JP2009278870A - ナトリウムチャネル阻害ペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】害虫駆除等において有用なナトリウムチャネルの活性を阻害するペプチド及びそれをコードする核酸を提供する。
【解決手段】複数の特定の配列からなるアミノ酸配列で示される、キタウロコアリ由来のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチド又はその類似ペプチドもしくはその誘導体からなる。また、当該ペプチドをコードする核酸、それを含むベクター、形質転換体および、当該ペプチドを有効成分とする殺虫剤からなる。
【選択図】なし
【解決手段】複数の特定の配列からなるアミノ酸配列で示される、キタウロコアリ由来のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチド又はその類似ペプチドもしくはその誘導体からなる。また、当該ペプチドをコードする核酸、それを含むベクター、形質転換体および、当該ペプチドを有効成分とする殺虫剤からなる。
【選択図】なし
Description
本発明は、殺虫剤として有用なナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチド及びそれをコードする核酸に関するものである。
従来から害虫駆除に用いられていたピレスロイド系殺虫剤は、昆虫のナトリウムチャネルの活性を阻害することによって機能するものであり、安価で効果も高いことから、公衆衛生、農畜産業などにおいて必要不可欠なものとなっている。しかしながら、この薬剤を多用した結果、広範囲の薬剤耐性の昆虫が出現している。kdr (knock down resistance)と呼ばれる薬剤耐性のハエ（非特許文献１）の出現は、大きな社会問題となっており、農業害虫でも、ピレスロイド耐性ヘリオシス(Heliothis)の幼虫による綿の木の大きな被害が報告されている。農業生産者らは、有機ホスフェート系およびカルバメート系殺虫剤への切り替えを余儀なくされているが、これら殺虫剤は、より高価であるにもかかわらず、殺虫効果が少ない点で満足がいくものではない。また、これらの合成有機化合物はいずれも油溶性であり分解しにくいので、農作物に散布した場合などの残留農薬として、人体への影響も無視できない。
このような殺虫剤にまつわる諸問題を克服すべく、ピレスロイド系殺虫剤と同様に効果的でかつ薬剤耐性になりにくいだけでなく、分解しやすく環境にもやさしい殺虫剤の開発が望まれていた。最近、ピレスロイド系殺虫剤と同様にナトリウムチャネルをターゲットとしつつ、薬剤耐性になりにくく、水溶性で分解しやすい殺虫剤の候補として、毒産生生物由来の神経毒ペプチドが注目されてきており、効果的にも優れた神経毒ペプチド系殺虫剤についての報告もなされている。ペプチド系殺虫剤は、一般に水溶性で分解しやすいために残留農薬が問題となる可能性が低く、特に昆虫特異的毒素であれば人体への影響は無視できる。また、当該ペプチドをコードする遺伝子を有するベクターを用いて投与することができるので、昆虫特異的に感染し、毒性を発揮するバキュロウイルス（特許文献１）をベクターとして選べば、さらに効果が高まる。例えば、クモ(Diguetia canities)の神経毒ペプチドでナトリウムチャネルに作用すると思われるDTX9.2を組込んだ組換えバキュロウイルスが、野生型のバキュロウイルスに比べて大幅に害虫駆除効果を発揮したことからも農薬としての期待が大きい（非特許文献２）。
このような殺虫剤にまつわる諸問題を克服すべく、ピレスロイド系殺虫剤と同様に効果的でかつ薬剤耐性になりにくいだけでなく、分解しやすく環境にもやさしい殺虫剤の開発が望まれていた。最近、ピレスロイド系殺虫剤と同様にナトリウムチャネルをターゲットとしつつ、薬剤耐性になりにくく、水溶性で分解しやすい殺虫剤の候補として、毒産生生物由来の神経毒ペプチドが注目されてきており、効果的にも優れた神経毒ペプチド系殺虫剤についての報告もなされている。ペプチド系殺虫剤は、一般に水溶性で分解しやすいために残留農薬が問題となる可能性が低く、特に昆虫特異的毒素であれば人体への影響は無視できる。また、当該ペプチドをコードする遺伝子を有するベクターを用いて投与することができるので、昆虫特異的に感染し、毒性を発揮するバキュロウイルス（特許文献１）をベクターとして選べば、さらに効果が高まる。例えば、クモ(Diguetia canities)の神経毒ペプチドでナトリウムチャネルに作用すると思われるDTX9.2を組込んだ組換えバキュロウイルスが、野生型のバキュロウイルスに比べて大幅に害虫駆除効果を発揮したことからも農薬としての期待が大きい（非特許文献２）。
しかしながら、これらの神経毒ペプチド類は選択性が高い場合が多く、１種類のペプチドでは広範な有害昆虫類のうち適用される範囲が限られることになる。薬剤耐性を起こさず、有害昆虫類全般に対して有効な効果を発揮できるためには、従来公知のアミノ酸配列とはできるだけ相同性が低いナトリウムチャネル阻害ペプチド及びそれを用いたペプチド系殺虫剤の提供が望まれていた。
［特許文献１］特表平１０−５０７０６５号公報
［非特許文献１］
Williamson MS, Denholm I, Bell CA, Devonshire AL. (1993) Knockdown resistance (kdr) to DDT and pyrethroid insecticides maps to a sodium channel gene locus in the housefly (Musca domestica). Mol Gen Genet.
