer with a solvent, a step of mixing with an adjuvant / peptide antigen molecule, a step of adding to water, and then stirring with a mixer and / or sonicator. The particle size can be controlled by controlling the agitation rate and / or the concentration of polymer, adjuvant / peptide antigen molecule, and surface stabilizer. The thickness of the coating can be controlled by adjusting the ratio of the second emulsion to the third emulsion. In any of the foregoing particle generation methods, the antigenic peptide and adjuvant can form a coating on the surface of the particle by binding to the polymer in the particle after particle generation.
適当な乳濁液安定剤は、モノオレイン酸マンノイド、デキストラン70,000、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテルなどの、非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、これらはすべて、例えば、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.から容易に購入可能である。界面活性剤は約0.3%から約10%、好ましくは約0.5%から約8%、より好ましくは約1%から約5%の濃度で含まれることになる。 Suitable emulsion stabilizers may include nonionic surfactants, such as monooleate manoids, dextran 70,000, polyoxyethylene ethers, polyglycol ethers, all of which are, for example, Sigma Chemical Co. , Easily available from St. Louis, Mo. The surfactant will be included at a concentration of about 0.3% to about 10%, preferably about 0.5% to about 8%, more preferably about 1% to about 5%.
アジュバント/ペプチド抗原の組成物からの放出速度は、コーティングの厚さ、粒子の外部を覆う抗原の数、粒径、構造、およびコーティングの密度を調節することにより制御することができる。コーティングの密度は、コーティング中のアジュバント/ペプチド抗原の負荷を調節することにより調節可能である。コーティングがアジュバント/ペプチド抗原を含まない場合、ポリマーコーティングは最も密度が高く、アジュバント/ペプチド抗原はコーティングを通って最もゆっくり溶出する。これとは対照的に、アジュバント/ペプチド抗原がコーティング中に負荷されている場合、コーティングはアジュバント/ペプチド抗原が溶出した後に多孔性となり、これはコーティングの外側表面から始まり、したがって粒子の中心のアジュバント/ペプチド抗原は速い速度で溶出することができる。薬物負荷が高いほど、コーティング層の密度は低く、溶出速度は速くなる。コーティング中のアジュバント/ペプチド抗原の負荷は、外側コーティングの下の粒子内部のものよりも低くなりうる。粒子からのアジュバント/ペプチド抗原の放出速度は、前述のとおりに調製した異なる放出速度の粒子を混合することによって制御することもできる。 The rate of release from the adjuvant / peptide antigen composition can be controlled by adjusting the thickness of the coating, the number of antigens lining the particle, the particle size, the structure, and the density of the coating. The density of the coating can be adjusted by adjusting the loading of the adjuvant / peptide antigen in the coating. If the coating does not contain an adjuvant / peptide antigen, the polymer coating is the most dense and the adjuvant / peptide antigen elutes most slowly through the coating. In contrast, when the adjuvant / peptide antigen is loaded into the coating, the coating becomes porous after the adjuvant / peptide antigen elutes, which starts from the outer surface of the coating and is therefore the central adjuvant of the particle / Peptide antigens can be eluted at a fast rate. The higher the drug load, the lower the density of the coating layer and the faster the dissolution rate. The adjuvant / peptide antigen loading in the coating can be lower than that inside the particles under the outer coating. The release rate of the adjuvant / peptide antigen from the particles can also be controlled by mixing particles with different release rates prepared as described above.
二重および三重乳濁液ポリマーの調製法の詳細な記載は、Pierre Autant et al, Medicinal and/or nutritional microcapsules for oral administration、米国特許第6,022,562号;Iosif Daniel Rosca et al., Microparticle formation and its mechanism in single and double emulsion solvent evaporation, Journal of Controlled Release(2004) 99:271-280;L. Mu and S.S. Feng, A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E (TPGS, J. Control. Release (2003) 86:33-48;Somatosin containing biodegradable microspheres prepared by a modified solvent evaporation method based on W/O/W-multiple emulsions, Int. J. Pharm. (1995) 126:129-138 and F. Gabor et al., Ketoprofenpoly(d,l-lactic-co-glycolic acid) microspheres: influence of manufacturing parameters and type of polymer on the release characteristics, J. Microencapsul. (1999) 16 (1):1-12に見いだすことができ、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。 A detailed description of how to prepare double and triple emulsion polymers can be found in Pierre Autant et al, Medicinal and / or nutritional microcapsules for oral administration, US Pat. No. 6,022,562; Iosif Daniel Rosca et al., Microparticle formation and its mechanism in single and double emulsion solvent evaporation, Journal of Controlled Release (2004) 99: 271-280; L. Mu and SS Feng, A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E (TPGS, J. Control. Release (2003) 86: 33-48; Somatosin containing biodegradable microspheres prepared by a modified solvent evaporation method based on W / O / W-multiple emulsions, Int. J. Pharm. (1995) 126: 129-138 and F. Gabor et al., Ketoprofenpoly (d, l-lactic-co-glycolic acid) microspheres: influence of manufacturing parameters and type of polymer on the release characteristics, J. Microencapsul. (1999) 16 (1): 1- 12 and can be found in their entirety by reference. Are incorporated herein.
水溶性ペプチド抗原および/またはアジュバント送達のためのさらなる態様において、粒子を循環への送達のために約20nmから約200nmの平均直径を有するナノ粒子に調製することができる。ナノ粒子は、ペプチド抗原をその中に分散して、すなわち本明細書に記載のとおり乳濁液中に混合、またはポリマーに結合して、一重乳濁液法により調製することができる。ナノ粒子は、本明細書に記載のPEAまたはPEURポリマーを含むミセルとして提供することもできる。ミセルを水中で形成し、アジュバントタンパク質を伴う水溶性抗原を溶媒なしで同時にミセル中に負荷する。 In further embodiments for water soluble peptide antigen and / or adjuvant delivery, the particles can be prepared into nanoparticles having an average diameter of about 20 nm to about 200 nm for delivery to the circulation. Nanoparticles can be prepared by a single emulsion method with peptide antigens dispersed therein, ie mixed in an emulsion as described herein, or attached to a polymer. Nanoparticles can also be provided as micelles comprising PEA or PEUR polymers as described herein. Micelles are formed in water and water soluble antigen with adjuvant protein is loaded into the micelles simultaneously without solvent.
特に、図2に例示する生分解性ミセルを疎水性ポリマー鎖に結合した水溶性イオン化ポリマー鎖で形成する。ミセルの外側部分は主にポリマーの水溶性イオン化部分からなる一方で、ポリマーの疎水性部分は主にミセルの内部に分配され、ポリマー分子をまとめる。 In particular, the biodegradable micelles illustrated in FIG. 2 are formed with water-soluble ionized polymer chains bonded to hydrophobic polymer chains. The outer part of the micelle consists mainly of the water-soluble ionized part of the polymer, while the hydrophobic part of the polymer is distributed mainly inside the micelle, bringing together the polymer molecules.
ミセルを調製するために用いるポリマーの生分解性疎水性部分は、本明細書に記載のPEA、PEURまたはPEUポリマーでできている。疎水性が強いPEA、PEURまたはPEUポリマーのために、1,4:3,6-ジアンヒドロ-D-ソルビトールのジ-L-ロイシンエステルまたはα,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)(C1-C8)アルカンのような硬性の芳香族二酸をポリマー反復単位に含むことができる。これとは対照的に、ポリマーの水溶性部分はポリエチレングリコール、ポリグリコサミノグリカンまたは多糖と少なくとも一つのイオン化可能または極性アミノ酸との反復交互単位を含み、ここで反復交互単位は実質的に類似の分子量を有し、かつポリマーの分子量は約10kDaから約300kDaの範囲である。水溶性部分の分子量が高いほど、ミセルの多孔度は大きく、より長い鎖は水溶性抗原およびアジュバントの高い負荷を可能にする。 The biodegradable hydrophobic portion of the polymer used to prepare micelles is made of PEA, PEUR or PEU polymers as described herein. For highly hydrophobic PEA, PEUR or PEU polymers, di-L-leucine ester of 1,4: 3,6-dianhydro-D-sorbitol or α, ω-bis (4-carboxyphenoxy) (C 1- C 8 ) Hard aromatic diacids such as alkanes can be included in the polymer repeat unit. In contrast, the water-soluble portion of the polymer includes repeating alternating units of polyethylene glycol, polyglycosaminoglycan or polysaccharide and at least one ionizable or polar amino acid, where the repeating alternating units are substantially similar. And the molecular weight of the polymer ranges from about 10 kDa to about 300 kDa. The higher the molecular weight of the water-soluble moiety, the greater the micelle porosity, and the longer chains allow for higher loading of water-soluble antigens and adjuvants.
反復交互単位は約300Dから約700Dの範囲の実質的に類似の分子量を有しうる。ポリマーの分子量が10kDよりも大きい一つの態様において、アミノ酸単位の少なくとも一つはセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンから選択されるイオン化可能または極性アミノ酸である。一つの態様において、イオン化可能アミノ酸の単位は、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩などのイオン化可能ポリ(アミノ酸)の少なくとも一つのブロックを含み、ポリマーに含まれうる。本発明のミセル組成物は、ポリマーの水溶性部分におけるイオン化可能アミノ酸の少なくとも一部がイオン化されるpH値を有する、薬学的に許容される水性媒体をさらに含んでいてもよい。 The repeating alternating unit can have a substantially similar molecular weight in the range of about 300D to about 700D. In one embodiment where the molecular weight of the polymer is greater than 10 kD, at least one of the amino acid units is an ionizable or polar amino acid selected from serine, glutamic acid, aspartic acid, lysine and arginine. In one embodiment, the ionizable amino acid unit comprises at least one block of an ionizable poly (amino acid) such as glutamate or aspartate and may be included in the polymer. The micelle composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable aqueous medium having a pH value at which at least some of the ionizable amino acids in the water soluble portion of the polymer are ionized.
