JP2009280526A - New versipelostatin derivative, microorganism exhibiting capability of producing the derivative and production method of the derivative using the microorganism, and anticancer agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規versipelostatin誘導体などに関する。より詳細には、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用を有する新規versipelostatin誘導体、該誘導体の生産能を有する微生物、及び該微生物を用いた前記誘導体の生産方法、並びに抗がん剤、該抗がん剤を含有する医薬品組成物、及び該医薬品組成物を含有する医薬品に関する。 The present invention relates to novel versipelostatin derivatives and the like. More specifically, a novel versipelostatin derivative having an action of suppressing the induction of GRP78 expression, a microorganism capable of producing the derivative, a method for producing the derivative using the microorganism, an anticancer agent, and the anticancer agent The present invention relates to a pharmaceutical composition containing an agent, and a pharmaceutical containing the pharmaceutical composition.
近年、抗がん剤などの開発において、ＧＲＰ７８が注目されている。ＧＲＰ７８（Glucose-Regulated Protein 78-kD）は、ＨＳＰ７０ファミリーに属するストレス応答型の分子シャペロンであり、小胞体に存在するタンパク質である。ＧＲＰ７８は、動物細胞において、グルコース飢餓条件下などにおいて、その発現が誘導されることが知られている。 In recent years, GRP78 has attracted attention in the development of anticancer agents and the like. GRP78 (Glucose-Regulated Protein 78-kD) is a stress-responsive molecular chaperone belonging to the HSP70 family and is a protein present in the endoplasmic reticulum. It is known that the expression of GRP78 is induced in animal cells under conditions such as glucose starvation.
固形がんは、一般的に、正常組織と異なり、グルコース飢餓状態の領域を持つことが知られている（非特許文献１）。また、固形がんでは、ＧＲＰ７８の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２）。その他、グルコース飢餓条件化などにおいて、ＧＲＰ７８の発現誘導がアポトーシス誘導を抑制することが報告されている（非特許文献３）。 It is known that solid cancer generally has a region of glucose starvation unlike normal tissues (Non-patent Document 1). In solid cancer, it is reported that the expression of GRP78 is induced (Non-patent Document 2). In addition, it has been reported that the expression induction of GRP78 suppresses apoptosis induction under conditions such as glucose starvation (Non-patent Document 3).
これらの各知見からは、グルコース飢餓状態において、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することによりアポトーシスなどを惹起できること、即ち、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することにより飢餓状態の細胞（がん細胞）を死滅できる可能性が示唆されている。そこで、新規抗がん剤として、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質を探索する試みが、各種、行われている（非特許文献１〜６）。 From each of these findings, apoptosis or the like can be induced by suppressing the induction of GRP78 expression in a glucose-starved state, that is, the starved cells (cancer cells) can be killed by suppressing the induction of GRP78 expression. The possibility is suggested. Therefore, various attempts have been made to search for substances that suppress the induction of GRP78 expression as novel anticancer agents (Non-Patent Documents 1 to 6).
例えば、特許文献１では、ストレプトマイセス バーシペリス（Streptomyces versipellis）４０８３−ＳＶＳ６株の代謝産物より、ＧＲＰ７８の発現抑制活性を有する下記化学式（２）で示される新規テトロン酸誘導体versipelostatin（別名ＪＬ６８）化合物（以下、「ＶＳＴ」と称する。）が提案されている。 For example, in Patent Document 1, a novel tetronic acid derivative versipelostatin (also known as JL68) compound represented by the following chemical formula (2) having an activity of suppressing the expression of GRP78 from a metabolite of Streptomyces versipellis 4083-SVS6 strain ( Hereinafter, it is referred to as “VST”).
また、特許文献２では、ＶＳＴの特定のケトン基に有機基を導入することにより、ＶＳＴと同等のＧＲＰ７８発現抑制活性を有するにも関わらず、ＶＳＴよりも毒性の低い、下記化学式（３）で示される化合物が提案されている。 Moreover, in patent document 2, although it has the GRP78 expression suppression activity equivalent to VST by introduce | transducing an organic group into the specific ketone group of VST, it is less toxic than VST by following Chemical formula (3). The compounds shown have been proposed.