240(1):17-22.
［非特許文献２］
Hughes PR, Wood HA, Breen JP, Simpson SF, Duggan AJ, Dybas JA. (1997)
Enhanced Bioactivity of Recombinant Baculoviruses Expressing Insect-Specific Spider Toxins in Lepidopteran Crop Pests. J Invertebr Pathol. 69(2):112-8.
［非特許文献３］
Craik DJ, Daly NL, Waine C. (2001) The cystine knot motif in toxins and implications for drug design. Toxicon. 39(1): 43-60.
［非特許文献４］
Yoshimura, M., Onoyama, K. (2007) A new sibling species of the genus Strumigenys, with a redefinition of S. lewisi Cameron, pp. 664-690. In Snelling, R. R., B. L. Fisher, and P. S. Ward(eds). Advances in ant systematics (Hymenoptera: Formicidae): homage to E. O. Wilson - 50 years of contributions.
Memoirs of the American Entomological Institute, 80.
［非特許文献５］
Bosmans F, Rash L, Zhu S, Diochot S, Lazdunski M, Escoubas P, Tytgat J. (2006)
Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes. Mol Pharmacol. 69(2):419-29.
［非特許文献６］
Xiao YC, Liang SP. (2003)
Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channel inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana. Toxicon. 41(6):643-50.
［非特許文献７］
Peng K, Chen XD, Liang SP. (2001)
The effect of Huwentoxin-I on Ca(2+) channels in differentiated NG108-15 cells, a patch-clamp study. Toxicon. 39(4):491-8.
［非特許文献９］
Conticello SG, Gilad Y, Avidan N, Ben-Asher E, Levy Z, and Fainzilber M. (2001)
Mechanisms for evolving hypervariability: the case of conopeptides. Mol. Biol. Evol. 18 (2):120-131.
［特許文献１］特表平１０−５０７０６５号公報
［非特許文献１］
Williamson MS, Denholm I, Bell CA, Devonshire AL. (1993) Knockdown resistance (kdr) to DDT and pyrethroid insecticides maps to a sodium channel gene locus in the housefly (Musca domestica). Mol Gen Genet.
240(1):17-22.
［非特許文献２］
Hughes PR, Wood HA, Breen JP, Simpson SF, Duggan AJ, Dybas JA. (1997)
Enhanced Bioactivity of Recombinant Baculoviruses Expressing Insect-Specific Spider Toxins in Lepidopteran Crop Pests. J Invertebr Pathol. 69(2):112-8.
［非特許文献３］
Craik DJ, Daly NL, Waine C. (2001) The cystine knot motif in toxins and implications for drug design. Toxicon. 39(1): 43-60.
［非特許文献４］
Yoshimura, M., Onoyama, K. (2007) A new sibling species of the genus Strumigenys, with a redefinition of S. lewisi Cameron, pp. 664-690. In Snelling, R. R., B. L. Fisher, and P. S. Ward(eds). Advances in ant systematics (Hymenoptera: Formicidae): homage to E. O. Wilson - 50 years of contributions.
Memoirs of the American Entomological Institute, 80.
［非特許文献５］
Bosmans F, Rash L, Zhu S, Diochot S, Lazdunski M, Escoubas P, Tytgat J. (2006)
Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes. Mol Pharmacol. 69(2):419-29.
［非特許文献６］
Xiao YC, Liang SP. (2003)
Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channel inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana. Toxicon. 41(6):643-50.
［非特許文献７］
Peng K, Chen XD, Liang SP. (2001)
The effect of Huwentoxin-I on Ca(2+) channels in differentiated NG108-15 cells, a patch-clamp study. Toxicon. 39(4):491-8.
［非特許文献９］
Conticello SG, Gilad Y, Avidan N, Ben-Asher E, Levy Z, and Fainzilber M. (2001)
Mechanisms for evolving hypervariability: the case of conopeptides. Mol. Biol. Evol. 18 (2):120-131.