ミセル中の荷電部分は水中で互いに部分的に分離し、ペプチド抗原および任意のタンパク質アジュバントなどの水溶性薬剤を吸収するための空間を作り出す。同じ型の電荷を有するイオン化した鎖は互いに反発し、さらに空間を作り出すことになる。また、イオン化ポリマーはペプチド抗原を引きつけ、基質に安定性をもたらす。加えて、水溶性のミセル外部はイオン化部位が治療薬によって取られた後、ミセルが体液中のタンパク質に付着するのを防止する。この型のミセルは多孔度が非常に高く、ミセル体積の95%にも達して、ペプチド/タンパク質抗原およびペプチドまたはタンパク質アジュバントなどの水溶性生物製剤の高い負荷を可能にする。ミセルの粒径の範囲は約20nmから約200nmで、血中での循環のためには約20nmから約100nmが好ましい。 The charged moieties in the micelles partially separate from each other in water, creating a space for absorbing water soluble drugs such as peptide antigens and any protein adjuvant. Ionized chains with the same type of charge will repel each other, creating more space. The ionized polymer also attracts peptide antigens and provides stability to the substrate. In addition, the water-soluble micelle exterior prevents the micelles from adhering to proteins in body fluids after the ionization site has been taken by the therapeutic agent. This type of micelle is very porous, reaching as much as 95% of the micelle volume, allowing high loading of water-soluble biologics such as peptide / protein antigens and peptide or protein adjuvants. Micellar particle size ranges from about 20 nm to about 200 nm, preferably about 20 nm to about 100 nm for circulation in blood.
アジュバント/ペプチド抗原の組成物からの放出速度は、コーティングの厚さ、粒径、構造、およびコーティングの密度を調節することにより制御することができる。コーティングの密度は、コーティング中のアジュバント/ペプチド抗原の負荷を変えることにより調節可能である。コーティングがペプチド抗原またはアジュバントを含まない場合、ポリマーコーティングは最も密度が高く、ペプチド抗原およびアジュバントのコーティングを通っての溶出は最も遅くなる。これとは対照的に、ペプチド抗原またはアジュバントがコーティング中に負荷されている場合、コーティングはペプチド抗原またはアジュバントが溶出した後に多孔性となり、これはコーティングの外側表面から始まり、したがって粒子の中心の活性薬剤は速い速度で溶出することができる。コーティング層の薬物負荷が高いほど、密度は低く、溶出速度は速くなる。コーティング中のアジュバント/ペプチド抗原の負荷は、外側コーティングの下の粒子内部のものよりも低くなりうる。粒子からのアジュバント/ペプチド抗原の放出速度は、前述のとおりに調製した異なる放出速度の粒子を混合することによって制御することもできる。 The rate of release from the adjuvant / peptide antigen composition can be controlled by adjusting the coating thickness, particle size, structure, and coating density. The density of the coating can be adjusted by changing the loading of the adjuvant / peptide antigen in the coating. If the coating contains no peptide antigen or adjuvant, the polymer coating is the most dense and the elution of the peptide antigen and adjuvant through the coating is the slowest. In contrast, when a peptide antigen or adjuvant is loaded into the coating, the coating becomes porous after the peptide antigen or adjuvant elutes, starting from the outer surface of the coating and thus the activity in the center of the particle The drug can be eluted at a fast rate. The higher the drug loading of the coating layer, the lower the density and the faster the dissolution rate. The adjuvant / peptide antigen loading in the coating can be lower than that inside the particles under the outer coating. The release rate of the adjuvant / peptide antigen from the particles can also be controlled by mixing particles with different release rates prepared as described above.
粒径は、例えば、ヘリウム-ネオンレーザーを組み込んでいる分光計を用いてのレーザー光散乱によってもとめることができる。一般に、粒径は室温で測定し、問題となる試料を複数回(例えば、5〜10回)分析して、粒径の平均値を出す。粒径は、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて容易にもとめることもできる。そのために、乾燥粒子を金/パラジウム混合物で約100オングストロームの厚さにスパッターコーティングし、次いで走査電子顕微鏡を用いて検査する。または、ペプチド抗原を化学結合せずにポリマー中に取り込む(「負荷」または「基質化」)のではなく、粒子またはそれ以外の形のポリマーを、当技術分野において公知かつ本明細書に記載のいくつかの方法のいずれかを用いて、ペプチド抗原に直接共有結合することもできる。ペプチド抗原の含有量は一般に、ポリマーに対して約0.1重量%から約40重量%のペプチド抗原、より好ましくは約1重量%から約25重量%のペプチド抗原、さらにより好ましくは約2重量%から約20重量%のペプチド抗原となる量である。ペプチド抗原のパーセンテージは、以下により詳細に論じるとおり、所望の用量および治療中の状態に依存することになる。ペプチド抗原およびアジュバントが負荷された粒子またはポリマー分子の調製に続き、組成物を凍結乾燥し、乾燥した組成物を免疫化の前に適当なビヒクルに懸濁することができる。 The particle size can be determined, for example, by laser light scattering using a spectrometer incorporating a helium-neon laser. Generally, the particle size is measured at room temperature, and the sample in question is analyzed a plurality of times (for example, 5 to 10 times) to obtain an average value of the particle sizes. The particle size can also be easily determined using a scanning electron microscope (SEM). To that end, dry particles are sputter coated with a gold / palladium mixture to a thickness of about 100 Å and then inspected using a scanning electron microscope. Alternatively, rather than incorporating peptide antigens into the polymer without chemical linkage (`` loading '' or `` substrateing ''), particles or other forms of polymer are known in the art and described herein. Any of several methods can also be used to covalently link directly to the peptide antigen. The content of peptide antigen is generally from about 0.1% to about 40% peptide antigen, more preferably from about 1% to about 25% peptide antigen, even more preferably from about 2% by weight based on the polymer. The amount is about 20% by weight of peptide antigen. The percentage of peptide antigen will depend on the desired dose and the condition being treated, as discussed in more detail below. Following preparation of the particle or polymer molecule loaded with peptide antigen and adjuvant, the composition can be lyophilized and the dried composition suspended in a suitable vehicle prior to immunization.
ワクチン送達組成物中に含まれる、ペプチド抗原およびアジュバントを含む免疫原性粒子またはポリマー分子の、任意の適当かつ有効な量を、ポリマー粒子(インビボで形成されるポリマーデポー内のものを含む)から経時的に放出することができ、これは典型的には、例えば、特定のポリマー、ペプチド抗原、アジュバントまたは存在する場合にはポリマー/ペプチド抗原結合に依存することになる。典型的には、ポリマー粒子または分子の約100%までをポリマーデポーから放出することができる。具体的には、その約90%まで、75%まで、50%まで、または25%までをポリマーデポーから放出することができる。ポリマーからの放出速度に典型的に影響をおよぼす因子は、ポリマーの性質および量、ポリマー/ペプチド抗原結合および/またはポリマー/生物活性薬剤結合の型、ならびに製剤中に含まれる追加の物質の性質および量である。 Any suitable and effective amount of immunogenic particles or polymer molecules, including peptide antigens and adjuvants, included in the vaccine delivery composition is taken from the polymer particles (including those in the polymer depot formed in vivo). It can be released over time and will typically depend on, for example, the particular polymer, peptide antigen, adjuvant, or polymer / peptide antigen binding if present. Typically, up to about 100% of the polymer particles or molecules can be released from the polymer depot. Specifically, up to about 90%, up to 75%, up to 50%, or up to 25% can be released from the polymer depot. Factors that typically affect the rate of release from the polymer include the nature and amount of the polymer, the type of polymer / peptide antigen binding and / or polymer / bioactive agent binding, and the nature of the additional substances included in the formulation. It is a quantity.
本発明のワクチン送達組成物を前述のとおりにいったん調製した後、組成物を続く粘膜または皮下送達のために製剤化する。組成物は一般には、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの、粘膜または皮下送達に適した、一つまたは複数の「薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル」を含むことになる。加えて、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質などの補助物質も、そのようなビヒクル中に含まれうる。 Once the vaccine delivery composition of the invention is prepared as described above, the composition is formulated for subsequent mucosal or subcutaneous delivery. A composition generally contains one or more “pharmaceutically acceptable excipients or vehicles” suitable for mucosal or subcutaneous delivery, such as water, saline, glycerol, polyethylene glycol, hyaluronic acid, ethanol, and the like. Will be included. In addition, auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering substances and the like may be included in such vehicles.
例えば、鼻内および肺製剤は通常、鼻粘膜に刺激を引き起こさず、繊毛機能を著しく妨害もしないビヒクルを含む。水、食塩水または他の公知の物質などの希釈剤を、本発明と共に用いることができる。鼻製剤は、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどであるが、それらに限定されるわけではない、保存剤を含んでいてもよい。鼻粘膜による吸収を促進するために、界面活性剤を含んでいてもよい。 For example, intranasal and pulmonary formulations typically include vehicles that do not cause irritation to the nasal mucosa and do not significantly interfere with ciliary function. Diluents such as water, saline or other known materials can be used with the present invention. Nasal formulations may include preservatives such as, but not limited to, chlorobutanol and benzalkonium chloride. A surfactant may be included to facilitate absorption by the nasal mucosa.
