JP2009513117A - 齧歯動物細胞におけるタンパク質発現 - Google Patents
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Abstract
Description
バイオテクノロジー的な産生プロセスの役割および影響は近年、重要さを増している。バイオテクノロジープロセスの重要性の高まりと並行して、製造される製品の複雑さも絶え間なく増している。
本発明は、齧歯動物細胞系における異種タンパク質の発現のための発現系を提供する。この系は、エプスタイン-バーウイルスのoriP/EBNA-1エピソーム複製および維持系を含む。
a)原核生物複製起点;
b)選択マーカー;
c)エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP);
d)前記齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、前記異種タンパク質をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット。
a)齧歯動物細胞を提供する段階;
b)原核生物複製起点、選択マーカー、およびエプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)用の機能性発現カセットを含むプラスミドを提供する段階であって、発現カセットが、プロモーター配列、5'非翻訳領域、EBNA-1タンパク質をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、段階;
c)プラスミドb)を齧歯動物細胞a)に導入する段階;
d)安定に形質転換された齧歯動物細胞を選択する段階;
e)原核生物複製起点、選択マーカー、エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP)、および形質転換された齧歯動物細胞における異種タンパク質の発現のために適した発現カセットを含む、1つまたは複数のさらなるプラスミドを提供する段階であって、発現カセットが、プロモーター配列、5'非翻訳領域、異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、段階;
f)さらなるプラスミドe)を齧歯動物細胞d)に導入する段階;
g)段階e)からf)までを最大5回繰り返す段階。
a)本発明による齧歯動物細胞を提供する段階;
b)齧歯動物細胞を、異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階;
c)異種ポリペプチドを培養物から回収する段階。
a)齧歯動物細胞;
b)原核生物複製起点、選択マーカー、およびエプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)用の機能性発現カセットを含む第1のプラスミドであって、発現カセットが、プロモーター配列、5'非翻訳領域、EBNA-1タンパク質をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、第1のプラスミド;
c)原核生物複製起点、選択マーカー、エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP)、および齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットを含む第2のプラスミドであって、発現カセットが、プロモーター配列、核酸配列の導入のためのクローニング部位、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、第2のプラスミド。
本発明は、エプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)を発現し、かつエピソームを含む齧歯動物細胞であって、前記エピソームが以下のものを含む齧歯動物細胞を提供する:
a)原核生物複製起点;
b)選択マーカー;
c)エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP);
d)前記齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット。
本発明の宿主細胞は、EBNA-1タンパク質をコードする核酸を提供する。
異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のためには、対応する構造遺伝子用の発現カセットを含む発現プラスミドを構築しなければならない。
本発明による基本的な齧歯動物細胞系に対して、構築した発現プラスミドの1つまたは複数をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の培養は、例えば一過性トランスフェクションの下での、異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で行った。
a)EBNA-1タンパク質をコードする構造遺伝子が安定にトランスフェクトされた齧歯動物細胞を提供する段階、
b)前記齧歯動物細胞に、エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP)を含む発現プラスミドをトランスフェクトする段階、
c)前記トランスフェクトされた細胞を、前記異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階、
d)前記異種ポリペプチドを培養物から回収する段階。
‐原核生物複製起点
‐選択マーカー
‐前記齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、前記異種タンパク質をコードする核酸配列(構造遺伝子)、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット。
実施例1 一般的な手法
実施例2 EBNA-1タンパク質を発現するCHO細胞系の構築
実施例3 EBV oriP、ならびにヒトモノクローナル抗IGF-1R抗体の軽鎖および重鎖用の発現カセットを保有するプラスミドの構築
実施例4 EBNA-1-陽性DG-700-IIIE3sub1細胞による、oriPを保有するプラスミドからの抗体の産生
一般的な手法
a)組換えDNAの手法
DNAの操作のためには、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載された通りに標準的な方法を用いた。分子生物学用試薬は、製造元の指示に従って用いた。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)で行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。
GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウエアパッケージ、バージョン10.2およびInfomax社のVector NTI Advanceスイート、バージョン8.0を、配列の生成、マッピング、解析、注釈付けおよび図示のために用いた。
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載された通りに、標準的な細胞培養手法を用いた。
