JP2009513643A - 少なくとも1つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物、その製造方法および使用方法 - Google Patents
少なくとも1つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物、その製造方法および使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2002年3月26日出願の米国特許出願第10/106,793号の一部継続出願(CIP)である、2004年11月9日出願の米国特許出願第10/985,798号に基づく利益を主張するものである。
本願では、種々の刊行物が括弧内の番号として引用される。これらの刊行物の完全な出典は本明細書の末尾、特許請求の範囲の前に示されている。これらの刊行物の開示は、本発明の属する技術の現状をより詳しく説明するために、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
本発明は、ショック、敗血症、出血および外科手術などの多様な血液減少症状の治療のための、ポリエチレンオキシド(ポリエチレングリコール(PEG)など)で修飾されたアルブミンであるPEG−Albなどのアルブミンベースコロイド組成物の使用に関する。好ましい実施態様では、該組成物は少なくとも1つの保護されたチオール領域を有する。もう1つの実施態様では、該アルブミンは指示試薬で修飾されている。
全身性炎症性応答症候群(systemic inflammtory response syndrome, SIRS)の様々な兆候に共通している血液減少症の回復を目的とし、可能性のある療法の開発に多大な資源が費やされている。米国では敗血症だけでも年間750,000症例にのぼり、200,000人の死者を出している(1)。この高い死亡率は、毛細血管漏出(capillary leak, CL)に続発する臓器の浮腫に関連する多臓器不全(multi organ dysfunction, MODS)によるものである。顕著なCLを有する患者は一般に、昇圧薬および他の支援物質に加え、オスモライト(例えば、アルブミン、デンプンまたはデキストラン)を含む蘇生液を投与することにより管理される。
材料および方法: PEG−Albの調製。2gのヒトアルブミン(Sigma, St. Louis, MO)を45mlの50MMリン酸カリウム(一塩基性と二塩基性の混合物)pH7.4に溶かした。500mgのメトキシポリエチレングリコール(Sigma, St. Louis, MO)を塩化シアヌルで活性化し、4mlの水に溶かした。1.4mlのメトキシポリエチレングリコール溶液を45mlのヒトアルブミン溶液に加え、この混合物を室温で2時間攪拌した。この混合物を透析チューブ(分子量カットオフ−12500)に移し、3000mlのリン酸緩衝生理食塩水に対し、4℃で72時間透析した。ポリエチレングリコール修飾アルブミン(PEGA)を回収した後、使用するまで−20℃で冷凍した。
動物を一晩絶食させた。ただし、水は自由に与えた。ナトリウムペントバルビタール(50mg/kg)を用いて動物を腹腔内麻酔し、試験過程で必要に応じて追加量を与えた。動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を頚動脈に留置し、継続的に血圧をモニタリングするための変換器/増幅器(TestPoint, Capital Equipment Corporation, Billerica, Mass.)にホックで留めた。G24カテーテルを用い、反対側の内頚静脈に静脈内ラインを留置した。基準ヘマトクリットとして頸動脈ラインから血液サンプルを採取し、アルブミンおよび置換輸液(0.9%生理食塩水1ml)を静脈内ラインから注入した。第1群には生理食塩水5mlを注入した。第2群にはアルブミン0.6g/kg体重(BW)を与え、第3群にはPEGA0.6g/kg BWを与えた。30分後、第3群には内毒素(LPS)(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)を、用量を変えて与えた。ラットは受けた蘇生輸液に基づいて3群に分けた:第1群(n=9)には生理食塩水中非修飾アルブミンを0.6g/kgで施し、アルブミンの注射濃度は40mg/mlであり、注射容量は1.5ml/100g体重(BW)であった。第2群(n=12)には、アルブミンの代わりに、第1群と同じ用量、タンパク質濃度および注射容量でPEG−Albを施した。第3群(n=6)には1.5ml/100g BWの生理食塩水を施した。内毒素注入した後3時間、血圧のモニタリングを行い、その後ラットを安楽死させた。
アルブミンおよびPEGA(PEG−Alb)の調製:
50mM KPi(pH7.5)に50〜60mg/mlで溶解させたヒトアルブミン(タイプV, Sigma Chemical Co.)に、22℃にて10分間隔で4回、穏やかに攪拌しながらメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌル(平均Mr5000)を加えた(添加する度にアルブミン1mgにつき0.2mg)。試薬を最後に添加した後40分、反応物を攪拌した。修飾は速やかで、室温で15分までに完了し、修飾程度は主として試薬の添加量に依存した。動物に注入する前に、アルブミンおよびPEG−Albはいずれも、高分子量カットオフ透析チューブ(50kDa分子量カットオフ)を用い、リン酸緩衝生理食塩水に対して48時間、バッファーを3回交換して透析した。
ヒトアルブミン(50mg/ml)を50mM KPi(pH7.5)、150mM NaClおよび0.5mMジチオトレイトール中で1時間インキュベートした。ジチオトレイトール処理アルブミンを4mM 5−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは1.5mMテトラメチルローダミン−5−ヨードアセトアミドとともに2時間インキュベートした。フルオレセイン修飾アルブミンを、リン酸緩衝生理食塩水を4回交換して48時間透析し、遊離フルオレセインを除去した。ローダミン標識アルブミンをSephadex 50によるクロマトグラフィーに付した後、リン酸緩衝生理食塩水に対して徹底的に透析した。
試験プロトコールはオハイオ医学大学のthe Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)およびthe Academic Chemical Hazardous Committee (ACHC)に認可されたものであった。体重400〜480gの成体雄Sprague−Dawleyラット(Charles River Laboratories, Portage, MI)を用いた。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALACI)認可施設で飼育した。標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前に動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。