直腸および尿道坐剤のために、ビヒクルは、カカオバター(カカオ脂)または他のトリグリセリド、エステル化、水素添加および/または分別により改変された植物油、グリセリン処理ゼラチン、ポリアルカリグリコール、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物ならびにポリエチレングリコールの脂肪酸エステルなどの、伝統的な結合剤および担体を含むことになる。 For rectal and urethral suppositories, vehicles are made of cocoa butter (cocoa butter) or other triglycerides, vegetable oils modified by esterification, hydrogenation and / or fractionation, glycerin-treated gelatin, polyalkali glycols, of various molecular weights. It will contain traditional binders and carriers, such as mixtures of polyethylene glycols and fatty acid esters of polyethylene glycol.
膣送達のために、本発明の製剤は、ポリエチレントリグリセリドの混合物を含むものなどの膣坐剤基剤に組み込む、またはコロイドシリカを任意に含む、トウモロコシ油またはゴマ油などの油中に懸濁することができる。例えば、Richardson et al., Int. J. Pharm. (1995) 115:9-15を参照されたい。 For vaginal delivery, the formulations of the invention may be incorporated into vaginal suppository bases such as those containing a mixture of polyethylene triglycerides, or suspended in oils such as corn oil or sesame oil, optionally including colloidal silica. Can do. See, for example, Richardson et al., Int. J. Pharm. (1995) 115: 9-15.
特定の送達様式で用いるのに適したビヒクルのさらなる議論については、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995を参照されたい。当業者であれば、特定の抗原および送達部位に対して用いるのに適当なビヒクルを容易に決定することができる。 See, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995, for further discussion of vehicles suitable for use in a particular mode of delivery. One skilled in the art can readily determine the appropriate vehicle to use for a particular antigen and delivery site.
本発明の方法において用いる組成物は、対象となるペプチド抗原の「有効量」を含みうる。すなわち、症状を予防、軽減または除去するために被験体に十分な免疫応答を起こさせる抗原の量が、組成物に含まれることになる。必要とされる厳密な量は、様々な因子の中でも特に、治療中の被験体;治療する被験体の年齢および全身状態;被験体の免疫系が抗体を合成する能力;望まれる保護の程度;治療中の状態の重症度;選択した特定の抗原およびその投与様式に応じて変動することになる。適当な有効量は当業者であれば容易に決定することができる。したがって、「有効量」は日常的試験によって決定することができる、比較的広い範囲となる。例えば、本発明の目的のために、有効用量は典型的には1用量あたり送達する抗原約1μgから約100mg、例えば約5μgから約1mg、または約10μgから約500μgの範囲となる。 The composition used in the method of the present invention may contain an “effective amount” of the peptide antigen of interest. That is, the composition will include an amount of an antigen that elicits a sufficient immune response in the subject to prevent, reduce or eliminate symptoms. The exact amount required will include, among other factors, the subject being treated; the age and general condition of the subject being treated; the ability of the subject's immune system to synthesize antibodies; the degree of protection desired; The severity of the condition being treated; it will vary depending on the particular antigen chosen and its mode of administration. An appropriate effective amount can be readily determined by one of skill in the art. Thus, an “effective amount” is a relatively broad range that can be determined by routine testing. For example, for purposes of the present invention, effective doses typically range from about 1 μg to about 100 mg of antigen delivered per dose, such as from about 5 μg to about 1 mg, or from about 10 μg to about 500 μg.
いったん製剤化した後、本発明の組成物を、標準の技術を用いて、注射により粘膜または皮下に投与する。例えば、鼻内、肺、膣および直腸送達技術を含む、粘膜送達技術については、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995、ならびに鼻内投与については、欧州特許第517,565号およびIllum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141を参照されたい。 Once formulated, the compositions of the invention are administered by mucosal or subcutaneous injection by standard techniques. For example, for mucosal delivery techniques, including intranasal, pulmonary, vaginal and rectal delivery techniques, see Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995, and for intranasal administration. EP 517,565 and Illum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29: 133-141.
投与処置は、当技術分野において公知のとおり、本発明の徐放性ワクチン送達組成物の一回投与でもよく、または複数回投与スケジュールでもよい。追加免疫は初回免疫応答のために投与した同じ製剤で行ってもよく、または抗原を含む異なる製剤で行ってもよい。投与法は、少なくとも部分的には、被験体の必要性によっても決定され、医師の判断に依存する。さらに、疾患の予防が望まれる場合、ワクチン送達組成物は一般には対象となる病原体による最初の感染前に投与する。治療、例えば、症状または再発の軽減が望まれる場合、ワクチン送達組成物は一般には最初の感染後に投与する。 Dosage treatment may be a single dose of the sustained release vaccine delivery composition of the invention or a multiple dose schedule, as is known in the art. The booster immunization may be performed with the same formulation administered for the primary immune response, or with a different formulation containing the antigen. The dosage regimen will also be determined, at least in part, by the subject's needs and will depend on the judgment of the physician. In addition, if disease prevention is desired, the vaccine delivery composition is generally administered prior to the first infection with the pathogen of interest. Vaccine delivery compositions are generally administered after the initial infection if treatment, eg, reduction of symptoms or recurrence, is desired.
本発明の組成物は、皮下または粘膜送達の試験用に開発されたいくつかの動物モデルにおいてインビボで試験することができる。例えば、意識のあるヒツジモデルは、物質の鼻内送達を試験するための当技術分野において認められたモデルである。例えば、Longenecker et al., J. Pharm. Sci. (1987) 76:351-355およびIllum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141を参照されたい。一般には粉末化された凍結乾燥型のワクチン送達組成物を鼻腔内に吹き込む。血液試料を、前述のとおり、当技術分野において公知の標準技術を用いて、抗体価について検定することができる。細胞性免疫応答も前述のとおりにモニターすることができる。 The compositions of the present invention can be tested in vivo in several animal models developed for testing subcutaneous or mucosal delivery. For example, a conscious sheep model is an art recognized model for testing intranasal delivery of a substance. See, for example, Longenecker et al., J. Pharm. Sci. (1987) 76: 351-355 and Illum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29: 133-141. Generally, a powdered lyophilized vaccine delivery composition is blown into the nasal cavity. Blood samples can be assayed for antibody titers using standard techniques known in the art, as described above. Cellular immune responses can also be monitored as described above.
現在のところ、供与者からの細胞を用いる、細胞性免疫応答に対する一連のインビトロ検定がある。検定は、細胞が供与者からのものである状況を含むが、多くの検定は他の供給源、例えば、B細胞株からの抗原提示細胞の供給源を提供する。これらのインビトロ検定には、細胞障害性Tリンパ球検定;リンパ球増殖検定、例えば、三重水素化チミジン取り込み;タンパク質キナーゼ検定、イオン輸送検定およびリンパ球遊走阻害機能検定が含まれる(Hickling, J. K. et al. (1987) J. Virol., 61: 3463;Hengel, H. et al. (1987) J. Immunol., 139: 4196;Thorley-Lawson, D. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5384;Kadival, G. J. et al. (1987) J. Immunol, 139:2447;Samuelson, L. E. et al. (1987) J. Immunol, 139:2708;Cason, J. et al. (1987) J. Immunol. Meth., 102:109;およびTsein, R. J. et al. (1982) Nature, 293: 68。これらの検定は、細胞性免疫活性に対する真の特異性を欠く可能性があり、同じMHC型のAPCによる抗原処理および提示を必要とし、遅く(時に数日間続く)、かつ一部は主観的かつ/または放射性同位体の使用を必要とする点で不利である。 Currently there are a series of in vitro assays for cellular immune responses using cells from donors. Assays include situations where the cells are from a donor, but many assays provide other sources, such as a source of antigen presenting cells from a B cell line. These in vitro assays include cytotoxic T lymphocyte assays; lymphocyte proliferation assays such as tritiated thymidine incorporation; protein kinase assays, ion transport assays and lymphocyte migration inhibition functional assays (Hickling, JK et al. al. (1987) J. Virol., 61: 3463; Hengel, H. et al. (1987) J. Immunol., 139: 4196; Thorley-Lawson, DA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5384; Kadival, GJ et al. (1987) J. Immunol, 139: 2447; Samuelson, LE et al. (1987) J. Immunol, 139: 2708; Cason, J. et al. 1987) J. Immunol. Meth., 102: 109; and Tsein, RJ et al. (1982) Nature, 293: 68. These assays may lack true specificity for cellular immune activity, It is disadvantageous in that it requires antigen processing and presentation with the same MHC-type APC, is slow (sometimes lasting several days), and partly requires the use of subjective and / or radioisotopes.
T細胞によって認識されたペプチドがT細胞を活性化して免疫応答を引き起こすかどうかを試験するために、いわゆる「機能試験」を用いる。酵素結合免疫スポット(ELISpot)法が、マイクロプレート上のサイトカインまたはエフェクター分子に特異的なモノクローナル抗体の結合により、特定のサイトカインまたは他のエフェクター分子を分泌する個々の細胞を検出するために改変されている。抗原によって刺激された細胞を固定化した抗体と接触させる。細胞および結合していない物質があればそれらを洗浄した後、標識ポリクローナル抗体または、しばしば、同じサイトカインまたは他のエフェクター分子に特異的なモノクローナル抗体をウェルに加える。洗浄後、サイトカイン局在部位に青-黒色の沈澱(またはスポット)が生成するように、標識抗体に結合する着色料を加える。スポットを手動で、または自動ELISpot読み取り器で計数して、応答を定量することができる。試験ペプチドによるT細胞活性化の最終確認には、例えば、マウスまたは他の動物モデルにおけるインビボ試験が必要となることもある。 In order to test whether peptides recognized by T cells activate T cells and cause an immune response, so-called “functional tests” are used. The enzyme-linked immunospot (ELISpot) method has been modified to detect individual cells that secrete specific cytokines or other effector molecules by the binding of monoclonal antibodies specific for cytokines or effector molecules on microplates. Yes. Cells stimulated by the antigen are contacted with the immobilized antibody. After washing the cells and any unbound material, labeled polyclonal antibodies, or often monoclonal antibodies specific for the same cytokine or other effector molecule, are added to the wells. After washing, a colorant that binds to the labeled antibody is added so that a blue-black precipitate (or spot) is formed at the site of cytokine localization. Spots can be counted manually or with an automatic ELISpot reader to quantify the response. Final confirmation of T cell activation by the test peptide may require, for example, in vivo testing in mice or other animal models.