細胞を200×gでの遠心によって収集し、PBS(リン酸緩衝食塩水)で洗浄した上で、溶解用緩衝液(50mM Tris*HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸)、pH 8.0、120mM NaCl、0.5%(v/v)Nonidet(登録商標)P40、10%(v/v)グリセロール、5mM DTT(ジチオトレイトール)、1mM EGTA(エチレン-ビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸)、1%(v/v)Trasylol(登録商標)、2mM PMSF(フェニルメタンスルホニルフロリド)、50μg/mlロイペプチン)中で氷上にて30分間インキュベートした。13,000×gでの遠心の後に、可溶性上清を収集し、Bio-Radタンパク質アッセイ(カタログ番号:5000-0001)を製造元のプロトコールに従って用いてタンパク質濃度に関して検査した。
細胞培養上清中の抗体は、ヒトFc検出キット(Cis Bio、カタログ番号:62HFCPEB)を用いる競合的イムノアッセイによって定量した。本アッセイは、HTRF(登録商標)技術(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)に基づく。手短に述べると、試料を希釈用緩衝液で1:10〜1:100に希釈した。50μlの希釈試料を、96ウェルOptiPlates(Perkin Elmer、カタログ番号:6005279)中にて、25μlの抗ヒトIgG Fcクリプテートおよび25μlのヒトIgG-XL665と混ぜ合わせた。このアッセイ混合物を室温で一晩インキュベートした。320nmで励起した後に、Victor 1420分析装置(Perkin-Elmer)を用いて蛍光発光を620nmおよび665nmで測定した。抗体濃度は、較正曲線を用いた比較により、665nm/620nmの比から推定した。
EBNA-1タンパク質を発現するCHO細胞系の構築
a)CHO細胞におけるEBNA-1タンパク質の発現のためのプラスミドpcDNA3_EBNA-1の構築
プラスミドpcDNA3.1(Invitrogen、カタログ番号:V790-20)を制限ヌクレアーゼSacIおよびDraIIIで切断し、その結果生じた4715bp断片を、オリゴヌクレオチド1(SEQ ID NO:06)およびオリゴヌクレオチド2(SEQ ID NO:07)のアニーリングによって得られたDNAリンカーと連結させた。その結果生じたプラスミドをHindIIIおよびDraIIIで切断した。この4748bpベクター断片を、pCEP4(Invitrogen、カタログ番号:V044-50)をテンプレートとして、オリゴヌクレオチド3(SEQ ID NO:08)およびオリゴヌクレオチド4(SEQ ID NO:09)をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得られた、EBNA-1をコードするHindIII/DraIII cDNA断片と連結させた。このEBNA-1用の真核生物発現プラスミドをpcDNA3_EBNA-1と命名した(図1)。
無血清浮遊培養に対してあらかじめ順化させたCHO-DG44細胞を、DHI培地(Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)を入れたスピナーフラスコ内にて、5%pCO2下にある37℃の加湿インキュベーター内で維持した。
EBV oriPならびにヒトモノクローナル抗IGF-1R抗体の軽鎖および重鎖用の発現カセットを保有するプラスミドの構築
サブクローニングおよびオーバーラップPCRにより、抗IGF-1R抗体の重鎖可変(VH)領域およびヒトγ1重鎖定常(CH1-CH2-CH3)領域の遺伝子と同様に、抗IGF-1R抗体の軽鎖可変(VL)領域およびヒトκ軽鎖定常(CL)領域をコードする遺伝子セグメントを正確に連結した。抗IGF-1R抗体の構造遺伝子(κ軽鎖およびγ1重鎖)をコードするDNA配列をDNAシークエンシングによって確認し、その後に、EBV oriPを保有する哺乳動物細胞発現ベクターまたは保有しないそれの中に挿入した。
‐このプラスミドの大腸菌における複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点(pUC ori)
‐大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子(Amp)
‐以下のエレメントから構成される、抗IGF-1R抗体κ軽鎖の発現のための転写ユニット:
‐ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期プロモーターおよびエンハンサー(hCMV IE1)
‐コザック配列を含む合成5'-UTR
‐シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列(L1_イントロン_L2)
‐5'末端の一意的なBsmI制限部位ならびに3'末端のスプライスドナー部位および一意的なNotI制限部位を伴って配列された、クローニングされた抗IGF-1R抗体可変軽鎖cDNA(VL)
‐イントロン性のマウスIgκエンハンサーを含む、ゲノム性のヒトκ軽鎖遺伝子定常領域[NotI_マウスIgκエンハンサー-イントロン-2_ヒト-イントロン-2_C-κ]
‐ポリアデニル化シグナル配列を含む、ヒトκ-免疫グロブリン3' UTR(3' UTR C-κ)
‐代替的な発現プラスミドへの発現カセットの移入を可能にするための、それぞれ5'および3'末端にある一意的な制限部位Sse8371IおよびFseI。
‐このプラスミドの大腸菌における複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点(pUC ori)
‐大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子(Amp)
‐以下のエレメントから構成される、抗IGF-1R抗体γ1重鎖の発現のための転写ユニット:
‐ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期プロモーターおよびエンハンサー(hCMV IE1)
‐コザック配列を含む合成5'-UTR
‐シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列(L1_イントロン_L2)
‐5'末端の一意的なBsmI制限部位ならびに3'末端のスプライスドナー部位および一意的なNotI制限部位を伴って配列された、クローニングされた抗IGF-1R抗体可変重鎖cDNA
‐マウスIg μエンハンサーを含む、ゲノム性のヒトγ1重鎖遺伝子定常領域[介在イントロンを伴うNotI_マウスIg μエンハンサー_ヒト-イントロン-2_CH1-CH2-CH3]
‐ポリアデニル化シグナル配列を含む、ヒトγ1-免疫グロブリン3' UTR
‐代替的な発現プラスミドへの発現カセットの移入を可能にするための、それぞれ5'および3'末端にある一意的な制限部位SgrAIおよびAscI。
‐真核細胞における選択用マーカーとして適したハイグロマイシン耐性遺伝子
‐エプスタイン-バーウイルスの複製起点oriP。
EBNA-1陽性DG-700-IIIE3sub1細胞によるoriP保有プラスミドからの抗体の産生