本発明は、ピレスロイド化合物と同様に、害虫駆除等において有用な昆虫のナトリウムチャネルの活性を制御し、かつ作用機序の異なる新規な神経毒ペプチド系殺虫剤を提供しようというものである。
本発明者らは、昆虫のナトリウムチャネルの活性を阻害する物質として注目されている毒産生生物由来の神経毒ペプチド（非特許文献３）に着目し、2007年に新種のアリとして記載された、キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)が産生する毒性の高い神経毒ペプチドについて鋭意研究した結果、その神経毒ペプチド（SKTXペプチド）がショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの活性を顕著に阻害することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、キタウロコアリ由来の、殺虫剤等に有用なナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチド及びそれをコードするDNAに関連した発明であって、以下の通りのものである。
〔１〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含む単離されたペプチド；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、前記〔１〕に記載の単離されたペプチド。
〔３〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸であって、以下の（ａ）〜（ｇ）の何れかの塩基配列を含む核酸；
（ａ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、
（ｂ）（ａ）の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）（ｄ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）（ｄ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）。
〔４〕 前記〔３〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔５〕 前記〔４〕に記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主。
〔６〕 前記〔５〕に記載の形質転換宿主を用いることを特徴とする、ナトリウムチャネル阻害活性を有する組換えペプチドの製造方法。
〔７〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドを有効成分として含有するナトリウムチャネル阻害剤。
〔８〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドを有効成分として含有する殺虫剤。
〔９〕 配列番号１３、１５又は１７に示された塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸。
〔１０〕 前記〔９〕に記載の核酸からなる、ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマー。
〔１〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含む単離されたペプチド；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、前記〔１〕に記載の単離されたペプチド。
〔３〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸であって、以下の（ａ）〜（ｇ）の何れかの塩基配列を含む核酸；
（ａ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、
（ｂ）（ａ）の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）（ｄ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）（ｄ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）。
〔４〕 前記〔３〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔５〕 前記〔４〕に記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主。
〔６〕 前記〔５〕に記載の形質転換宿主を用いることを特徴とする、ナトリウムチャネル阻害活性を有する組換えペプチドの製造方法。
〔７〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドを有効成分として含有するナトリウムチャネル阻害剤。
〔８〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドを有効成分として含有する殺虫剤。
〔９〕 配列番号１３、１５又は１７に示された塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸。
〔１０〕 前記〔９〕に記載の核酸からなる、ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマー。
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドは、微量でも優れたナトリウムチャネル阻害活性を発揮するものであることから、有害昆虫に対する効果的な殺虫効果が期待できる。
次に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するＳＫＴＸペプチドは、キタウロコアリの毒腺から得られたナトリウムチャネル阻害活性を有する殺昆虫効果の高いペプチドである。
本発明のキタウロコアリ(Strumigenys kumadori)は、フタフシアリ亜科ウロコアリ属のアリで、毒液をトビムシ、ジムカデ等の土壌昆虫に注入してこれらの昆虫を狩るアリである。これまで近縁種のウロコアリと同種として分類されてきたが、形態上の特徴が明らかに異なるため、２００７年に新種のアリとして九州大学熱帯農学研究センターの吉村正志らによって記載された（非特許文献４）。
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するＳＫＴＸペプチドは、キタウロコアリの毒腺から得られたナトリウムチャネル阻害活性を有する殺昆虫効果の高いペプチドである。