容易に明らかとなるとおり、本発明のワクチン送達組成物は、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌によって引き起こされる様々な疾患および感染症を治療および/または予防するため、ならびに様々な腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するために、そのような病原体に対する免疫応答を誘導するために有用である。組成物は前述のとおり治療的または予防的に用いうるだけでなく、組成物は、例えば、診断目的、ならびに対象となる抗原の免疫精製のために、ポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体を調製するためにも用いることができる。ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択した哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど)を本発明の組成物で免疫する。動物を2〜6週後に抗原の一回または複数回投与により任意に追加免疫する。次いで、免疫した動物からポリクローナル抗血清を得、公知の方法により処理する。例えば、Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370を参照されたい。 As will be readily apparent, the vaccine delivery composition of the present invention is intended to treat and / or prevent various diseases and infections caused by viruses, bacteria, parasites and fungi, and immune responses against various tumor antigens. Is useful for inducing an immune response against such pathogens. Not only can the composition be used therapeutically or prophylactically as described above, the composition can be used to prepare both polyclonal and monoclonal antibodies, for example, for diagnostic purposes and for immunopurification of the antigen of interest. Can also be used. If a polyclonal antibody is desired, a selected mammal (eg, mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with the composition of the invention. Animals are optionally boosted 2 to 6 weeks later by single or multiple doses of antigen. A polyclonal antiserum is then obtained from the immunized animal and processed by known methods. See, for example, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348: 363-370.
モノクローナル抗体は一般にはKohler and Milstein, Nature (1975) 256:495-96、またはその改変法を用いて調製する。典型的には、マウスまたはラットを前述のとおりに免疫する。しかし、血清を抽出するために動物から採血するのではなく、脾臓(および任意にいくつかの大きいリンパ節)を摘出し、単一の細胞に分離する。望まれる場合には、脾細胞の懸濁液をタンパク質抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに加えて、脾細胞をスクリーニングしてもよい(非特異的付着細胞の除去後)。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するB細胞はプレートに結合し、懸濁液の残りと共に洗い流されることはない。次いで、得られるB細胞、またはすべての分離脾細胞を、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成するよう誘導し、選択した培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「HAT」)中で培養する。得られるハイブリドーマを限界希釈により播種し、免疫抗原に特異的に結合する(および無関係の抗原には結合しない)抗体の産生について検定する。次いで、選択したモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマをインビトロ(例えば、組織培養瓶または中空繊維反応器中)またはインビボ(マウスの腹水など)のいずれかで培養する。例えば、M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980);Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981);Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)を参照されたく;米国特許第4,341,761号;第4,399,121号;4,427,783号;第4,444,887号;第4,466,917号;第4,472,500号、第4,491,632号;および第4,493,890号も参照されたい。対象となるポリペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性などについでスクリーニングすることができる。 Monoclonal antibodies are generally prepared using Kohler and Milstein, Nature (1975) 256: 495-96, or modifications thereof. Typically, mice or rats are immunized as described above. However, rather than drawing blood from the animal to extract serum, the spleen (and optionally several large lymph nodes) is removed and separated into single cells. If desired, splenocyte suspensions may be added to plates or wells coated with protein antigens to screen splenocytes (after removal of nonspecific adherent cells). B cells expressing membrane-bound immunoglobulin specific for the antigen bind to the plate and are not washed away with the rest of the suspension. The resulting B cells, or all isolated splenocytes, are then induced to fuse with myeloma cells to form hybridomas and in a selected medium (e.g., hypoxanthine, aminopterin, thymidine medium, `` HAT '') Incubate at The resulting hybridomas are seeded by limiting dilution and assayed for the production of antibodies that specifically bind to the immune antigen (and do not bind to unrelated antigens). The selected monoclonal antibody-secreting hybridoma is then cultured either in vitro (eg, in a tissue culture bottle or hollow fiber reactor) or in vivo (such as mouse ascites). See, eg, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); US Pat. No. 4,341,761 See also: Nos. 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500, 4,491,632; and 4,493,890. A panel of monoclonal antibodies raised against the polypeptide of interest can then be screened for various properties, ie isotype, epitope, affinity, etc.
以下の実施例は例示を意味するもので、本発明を制限するものではない。 The following examples are meant to be illustrative and not limiting of the present invention.
実施例1
PEA-抗原結合体の合成
PEAスクシンイミジルエステル(PEA-OSu)の合成。すべての実施例はN-アセチル化ポリマー(A)からである。PEA 1.392g、754μM、反復単位あたりのMW計算値=1845(式I、R1=(CH2)8;R2=H;R3=(CH3)2CHCH2;R4=(CH2)6;n=70;m/m+p=0.75およびp/m+p=0.25)を無水DMF(7ml)に撹拌しながら溶解した。PEAのわずかに粘性の溶液にN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、0.110g、955μMを固体で加えた。1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、146mg、759.8μMをDMF中の懸濁液として移した。反応用のDMFの全量は10mlであった。反応を室温、窒素雰囲気下で24時間実施した。
Example 1
Synthesis of PEA-antigen conjugate
Synthesis of PEA succinimidyl ester (PEA-OSu). All examples are from N-acetylated polymer (A). PEA 1.392 g, 754 μM, MW calculated per repeating unit = 1845 (Formula I, R 1 = (CH 2 ) 8 ; R 2 = H; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 6 ; n = 70; m / m + p = 0.75 and p / m + p = 0.25) were dissolved in anhydrous DMF (7 ml) with stirring. To a slightly viscous solution of PEA, N-hydroxysuccinimide (NHS), 0.110 g, 955 μM was added as a solid. 1-Ethyl-3- (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 146 mg, 759.8 μM was transferred as a suspension in DMF. The total amount of DMF for reaction was 10 ml. The reaction was carried out at room temperature under a nitrogen atmosphere for 24 hours.
PEA-インフルエンザペプチド結合体の合成
B1)
PEA-ペプチド結合体(式IV、R1=(CH2)8;;R3=(CH3)2CHCH2;R4=(CH2)6;R5=NH;n=70;m/m+p=0.75およびp/m+p=0.25ならびに
)の合成を、DMF中の活性エステル(A)の49.5μM量およびトリフルオロ酢酸塩としての
96mg(49.5μM)により実施した。ペプチドを溶解し、DMSO(5ml)中の活性エステルに移した。1当量、すなわち49.5μMのエチル-ジイソプロピルアミンを加え、反応を窒素雰囲気下で24時間続けた。DMSO(300μl)中の蒸留水30μlを加え、室温でさらに4時間撹拌を続けた。
Synthesis of PEA-influenza peptide conjugates
B1)
PEA-peptide conjugate (formula IV, R 1 = (CH 2 ) 8 ;; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 ) 6 ; R 5 = NH; n = 70; m / m + p = 0.75 and p / m + p = 0.25 and
) In the amount of 49.5 μM active ester (A) in DMF and trifluoroacetate
Performed with 96 mg (49.5 μM). The peptide was dissolved and transferred to the active ester in DMSO (5 ml). One equivalent, ie 49.5 μM ethyl-diisopropylamine was added and the reaction was continued for 24 hours under a nitrogen atmosphere. 30 μl of distilled water in DMSO (300 μl) was added and stirring was continued for another 4 hours at room temperature.
反応混合物をジエチルエーテル(60ml)中で沈澱させ、遠心分離後、得られた材料をジエチルエーテル(15ml)で三回洗浄した。風乾後、得られた生成物を3×5mlの蒸留水で1分間超音波にかけて処理した。遠心分離後、得られた材料を凍結乾燥した。収量86mg、47%。 The reaction mixture was precipitated in diethyl ether (60 ml) and after centrifugation, the resulting material was washed three times with diethyl ether (15 ml). After air drying, the resulting product was treated with 3 × 5 ml distilled water for 1 minute by sonication. After centrifugation, the resulting material was lyophilized. Yield 86 mg, 47%.