これら２化合物の発明は、本発明者らが行った発明であり、いずれの化合物もＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用を有し、抗がん剤として適用できる可能性を有するものである。 The inventions of these two compounds are the inventions made by the present inventors, and each compound has an action of suppressing the induction of GRP78 expression and has the possibility of being applicable as an anticancer agent.
前記で述べた通り、ＧＲＰ７８の発現を抑制する物質の探索は進みつつあるが、その抑制活性の程度は様々であり、更なる開発が期待されているのが現状である。 As described above, the search for a substance that suppresses the expression of GRP78 is progressing, but the degree of its inhibitory activity varies, and the current situation is that further development is expected.
そこで、本発明では、高いＧＲＰ７８発現抑制活性を有し、抗がん作用を示す新規化合物を提供することを主な目的とする。 Therefore, the main object of the present invention is to provide a novel compound having a high GRP78 expression inhibitory activity and exhibiting an anticancer activity.
本発明者らは、ＧＲＰ７８発現抑制活性の強度に着目して種々の探索を行った結果、ＶＳＴに比べ非常に強い活性を示す化合物を新規に見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of various searches focusing on the strength of the GRP78 expression-suppressing activity, the present inventors have found a compound exhibiting a very strong activity compared to VST and have completed the present invention.
即ち、本発明では、まず、下記化学式（１）で表される化合物（以下、「ＪＢＩＲ−０９」と称する。）、若しくはその塩を提供する。
また、本発明では、ストレプトマイセス属に属し、前記化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物を提供する。
前記化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物であれば、全て本発明に係る微生物に含有されるが、具体的な一例としては、前記化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有するストレプトマイセス バーシペリス ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１７９）またはその変異株を挙げることができる。
前記化合物ＪＢＩＲ−０９、若しくはその塩の生産方法は特に限定されないが、例えば、ストレプトマイセス属に属し、前記化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物を培養し、前記化合物ＪＢＩＲ−０９を採取する工程を少なくとも行うことで、生産することができる。
この生産方法には、前記化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物であれば特に限定されずに用いることができるが、例えば、ストレプトマイセス バーシペリス ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１７９）を用いれば、確実に前記化合物ＪＢＩＲ−０９を生産することが可能である。
That is, the present invention first provides a compound represented by the following chemical formula (1) (hereinafter referred to as “JBIR-09”) or a salt thereof.
The present invention also provides a microorganism belonging to the genus Streptomyces and capable of producing the compound JBIR-09.
Any microorganism having the ability to produce the compound JBIR-09 is included in the microorganism according to the present invention. As a specific example, Streptomyces versiperis 4083 having the ability to produce the compound JBIR-09 is used. SVS6 strain (FERM BP-8179) or its mutant can be mentioned.
The method for producing the compound JBIR-09 or a salt thereof is not particularly limited. For example, a microorganism belonging to the genus Streptomyces and capable of producing the compound JBIR-09 is cultured, and the compound JBIR-09 is collected. It can produce by performing at least a process.
For this production method, any microorganism can be used as long as it is capable of producing the compound JBIR-09. For example, if Streptomyces versiperis 4083-SVS6 strain (FERM BP-8179) is used. It is possible to reliably produce the compound JBIR-09.
本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９、若しくはその塩は、これを有効成分として抗がん剤に用いることができる。
本発明に係る抗がん剤は、特に、低栄養状態または低酸素状態などの生理的ストレス状態にあるがん細胞に対して細胞死を誘導することで、抗がん作用を発揮する。
本発明に係る抗がん剤は、あらゆるがんに対して抗がん作用を有すると考えられるが、特に、固形がんに対しては、高い抗がん作用を有する。
The compound JBIR-09 or a salt thereof according to the present invention can be used as an active ingredient in an anticancer agent.
The anticancer agent according to the present invention exerts an anticancer effect by inducing cell death against cancer cells in a physiological stress state such as a hypotrophic state or a hypoxic state.