注入用静脈ラインを左頚静脈に挿入した(G24 Protectiv*Plus, Johnson and Johnson/ Ethicon, Arlington, Texas)。
肺および腎臓組織をホルマリン溶液から取り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。コード化したこれらの標本を盲検病理学者が光学顕微鏡で調べ、次の5ポイントシステムを用いて炎症の組織学的特徴にスコアを付けた:0=有意な組織病理学的変化無し;1=最少の間質の炎症性浸潤;2=軽度の硝子質化を伴った軽度の間質の炎症性浸潤;3=中度の硝子質化を伴った中度の間質の炎症性浸潤;4=重度の硝子質化を伴った重度の間質の炎症性浸潤。一貫性を確保するために、同じ病理学者が2回の別の機会にサンプルを調べ、平均したスコアを用いた。
SDSゲル電気泳動。非修飾アルブミンおよびPEGAのサンプルを、SDS(1%,W/V)およびβメルカプトエタノール(5%,V/V)を加え、沸騰水浴中で1分間加熱することにより、電気泳動用に調製した。サンプルを、7.5%または10%アクリルアミドゲルで電気泳動に付した(30)。
アルブミンおよびPEGAをベッド容量24mlのSuperose 6カラム(Pharmacia)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。サンプルまたは標品混合物(0.5ml)をカラムに適用し、10mMリン酸カリウム(pH7.5)および150mM NaClを用い、0.5ml/分で溶出した。280nmにおける吸光度を継続的にモニタリングした。
表面増強レーザー脱離法/イオン化−タイム・オブ・フライト(SELDI−TOF)質量分析を用い、PEG−アルブミンおよびアルブミンサンプルを同定した。サンプル1ml(1〜5mg/ml)を付着させ、脂肪コーティングしたアルミニウムProteinChipアレイ(H4 ProteinChip, Ciphergen Biosystems, Palo Alto, CA)の2mmスポット上で直接風乾させた。1/2μlのエネルギー吸収マトリックス(EAM,50%アセトニトリルおよび0.5%トリフルオロ酢酸水溶液中、3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシ桂皮酸の飽和溶液)を2回サンプルに適用し、風乾させた。
PEGA−Albおよびアルブミンの双方をCOP測定のため同様に調製した。要するに、サンプルを10mMリン酸カリウム(pH7.5)、150mM NaClに50mg/mlとなるように溶かし、30℃にて1時間ジチオトレイトール(0.5mMジチオトレイトール)で処理した後、30℃1時間ヨードアセトアミド(5mMヨードアセトアミド)とともにインキュベートした。次ぎに、このアセトアミド化アルブミン(50mg/mlを5ml)を、10mMリン酸カリウム(pH7.5)および150mM NaClで平衡化し、アルブミン二量体および浸透圧の測定を妨げる他の低分子量および高分子量夾雑物を減らしたSephacryl S300(2.8cm×40cm)でクロマトグラフィーに付した。最後に、アルブミンおよびPEGAの双方を、0.9%NaClを数回交換して透析した。
これら3つの処理群の、LPS前後のヘマトクリット間の差をANOVAで比較した。ここでは、ANOVA二元配置反復測定を用い、LPS前およびLPS後の種々の時点での平均動脈圧(MAP)を比較した。各群間の個々の差をTukey多重比較検定を用いて評価した。p<0.05を用い、統計学的有意性を示した。
LPS後の血管容積の収縮/拡大−誘発された敗血症をMAPおよびHctの変化から推定した。これらの測定は双方とも、PEG−Alb、アルブミンまたは生理食塩水で前処理したラットでは有意に変動した。最初に、LPSボーラス注入後15〜25分内に3群総てがMAPにおいて同様の〜40%低下を示した(生理食塩水:135±11から81±30mmHgへ低下;アルブミン:134±14から85±20mmHgへ低下;PEG−Alb:125±12から79±19mmHgへ低下)(図2)。その後のMAPの回復は、生理食塩水(99±29mmHg)およびアルブミン(108±14mmHg)処理に比べ、PEG−Alb処理ラットでは有意に良好であった[MAP[LPS後3時間]=120±10mmHg;p=0.023)。MAPの回復は生理食塩水処理ラットに対してアルブミンではやや大きかったが、この差は有意ではなかった。
PEG−Alb処理ラットおよび対照(非敗血症)ラットから採取した肺組織切片の顕微鏡検査では、有意な組織病理学的変化が無かった(図3A〜D)。その代わりに、ほとんどの生理食塩水処理ラットおよびアルブミン処理ラットでは、硝子質化および間質のリンパ性浸潤を含む、重度の急性肺傷害(ALI)に一致する実質的な炎症性の組織病理学的変化が明らかであった(図3)。全体として、平均ALIスコア(0=傷害無し;1=最少;2=軽度;3=中度の;4=重度)は、生理食塩水群(2.0±1.0;範囲0〜3)およびアルブミン群(2.4±0.9;範囲1〜4)の双方に比べ、PEG−Alb処理ラット(0.76±0.47;範囲0〜1)では有意に低かった(一元配置ANOVA;P=0.002)。4つの群の総てで、腎臓の顕微鏡切片は有意な組織病理学的変化を示さなかった。
分子サイズ−アルブミンおよびPEG−AlbのSDSゲル電気泳動の結果を図5A(右)に対比させる。予想としては、アルブミンはかなり均質のタンパク質として、その既知の分子量で泳動する。これに対し、PEG−Albはより大きな見掛けの分子量で泳動し、PEG−Alb材料はゲル内に容易に入らない。特筆すべきは、理想的でないタンパク質の場合、電気泳動移動度は、それらの分子量というより主としてそれらの拡大特性を反映したものである。修飾タンパク質の実質的不均質性は、複数のリシル残基でのPEG修飾によるものである。PEG−Albをゲル濾過でも調べた。SDSゲル電気泳動でのその挙動と一致して、この修飾タンパク質は実質的に不均質であり、500,000〜数百万の範囲の見掛けのMrとしてカラムから溶出する(図5B(左))。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムでのその挙動も、実際の分子量ではなく、結合されたPEGの拡大特性の現れである。図7のアルブミンおよびPEG−Alb双方の吸光度−Ve/V0データを用い、本発明者らは対応する平均Ve/V0がそれぞれ2.112および1.588であると算出した。これらのサンプルにおけるアルブミンおよびPEG−Albの有効分子量(またはサイズ)はそれぞれ約77,670Daおよび994,300Daであり、あるいは相対的サイズ比は約12.8であると判定された。アルブミン推定値は既知のアルブミンサイズ(67,000Da)よりも大きく、その単量体と二量体の間であり、これは、主要な単量体ピークと小さな二量体ピークという2つのアルブミン吸光度ピークの存在と一致している。