DG-700-IIIE3sub1細胞および非改変CHO-DG44型細胞を、ProCHO4-CDM(Cambrex、カタログ番号:BE12-029Q)、2mMグルタミン、2%(v/v)50×HT補給物質(Invitrogen、カタログ番号:41065-012)および300μg/mlのG418中での37℃、5%CO2下の静置培養下にて維持した。トランスフェクションの1時間前に細胞を遠心処理によって収集し、DHI培地(Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)中に0.5×106個/mlで再懸濁させた。
SEQ ID NO:01
EBV oriPの核酸配列である;V01555(GenBank);Yates, J.L., et al., Proc Natl Acad Sci USA 81 (1984) 3806-3806。
SEQ ID NO:02
EBVの2回対称エレメントの核酸配列である;V01555(GenBank);Reisman, D., et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 1822-1832。
SEQ ID NO:03
EBVの反復配列群の核酸配列である;V01555(GenBank);Reisman et al., 1985。
SEQ ID NO:04
EBNA-1タンパク質をコードする核酸配列である;V01555(GenBank)。
SEQ ID NO:05
EBNA-1タンパク質のアミノ酸配列である;P03211(SwissProt)。
SEQ ID NO:06
プライマーオリゴヌクレオチド1である。
SEQ ID NO:07
プライマーオリゴヌクレオチド2である。
SEQ ID NO:08
プライマーオリゴヌクレオチド3である。
SEQ ID NO:09
プライマーオリゴヌクレオチド4である。
Claims (11)
- 以下を特徴とする齧歯動物細胞:
a)エプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)を発現する;
b)以下を含むエピソームを含む:
(i)原核生物複製起点;
(ii)選択マーカー;
(iii)エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP);
(iv)該齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、該異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、齧歯動物細胞を入手するための方法:
a)齧歯動物細胞を提供する段階;
b)以下を含むプラスミドを提供する段階:
(i)原核生物複製起点;
(ii)選択マーカー;
(iii)エプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)用の機能性発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、EBNA-1をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳配列を含む、発現カセット;
c)プラスミドb)を齧歯動物細胞a)に導入する段階、および安定に形質転換された齧歯動物細胞を選択する段階;
d)以下を含む、1つから4つまでのさらなるプラスミドを提供する段階:
(i)原核生物複製起点;
(ii)選択マーカー;
(iii)エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP);
(iv)該形質転換された齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを伴う3'非翻訳領域を含む、発現カセット;
e)さらなるプラスミドd)を、該安定に形質転換された齧歯動物細胞に導入する段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドの産生のための方法:
a)請求項1記載の齧歯動物細胞を提供する段階;
b)該齧歯動物細胞を、該異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階;
c)該ポリペプチドを培養物から回収する段階。 - 以下を含むことを特徴とする、請求項1記載の齧歯動物細胞の産生のためのキット:
a)齧歯動物細胞;
b)以下を含む、第1のプラスミド:
(i)原核生物複製起点;
(ii)選択マーカー;
(iii)エプスタイン-バーウイルス核抗原1(EBNA-1)用の機能性発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、EBNA-1をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット;
c)以下を含む、第2のプラスミド:
(i)原核生物複製起点;
(ii)選択マーカー;
(iii)エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP);
(iv)該齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5'非翻訳領域、核酸配列の導入のためのクローニング部位、およびポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域を含む、発現カセット。 - 異種ポリペプチドが、プロドラッグ、酵素、酵素断片、酵素阻害物質、酵素活性化物質、生物活性ポリペプチド、ヘッジホッグ(hedgehog)タンパク質、骨形成タンパク質(bone morphogenetic protein)、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含む群から選択されることを特徴とする、請求項2〜3のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含むことを特徴とする、齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のための方法:
a)EBNA-1タンパク質をコードする構造遺伝子で安定にトランスフェクトされた齧歯動物細胞を提供する段階、
b)該齧歯動物細胞に、エプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点(oriP)を含む発現プラスミドをトランスフェクトする段階;
c)該トランスフェクトされた細胞を、該異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階、
d)該異種ポリペプチドを培養物から回収する段階。 - 異種ポリペプチドが、分泌性の異種ポリペプチドであることを特徴とする、請求項2〜3および5〜6のいずれか一項記載の方法。
- 発現プラスミドが、EBNA-1タンパク質をコードする構造遺伝子を全く含まないことを特徴とする、請求項2〜3および5〜7のいずれか一項記載の方法。
- 培養する段階が一過性トランスフェクション下で行われることを特徴とする、請求項2〜3および5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 齧歯動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項2〜3および5〜9のいずれか一項記載の方法。
- CHO細胞が、CHO-DBX11細胞、CHO-K1細胞、CHO-DG44細胞、およびEBNA-1を発現するCHO細胞を含む群から選択される、請求項10記載の方法。
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