The anticancer agent according to the present invention is considered to have an anticancer effect against any cancer, but has a particularly high anticancer effect against solid cancer.
本発明では、更に、前記抗がん剤と、薬理学的に許容され得る添加剤と、を含有する医薬品組成物、及び、該医薬品組成物を含有する医薬品を提供する。 The present invention further provides a pharmaceutical composition containing the anticancer agent and a pharmacologically acceptable additive, and a pharmaceutical containing the pharmaceutical composition.
本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９は、ＶＳＴに比べ、非常に強いＧＲＰ７８発現抑制活性を有しているため、これを有効成分として医薬品に用いることで、効果の高い新規な抗がん剤の提供を実現することができる。 Since the compound JBIR-09 according to the present invention has a very strong GRP78 expression inhibitory activity compared to VST, the use of this as an active ingredient in a pharmaceutical product provides a highly effective novel anticancer agent. Can be realized.
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the present invention will be described. In addition, embodiment described below shows an example of typical embodiment of this invention, and, thereby, the range of this invention is not interpreted narrowly.
＜本発明に係る化合物＞
本発明に係る新規化合物ＪＢＩＲ−０９は、前記化学式（１）に示す化学式からなり、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用を有する。このＧＲＰ７８発現抑制作用により、高い抗がん活性を示す。以下、本発明に係る化合物の性状等を詳しく説明する。
<Compound according to the present invention>
The novel compound JBIR-09 according to the present invention has the chemical formula shown in the chemical formula (1) and has an action of suppressing the induction of GRP78 expression. Due to this GRP78 expression inhibitory action, it exhibits high anticancer activity. Hereinafter, properties of the compound according to the present invention will be described in detail.
まず、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９の物理学的性状を、表１に示す。 First, Table 1 shows the physical properties of the compound JBIR-09 according to the present invention.
表１中、
（１）「Appearance」は物質の性状を示し、「Colorless amorphous solid」は無色の非結晶質固体であることを示す。
（２）「MP」は融点（Melting Point）を示す。
（３）［α］は、比旋光度を示す。「２４」は測定温度を示し、「Ｄ」はナトリウムＤ線を用いて測定したことを示す。「ｃ１．０」は溶液濃度を、「ＭｅＯＨ」はメタノール中で測定したことを示す。
（４）「Molecular formula」は、分子式を示す。
（５）「HR-ESI MS (High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectra)」は高分解能ESI質量分析装置によって測定した、ＪＢＩＲ−０９の精密質量（m/z）を示す。「found」は実測値（[M-H]−）を、「calcd」は計算値を示す。
（６）「ＵＶ」は紫外線吸収スペクトルを、「λmax nm(logε)」は極大吸収波長およびモル吸光係数を、「ＭｅＯＨ」はメタノール中で測定したことを示す。
（７）「ＩＲ」は赤外線吸収スペクトルを、「νmax cm−１」は極大吸収波数を、「ＫＢｒ」は臭化カリウム錠剤法で測定したことを示す。
In Table 1,
(1) “Appearance” indicates the property of the substance, and “Colorless amorphous solid” indicates a colorless amorphous solid.
(2) “MP” indicates melting point.
(3) [α] indicates specific rotation. “24” indicates the measurement temperature, and “D” indicates that measurement was performed using the sodium D line. “C1.0” indicates the solution concentration, and “MeOH” indicates the measurement in methanol.
(4) “Molecular formula” indicates a molecular formula.
(5) “HR-ESI MS (High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectra)” indicates the accurate mass (m / z) of JBIR-09 measured by a high-resolution ESI mass spectrometer. “Found” indicates an actually measured value ([MH] − ), and “calcd” indicates a calculated value.
(6) “UV” indicates an ultraviolet absorption spectrum, “λ max nm (logε)” indicates a maximum absorption wavelength and molar extinction coefficient, and “MeOH” indicates measurement in methanol.
(7) “IR” indicates an infrared absorption spectrum, “ν max cm −1 ” indicates a maximum absorption wave number, and “KBr” indicates a measurement by a potassium bromide tablet method.