本発明のキタウロコアリ(Strumigenys kumadori)は、フタフシアリ亜科ウロコアリ属のアリで、毒液をトビムシ、ジムカデ等の土壌昆虫に注入してこれらの昆虫を狩るアリである。これまで近縁種のウロコアリと同種として分類されてきたが、形態上の特徴が明らかに異なるため、２００７年に新種のアリとして九州大学熱帯農学研究センターの吉村正志らによって記載された（非特許文献４）。
ナトリウムチャネルは、細胞膜上にあって、刺激に応じてＮａイオンを細胞内へ透過させることにより、活動電位を発生および伝達させ、生体内における神経系の情報伝達を司っている。ナトリウムチャネル阻害活性というとき、チャネル分子に結合して、チャネルの正常な活性を阻害する活性は全て含まれ、ナトリウムチャネル阻害剤とは、そのナトリウムチャネル阻害活性を有する薬剤のことを指す。ピレスロイド系殺虫剤やＤＤＴなど有機塩素系殺虫剤は、ナトリウムチャネルに結合して開いた状態にし、神経細胞を常に興奮状態にし、正常な生体内の神経伝達が行えなくする。その結果、これらの薬剤は昆虫など小動物に対しては致死性を示す。なお、脂環式有機塩素系殺虫剤は油脂含有食品中への残留が問題となり使用禁止されている。
一方、本発明のＳＫＴＸペプチドなど神経毒ペプチド類は、一般にナトリウムチャネルに結合するものの、ピレスロイド系殺虫剤等と異なり、ナトリウムチャネルが常に閉じた状態にし、ナトリウムイオンの流入を阻害する結果、神経伝達がおこらなくなり致死作用を示すタイプのナトリウムチャネル阻害剤であり、通常は水溶性であるため、残留農薬は問題とならない。
一方、本発明のＳＫＴＸペプチドなど神経毒ペプチド類は、一般にナトリウムチャネルに結合するものの、ピレスロイド系殺虫剤等と異なり、ナトリウムチャネルが常に閉じた状態にし、ナトリウムイオンの流入を阻害する結果、神経伝達がおこらなくなり致死作用を示すタイプのナトリウムチャネル阻害剤であり、通常は水溶性であるため、残留農薬は問題とならない。
本発明におけるナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドとは、配列番号１〜３に示される、アミノ酸数３５又は３６のキタウロコアリの毒液中のＳＫＴＸ１〜３ペプチド（ＳＫＴＸペプチド）のみならず、ナトリウムチャネル阻害活性を失わない程度に、その１部のアミノ酸が欠失したり、他のアミノ酸と置換したり、アミノ酸配列が挿入、付加される変異を有する場合も包含する。その際、他のナトリウムチャネル阻害活性を有する生物毒に共通な６箇所のシステイン残基は保存される必要がある。
具体的には、以下のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｄ）などのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドとして表現することができる。ただし、いずれのペプチドにおいても、ＳＫＴＸ成熟ペプチドのアミノ酸配列中の６箇所のシステイン残基は変更されていないアミノ酸配列を含むものである。
（ａ）配列番号１〜３に示されたＳＫＴＸ１〜３の成熟ペプチドに対応するアミノ酸配列。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列のうち、６箇所のシステイン残基以外のアミノ酸残基が１もしくは数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換されたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中に、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸残基が挿入された、又は当該アミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示されたアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法（図３）で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）ここで、配列番号１〜３で示されるＳＫＴＸ１〜３ペプチドのアミノ酸配列は、６箇所のシステイン残基以外にも共通配列が多く、７２％の相同性を有している。
したがって、本発明における典型的なＳＫＴＸペプチドは、下記式（Ｉ）のような１文字表記のアミノ酸配列として表すことができる。
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
式（Ｉ）中で、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸であってよく、そのうちのX1を含む１〜３個は欠失してもよい。好ましくは、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである。（配列番号７，８）
（ｅ）配列番号４〜６に示された塩基配列によりコードされたアミノ酸配列（配列番号１〜３）を含むアミノ酸配列と共に、配列番号４〜６に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。ここで、ストリンジェントな条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。
具体的には、以下のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｄ）などのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドとして表現することができる。ただし、いずれのペプチドにおいても、ＳＫＴＸ成熟ペプチドのアミノ酸配列中の６箇所のシステイン残基は変更されていないアミノ酸配列を含むものである。
（ａ）配列番号１〜３に示されたＳＫＴＸ１〜３の成熟ペプチドに対応するアミノ酸配列。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列のうち、６箇所のシステイン残基以外のアミノ酸残基が１もしくは数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換されたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中に、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸残基が挿入された、又は当該アミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示されたアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法（図３）で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）ここで、配列番号１〜３で示されるＳＫＴＸ１〜３ペプチドのアミノ酸配列は、６箇所のシステイン残基以外にも共通配列が多く、７２％の相同性を有している。
したがって、本発明における典型的なＳＫＴＸペプチドは、下記式（Ｉ）のような１文字表記のアミノ酸配列として表すことができる。