10mMリン酸カリウム(pH7.5)、150mM NaClおよび0.5mMジチオトレイトール中、ヒトアルブミン(Sigma Chemical Co., タイプV)50mg/mlを30℃で1時間インキュベートした。マレイミド−メトキシポリエチレングリコール20,000Mr(Shearwater Inc., カタログ番号2D2MOP01)またはマレイミド−メトキシポリエチレングリコール40,000Mr(Shearwater Inc., カタログ番号2D2MOP01)を1mMまで加え、反応物を30℃で1時間インキュベートした。PEG修飾アルブミンをQ−Sepharose(Pharmacia)でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
別の態様では、本発明は、アルブミンより16倍大きな(42a)、本明細書において本発明者らが開発したポリエチレングリコール修飾アルブミン(PEG−Alb)に関する。代表的なPEG−Albを図11に示す。PEG化は親水性の増大の他、血漿中のタンパク質の半減期を延長し(43a)、タンパク質の免疫原性を低下させる(44a〜46a)。タンパク質にPEGを結合させると、免疫系(細胞性または体液性)のタンパク質を非自己として認識する能力が低下する。PEG化により誘導されるこのステルス効果は、ポリマーの結合による排除体積効果およびPEGとアルブミンの間の適合性に二次的なものであり、これによりPEG−Albは天然アルブミンに似たものとなる(47a)。
PEG−Alb1は3種類の異なるモデルで調べ、2つは敗血性ショックを模倣したものであり(CLPおよびLPS)、1つは出血性ショック(HS)を模倣するものである。これらの研究は、PEG−AlbCys−34がPEG−Albi、デンプンおよびHTSよりも有効な蘇生薬であることを示す。
CLPモデル−メトキシポリエチレングリコールを用いて複数部位で修飾したアルブミンを評価した。この材料はMAPの維持においてアルブミンまたは生理食塩水よりも有効である。PEG−Alb1はまた、血清コロイド浸透圧の維持にもより有効であった。mPEG5000とアルブミンの混合物は、血圧の維持おいてアルブミン単独または生理食塩水よりも有効とは言えず、このことは、PEG−Albの有効性には、PEGがタンパク質と共有結合されていることが必要である。図15に示されるように、遊離のPEGが容易に排泄されることを示す研究(50a)と一致して、遊離PEG5000の血液レベルは静脈投与後、尿に受け渡されるにつれ急速に低下する。16AおよびBで蛍光顕微鏡観察により示されるように、それぞれフルオレセインおよびテキサスレッドで標識したPEG−Alb1および非修飾アルブミンをCLPラットに投与した場合、フルオレセイン標識は肺血管系に保持されたが、テキサスレッドは肺の管外空間で検出された。対照動物では、フルオレセイン標識PEG−Alb1およびテキサスレッド標識アルブミンは双方とも、血管内空間にのみ見られた。これらの結果は、そのサイズが大きいことにより毛細血管漏出の際に血管にPEG−Alb1が保持されることと一致する。
出血性ショックの試験モデル
cys 34がチオールとして保持されているアルブミン(PEG−AlbCys−34)を含むPEG−Albを、十分特徴付けられているラットHSモデルで他の蘇生薬と比較した(51a〜53a)。肺傷害、組織潅流(過剰塩基、乳酸)、動脈血液ガス(ABG)、平均動脈圧(MAP)、心拍数(HR)および腎機能指数(クレアチニン)に関するものを含む、ショックの種々の側面の重篤度を反映するいくつかの生理学的パラメーターを調べた。この情報を用い、PEG−Albと、非修飾アルブミン、デンプンおよび高張生理食塩水などの確立された薬剤を比較した。また、PEG−Albの性能を最適化するため、PEG−Albを種々の程度のPEG修飾、種々のPEGサイズ、および種々のタンパク質−PEG結合と比較した。この試験モデルは、実際の生活に見られる状況を模倣する。フェーズ1(入院前)は初期外傷および野外で蘇生を施すことができる場所に個体を運ぶのに必要な時間に相当する。これは実際には、救急車で到着するEMTにより施される蘇生または戦地の医者により提供された蘇生に相当する。フェーズII(入院)は、個体が病院に搬送された後に提供される処置に相当し、ここでは輸血を行うことができる。フェーズIII(観察フェーズ)は、処置後の病院またはリハビリセンターでの時間に相当する。次のプロトコールを用いる。
特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、PEG−Albは毛細血管漏出の際に血管内に保持され、従って血液のコロイド浸透圧を維持すると考えている。本発明者らは、アルブミンよりも16倍大きいPEG−Alb1はCLPおよびLPSモデルに伴う毛細血管漏出状態にあって、管外遊出が少ないことを示した(42a)。本発明者らは、出血性ショックモデルの場合にもそうであると決定付けた。本発明者らが開発した方法を用い、標識アルブミンおよびPEG−Alb(テキサスレッド、TR)およびPEG−Alb(フルオレセイン、F)をラットに注入し、注入後の異なる時点で分析のために尾の静脈から少量の血液を採取する。標識アルブミンの調製については、本明細書の、PEG−Albの生物物理学的同定を取り扱う節に記載されている。アルブミンが管外空間に失われ、PEG−Albが保持されるとすれば、アルブミンの喪失とPEG−Albの優先的保持に一致して、フルオレセインとテキサスレッドの比(F/TR)が大きくなる。テキサスレッドとフルオレセインの励起スペクトルおよび発光スペクトルは有意に異なり、この2種類の色素の混合物は血清サンプル中で定量的に調べることができる。また、アルブミンとPEG−Albの分布も、蛍光顕微鏡により肺の凍結組織切片で定量的に調べ、敗血性ショックのモデルで見られるように、PEG−Albが血管内に保持されるかどうかを判定することができる(図16AおよびB)。