また、ＪＢＩＲ−０９の非糖部分の13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル及び1Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを表２に、ＪＢＩＲ−０９の糖部分の13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル及び1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル表３に示す。 The 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum and 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum of the non-sugar part of JBIR-09 are shown in Table 2, and the 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum and 1 H-nuclear magnetic spectrum of the sugar part of JBIR-09 are shown in Table 2. Resonance spectra are shown in Table 3.
本発明に係る化合物は、ＧＲＰ７８発現抑制作用を有していれば、前記化合物ＪＢＩＲ−０９のみに限定されず、その塩、溶媒和物なども広く包含する。 The compound according to the present invention is not limited only to the compound JBIR-09 as long as it has a GRP78 expression-inhibiting action, and widely includes salts and solvates thereof.
塩としては、例えば、前記化合物ＪＢＩＲ−０９のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、金属塩（アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩など）、無機塩（酢酸塩、アンモニウム塩など）、有機アミン塩（ジベンジルアミン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩など）、アミノ酸塩（グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩など）なども本発明に係る化合物に包含する。 Examples of the salt include an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, lithium salt, etc.), alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, etc.), metal salt (aluminum salt, iron salt, etc.) of the compound JBIR-09. Zinc salt, copper salt, nickel salt), inorganic salt (acetate salt, ammonium salt, etc.), organic amine salt (dibenzylamine salt, glucosamine salt, ethylenediamine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, diethanolamine salt, Tetramethylammonium salt, etc.), amino acid salts (glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, asparagine salt, etc.) and the like are also included in the compounds according to the present invention.
また、溶媒和物としては、例えば、前記化合物ＪＢＩＲ−０９を大気中に放置したり、再結晶をしたりすることにより、水分を吸収、吸着水の付着などで水和物となった溶媒和物も本発明に包含する。 As the solvate, for example, the compound JBIR-09 is allowed to stand in the air or recrystallized to absorb moisture, adhere to adsorbed water, and the like to form a hydrate. Also included in the present invention.
更に、本発明に係る各化合物には、生体内において代謝されて本発明に係る各化合物に変換される化合物（プロドラッグ）も全て包含する。 Furthermore, each compound according to the present invention includes all compounds (prodrugs) that are metabolized in vivo and converted into each compound according to the present invention.
＜本発明に係る新規化合物の生産方法、及び該生産方法に用いる微生物＞
本発明に係る新規化合物ＪＢＩＲ−０９等は、それ自体が新規であって、その生産方法は限定されず、あらゆる方法を用いて生産することができる。一例を挙げると、微生物の代謝産物として生産することができる。
<Production method of novel compound according to the present invention and microorganism used in the production method>
The novel compound JBIR-09 and the like according to the present invention are novel per se and the production method is not limited and can be produced using any method. For example, it can be produced as a metabolite of a microorganism.
本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９等の生産に用いることができる微生物は、新規化合物ＪＢＩＲ−０９等の生産能を有する微生物であれば特に限定されず、あらゆる微生物を用いて、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９等を生産することができる。一例としては、ストレプトマイセス属菌などの放線菌が挙げられる。 The microorganism that can be used for the production of the compound JBIR-09 and the like according to the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce the novel compound JBIR-09 and the like. JBIR-09 etc. can be produced. An example is actinomycetes such as Streptomyces.
このストレプトマイセス属菌は、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、ストレプトマイセス バーシペリス ４０８３−ＳＶＳ６株およびその変異株を好適に用いることができる。
（１）受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−８１７９
（２）寄託日：平成１３年１１月１６日
（３）寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（４）住所：郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
The Streptomyces genus is not particularly limited as long as it has the ability to produce the compound JBIR-09 according to the present invention. For example, the Streptomyces versiperis 4083-SVS6 strain and its mutants are preferably used. Can do.
(1) Accession number: FERMBP-8179
(2) Date of deposit: November 16, 2001 (3) Depositary: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (4) Address: 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan Address 1 Central 6th
本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９のより具体的な生産方法を説明すると、前記のような本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物を培養し、その培養物より化合物ＪＢＩＲ−０９を分離・精製することにより行う。 A more specific production method of the compound JBIR-09 according to the present invention will be described. A microorganism having the ability to produce the compound JBIR-09 according to the present invention is cultured, and the compound JBIR-09 is obtained from the culture. It is performed by separating and purifying.