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
式（Ｉ）中で、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸であってよく、そのうちのX1を含む１〜３個は欠失してもよい。好ましくは、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである。（配列番号７，８）
（ｅ）配列番号４〜６に示された塩基配列によりコードされたアミノ酸配列（配列番号１〜３）を含むアミノ酸配列と共に、配列番号４〜６に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。ここで、ストリンジェントな条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。
本発明における、ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸とは、配列番号４〜６に示されるＳＫＴＸペプチド成熟体をコードするＤＮＡ、配列番号１３，１５又は１７中のＳＫＴＸペプチド前駆体をコードするＤＮＡのみならず、以下の（ａ）〜（ｇ）の塩基配列を含む核酸も包含するものである。ただし、発現される組換えペプチドは、配列番号１〜３に共通する６箇所のシステイン残基は保存されているペプチドである。
（ａ）配列番号４〜６に示される塩基配列を含む核酸、配列番号１３，１５、１７中のＳＫＴＸペプチド前駆体をコードする核酸（配列番号１３の70〜246位、配列番号１５の82〜267位、配列番号１７の2〜178位に対応する。）、又は配列番号１３，１５、１７に示される塩基配列に含まれる核酸であって、配列番号４〜６と読み枠をそろえた核酸。
（ｂ）（ａ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）配列番号１〜３に示されたＳＫＴＸ成熟体ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号１４，１６，１８に示されたＳＫＴＸ前駆体ペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。ここで、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換・挿入された配列をいう。または、配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列をいう。
（ｆ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
これらの核酸を含む発現ベクターを用い、形質転換宿主でＳＫＴＸ１〜３ペプチド又はその類似ペプチドを単独又は融合組換え蛋白として発現させることができるが、その際に選択した宿主に応じて、成熟ペプチドに対応する塩基配列も、シグナル配列を含む前駆体ペプチドに対応する塩基配列も利用可能である。
そして、これら塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸は、ＳＫＴＸ１〜３ペプチドと類似のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマーとして用いることができる。特に、プライマーとしては5’側、3’側のノンコーディング領域に対応する塩基配列も有用に用いられる。
（ａ）配列番号４〜６に示される塩基配列を含む核酸、配列番号１３，１５、１７中のＳＫＴＸペプチド前駆体をコードする核酸（配列番号１３の70〜246位、配列番号１５の82〜267位、配列番号１７の2〜178位に対応する。）、又は配列番号１３，１５、１７に示される塩基配列に含まれる核酸であって、配列番号４〜６と読み枠をそろえた核酸。
（ｂ）（ａ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）配列番号１〜３に示されたＳＫＴＸ成熟体ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号１４，１６，１８に示されたＳＫＴＸ前駆体ペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。ここで、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換・挿入された配列をいう。または、配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列をいう。
（ｆ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
これらの核酸を含む発現ベクターを用い、形質転換宿主でＳＫＴＸ１〜３ペプチド又はその類似ペプチドを単独又は融合組換え蛋白として発現させることができるが、その際に選択した宿主に応じて、成熟ペプチドに対応する塩基配列も、シグナル配列を含む前駆体ペプチドに対応する塩基配列も利用可能である。
そして、これら塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸は、ＳＫＴＸ１〜３ペプチドと類似のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマーとして用いることができる。特に、プライマーとしては5’側、3’側のノンコーディング領域に対応する塩基配列も有用に用いられる。
本発明のペプチドは、化学的に合成することもできるが、遺伝子組換え技術を用い形質転換宿主から組換えペプチドとして取得することができる。その際に、用いられる宿主・ベクター系としては、大腸菌、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を宿主とする通常の宿主・ベクター系はいずれも用いることができる。例えば、大腸菌宿主を用いて大量に生産可能であるが、特にコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いることで、さらに大量生産が可能となる。また、融合蛋白として取得することができ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GE Healthcare)として発現させれば、高い効率で立体構造が正確に形成されたペプチドを大量に取得することができる。その際には、発現させようとする宿主により、成熟体ペプチドをコードするDNAでも、シグナル配列を含むDNAでも適宜用いることができる。