敗血性ショックモデルで生理食塩水およびアルブミンと比べたPEG−Alb1の特徴は、その血圧を維持し、血液濃縮を防ぐ能力である。出血性ショックモデルにおける重要な問題は、標準的な蘇生薬に比べてPEG−AlbCys−34がいかによく働くかということである。ラットをナトリウムペントバルビタールで麻酔した後、必要に応じて鎮静を維持する。右頚動脈に動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を挿入し、血圧変換器に接続し、増幅させ、継続的にモニタリングする(サンプリング速度100Hz;MP100, BioPac Systems Inc, Santa Barbara, CA)し、コンピューターに採集する。液体注入のため、左頚静脈に静脈ライン(G24 Protective*Plus, Johnson and Johnson/Ethicon, Arlington, Texas)を挿入する。種々の液体蘇生薬を投与した動物のMAPおよびHRをモニタリングする。入院前フェーズでは、総てのラットに同レベルの虚血を最低60分与え、その後、各処理群に無作為化する。クリスタロイド群にはコロイド群の容量の3倍、HTS群の容量の8倍を与える。CLは出血性ショック後20分といった早いうちに起こり得るということに基づけば、PEG−Albは、初期段階(入院前)で始めるとMAPに優れた能力を示す(58a)。入院フェーズでは、PEG−AlbCys−34群の能力は、次の理由から、他の処理群より優れている。1)処理後(再潅流)、毛細血管漏出はいっそう重篤になり、ここでPEG−Albは血管空間により良く保持される;2)クリスタロイドおよび合成コロイドとは対照的に、PEG−AlbCys−34は酸化産物を減らすことで、内因的血圧に対する血管の感受性を高める(10a)。
出血性ショック中の生体器官の潅流不足が臓器不全の主因である。PEG−Albと他の蘇生薬を比較するため、薬剤血流低下の指標となるいくつかの生理学的パラメーターを調べる。
Beua=BE−(Befw+Becl+Bealb)。
BEua−測定されていない陰イオンに関して補正したBE;
BEfw−自由水作用により生じる過剰塩基=0.3*Na−140;
BEcl−塩化物の変化により生じる過剰塩基=102−Clcor(ここで、Clcor=CL*140/N);
BEalb−アルブミンの変化により生じる過剰塩基=3.4*(4.5−アルブミン)。
in vivo研究は、「酸化ストレスが強く、天然アルブミンが漏出する虚血/再潅流傷害の際にPEG−AlbCys−34を血管空間に維持する」と、血管空間の抗酸化能が高まり、アポトーシスが低下し、炎症が制御される。
NF−κBは出血性ショックの後に活性化され、TNF−αなどのサイトカインの過剰発現および産生に至る(68a)。虚血中(69a)または蘇生中(70a)のNF−κBの活性化は、炎症性応答の誘発および悪化した炎症性応答の持続において重要な段階である考えられる。重要なこととしては、アルブミンが投与される容量は炎症に重要な役割を果たしているのが明らかである。25%アルブミンは、肺の好中球隔離を低下させ、ショック/蘇生後の肺傷害を防いだが、5%またはR/Lではそうではなかった(40a)。これは、2種類の濃度を用いてアルブミン調製物を試験するための基礎である。
虚血−再潅流の結果、内皮の健全性が損なわれる(78a,79a)。肺動脈内皮細胞(EC)虚血症のヒト血漿に曝したところ、10分後にそれらは丸くなり、ギャップを形成し、その後、突起ができる(80a,81a)。毛細血管漏出症候群患者由来の血清に曝した後にミトコンドリアEC培養物でも同じ形態変化が見られる(12a)。ECのアポトーシスを形態学的基準、血漿ホスファチジルセリン曝露(アネキシン染色)およびDNAのフラグメンテーションにより明らかにした。内皮細胞におけるBax/Bcl2に増加を免疫組織化学により検出した。これらの作用の機構を細胞内反応性酸素種(ROS)を測定することで探索し、その結果から、酸化性の傷害がECのアポトーシス機構に役割を果たしていることが示唆された(12a)。酸化ストレスはアポトーシスの周知のインデューサーである(11a)。さらに、外傷および出血後にアポトーシスの増強が起こる(15a,78a,79a,82a)。カスパーゼ阻害剤によるアポトーシスの阻害は、I/Rにより誘発される炎症を弱めた(36a,83a,84a)。虚血−再潅流に曝された組織では、抗酸化剤がこの傷害からの損傷を最小限にした。アルブミンは血漿における主要な細胞外抗酸化剤である。アルブミンは酵素γグルタミルシステインジペプチドを通じてこの機能を発揮し、そこでアルブミンはグルタチオンの合成に重要な役割を果たす(38a)。グルタチオンは哺乳動物細胞に存在する主要な低分子量可溶性チオールであり(85a)、その枯渇はアポトーシスの誘導に役割を果たす(86,87)。アルブミンがいかにしてその抗酸化活性を発揮するかを見る別の研究では(40)、1つの遊離チオール(cys34)を修飾すると、抗酸化活性に45%の低下を伴った(88a)。アルブミンは、そのグルタチオン(GSH)増加能により酸化から保護される。逆に、GSHが低下すると、a)カスパーゼ3およびポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)のフラグメンテーションが活性化し(89a)、b)Bcl−2/Bax比が低下する。後者の比は細胞生存、特に酸化傷害に対する防御の強力な指標である(90a,91a)。結果として、アルブミンは、その抗酸化剤としての機能を通じて、アポトーシスからの保護作用に有意に寄与する。内皮に比べ、アルブミンは微小血管透過性を低下させ(33a,92a,93a)、内皮細胞のアポトーシスを防ぐのに不可欠な役割を果たした(36a,84a)。
a.TUNELアッセイ−この方法では、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、DNA鎖の破断をフルオレセインコンジュゲートヌクレオチドで標識する(94a)。アポトーシス検出キット(Boehringer, Indianapolis, IN)を用いる。組織サンプルは盲検病理学者が調べる。B.アポトーシスマーカーのウエスタンブロット解析−組織サンプルを急速冷凍し、ウエスタンブロット解析のための抽出まで−80℃で保存する。アポトーシスは、その存在または修飾がアポトーシスに伴ういくつかのタンパク質を調べることにより検出される。ウエスタンブロット解析を用い、アポトーシス誘導タンパク質のRhe発現および抗アポトーシスタンパク質bcl−2を調べる。ポリADP−リボースポリメラーゼ(PARP)の切断産物に関する組織抽出物を分析する。PARPはカスパーゼ3および7の基質であり、認知されているアポトーシスマーカーである。全長PARP(115Kda)は、85〜90Kdaと23〜24Kdaの断片に切断され、その結果、その酵素活性が不活性化される(11,95)。
PEG−アルブミンのin vivo有効性の実施例と並行して、ショック治療におけるそのin vivo有効性と相関する特性を特定するため、修飾アルブミンに対する物理的研究を行う。
1.PEG−Albの作製およびサイズ分析
修飾の様式および程度ならびにアルブミンに結合しているmPEG(メトキシポリエチレングリコール)のサイズはその生物物理学的特性およびin vivo特性を変化させ得るので、本発明者らはPEGとアルブミンを連結する種々の方法を検討し、サイズ、安定性および浸透圧特性に関して改変されたタンパク質を同定した。本発明者らはN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(mPEG5000)、塩化シアヌル(mPEG5000)、およびチオール選択性マレイミド誘導体(mPEG20000およびmPEG40000)を検討した。