前記培養のための培地は、特に限定されず、通常の微生物が利用し得る栄養源を含有する培地等を自由に選択して用いることができる。 The medium for the culture is not particularly limited, and a medium containing a nutrient source that can be used by normal microorganisms can be freely selected and used.
前記栄養源も特に限定されず、従来から培養に利用されている栄養源を自由に選択して用いることができる。具体的には、炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、玄米、油脂類などが使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、綿実粕、コーンステイープリカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、などの有機物ならびに硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機物が利用できる。その他、必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することができる。更に、菌の発育を助け、本発明におけるステロイド化合物の生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。 The nutrient source is not particularly limited, and any nutrient source conventionally used for culturing can be freely selected and used. Specifically, as the carbon source, glucose, starch syrup, dextrin, starch, molasses, brown rice, fats and the like can be used. As the nitrogen source, organic substances such as soybean flour, wheat germ, cottonseed meal, corn steep liquor, meat extract, peptone, yeast extract, and inorganic substances such as ammonium sulfate and sodium nitrate can be used. In addition, if necessary, inorganic salts capable of generating sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions can be added. Furthermore, organic and inorganic substances that assist the growth of bacteria and promote the production of steroid compounds in the present invention can be added appropriately.
培養温度、通気量、培養時間などの培養方法は特に限定されず、用いる微生物に応じて、適宜設定することができる。例えば、放線菌を用いる場合であれば、好気的液体培養法（振盪培養、通気撹拌培養など）が最も適している。この場合の培養温度も特に限定されないが、２０〜３０℃が好適であり、２７℃付近がより好適である。 The culture methods such as culture temperature, aeration volume, and culture time are not particularly limited, and can be set as appropriate according to the microorganism to be used. For example, when using actinomycetes, an aerobic liquid culture method (shaking culture, aeration stirring culture, etc.) is most suitable. The culture temperature in this case is not particularly limited, but is preferably 20 to 30 ° C, more preferably around 27 ° C.
大量液体培養を行う場合、例えば、まず、２〜３日前培養を行った後、本培養を行ってもよい。少量の培地で前培養を行うことにより、菌株の増殖を活性化できるため、前培養後、その培養液を大量の培地に摂取することにより、培養の効率化を図ることができる。 In the case of performing large-scale liquid culture, for example, the main culture may be performed after first performing the pre-culture for 2 to 3 days. Since the growth of the strain can be activated by pre-culturing with a small amount of medium, the efficiency of the culture can be improved by ingesting the culture solution into a large amount of medium after the pre-culture.
次に、前記培養後、培養物から化合物ＪＢＩＲ−０９等を分離・精製する。分離・精製方法も、特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。一例を挙げると、まず、前記培養液を遠心分離又はろ過などした後、菌体成分を回収し、菌体をアセトン等にて抽出する。次に、例えば、シリカゲルなどの担体を用いた吸着カラムクロマト法、ゲル濾過用樹脂を用いたゲルろ過カラムクロマト法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、分配カラムクロマト法、透析法、沈澱法などを単独で又は適宜組み合わせて抽出精製する方法を用いることができる。 Next, after the culture, compound JBIR-09 and the like are separated and purified from the culture. The separation / purification method is also not particularly limited, and a known method can be freely selected and used. For example, first, after centrifuging or filtering the culture solution, the bacterial cell components are collected, and the bacterial cells are extracted with acetone or the like. Next, for example, an adsorption column chromatography method using a carrier such as silica gel, a gel filtration column chromatography method using a gel filtration resin, a solvent extraction method, an ion exchange resin method, a distribution column chromatography method, a dialysis method, a precipitation method, etc. These can be used alone or in combination as appropriate.