また、有害昆虫に対して、本発明のペプチドを適用する際には、本発明のペプチドをコードする核酸を組み込んだバキュロウイルス由来ベクターをそのまま用いることで、昆虫体内で本発明のペプチドを発現させて殺虫効果を発揮することが期待できる。その場合、対象害虫により致死量に見合う量を適宜発現させる。例えば、昆虫の場合、通常200〜20000PIBs/g (Polyhedrin Inclusion Bodies/g)の量を用いる。その他の方法として、本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターを植物体に遺伝子導入し、植物体でペプチドを発現させて、これを有害昆虫が摂食することで殺虫効果を発揮することも期待できる。
また、有害昆虫に対して、本発明のペプチドを適用する際には、本発明のペプチドをコードする核酸を組み込んだバキュロウイルス由来ベクターをそのまま用いることで、昆虫体内で本発明のペプチドを発現させて殺虫効果を発揮することが期待できる。その場合、対象害虫により致死量に見合う量を適宜発現させる。例えば、昆虫の場合、通常200〜20000PIBs/g (Polyhedrin Inclusion Bodies/g)の量を用いる。その他の方法として、本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターを植物体に遺伝子導入し、植物体でペプチドを発現させて、これを有害昆虫が摂食することで殺虫効果を発揮することも期待できる。
本発明を殺虫剤として用いる場合に、精製ペプチド、未精製ペプチド、又は複数種の混合ペプチドとして用いてもよく、さらに他の公知の殺虫剤と併用してもよい。その場合は、エタノールなどを含む通常の水性溶媒に、適量溶解させて（例えば0.00001〜10mg／ml）、散布又は塗布してもよいが、農園芸用毒餌剤の有効成分として、通常の可食性担体と共に用いることができる。その際の可食性担体としては、澱粉類、穀類が典型的であるが、さらに誘引性の砂糖など糖類、油脂類、動物性粉末などを混合することが好ましい。
本発明の殺虫剤は、昆虫、ダニ、ナメクジ等が対象となる。
本発明の殺虫剤は、昆虫、ダニ、ナメクジ等が対象となる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、特に記載のない限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、Molecular Cloning 2nd edition. Cold Spring Harvor Laboratory Press, Cold Spring Harvor, NY. (1989)に記載の方法に従った。
また、特に記載のない限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、Molecular Cloning 2nd edition. Cold Spring Harvor Laboratory Press, Cold Spring Harvor, NY. (1989)に記載の方法に従った。
（実施例１）キタウロコアリ由来生理活性ペプチドSKTX1をコードするcDNAの単離
（１−１）キタウロコアリ由来、生理活性ペプチドに共通する合成プライマーの製造
公知のトビキバハリアリ(Myrmecia pilosula)由来の生理活性ペプチドPilosulin及びコモリグモの一種(Oxyopes kitabensis)由来の生理活性ペプチドOxyopininsのアミノ酸配列を比較した。この配列の中で相同性の高く、シグナルペプチドの作用部位に近いアミノ酸配列に対応する塩基配列をプライマーPilosulin/Oxyopinin (5’-ACYTTNGGIAGIACYTT-3’)（配列番号９）として合成した。
（１−１）キタウロコアリ由来、生理活性ペプチドに共通する合成プライマーの製造
公知のトビキバハリアリ(Myrmecia pilosula)由来の生理活性ペプチドPilosulin及びコモリグモの一種(Oxyopes kitabensis)由来の生理活性ペプチドOxyopininsのアミノ酸配列を比較した。この配列の中で相同性の高く、シグナルペプチドの作用部位に近いアミノ酸配列に対応する塩基配列をプライマーPilosulin/Oxyopinin (5’-ACYTTNGGIAGIACYTT-3’)（配列番号９）として合成した。
（１−２）RNAの単離
キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)よりTRIZOL LS溶液（GIBCO BRL）を用いて、その使用方法に従いtotal RNAを抽出した。このtotal RNAから、Oligotex-dT30 (Super)（タカラバイオ株式会社）を用い、その使用方法に従って、poly A+ RNAを精製した。
キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)よりTRIZOL LS溶液（GIBCO BRL）を用いて、その使用方法に従いtotal RNAを抽出した。このtotal RNAから、Oligotex-dT30 (Super)（タカラバイオ株式会社）を用い、その使用方法に従って、poly A+ RNAを精製した。
（１−３）cDNAライブラリーの構築
こうして得られたpoly A+ RNAを鋳型としてcDNA合成キット(Stratagene)を用いて、２本鎖化したcDNAの混合物を得た。これにEcoR Iアダプター（タカラバイオ株式会社）を付加してポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Xho Iで制限酵素処理後、0.8〜2kbのDNA断片を抽出した。こうして得られたDNA断片を、pSD64TRベクター(Nucleic Acids Res., 12: 7057 (1984) 及びArch. Biochem. Biophys., 428(2): 170-178 (2004))のEcoR I, Xho Iサイトに挿入した。これをcDNAライブラリーとして以降、使用した。
こうして得られたpoly A+ RNAを鋳型としてcDNA合成キット(Stratagene)を用いて、２本鎖化したcDNAの混合物を得た。これにEcoR Iアダプター（タカラバイオ株式会社）を付加してポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Xho Iで制限酵素処理後、0.8〜2kbのDNA断片を抽出した。こうして得られたDNA断片を、pSD64TRベクター(Nucleic Acids Res., 12: 7057 (1984) 及びArch. Biochem. Biophys., 428(2): 170-178 (2004))のEcoR I, Xho Iサイトに挿入した。これをcDNAライブラリーとして以降、使用した。
(１−４)ＳＫＴＸ１〜３ cDNAの単離
前記（１−１）で得たcDNAライブラリーを鋳型としたPCR反応によって、プライマー