これらのoPEG−Albの分析の争点は、その修飾がアルブミンの天然構造、さらに可能性としては、リガンド結合特性および安定性を変化させるかどうかということである。本発明者らは、尿素により誘導される脱フォールディングを分析することより、PEG−Albの安定性を調べた。これは、タンパク質の熱力学的安定性を研究する標準的な方法であり、脱フォールディングの自由エネルギーが得られ、そのタンパク質が脱フォールディング中間体と考えられるかどうかを明らかにすることができる(103a−105a)。このタンパク質を変性剤の濃度を増しながらインキュベートし、天然状態および脱フォールディング状態に特徴的な分光光度シグナルを調べる。本発明者らは、トリプトファン(trp214)の蛍光発光波長(強度平均発光波長<λ>)におけるシフトをシグナルとして用いたが、これはタンパク質を脱フォールディングする際に顕著な赤色シフトが存在するためである(106a)。非修飾アルブミン(パネルA)、mPEG20000修飾アルブミン(パネルB)およびmPEG40000修飾アルブミン(パネルC)を含むこのような研究の結果の例を図25に示す。他者らの研究では、非修飾ヒトアルブミンは少なくとも1つの中間体種を伴う複雑な脱フォールディング経路を示すことが示されており(106a,107a)、本発明者らの結果が確認される。mPEG20000およびmPEG40000修飾アルブミンの脱フォールディングは、非修飾アルブミンとの類似性が著しく(図15パネルA)、このPEG修飾アルブミンは非修飾アルブミンによりもやや安定性を欠いているだけである。mPEG20000修飾アルブミンは、中程度の尿素濃度で若干の青色シフトを示し、これは部分的に脱フォールディングした中間体種におけるトリプトファンの状態が変化している可能性があることを示唆する。mPEG20000修飾アルブミンとmPEG40000修飾アルブミンは双方とも、この脱フォールディングの中間点は、非修飾アルブミンの場合と同じ濃度に存在する(7M)。本発明者らは、種々のサイズ分画多重修飾mPEG5000アルブミンに対して同様の脱フォールディング研究を行ったところ、それらの結果は単一修飾のアルブミンで得られたものと同様である。全体として、PEG修飾はそれほど安定性を欠いていない。
修飾アルブミンの浸透圧特性はin vivo機能に不可欠であることから、本発明者らは、図28に示されるように、mPEG20000、mPEG40000、多重修飾mPEG5000アルブミンおよび非修飾アルブミンの濃度に対するコロイド浸透圧の依存性(114a,115a)を調べた。1モル当たりで、mPEG20000−Alb、mPEG40000−AlbおよびmPEG5000−Albは非修飾アルブミンよりも高濃度でより高い浸透圧を示したが、低濃度では浸透圧はアルブミンの場合と同等であり、アルブミンの血清濃度はおよそ0.6mMである。高濃度のmPEG−Albで見られる理想的でない挙動は、これらの種の大きな排除容量と水和程度を反映している。本発明者らはまたサイズ分画mPEG5000修飾アルブミンも調べ、修飾の顕著な画分は修飾の低い画分よりも大きな浸透圧を示す。これらの研究は、血管内への保持を助け、組織の間質性空間への液体の管外遊出を軽減するコロイド浸透圧勾配を維持する特性である大きな排除容量を有する分子と一致する。
本発明者らは、cys34を介して結合したフルオレセインまたはテキサスレッドを有する非修飾アルブミンおよびmPEG−Albを作製した。これらの蛍光アルブミン誘導体を用い、毛細血管漏出を伴う動物の循環中にいかに効率的にアルブミンが保持されるか調べる。なお、これらのアルブミンの傾向は、体液中の蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察によりモニタリングすることができる。これら2つの蛍光団は十分離れた励起・発光スペクトルを有するので、2種類の(例えば、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンとフルオレセインを有するPEG−アルブミン)アルブミンの混合物を含むサンプルを同じ動物で調べることができる。cys34を介してPEGを結合させる場合、本発明者らは、リシルε−アミノ基を介してアミン反応型のフルオレセインまたはテキサスレッドを結合させる。2種類の異なる蛍光団を有するアルブミンをもってすれば、フルオレセインを有するPEGアルブミンが、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができる。これらの蛍光アルブミンは、ショックモデルにおいて非修飾アルブミンとPEG−アルブミンの保持をモニタリングするため、またはin vivo半減期をモニタリングするために分析的に限って使用される。本発明者らは、血清希釈液において、他の蛍光物質のバックグラウンドを十分超えるフルオレセイン−アルブミンの蛍光を容易に検出した。必要に応じ、血清サンプル中の他の発色団から生じる内部フィルター効果(112a,113a)に関して強度測定値を補正するが、蛍光アルブミンを用いた本発明者らの研究では、必要とされる血清の大希釈(1:1000〜1:2000)による支障は無視できるものであることを示す。
1.PEG−アルブミンの作製
本発明者らは、PEGとアルブミンを結合させるためのいくつかの試薬およびmPEG5000−Albをin vivoで調べた。アルブミンと結合したPEGのサイズ、その位置および共有結合の性質は安定性、生体半減期およびリガンド結合が有意に異なる生成物を生じるので、種々の結合様式およびmPEGの種類(46a,116a〜120a)を検討する。複数のリシル残基を修飾する傾向があるアミン選択性試薬では、有効性のサイズ依存性を調べるためにより規定されたサイズ分布を有する材料を作製するための特定の方法を用いる。サイズ分布の制御は、1つには、本発明者らがマレイミドPEGで行ったように、最初の反応の修飾程度を制限すること、生成物をイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーにより精製すること、および特定の残基の選択的修飾により達成される。
種々のサイズのPEGおよび分枝構造を有するPEGで修飾されたアルブミンを調べる。使用可能なサイズとしては、3,400Mr、5,000Mr、20,000Mrおよび40,000Mrがある。タンパク質との結合に関して種々の化学特性を有する分枝型(図29の3)およびフォーク型(図29の5)のPEGが存在する(46a,117a)。PEGが大きいほど、同じ有効サイズを達成するのに少ない部位の修飾ですむ。サイズ分布が大きければ、組み込まれるPEGは1つだけなので、cys34を介した結合に特に重要である。試薬サイズに関して考慮することは、小さいPEG−ペプチド(例えば、PEG≦1200)(119)の方が腎臓から容易に排泄され、多重修飾アルブミンの分析が適正となるということである。PEG鎖長を長くすると、循環中のその物質の半減期が長くなる(117a,126a)。