＜本発明に係る抗がん剤、医薬品組成物、及び医薬品＞
本発明に係る抗がん剤は、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９、若しくはその塩、又はＪＢＩＲ−０９類縁体、若しくはその塩を有効成分として少なくとも含有するもの全てを包含する。
<Anticancer agent, pharmaceutical composition, and pharmaceutical according to the present invention>
The anticancer agent according to the present invention includes all compounds containing at least the compound JBIR-09 according to the present invention, or a salt thereof, or a JBIR-09 analog, or a salt thereof as an active ingredient.
本発明に係る抗がん剤は、特に、低栄養状態または低酸素状態などの生理的ストレス状態にあるがん細胞に対して細胞死を誘導することで、抗がん作用を発揮する。後述する実施例２に示すように、逆に、生理的ストレス状態にないがん細胞には、ほとんど影響がないことが分かっている。従って、グルコース飢餓状態の領域を持つ固形がんに対して、特に高い抗がん作用を有する。 The anticancer agent according to the present invention exerts an anticancer effect by inducing cell death particularly against cancer cells in a physiological stress state such as a hypotrophic state or a hypoxic state. On the contrary, it is known that cancer cells that are not in a physiological stress state have almost no influence as shown in Example 2 described later. Therefore, it has a particularly high anticancer effect against a solid cancer having a region of glucose starvation.
本発明に係る抗がん剤は、単独で用いることもでき、また既存のあらゆる薬剤等と併用することができる。更には、本発明の抗がん効果を損なわない範囲において、既存のあらゆる薬剤等と合剤とすることもできる。 The anticancer agent according to the present invention can be used alone or in combination with any existing drug or the like. Furthermore, in the range which does not impair the anticancer effect of this invention, it can also be set as a combination with all the existing chemical | medical agents.
本発明に係る抗がん剤を用いた医薬品の剤型は特に限定されず、既存の剤型に全て適用することができる。一例としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤等の経口剤、注射剤、又は、外用液剤、外用ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、点鼻液剤等の外用剤などに製剤化することも可能である。 The dosage form of the pharmaceutical using the anticancer agent according to the present invention is not particularly limited, and can be applied to all existing dosage forms. Examples include powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, pills and other oral preparations, injections, or external liquids, external gels, It can also be formulated into external preparations such as creams, ointments, sprays and nasal drops.
前記経口剤には、有効成分である本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９等に加え薬理学的に許容される添加剤を含有させることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、潤沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。 The oral preparation can contain a pharmacologically acceptable additive in addition to the compound JBIR-09 according to the present invention which is an active ingredient. For example, excipients, binders, disintegrants, surfactants, preservatives, colorants, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, stabilizers, preservatives, antioxidants, lubricants, solubilizers, suspensions All additives that can be usually used in the field of pharmaceutical preparations, such as an agent and a coating agent, can be contained. In addition, a sustained-release preparation can be obtained using a drug delivery system (DDS).
前記注射剤には、有効成分である本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９等に加え薬理学的に許容される添加剤を含有させることができる。例えば、溶剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、等張化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。 The injection may contain a pharmacologically acceptable additive in addition to the compound JBIR-09 according to the present invention which is an active ingredient. For example, all additives that can be normally used in the field of pharmaceutical preparations, such as solvents, stabilizers, solubilizers, suspending agents, preservatives, isotonic agents, preservatives, antioxidants, etc. Can do.
前記外用剤には、有効成分である本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９等に加え薬理学的に許容される添加剤を含有させることができる。例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。 The external preparation may contain a pharmacologically acceptable additive in addition to the compound JBIR-09 according to the present invention which is an active ingredient. For example, all additives that can be usually used in the field of pharmaceutical preparations such as a base material, a preservative, an emulsifier, a colorant, an antiseptic, a surfactant, and an antioxidant can be contained.
実施例１では、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９の生産能を有する微生物を用いて、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９を生産した。本実施形態では、前記微生物の一例として、ストレプトマイセス バーシペリス ４０８３−ＳＶＳ６株を用いた。 In Example 1, the compound JBIR-09 according to the present invention was produced using a microorganism capable of producing the compound JBIR-09 according to the present invention. In the present embodiment, Streptomyces versiperis 4083-SVS6 strain was used as an example of the microorganism.