B2)
PEA-ペプチド結合体(式IX、R5-R7-R5を通じて架橋、R1=(CH2)8;R3=(CH3)2CHCH2;R4=(CH2)6;R5=NH;n=70;m/m+p=0.75およびp/m+p=0.25ならびに
)の合成を、DMF(600μl)中の活性エステル(A)の37.7μM量およびトリフルオロ酢酸塩としての
74mg(37.7μM)により実施した。ペプチドを溶解し、DMSO(ジメチルスルホキシド)(0.8ml)中の活性エステルに移した。4当量、すなわち198μMのエチル-ジイソプロピルアミンを加え、反応を窒素雰囲気下で48時間続けた。透明のゲル様材料を有機溶媒からデカンテーションにより分離した。2〜3mmの大きい断片に切断後、生成物を蒸留水17mlにより+4℃で18時間処理した。遠心分離およびデカンテーションをした後、材料を蒸留水17mlで二回(各回3時間)処理し、最後の遠心分離後、生成物を凍結乾燥した。収量:75mg、53%。
B2)
PEA-peptide conjugate (cross-linked through formula IX, R 5 -R 7 -R 5 , R 1 = (CH 2 ) 8 ; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 ) 6 ; R 5 = NH; n = 70; m / m + p = 0.75 and p / m + p = 0.25 and
) In the amount of 37.7 μM active ester (A) in DMF (600 μl) and trifluoroacetate as
Performed with 74 mg (37.7 μM). The peptide was dissolved and transferred to the active ester in DMSO (dimethyl sulfoxide) (0.8 ml). Four equivalents, ie 198 μM ethyl-diisopropylamine, were added and the reaction was continued for 48 hours under a nitrogen atmosphere. The transparent gel-like material was separated from the organic solvent by decantation. After cutting into large pieces of 2-3 mm, the product was treated with 17 ml of distilled water at + 4 ° C. for 18 hours. After centrifugation and decantation, the material was treated twice with 17 ml of distilled water (3 hours each time) and after the last centrifugation the product was lyophilized. Yield: 75 mg, 53%.
B3)
PEA-ペプチド結合体(式IX、R5-R7-R5を通じて架橋、R1=(CH2)8;R3=(CH3)2CHCH2;R4=(CH2)6;R5=NH;n=8;m/m+p=0.75およびp/m+p=0.25ならびにR7=PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO:19))の合成を、DMF(600μl)中の(A)と同様の様式で合成した活性エステル41.2μMおよびトリフルオロ酢酸塩としての
40mg(20.6μM)により実施した。ペプチドを溶解し、DMSO(5ml)中の活性エステルに移した。4当量、すなわち80μMのエチル-ジイソプロピルアミンを加え、反応を窒素雰囲気下で72時間続けた。DMSO(300μl)中の蒸留水75μl(4.2mM)を加え、さらに24時間撹拌を続けた。次いで、反応混合物を水/アセトン(1:1 v/v、24ml)中で沈澱させた。得られた沈殿を蒸留水(4×12ml)により+4℃で各回約1時間処理した後、遠心分離した。最後の遠心分離後、生成物を凍結乾燥した。収量50mg、45%。
B3)
PEA-peptide conjugate (crosslinked through formula IX, R 5 -R 7 -R 5 , R 1 = (CH 2 ) 8 ; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 ) 6 ; R 5 = NH; n = 8; m / m + p = 0.75 and p / m + p = 0.25 and R 7 = PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 19))) was synthesized with (A) in DMF (600 μl) Active ester synthesized in a similar manner 41.2 μM and as trifluoroacetate
Performed with 40 mg (20.6 μM). The peptide was dissolved and transferred to the active ester in DMSO (5 ml). Four equivalents,
インビトロヒトT細胞応答プロトコルの概要
CD4+ T細胞および単球をヒト供与者の末梢血から単離する。単球を、サイトカインを多く含む培地中で48時間培養して、樹状細胞(抗原提示細胞)への分化を誘導する。培養24時間後に、PEAまたはPEA-ヘマグルチニンペプチド(307〜319)結合体を培地に加える。樹状細胞およびT細胞の共培養開始の2時間前に、遊離ペプチドを対照ウェルに加える。樹状細胞と一緒に培養したT細胞を、48時間、72時間、および96時間の時点で増殖およびサイトカイン分泌により活性化について測定する。T細胞応答プロトコルの概略図を本明細書の図3に例示する。
Overview of in vitro human T cell response protocol
CD4 + T cells and monocytes are isolated from the peripheral blood of human donors. Monocytes are cultured in a medium rich in cytokines for 48 hours to induce differentiation into dendritic cells (antigen-presenting cells). After 24 hours of culture, PEA or PEA-hemagglutinin peptide (307-319) conjugate is added to the medium. Free peptide is added to control
ポリマー-ペプチド結合体に曝露した樹状細胞に応答してのT細胞活性化を、前述のプロトコルを用いて試験した。図4Aは、96時間のT細胞増殖を示し、PEA-ペプチド結合体はペプチドまたはPEA単独に比べて有意な増殖を刺激した。図4Bは、96時間のT細胞IL-2分泌を示し、PEA-ペプチド(式III、実施例B1)はペプチドまたはPEA単独に比べて有意なIL-2分泌を刺激した。 T cell activation in response to dendritic cells exposed to polymer-peptide conjugates was tested using the protocol described above. FIG. 4A showed 96 hours of T cell proliferation, where PEA-peptide conjugates stimulated significant proliferation compared to peptide or PEA alone. FIG. 4B showed 96 hours of T cell IL-2 secretion, with PEA-peptide (Formula III, Example B1) stimulated significant IL-2 secretion compared to peptide or PEA alone.
実施例2
APCへのPEA-黒色腫ペプチド抗原の送達による細胞障害性T細胞応答
本発明者らは、細胞障害性Tリンパ球の殺傷応答を誘導するPEA-黒色腫ペプチドの能力について調べた。2つの黒色腫関連タンパク質であるgp100およびMART-1由来のMHCI制限ペプチドをペプチド抗原として用いて、実施例1に記載したPEAに結合した。MHCI対立遺伝子であるHLA-A2を発現する健康なヒト供与体から末梢血を収集した。血液から末梢血単核細胞(PBMC)を単離し、MART-1ペプチド、gp100ペプチド、PEA-MART-1結合体、またはPEA-gp100結合体に曝露させた。腫瘍浸潤性リンパ球をHLA-A2黒色腫患者から単離し、これらの細胞がペプチド処理または構築物処理した末梢血単核細胞を殺す能力を、殺された細胞によるラクトースデヒドロゲナーゼの培地中への放出によって測定した。ポリマーのみ、ペプチドのみ、またはポリマーとペプチドの混合物のみでは、腫瘍浸潤性リンパ球のPBMC殺傷を誘導しなかった。ペプチドとポリマーの結合体のみでは殺傷を誘導した。重要なことに、Tリンパ球の殺傷活性は7日間持続し、このことからPEA-ペプチド結合体処理の持続性およびPBMCの表面上におけるMHCI-抗原複合体の持続的存在が示された(図5(A)MART-1ペプチド(B)gp100ペプチド)。PEAによって送達された黒色腫抗原は、癌患者の腫瘍細胞から強力かつ持続的なTリンパ球応答を刺激し、結果はペプチドベースの癌ワクチンのための本発明の組成物の使用を実証している。
Example 2
Cytotoxic T cell response by delivery of PEA-melanoma peptide antigen to APC We investigated the ability of PEA-melanoma peptide to induce killing response of cytotoxic T lymphocytes. Two melanoma-related proteins, gp100 and MART-1 derived MHCI restricted peptides were used as peptide antigens to bind to PEA as described in Example 1. Peripheral blood was collected from healthy human donors expressing the MHCI allele HLA-A2. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from blood and exposed to MART-1 peptide, gp100 peptide, PEA-MART-1 conjugate, or PEA-gp100 conjugate. Tumor-infiltrating lymphocytes were isolated from HLA-A2 melanoma patients and the ability of these cells to kill peptide- or construct-treated peripheral blood mononuclear cells was determined by the release of lactose dehydrogenase into the medium by the killed cells. It was measured. Polymer alone, peptide alone, or a mixture of polymer and peptide alone did not induce PBMC killing of tumor infiltrating lymphocytes. Only peptide and polymer conjugates induced killing. Importantly, the killing activity of T lymphocytes persisted for 7 days, indicating the persistence of PEA-peptide conjugate treatment and the persistent presence of MHCI-antigen complexes on the surface of PBMC (Fig. 5 (A) MART-1 peptide (B) gp100 peptide). Melanoma antigen delivered by PEA stimulates a strong and persistent T lymphocyte response from tumor cells of cancer patients, and the results demonstrate the use of the composition of the invention for peptide-based cancer vaccines Yes.
実施例3
PEA-HIVペプチド抗原送達によるインビボでのT細胞応答
実際のエピトープより長いペプチド抗原を用いて、固有のプロセシングおよびインビボでのMHC-I制限T細胞応答を実証した。
は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のgp120コートタンパク質のV3ループの構造に基づく合成ペプチドである。ウイルスは、ウイルスの融合が起こる前に、この構造を用いて細胞表面に結合する。ペプチド抗原は、本明細書の実施例1に記載のようにPEAに結合した。マウスを、20μgのBlockAide/CRを含むペプチド、ペプチドアジュバント混合物、またはPEA-ペプチド結合体を用いて、最大4回、週に1回尾部への皮下注射によって免疫した。2回目の免疫の1週間後、および4回目の免疫の1週間後に、外科的切除によって1群あたり三匹のマウスから脾臓を採取した。ペプチド特異的T細胞の応答は、IFN-γおよびIL-2特異的ELISpotアッセイによって分析し、抗原特異的T細胞の相対的な数および活性を定量した。ELISpotアッセイの結果(図6)により、BlockAide/CRが、その後の脾臓によるT細胞活性化によって測定されるような全身の免疫応答を誘起する代わりに、局所的APCに送達されプロセシングをうけたことが示された。アジュバントを含まないPEA-BlockAide/CR結合体が、PEA-BlockAide/CR結合体プラスアジュバントと同程度強力な応答を刺激したことに留意されたい。サイトカインの分泌を用いて、ELISpotによってエピトープ特異的T細胞を数え上げた。ペプチドのみ(A)、アジュバントのみ(B)、およびPEAのみ(C)ではサイトカインの分泌を誘導しなかった。2つのPEA-ペプチド製剤(EおよびF)は、アジュバントなしで、ペプチドプラスアジュバント(D)と同程度強力にT細胞の応答を刺激することが示される。特に製剤Eは、ペプチドプラスアジュバント(D)に比べて持続的なIL-2の放出を誘導した。
Example 3
In vivo T cell response by PEA-HIV peptide antigen delivery
Peptide antigens longer than the actual epitope were used to demonstrate intrinsic processing and in vivo MHC-I restricted T cell responses.