アルブミンの構造および安定性はその生理学的機能に重要である。分光光度技術を用いてコンフォメーションおよび二次構造を調べ、アルブミンのPEG修飾がそのタンパク質の構造および安定性を変化させる程度を判定する。非修飾アルブミンおよびPEG修飾アルブミンについて、近紫外線および遠紫外線における円二色性(CD)スペクトルを得る。近紫外線スペクトル(250〜320nm)の分析により、チロシル残基およびトリプトファニル残基の微小環境を混乱させた程度に関する情報が得られる(129a,130a)。遠紫外線CDスペクトル(180〜250nm)からは、二次構造が混乱された程度に関する情報が得られる(129a,130a)。ヒト血清アルブミンはα−ヘリックスが優勢であり(67%)(100a〜102a)、両スペクトルとも、このタイプの二次構造を反映している。トリプトファニル残基の状態は内在のトリプトファン蛍光のヨウ化物およびアクリルアミド消光により調べ(112a,113a)、このような実験の例を結果の節に示す。トリプトファン蛍光およびその消光剤感受性はタンパク質コンフォメーションの高感度プローブである。本発明者らは非修飾アルブミンとPEG修飾アルブミンをヨウ化物消光により調べたところ、両タンパク質とも、その単一のトリプトファンはこの消光剤に比較的接近しにくく、PEG修飾がその環境を変化させないということと一致していた。さらに、これら2つの天然タンパク質のトリプトファンの発光スペクトルは本質的に同じである。これらの例により、タンパク質のコンフォメーションおよび二次構造に最小限の変化だけでPEG−アルブミンを生じる修飾条件が特定される。
1.PEG−アルブミンの半減期の決定−PEG−アルブミンの半減期はその有効性および潜在的副作用の双方の懸念点である。一般にタンパク質のPEG修飾(116a,119a)およびアルブミンは特異的に半減期を長くし、抗原性を小さくし、それらのタンパク質分解感受性を引き下げる。PEG修飾はインターフェロンαの半減期(6時間から75時間)およびC型肝炎の治療におけるその治療有効性に顕著な作用を有し(143a,144a)、ウシアルブミンでは、ウサギにおける半減期の変化はわずかである(143a)。アルブミンによる後者の結果は、PEG修飾なしであっても比較的長命なタンパク質(ヒトで20日)であるので、予期されないことではない。フルオレセインまたはテキサスレッドで修飾したPEGアルブミンおよび通常のアルブミンはそのまま投与されるが、これらの蛍光団は循環からのクリアランスをモニタリングするためのシグナルを提供する。1つは非修飾アルブミンに対するもので、もう1つはPEG修飾アルブミンに対するものである2つの発色団を用いれば、この2種類のアルブミンを同じ動物でモニタリングすることができ、これにより循環中における優先的保持の程度が評価できる。本発明者らは、これらの双方の色素−アルブミンコンジュゲートを作製した。これらの色素−アルブミンコンジュゲートを本質的にトレーサーとして動物に投与し、分析のため1〜2週間にわたって尾の静脈から少量の血液サンプル(〜100〜200μl)を採取する。もし続いてクリアランスが起これば、ヒトアルブミンに特異的な市販のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によりタンパク質を定性的に調べる。なお、このアプローチは蛍光団をタンパク質に付加することがもたらし得るいずれの作用も回避する。PEG−albは非修飾アルブミンに比べ、SDSゲル上で劇的に異なる移動を示し、モノクローナル抗体がヒトアルブミンとラットアルブミンを識別する。ヒトアルブミンに特異的な抗体を用い、クリアランスが酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて定量的にモニタリングされる。なお、抗体の使用には、PEG修飾後もなおアルブミンと結合することの確認が必要である。
最も有望なPEG−アルブミンコンジュゲートを、予測される治療用量で始め、かなり高い用量になるまでの範囲の用量で投与することにより毒性を評価する。動物を4週間までモニタリングする。単回用量と多回用量の双方を試験する。動物の屠殺前に採集するデータには、体重、食物摂取量、水摂取量、糞便の産生量および尿の産生量が含まれる。また、挙動変化の徴候に関しても動物を観察する。定期的に少量の血液を抜き取り、肝毒性に特徴的なマーカーに関して血清で酵素アッセイを行う。試験の終了時に、動物を屠殺し、組織および器官の顕微鏡的損傷証拠を調べる。肝臓、腎臓、肺、脳、心臓および骨格筋をはじめ、いくつかの組織の毒性証拠を顕微鏡で調べる。ビヒクルを与えた対照動物も同様に調べる。
色素コンジュゲートアルブミンPEG−Albの作製方法は次の通りであった。ヒトアルブミン(50mg/ml)を50mMリン酸カリウム(pH7.5)、150mM NaClおよび0.5mMジチオトレイトール中で1時間インキュベートした。このジチオトレイトール処理アルブミンを4mM 5−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは1.5mMテキサスレッドマレイミド(Molecular Probes)とともに2時間インキュベートした。これらの色素修飾アルブミンを5倍希釈し、遠心分離濃縮器(カットオフ10,000Mr、Millipore)で3回再濃縮して組み込まれなかった色素の大部分を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水を4回交換して48時間透析した。
正常な健康ラット(n=4)およびCLPラット(n=11)で測定を行った。CLPでは、ラット6匹に(PEG−ALB−FL+アルブミン−TR)を注入し、5匹に逆の発色団を注入した。オハイオ医学大学のThe Institutional Animal Care and Use Committeeおよびthe Academic Chemical Hazards Committeeが試験プロトコールを認可した。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care; International (AAALACI)認可施設で飼育した。体重400〜480gの成体雄Sprague−Dawleyラット(Charles River Laboratories, Portage, Ml)を用いた。これらのラットには標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前、動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。本発明者らは盲腸結紮穿刺(CLP)誘発敗血症ラットと擬似術モデルを用い、PEG−Albの蛍光団とアルブミンの蛍光団を注入した。ラットをナトリウムペントバルビタール(50mg/kg BW、i.p.)で麻酔した後、必要に応じてペントバルビタールを追加した。正中腹部切開から開腹を行った。回盲弁直下で、腸の連続性が維持されるように3−0絹結紮糸にて盲腸を結紮した。この盲腸を16ゲージの針で2箇所穿刺し、排便されるまで軽く押した。内臓を腹部に戻し、筋肉は一層のプロリン縫合糸、皮膚は3−0絹縫合糸で切開部を閉じた。擬似術ラットにも同じプロトコールを施し、盲腸は内臓を腹部に戻す前に穿刺を行わずに操作した。蘇生のため、体重100グラム当たり3mlの無菌0.9%塩化ナトリウム溶液を背部に皮下投与した。術後、ラットには食物は与えなかったが、水は自由に摂らせた。