（１）ストレプトマイセス バーシペリス ４０８３−ＳＶＳ６株の培養
まず、表４に示す組成の前培養培地１５ｍｌを、５０ｍｌの大型試験管に分注、殺菌後、本菌株を培養スラント上より白金耳接種し、２７℃、３日間、培養したものを種母とした。
(1) Cultivation of Streptomyces versiperis 4083-SVS6 strain First, 15 ml of the preculture medium having the composition shown in Table 4 was dispensed into a 50 ml large test tube and sterilized, and then this strain was inoculated into the platinum loop from the culture slant. What was cultured at 27 ° C. for 3 days was used as a seed mother.
次に、５００ｍｌ容コブ付き三角フラスコに、表５に示す組成の生産培地１００ｍｌずつ分注後、殺菌した。そして、各フラスコに、上記種母を２ｍｌずつ添加し、ロータリーシェーカー上で、２７℃、５日間、培養し、培養液を調製した。 Next, 100 ml of the production medium having the composition shown in Table 5 was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask with a bump and then sterilized. Then, 2 ml of the above-mentioned seed mother was added to each flask and cultured on a rotary shaker at 27 ° C. for 5 days to prepare a culture solution.
（２）化合物ＪＢＩＲ−０９の分離・精製
前記で調製した培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）にかけ、培養上清を回収し、菌体を除去した。回収した培養上清を酢酸エチルにより抽出し、その後、硫酸ナトリウムで脱水した。この脱水後の粗精製物の重量は２．５７ｇであった。
(2) Separation and Purification of Compound JBIR-09 The culture solution prepared above was centrifuged (10,000 rpm, 10 minutes), the culture supernatant was collected, and the cells were removed. The collected culture supernatant was extracted with ethyl acetate, and then dehydrated with sodium sulfate. The weight of the crude product after this dehydration was 2.57 g.
脱水後の酢酸エチル抽出物を濃縮乾燥後、クロロホルム：メタノール（２０：１）溶液に溶解し、この溶解液をシリカゲルカラム（カラム容量：３．５φＸ３０ｃｍ）に供与し、同溶媒にてクロマトグラフィーを行った。続いて、活性を有する画分を集め、濃縮乾固後、メタノールに溶解し、ＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ、２０φＸ２５０ｍｍ、センシュー科学製）に供与し、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で８０％ＭｅＯＨを用いてクロマトグラフィー行い、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９を精製した。 The ethyl acetate extract after dehydration is concentrated and dried, and then dissolved in a chloroform: methanol (20: 1) solution. This solution is applied to a silica gel column (column capacity: 3.5φX30 cm) and chromatographed in the same solvent. went. Subsequently, the active fractions were collected, concentrated to dryness, dissolved in methanol, and supplied to an HPLC column (Senshu Pak: PEGASIL ODS, 20φX250 mm, manufactured by Senshu Kagaku), and 80% MeOH was added at a flow rate of 10 ml / min. The compound JBIR-09 according to the present invention was purified by chromatography.
実施例２では、実施例１で生産した本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９について、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用の有無を調べた。 In Example 2, the compound JBIR-09 produced in Example 1 according to the present invention was examined for the action of suppressing the induction of GRP78 expression.
ＧＲＰ７８は、グルコース飢餓条件下で、発現が誘導されることが知られている。そこで、グルコース飢餓条件と正常条件の両方において、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９がＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用をもつか、ＧＲＰ７８のプロモーター領域を用いたルシフェラーゼアッセイにより調べた。なお、ルシフェラーゼアッセイとは、ＧＲＰ７８のプロモーターが活性化されることでルシフェラーゼ遺伝子が発現し、発光が観察され、この発光量を定量することにより、ＧＲＰ７８の発現量を調べることができる方法である。 GRP78 is known to induce expression under glucose starvation conditions. Therefore, whether or not the compound JBIR-09 according to the present invention has an action of suppressing the induction of GRP78 expression under both glucose starvation conditions and normal conditions was examined by a luciferase assay using the promoter region of GRP78. The luciferase assay is a method whereby the luciferase gene is expressed by activating the GRP78 promoter, luminescence is observed, and the amount of GRP78 expressed can be examined by quantifying the amount of luminescence.