Pilosulin/Oxyopininとプライマー SDA(5’-TTATGTAGCTTAGAGACT-3’)（配列番号１０）を用いてDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを、クローニングベクターpCR2.1 (invitrogen)を用い、サブクローニングした。部分長cDNAの塩基配列を決定し、公知のcDNAの塩基配列と比較した後、新規のペプチドをコードしているものを選択した。新規ペプチドの全長cDNAを単離するために、新規ペプチドの部分長cDNAの塩基配列の一部からプライマーconoR (5’-TTAAAACAGGTCATAGCG-3’)（配列番号１１）を設計し、当該プライマーとベクタープライマー SP6 (5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’)（配列番号１２）を用いて再度同じcDNAライブラリーを鋳型としたPCRを行った。全長cDNAを取得後、全塩基配列を決定し、このクローンをSKTX1、SKTX2、SKTX3と命名した。
DNAの塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)とSP６プライマーを用いて反応し、蛍光自動シークエンサーABI Sequencer377（Applied Biosystems）で解析した。
以上のようにして単離、配列決定したSKTX1 cDNAの塩基配列及び塩基配列から推測されるアミノ酸配列を図１に示す。（SKTX1は、配列番号１３，１４及び１，４に対応。SKTX2は、配列番号１５，１６及び２，５に対応。SKTX3は、配列番号１７，１８及び３，６に対応。）
ＳＫＴＸ１〜３がコードする成熟体ペプチド（図２）は、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0)による相同性の算出法で、クモの神経毒CcoTX（非特許文献５），HNTX（非特許文献６），HWTX（非特許文献７），TLTX（非特許文献８），イモ貝のコノトキシン（非特許文献９）と相同性を示したが、その相同性はシステイン残基に限られており、成熟体ペプチドのアミノ酸配列レベルで３０％〜５０％という低い相同性しか示さない新しいタイプの神経毒ペプチドであることが判明した（図３）。
前記（１−１）で得たcDNAライブラリーを鋳型としたPCR反応によって、プライマー
Pilosulin/Oxyopininとプライマー SDA(5’-TTATGTAGCTTAGAGACT-3’)（配列番号１０）を用いてDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを、クローニングベクターpCR2.1 (invitrogen)を用い、サブクローニングした。部分長cDNAの塩基配列を決定し、公知のcDNAの塩基配列と比較した後、新規のペプチドをコードしているものを選択した。新規ペプチドの全長cDNAを単離するために、新規ペプチドの部分長cDNAの塩基配列の一部からプライマーconoR (5’-TTAAAACAGGTCATAGCG-3’)（配列番号１１）を設計し、当該プライマーとベクタープライマー SP6 (5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’)（配列番号１２）を用いて再度同じcDNAライブラリーを鋳型としたPCRを行った。全長cDNAを取得後、全塩基配列を決定し、このクローンをSKTX1、SKTX2、SKTX3と命名した。
DNAの塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)とSP６プライマーを用いて反応し、蛍光自動シークエンサーABI Sequencer377（Applied Biosystems）で解析した。
以上のようにして単離、配列決定したSKTX1 cDNAの塩基配列及び塩基配列から推測されるアミノ酸配列を図１に示す。（SKTX1は、配列番号１３，１４及び１，４に対応。SKTX2は、配列番号１５，１６及び２，５に対応。SKTX3は、配列番号１７，１８及び３，６に対応。）
ＳＫＴＸ１〜３がコードする成熟体ペプチド（図２）は、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0)による相同性の算出法で、クモの神経毒CcoTX（非特許文献５），HNTX（非特許文献６），HWTX（非特許文献７），TLTX（非特許文献８），イモ貝のコノトキシン（非特許文献９）と相同性を示したが、その相同性はシステイン残基に限られており、成熟体ペプチドのアミノ酸配列レベルで３０％〜５０％という低い相同性しか示さない新しいタイプの神経毒ペプチドであることが判明した（図３）。
（実施例２）組換えＳＫＴＸ１〜３ペプチドの発現・精製
配列番号１〜３で示したアミノ酸配列からなるＳＫＴＸ１〜３ペプチドを、大腸菌のコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いる手法、及びグルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)とする手法の２種類の方法を用いて大腸菌Rossetta Gami2（メルク）で発現させた。いずれの場合も、融合タンパク質を精製したのち、プロテアーゼPreScissionTM (GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いて処理し、SepPakC18により0.1%トリフルオロ酢酸を含む40%のアセトニトリルで溶出し組換えSKTX1ペプチドを精製した。これを凍結乾燥後、蒸留水に溶解させた。
配列番号１〜３で示したアミノ酸配列からなるＳＫＴＸ１〜３ペプチドを、大腸菌のコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いる手法、及びグルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)とする手法の２種類の方法を用いて大腸菌Rossetta Gami2（メルク）で発現させた。いずれの場合も、融合タンパク質を精製したのち、プロテアーゼPreScissionTM (GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いて処理し、SepPakC18により0.1%トリフルオロ酢酸を含む40%のアセトニトリルで溶出し組換えSKTX1ペプチドを精製した。これを凍結乾燥後、蒸留水に溶解させた。
（２−１）ＳＫＴＸ１〜３ペプチドを大腸菌のコールド・ショックシステムを用いて発現させた場合