ホルマリン固定した肺および腎臓組織に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。免疫蛍光研究のため、肺切片をNikon Eclipse E800蛍光顕微鏡で調べ、Image Pro Plus Version 4.0(Media Cybernetics, L.P.)を用いて対物20倍および40倍で写真を記録した。
特に断りのない限り、値は平均値±SDで表す。処理群内で、各時点で繰り返して分析したデータ(各時点での蛍光濃度)を、多重比較用の補正を用いる事後両側t検定を用い、反復測定分散分析により評価した。匹敵する時点の処理群間の差は分散分析により評価した。統計学的有意性をp<0.05およびp<0.01水準でリプレート(reprete)する。
色素−アルブミンコンジュゲートを動物に本質的にトレーサーとして投与し、少量の血液サンプル(〜100〜200マイクロリットル)を頚静脈から(最初の8時間)、その後は尾の静脈から採取した。これらのアルブミンの移動を、血中の蛍光測定および肺組織切片を調べる蛍光顕微鏡観察によりモニタリングした。本発明者らが開発した方法を用い、蛍光標識したアルブミンおよび(テキサスレッド、TR)およびPEG−Alb(フルオレセイン、F)をラットに注入し、注入後の各時点で分析のため尾の静脈から少量の血液を採取する。アルブミンが管外空間へ失われ、PEG−Albが保持されていれば、アルブミンの喪失とPEG−Albの優先的保持に一致してフルオレセイン/テキサスレッド(F/TR)比が経時的に高まる。テキサスレッドとフルオレセインの励起・発光スペクトルは、この2種類の色素の混合物が血清サンプル中で定量的に調べることができるように十分異なっている。これらの標識を切り替えれば(フルオレセインアルブミンおよびテキサスレッドPEG−Alb)、そのタンパク質のクリアランスがそれらの蛍光団の特性ではないということを確認する、厳密に補足する結果が得られる。このクリアランスは、物質の別のコンパートメントへの再分布に一致するファーストフェーズとクリアランスを反映するスローフェーズを示す。PEG−アルブミンはアルブミンに比べて〜3時間以内に急速にクリアランスされる。アルブミンとPEG−Albの分布はまた、本発明者らが敗血性ショックで観察したように、PEG−Albが血管内に保持されるかどうかを判定するための蛍光顕微鏡観察により、肺の冷凍組織切片でも質的に調べられた。
Claims (50)
- 少なくとも1つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物であって、そのアルブミンが指示試薬で修飾されている、組成物。
- 指示試薬が色素とコンジュゲートした試薬である、請求項1に記載の組成物。
- アルブミンが、色素とコンジュゲートしたアルブミンまたは色素とコンジュゲートしたPEG−アルブミンである、請求項1に記載の組成物。
- 指示試薬が色素である、請求項1に記載の組成物。
- 指示試薬が、発光波長および励起波長を有する第一の色素ならびに発光波長および励起波長を有する第二の色素であり、第二の色素の発光波長および励起波長が第一の色素の発光波長および励起波長から大きくかつ有意に離れている、請求項4に記載の組成物。
- 第一の色素がある色を有し、第二の色素が第一の色素と同じ色である、請求項5に記載の組成物。
- 第一の色素が緑色であり、第二の色素が赤色である、請求項5に記載の組成物。
- 色素が緑色である、請求項4に記載の組成物。
- 色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニングリーンである、請求項4に記載の組成物。
- 指示試薬がフルオレセインである、請求項1に記載の組成物。
- インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項10に記載の組成物。
- フルオレセインが5−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項10に記載の組成物。
- アルブミンベースコロイド組成物が、ジチオトレイトール処理したアルブミン組成物である、請求項1に記載の組成物。
- アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも1つのPEG化産物であり、アルブミンがある分子排除体積を有し、PEG化産物の分子排除体積がアルブミンの分子排除体積より16倍大きい、請求項1に記載の組成物。
- アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも1つのPEG化産物であり、アルブミンがある流体力学的半径を有し、PEG化産物の流体力学的半径がアルブミンの流体力学的半径より13倍大きい、請求項1に記載の組成物。
- PEG−AlbCys−34を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- PEG−AlbCys−34を含んでなる、請求項14に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を製造する方法であって、
アルブミンまたはPEG−アルブミンを、アルブミンタンパク質のジスルフィド構造を混乱させずに少なくとも1種のチオール選択性試薬で修飾すること、
前記チオ修飾タンパク質を指示試薬で修飾すること、および
アルブミンまたはPEG−アルブミンを精製して、非修飾タンパク質、過剰な試薬および反応副産物を除去すること
を含んでなる、方法。 - アルブミンまたはPEG−アルブミンをチオ試薬で修飾する工程が、過剰量のジチオトレイトールで処理することによって行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記方法を多重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記方法を二重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項18に記載の方法。
- アルブミンおよびPEG−アルブミンを分光光度的に異なる発色団でタグ付けする工程、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価する工程