Is a synthetic peptide based on the structure of the V3 loop of the gp120 coat protein from human immunodeficiency virus (HIV). Viruses use this structure to bind to the cell surface before viral fusion occurs. The peptide antigen was conjugated to PEA as described in Example 1 herein. Mice were immunized by subcutaneous injection into the tail with peptides containing 20 μg BlockAide / CR, peptide adjuvant mixtures, or PEA-peptide conjugates up to 4 times per week. One week after the second immunization and one week after the fourth immunization, spleens were collected from 3 mice per group by surgical excision. Peptide-specific T cell responses were analyzed by IFN-γ and IL-2 specific ELISpot assays to quantify the relative number and activity of antigen-specific T cells. The ELISpot assay results (Figure 6) showed that BlockAide / CR was delivered to local APC and processed instead of inducing a systemic immune response as measured by subsequent spleen T cell activation. It has been shown. Note that PEA-BlockAide / CR conjugate without adjuvant stimulated a response as strong as PEA-BlockAide / CR conjugate plus adjuvant. Epitope-specific T cells were enumerated by ELISpot using cytokine secretion. Peptide alone (A), adjuvant alone (B), and PEA alone (C) did not induce cytokine secretion. Two PEA-peptide formulations (E and F) are shown to stimulate T cell responses as potent as peptide plus adjuvant (D) without adjuvant. In particular, Formulation E induced sustained IL-2 release compared to peptide plus adjuvant (D).
実施例4
PEA-タンパク質抗原送達を用いた、致死的なA型インフルエンザウイルスの攻撃からの防御
図7に示した結果によって示されるように、本発明の組成物および方法を用いて、A型インフルエンザウイルスの攻撃からの防御を実証した。PEAミクロスフェアにH1N1 A型インフルエンザ株由来の精製バキュロウイルス産生ヘマグルチニン(HA)を負荷し、1回の皮下免疫化によって、CpGアジュバントを含む、または含まない分散液中の5μgのタンパク質抗原を送達した。または、生きたH1N1ウイルスのPR8株(腹腔内)、すなわち5μgのHAを用いて、ミョウバンまたはCpGアジュバントあり、またはなしでマウスを免疫した。免疫されていないマウスを対照として用いた。ワクチン接種後21日目に、LD50の10倍のH1N1ウイルスPR8株を用いて動物を鼻腔内で攻撃し、致死的なインフルエンザ感染を生じさせ、7日間にわたって重量減少をモニタリングした。群あたりの生存しているマウス数を図7に示し、それは、本発明のタンパク質抗原HA-PEAポリマーのワクチン送達組成物が、致死的な感染に対して100%の防御を与えたことを示す。
Example 4
Protection against lethal influenza A virus attack using PEA-protein antigen delivery As shown by the results shown in FIG. 7, using the compositions and methods of the present invention, an influenza A virus attack Demonstrated protection from. PEA microspheres were loaded with purified baculovirus-produced hemagglutinin (HA) from H1N1 influenza A strain and delivered 5 μg protein antigen in dispersion with or without CpG adjuvant by one subcutaneous immunization . Alternatively, live H1N1 virus PR8 strain (intraperitoneal),
実施例5
PEA-HPVタンパク質抗原を用いた免疫化による腫瘍成長の阻止
ワクチン送達組成物は、悪性の癌に対する予防的かつ治療的なワクチンとしても使用される。本出願の概念実証は、E6E7癌遺伝子融合タンパク質を負荷したPEAまたはPEURミクロスフェアを用いた免疫化によってマウスに注射することで、HPV-トランスフェクト腫瘍細胞の定着を阻止することを実証することによって行われる。
Example 5
Inhibition of tumor growth by immunization with PEA-HPV protein antigen Vaccine delivery compositions are also used as prophylactic and therapeutic vaccines against malignant cancers. The proof of concept of this application is to demonstrate that HPV-transfected tumor cell colonization is blocked by injection into mice by immunization with PEA or PEUR microspheres loaded with E6E7 oncogene fusion protein. Done.
PEA/PEUR-抗原ミクロスフェアの製剤化
有機中水性(aqueous in organic)一次乳濁液の調製
所望のポリマーの種類、すなわちPEAまたはPEUR-リジン-ニトリロ三酢酸結合体(PEA-NTAまたはPEUR-NTA)を、室温、1気圧(RT、1Atm)で1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)の有機溶媒系(A1相と呼ぶ)に溶解させた。A1相中のポリマー濃度は5%、または有機溶媒1mlあたりポリマー50mgであった。A1相に室温(RT)、1Atmで1.16モル当量のNiSO4(水溶性で0.1M)、リジン-ニトリロ三酢酸(ポリマーに結合したNTA)を添加することによって有機中水性乳濁液を作製した。より詳細には、1.4ml、0.1MのNiSO4を、5.7mlのHFIP(120μmolのNTAに対して140μmolのNiSO4)に溶解した285mgのPEA-NTAに加えた。乳濁液(A2相と呼ぶ)をそれぞれRT、1Atmで120秒間、ボルテックス撹拌および音波処理槽に置くことによって均一にした。HFIPに対して体積0.5当量の脱イオン化H2O(2.35mlの脱イオン化H2Oを、5.7mlのHFIPに溶解した285mgのPEA-NTAに添加した)を、均一なA2にさらに添加し、溶液をそれぞれRT、1Atmで120秒間、ボルテックス撹拌および音波処理に再度供した。
Formulation of PEA / PEUR-antigen microspheres in an aqueous in organic primary emulsion Desired polymer type, ie PEA or PEUR-lysine-nitrilotriacetic acid conjugate (PEA-NTA or PEUR-NTA ) Was dissolved in an organic solvent system of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) (referred to as phase A1) at room temperature and 1 atmosphere (RT, 1 Atm). The polymer concentration in the A1 phase was 5%, or 50 mg polymer per ml organic solvent. A water-in-organic emulsion was prepared by adding 1.16 molar equivalents of NiSO 4 (water soluble 0.1 M), lysine-nitrilotriacetic acid (NTA bound to polymer) at room temperature (RT), 1 Atm, to phase A1. . More specifically, 1.4 ml, 0.1 M NiSO 4 was added to 285 mg PEA-NTA dissolved in 5.7 ml HFIP (140 μmol NiSO 4 for 120 μmol NTA). The emulsion (referred to as phase A2) was homogenized by placing it in a vortexing and sonication bath at RT, 1 Atm for 120 seconds, respectively. Volume 0.5 equivalents of deionized H 2 O with respect to HFIP (the deionized of H 2 O 2.35 ml, was added to the PEA-NTA of 285mg dissolved in HFIP of 5.7 ml), further added to the homogeneous A2, The solution was again subjected to vortexing and sonication for 120 seconds at RT and 1 Atm, respectively.