本実施形態では、ヒト繊維肉腫細胞であるＨＴ１０８０細胞を用いて行った。培地としては、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。また、ベクターとしては、ＧＲＰ７８のプロモーター領域をpGL3 basic (Promega社製)に連結したプラスミドを用いた。また、内部標準としてRenilla luciferase expression plasmid pRL-TK (Promega社製)を用いた。これらのベクターをＨＴ１０８０細胞にトランスフェクションした。次に、トランスフェクションした培養細胞を、（１）本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９存在下、（２）本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９及び２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）存在下、（３）ＶＳＴ存在下、（４）ＶＳＴ及び２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）存在下、で培養し、ルシフェラーゼの活性をdual luciferase kit (Promega社製)を用いて測定した。ここで、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）は、グルコース飢餓状態を誘導する化合物である。 In the present embodiment, HT1080 cells that are human fibrosarcoma cells were used. As the medium, RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum was used. As a vector, a plasmid in which the promoter region of GRP78 was linked to pGL3 basic (Promega) was used. In addition, Renilla luciferase expression plasmid pRL-TK (Promega) was used as an internal standard. These vectors were transfected into HT1080 cells. Next, the transfected cultured cells were (1) in the presence of compound JBIR-09 according to the present invention, (2) in the presence of compound JBIR-09 according to the present invention and 2-deoxyglucose (2-DG), (3 ) In the presence of VST and (4) in the presence of VST and 2-deoxyglucose (2-DG), the luciferase activity was measured using a dual luciferase kit (Promega). Here, 2-deoxyglucose (2-DG) is a compound that induces a glucose starvation state.
結果を図１に示す。図１中、縦軸は「ルシフェラーゼ活性」、横軸は「処理した化合物とその濃度をμＭ」で示す。 The results are shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis indicates “luciferase activity” and the horizontal axis indicates “treated compound and its concentration in μM”.
図１に示す通り、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９は、ＶＳＴと比較して、グルコース飢餓状態でのみ、１／１０の低濃度でＧＲＰ７８の発現を抑制した。なお、サンプル添加群のＩＣ５０値（コントロールのルシフェラーゼの値が５０％阻害される濃度）は３３７ｎＭだった。また、グルコース飢餓状態ではない状態では、ＧＲＰ７８の発現に影響を示さないことが確認できた。 As shown in FIG. 1, the compound JBIR-09 according to the present invention suppressed the expression of GRP78 at a low concentration of 1/10 only in the glucose starvation state as compared with VST. The IC 50 value of the sample addition group (concentration at which the control luciferase value was inhibited by 50%) was 337 nM. Further, it was confirmed that the expression of GRP78 was not affected in a state that was not in a glucose starvation state.
実施例２では、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９は、ＶＳＴより１０倍以上低い濃度で、抗がん活性を示すことが示唆された。 In Example 2, it was suggested that the compound JBIR-09 according to the present invention exhibits anticancer activity at a concentration 10 times or more lower than VST.
本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９は、既存のＶＳＴより非常に低濃度で小胞体ストレス誘発剤によるＧＲＰ７８の発現上昇を抑制する。この結果より、本発明に係る化合物ＪＢＩＲ−０９を利用し、化学療法や放射線療法によるがん治療の際にがん細胞のストレス応答機構を抑制することが可能である。また、がん細胞にこれら化学療法剤や放射線療法に対する高い感受性を付与する薬剤の開発に貢献できる。 The compound JBIR-09 according to the present invention suppresses the increase in the expression of GRP78 by the endoplasmic reticulum stress inducer at a concentration much lower than that of the existing VST. From this result, it is possible to suppress the stress response mechanism of cancer cells at the time of cancer treatment by chemotherapy or radiotherapy using the compound JBIR-09 according to the present invention. It can also contribute to the development of drugs that give cancer cells high sensitivity to these chemotherapeutic agents and radiation therapy.
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2008
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