を含む、請求項18に記載の方法。 - 多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する工程を含む、請求項22に記載の方法。
- 多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する方法であって、
既知分子量の第一のタンパク質を準備すること、
有意に異なる分子量の第二のタンパク質を準備すること、
第一および第二のタンパク質を、離れた発光波長および励起波長を有する発色団でタグ付けすること、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価すること
を含んでなる、方法。 - 指示試薬が色素である、請求項18に記載の方法。
- 前記色素が、大きくかつ有意に異なる発光波長および励起波長を有する色素の組合せである、請求項25に記載の方法。
- 色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニンである、請求項21に記載の方法。
- 指示試薬がフルオレセインである、請求項18に記載の方法。
- インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項28に記載の方法。
- フルオレセインが5−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項28に記載の方法。
- 多臓器不全症候群を発症するリスクのある患者を正確に特定する方法であって、
分子量が異なり、各々明瞭に異なる離れた発光波長および励起波長を有する異なる蛍光団でタグ付けされた複数のタンパク質または分子を使用すること、
それら複数のタンパク質または分子を、多臓器不全を発症するリスクのある患者に投与すること、および
同じ病態生理学的プロセス下で、連続的に複数回、その異なる蛍光団の濃度を追跡すること
を含んでなる、方法。 - 前記病態生理学的プロセスが血液濃縮および毛細血管漏出である、請求項31に記載の方法。
- 治療量の請求項1に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。 - 治療量の請求項1に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。 - 前記傷害が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全、および/または無酸素症によるものである、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物を、多臓器不全に代わる血管漏出を測定および定量するためのマーカーとして使用する工程、および
臓器不全を発症するリスクのある患者を予測する工程
を含む、請求項34に記載の方法。 - 血液減少症状または多臓器不全のリスクのある患者において、毛細血管漏出により引き起こされるこのような症状または不全を治療または予防する方法であって、
a)このような症状または不全のリスクのある患者に対して、その患者に毛細血管漏出の増加があるかどうかを判定する診断試験を行うこと、
そして、その患者に毛細血管漏出の増加があれば、
b)患者に治療上有効な量の血漿増量剤を投与すること
を含んでなる、方法。 - 診断試験の実施が、
a)患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
b)患者の血流に、工程(a)と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
c)第一および第二のマーカー組成物を投与した後の2以上の時点で患者から採取した血液サンプル中の第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の相対的低下速度を測定すること
を含む、請求項37に記載の方法。 - 第二のマーカー組成物の低下速度に比べ、第一のマーカー組成物の量の低下速度が速ければ、その患者に毛細血管漏出の増加があることを示す、請求項38に記載の方法。
- 前記血液タンパク質分子がアルブミンまたはヘモグロビンである、請求項38に記載の方法。
- 血液タンパク質分子の分子排除体積が、血液タンパク質分子と1以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により実質的に大きくされている、請求項38に記載の方法。
- 第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が同時に患者に投与される、請求項38に記載の方法。
- 第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が患者に投与するための単一の製剤中に処方される、請求項42に記載の方法。
- 第一の検出可能な標識と第二の検出可能な標識がともに蛍光マーカーである、請求項38に記載の方法。
- 前記血漿増量剤がPEG化アルブミンまたはPEG化ヘモグロビンである、請求項38に記載の方法。
- 前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ラクトアルブミンおよびオボアルブミンからなる群から選択されるものである、請求項45に記載の方法。
- 前記患者が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全または無酸素症の結果としてのこのような症状または不全のリスクを有する、請求項37に記載の方法。
- 第一のマーカー組成物および第二のマーカー組成物の双方の血液タンパク質分子がアルブミンであり、第二のマーカー組成物のアルブミンが、該アルブミンと1以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により修飾されている、請求項38に記載の方法。
- 診断試験の実施が、
a)患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
b)患者の血流に、工程(a)と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
c)第一および第二のマーカー組成物を投与した後の2以上の時点で、第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の比率を測定すること
を含む、請求項37に記載の方法。 - 第一の検出可能な標識の量と第二の検出可能な標識の量との比率が、第一および第二のマーカー組成物を投与した後の3以上の時点で測定され、
経時的な比率の変化の曲線が作成され、曲線下面積が測定される、
請求項49に記載の方法。
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