水性中有機中水性(aqueous in organic in aqueous)二次乳濁液の調製
A2相を水溶液(B1相と呼ぶ)に添加して、0.2%または1mlのポリ(ビニル)アルコール(80%加水分解、20%アセテート)中2mgで、25W出力、4℃、1Atmで超音波処理(Fisher Scientific Sonic Dismembrator, model 100)によって形成させて、二次乳濁液を作製した。A2相とB1相との体積比は1:11であり、例えば、9.1mlのA2相を100mlのB1相に加えた。二次乳濁液(B2相と呼ぶ)を760mHg減圧下で600秒間、30℃で回転蒸発させ、HFIPを除去した。20μmメッシュフィルターを用いて大きなミクロスフェアを乳濁液から除去した。次に、ろ液を分子量10,000のカットオフのセルロース膜中で24時間透析し、過剰な溶媒および対イオン(SO4 2-)を除去した。透析は脱イオン化H2O中で、外液と内液との体積比が40:1で室温で行った。4リットルの脱イオン化H2Oに対して100mlのB2相を透析した。透析時間4、8、および20時間目に脱イオン化H2Oを新鮮なH2Oと置き換えた。透析でB2相を除去し、再度20μmメッシュフィルターに通し(凝集物を収集)、液体窒素中で凍結させ、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥の後、球体は乾燥した緑色の粉末となり、脱イオン化H2Oまたは所望の緩衝剤で還元することができる。
Preparation of aqueous in organic in aqueous secondary emulsion
Add A2 phase to aqueous solution (referred to as B1 phase) and sonicate with 2mg in 0.2% or 1ml poly (vinyl) alcohol (80% hydrolyzed, 20% acetate), 25W output, 4 ℃, 1Atm (Fisher Scientific Sonic Dismembrator, model 100) to form a secondary emulsion. The volume ratio of A2 phase to B1 phase was 1:11, for example, 9.1 ml of A2 phase was added to 100 ml of B1 phase. The secondary emulsion (referred to as phase B2) was rotoevaporated at 30 ° C. under reduced pressure of 760 mHg for 600 seconds to remove HFIP. Large microspheres were removed from the emulsion using a 20 μm mesh filter. The filtrate was then dialyzed for 24 hours in a 10,000 molecular weight cut-off cellulose membrane to remove excess solvent and counterion (SO 4 2− ). Dialysis was performed in deionized H 2 O at a room temperature with a volume ratio of external solution to internal solution of 40: 1. 100 ml of B2 phase was dialyzed against 4 liters of deionized H 2 O. Deionized H 2 O was replaced with fresh H 2 O at
PEA/PEUR抗原粒子の調製
上述の調製による凍結乾燥球体を、4℃で、溶液中のタンパク質量の4倍の負荷率で所望のタンパク質溶液で還元した。この実施例において、20mgの球体を5mgのタンパク質溶液(10ml、0.2mg/ml)で還元した。タンパク質溶液中の粒子の懸濁液をロッキングプレートを用いて4℃で1.1時間穏やかに振とうさせた。懸濁液を、4℃、4000×gで5分間遠心分離して得られた上清を移し、過剰な遊離タンパク質を除去した。洗浄工程の際に、ペレットをタンパク質溶液(本発明者らの実施例では10ml)と等量のPBS7.4緩衝剤中で再懸濁した。この洗浄工程をさらに2回繰り返し(同様の断続的な遠心分離とともに)、最終的に開始時のタンパク質溶液と等量の脱イオン化H2O中に再懸濁した。液体窒素中でこの溶液を凍結させ、一晩凍結乾燥させた。最終産物はわずかに緑色の粉末で、所望の生理緩衝剤で還元することができる。
Preparation of PEA / PEUR antigen particles Lyophilized spheres according to the above preparation were reduced with the desired protein solution at 4 ° C. with a loading factor of 4 times the amount of protein in the solution. In this example, 20 mg spheres were reduced with 5 mg protein solution (10 ml, 0.2 mg / ml). The suspension of particles in protein solution was gently shaken at 4 ° C. for 1.1 hours using a rocking plate. The supernatant obtained by centrifuging the suspension at 4000 × g for 5 minutes at 4 ° C. was transferred to remove excess free protein. During the washing step, the pellet was resuspended in an equal volume of PBS 7.4 buffer with the protein solution (10 ml in our example). This washing step was repeated two more times (with similar intermittent centrifugation) and finally resuspended in an equal volume of deionized H 2 O to the starting protein solution. The solution was frozen in liquid nitrogen and lyophilized overnight. The final product is a slightly green powder that can be reduced with the desired physiological buffer.
マウスの尾部の基部に以下を皮下注射した(1)E6E7タンパク質 10μg+CpG、PEA-E6E7(10μgのタンパク質抗原を含む)+本発明のCpGワクチン組成物、(2)放射線照射腫瘍細胞、または(3)なし。免疫化の5週間後に、マウスを側腹部に5×105 C3-43 HPV-トランスフェクト細胞を皮下注射して攻撃した。腫瘍の攻撃後15日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を取り出して重量測定した(図8)。PEA-E6E7で免疫したマウスは5匹中4匹が無視できるほど小さい腫瘍を有していたのに対し、融合タンパク質のみで免疫したマウスは5匹中5匹が大きな腫瘍を有した。
(1)
実施例6
ポリマー-アジュバント組成物による抗原提示細胞の活性化
抗原全体が迅速に結合するように、カプセル化、またはPEA球体に対するTLRアゴニストなどの異なる種類のアジュバントとの共有結合のような一定の様式で、PEA抗原送達プラットフォームを修飾した。これにより、本発明の組成物を、各ワクチン候補物の所望の免疫応答を増強するように調製する手段が提供される。Toll様受容体(TLR)は、細菌またはウイルス性DNAなどの病原体に対する先天免疫応答を調節する分子のファミリーである。それらは、いくつかの公知の免疫刺激アジュバントに対する受容体である。TLR-7は細胞内受容体であるため、この受容体に対しては、イミキモドなどのTLRアゴニストを用いて直接的な細胞内刺激を提供することが望ましい。
Example 6
Activation of antigen-presenting cells with polymer-adjuvant compositions PEA in a certain manner, such as encapsulation or covalent coupling with different types of adjuvants such as TLR agonists for PEA spheres so that the entire antigen binds rapidly The antigen delivery platform was modified. This provides a means for preparing the compositions of the invention to enhance the desired immune response of each vaccine candidate. Toll-like receptors (TLRs) are a family of molecules that modulate innate immune responses against pathogens such as bacterial or viral DNA. They are receptors for several known immunostimulatory adjuvants. Since TLR-7 is an intracellular receptor, it is desirable to provide direct intracellular stimulation to this receptor using a TLR agonist such as imiquimod.
PEA_スクシンイミジルエステルの合成
PEA (I).Ac.H (1)、1.116g (606μmol, 1.0 eq)、反復単位あたりの計算値MW=1845 (式、R1 = (CH2)8; R2 = H; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; n = 35を6.0mlの無水DMFに溶解させ、撹拌してポリマーを完全に溶解させた。N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、0.137g (667μmol, 1.1 eq)、および固体のジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、0.076g (667μmol, 1.1 eq)を、わずかに粘性のPEA溶液に添加した。室温、窒素雰囲気下で24時間、反応を行った。DCCウレアが白色固体として沈殿した。反応混合物を0.2μポアフィルターでろ過した。
Synthesis of PEA_succinimidyl ester
PEA (I) .Ac.H (1), 1.116 g (606 μmol, 1.0 eq), Calculated per repeating unit MW = 1845 (Formula, R 1 = (CH 2 ) 8 ; R 2 = H; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 ) 6; n = 35 was dissolved in 6.0 ml of anhydrous DMF and stirred to completely dissolve the polymer.N-hydroxysuccinimide (NHS), 0.137 g (667 μmol, 1.1 eq), and solid dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 0.076 g (667 μmol, 1.1 eq), were added to the slightly viscous PEA solution at room temperature for 24 hours under nitrogen atmosphere. DCC urea precipitated as a white solid and the reaction mixture was filtered through a 0.2μ pore filter.
PEA-イミキモド結合体の合成
DMFおよびDMSO、0.16g (667μmol, 1.1 eq)中のイミキモドの活性化エステル(2)を用いて、PEA-イミキモド結合体(式、R1 = (CH2)8; R2 = H; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; R5 = NH; R6 =イミキモド)の合成を行った。イミキモドを25.0mlのDMSOに溶解させ、活性化エステルに変換した。115μlのエチル-ジイソプロピルアミン(667μmol、1.1eq)を添加し、48〜50℃の窒素下で6日間反応を続けた。反応混合物をDI水(30ml)中で沈殿させた。遠心分離およびデカンテーションの後、得られた材料をDI水(30ml)で2回、および0.1NのHClで2回洗浄して未反応のイミキモドを除去し、最後に再びDI水(25ml)で2回洗浄した。遠心分離およびデカンテーションの後、得られた材料を凍結乾燥した。収量1.133g、89.84%。
Synthesis of PEA-imiquimod conjugate
Using activated ester of imiquimod (2) in DMF and DMSO, 0.16 g (667 μmol, 1.1 eq), the PEA-imiquimod conjugate (formula, R 1 = (CH 2 ) 8 ; R 2 = H; R 3 = (CH 3 ) 2 CHCH 2 ; R 4 = (CH 2 ) 6; R 5 = NH; R 6 = imiquimod). Imiquimod was dissolved in 25.0 ml DMSO and converted to the activated ester. 115 μl of ethyl-diisopropylamine (667 μmol, 1.1 eq) was added and the reaction continued for 6 days under nitrogen at 48-50 ° C. The reaction mixture was precipitated in DI water (30 ml). After centrifugation and decantation, the resulting material was washed twice with DI water (30 ml) and twice with 0.1 N HCl to remove unreacted imiquimod and finally again with DI water (25 ml). Washed twice. After centrifugation and decantation, the resulting material was lyophilized. Yield 1.133 g, 89.84%.
図9に示すとおり、ポリマーは、1つのTLR-7アゴニストであるイミキモド(IMQ)の細胞内送達を提供することができる。この実施例において細胞内送達は、遊離のIMQよりも10〜100倍優れた刺激をもたらす。図9Aにおいて、示された物質とともにインキュベートされ、かつ活性化マーカーである表面のCD40上昇について染色された、Balb/cマウスからのCD11c陽性骨髄派生樹状細胞(BMDC)のFACS分析強度分布の記録を示す。計算された強度分布の幾何平均を、各条件に対して「幾何平均」と表示した列に記入した。PEA-IMQは10μMおよび1μM IMQの両方でCD40の発現を増加させたのに対し、IMQ単独では10μMでのみCD40発現を増加させた。図9Bにおいて、パネル下部に示した物質とともに一晩培養した5×104のBMDCからの上清について、IL-12サイトカイン分泌を分析した。IL-12、すなわちBMDCの活性化を示すサイトカインの量を、製造業者の指示に従ってELISA(BD Bioscience、キットカタログ番号555165)によって検出した。またPEA-IMQは、応答を刺激するのにIMQ単独よりも10倍超強力であった。リポ多糖(LPS)を陽性対照として、ジメチルスルホキシド(DMSO)をビヒクル陰性対照として使用した。 As shown in FIG. 9, the polymer can provide intracellular delivery of one TLR-7 agonist, imiquimod (IMQ). In this example, intracellular delivery results in stimulation that is 10-100 times better than free IMQ. In FIG. 9A, recording of FACS analysis intensity distribution of CD11c-positive bone marrow derived dendritic cells (BMDC) from Balb / c mice, incubated with the indicated substances and stained for elevated CD40, the activation marker. Indicates. The calculated geometric mean of the intensity distribution was entered in the column labeled “Geometric mean” for each condition. PEA-IMQ increased CD40 expression at both 10 μM and 1 μM IMQ, whereas IMQ alone increased CD40 expression only at 10 μM. In FIG. 9B, IL-12 cytokine secretion was analyzed on supernatants from 5 × 10 4 BMDCs cultured overnight with the materials shown at the bottom of the panel. The amount of IL-12, a cytokine showing activation of BMDC, was detected by ELISA (BD Bioscience, kit catalog number 555165) according to the manufacturer's instructions. PEA-IMQ was also 10 times more potent than IMQ alone in stimulating the response. Lipopolysaccharide (LPS) was used as a positive control and dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as a vehicle negative control.
すべての出版物、特許、および特許文書は、個々に参照により組み入れられるがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。本発明を様々な特定の好ましい態様および技術に関して記載してきた。しかし、本発明の精神および範囲内のままで、多くの変更および改変を行いうることが理解されるべきである。 All publications, patents, and patent documents are hereby incorporated by reference as though individually incorporated by reference. The invention has been described with reference to various specific and preferred embodiments and techniques. However, it should be understood that many variations and modifications may be made while remaining within the spirit and scope of the invention.
本発明を前述の実施例に関して記載してきたが、改変および変更も本発明の精神および範囲内に含まれることが理解されると思われる。したがって、本出願における本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。 Although the invention has been described with reference to the foregoing examples, it will be understood that modifications and variations are encompassed within the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention in this application is limited only by the following claims.
Claims (41)
少なくとも一つのMHCクラスIまたはクラスIIペプチド抗原を含む、タンパク質全体の抗原またはペプチド抗原、および
以下のポリマーの少なくとも一つまたは混合物を含む、生分解性ポリマー担体
を含む、ワクチン送達組成物:
構造式(I)に記載の化学構造を有するポリ(エステルアミド)(PEA):
式中、nは約5〜約150の範囲であり;R1 は、α,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立して選択され;個々のn個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;かつR4は(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせ、(C2-C20)アルキレン、ならびに(C2-C20)アルケニレンからなる群より独立して選択される;
または、構造式(III)に記載の化学式を有するPEA:
式中、nは約5〜約150の範囲であり;mは約0.1〜0.9の範囲であり;pは約0.9〜0.1の範囲であり;式中、R1は、α,ω-ビス(4-カルボキシフェノキシ)-(C1-C8)アルカン、3,3'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸もしくは4,4'-(アルカンジオイルジオキシ)二ケイ皮酸、(C2-C20)アルキレン、または(C2-C20)アルケニレンの残基から独立して選択され;各R2は独立して、水素、(C1-C12)アルキルもしくは(C6-C10)アリール、または保護基であり;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;かつR4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ、(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルまたは(C2-C20)アルケニルである;
または、構造式(IV)に記載の化学式を有するポリ(エステルウレタン)(PEUR):
式中、nは約5〜約150の範囲であり;式中、R3は独立して、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され;かつR6は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせより独立して選択される;
または、一般構造式(V)に記載の化学構造を有するPEUR:
式中、nは約5〜約150の範囲であり;mは約0.1〜約0.9の範囲であり;pは約0.9〜約0.1の範囲であり;R2は、水素、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、もしくは保護基より独立して選択され;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)からなる群より独立して選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、および構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択され;かつR6は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレンもしくはアルキルオキシ、一般式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基の有効量、およびそれらの組み合わせより独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルもしくは(C2-C20)アルケニルである;
または、一般構造式(VI)に記載の化学式を有するポリ(エステルウレア)(PEU) :
式中、nは約10〜約150であり;個々のn個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)より独立して選択され;R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、または構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片より独立して選択される;
または、構造式(VII)に記載の化学式を有するPEU:
式中、mは約0.1〜約1.0であり;pは約0.9〜約0.1であり;nは約10〜約150であり;各R2は独立して、水素、(C1-C12)アルキル、もしくは(C6-C10)アリールであり;個々のm個のモノマー中のR3は、水素、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C6-C10)アリール(C1-C20)アルキル、および-(CH2)2S(CH3)より独立して選択され;各R4は、(C2-C20)アルキレン、(C2-C20)アルケニレン、(C2-C8)アルキルオキシ(C2-C20)アルキレン、飽和型もしくは不飽和型の治療的ジオールの残基、構造式(II)の1,4:3,6-ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびそれらの組み合わせより独立して選択され;かつR13は独立して、(C1-C20)アルキルもしくは(C2-C20)アルケニルである。 An immune stimulating adjuvant,
Vaccine delivery composition comprising a biodegradable polymer carrier comprising a whole protein antigen or peptide antigen comprising at least one MHC class I or class II peptide antigen and at least one or a mixture of the following polymers:
Poly (ester amide) (PEA) having the chemical structure described in Structural Formula (I):
Where n is in the range of about 5 to about 150; R 1 is α, ω-bis (4-carboxyphenoxy)-(C 1 -C 8 ) alkane, 3,3 ′-(alkanedioyldi Independently selected from residues of (oxy) dicinnamic acid or 4,4 '-(alkanedioyldioxy) dicinnamic acid, (C 2 -C 20 ) alkylene, or (C 2 -C 20 ) alkenylene R 3 in each n monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) Independently selected from the group consisting of aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20) alkenylene, a (C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, saturated or residues of unsaturated therapeutic diol, structural formula (II) 1,4: 3,6 - dianhydrohexitols bicyclic fragments, and combinations thereof, (C 2 -C 20) if alkylene, It is selected (C 2 -C 20) independently from the group consisting of alkenylene to;
Alternatively, PEA having the chemical formula described in Structural Formula (III):
Where n is in the range of about 5 to about 150; m is in the range of about 0.1 to 0.9; p is in the range of about 0.9 to 0.1; where R 1 is α, ω-bis ( 4- carboxyphenoxy) - (C 1 -C 8) alkane, 3,3 '- (alkanedioyldioxy oil dioxy) Double cinnamic acid or 4,4' - (alkanedioyldioxy oil dioxy) Double cinnamic acid, ( C 2 -C 20 ) alkylene or (C 2 -C 20 ) alkenylene residues independently selected; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) alkyl or (C 6- C 10 ) aryl, or a protecting group; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) Independently selected from the group consisting of alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); and R 4 is (C 2 − C 20) alkylene, (C 2 -C 20) alkenylene, (C 2 -C 8) alkyloxy, (C 2 -C 20) alkylene, also saturated Independently of the group consisting of residues of unsaturated therapeutic diols, or bicyclic fragments of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of structural formula (II), and combinations thereof And R 13 is independently (C 1 -C 20 ) alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl;
Alternatively, poly (ester urethane) having the chemical formula described in Structural Formula (IV) (PEUR):
In which n ranges from about 5 to about 150; wherein R 3 is independently hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 10) aryl (C 1 -C 20) alkyl, and - (CH 2) is selected from the group consisting of 2 S (CH 3); R 4 is, (C 2 -C 20 ) Alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, the residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of structural formula (II) Selected from the group consisting of cyclic fragments, and combinations thereof; and R 6 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, 1,4 of general formula (II) : Independently selected from bicyclic fragments of 3,6-dianhydrohexitol, and combinations thereof;
Alternatively, PEUR having the chemical structure described in the general structural formula (V):
Wherein, n in the range of from about 5 to about 0.99; m is in the range of from about 0.1 to about 0.9; p is in the range of from about 0.9 to about 0.1; R 2 is hydrogen, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, or independently selected from protecting groups; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 10) aryl (C 1 -C 20) alkyl, and - (selection CH 2) 2 S (CH 3 ) consisting essentially independently from the group R 4 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene or alkyloxy, a residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, and 1, of structural formula (II) Selected from the group consisting of bicyclic fragments of 4: 3,6-dianhydrohexitol, and combinations thereof; and R 6 is (C 2 -C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene Or alkyloxy, 1,4: 3,6-dianch of general formula (II) Bicyclic fragment of Rohekishitoru, an effective amount of residues of saturated or unsaturated therapeutic diol, and are independently selected from combinations thereof; and R 13 is independently, (C 1 -C 20) Alkyl or (C 2 -C 20 ) alkenyl;
Alternatively, poly (ester urea) (PEU) having the chemical formula described in general structural formula (VI):
Where n is from about 10 to about 150; R 3 in each n monomer is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) independently selected from alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); R 4 is (C 2 -C 20 ) Alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8 ) alkyloxy (C 2 -C 20 ) alkylene, the residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, or structural formula (II) Independently selected from a bicyclic fragment of 1,4: 3,6-dianhydrohexitol of
Alternatively, PEU having the chemical formula described in Structural Formula (VII):
Wherein m is from about 0.1 to about 1.0; p is from about 0.9 to about 0.1; n is from about 10 to about 150; each R 2 is independently hydrogen, (C 1 -C 12 ) Alkyl or (C 6 -C 10 ) aryl; R 3 in each m monomers is hydrogen, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2- C 6 ) alkynyl, (C 6 -C 10 ) aryl (C 1 -C 20 ) alkyl, and — (CH 2 ) 2 S (CH 3 ); each R 4 is selected from (C 2- C 20 ) alkylene, (C 2 -C 20 ) alkenylene, (C 2 -C 8 ) alkyloxy (C 2 -C 20 ) alkylene, the residue of a saturated or unsaturated therapeutic diol, structural formula (II ) of 1,4: 3,6-dianhydrohexitols bicyclic fragments, and are independently selected from combinations thereof; and R 13 is independently, (C 1 -C 20) alkyl or ( C 2 -C 20 ) alkenyl.
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