ＳＫＴＸ１〜３ cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をpCOLD II（タカラバイオ株式会社）ヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列とともに、BamHIサイトに接続し、ｐCOLD-ＳＫＴＸ１〜３ を作成した。これを大腸菌、BL21に大腸菌のシャペロニン配列をもつｐGro7（タカラバイオ株式会社）とともに共形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB (0.02%アラビノースを含む)培地中で３７度、３時間培養した後、１５度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しNi-NTA（Qiagen）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTM を用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得した。プロテアーゼ処理はTagzyme (Qiagen)を用いて３７度で１時間の反応を行っても同じ余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得することができた。
ＳＫＴＸ１〜３ cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をpCOLD II（タカラバイオ株式会社）ヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列とともに、BamHIサイトに接続し、ｐCOLD-ＳＫＴＸ１〜３ を作成した。これを大腸菌、BL21に大腸菌のシャペロニン配列をもつｐGro7（タカラバイオ株式会社）とともに共形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB (0.02%アラビノースを含む)培地中で３７度、３時間培養した後、１５度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しNi-NTA（Qiagen）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTM を用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得した。プロテアーゼ処理はTagzyme (Qiagen)を用いて３７度で１時間の反応を行っても同じ余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得することができた。
（２−２）ＳＫＴＸ１〜３ペプチドを大腸菌の発現ベクターpGEXを用いて発現させた場合
ＳＫＴＸ１〜３ cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をPreScissionTMの認識配列とともに、pGEX-2T（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）のBamH IサイトとEcoR Iサイトの間に接続し、ｐGEX-SKTX1を作成した。これを大腸菌Rossetta Gami2に形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB培地中で３７度、３時間培養した後、２０度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しグルタチオンセファロース（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にグルタチオンSトランスフェラーゼとPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないＳＫＴＸ１〜３ペプチドを取得した。
ＳＫＴＸ１〜３ cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をPreScissionTMの認識配列とともに、pGEX-2T（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）のBamH IサイトとEcoR Iサイトの間に接続し、ｐGEX-SKTX1を作成した。これを大腸菌Rossetta Gami2に形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB培地中で３７度、３時間培養した後、２０度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しグルタチオンセファロース（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にグルタチオンSトランスフェラーゼとPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないＳＫＴＸ１〜３ペプチドを取得した。
（実施例３）ＳＫＴＸ１〜３ペプチドのナトリウムチャネル・阻害活性
従来のアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二本差し膜電位固定法は、例えば「Ion Channels. Edited by: Bernardo Rudy, Methods in Enzymology Volume 207, Pages 3-917 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、以下の方法に従い、イオンチャネルの活性を電気生理学的解析にするという方法である（図４）。
（１）イオンチャネルcRNAを合成し、
（２）そのcRNAを卵母細胞へ注入しチャネル分子を細胞膜表面に発現させて、
（３）２日〜４日後に、２本の微小電極を卵母細胞に差し込み、膜内外で電圧を変化させることによって誘起されるイオンの流出もしくは流入を、電流量の変化に置き換えて測定する。
本実施例では、上記方法の（１）の段階でのイオンチャネルcRNAとしてショウジョウバエ・ナトリウムチャネルαサブユニットPara及びβサブユニットTipEを使用した。また、（３）の段階で、前記（実施例２）で取得したＳＫＴＸ１〜３ペプチドを添加し、５分後にイオンチャネルの活性を測定した。
この結果とＳＫＴＸ１〜３ペプチド無添加の状態のイオンチャネルの活性とを比較した。その結果、ＳＫＴＸ１〜３ペプチドは0.1〜10μMの範囲で濃度依存的に効果を示し、10μM以上でショウジョウバエのナトリウムチャネルの活性をほぼ完全に阻害した（図４A，５A，６A）。また、この時ナトリウムチャネルの電位依存性を変化させることはなかった（図４B, ５B，６B）。
従来のアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二本差し膜電位固定法は、例えば「Ion Channels. Edited by: Bernardo Rudy, Methods in Enzymology Volume 207, Pages 3-917 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、以下の方法に従い、イオンチャネルの活性を電気生理学的解析にするという方法である（図４）。
（１）イオンチャネルcRNAを合成し、
（２）そのcRNAを卵母細胞へ注入しチャネル分子を細胞膜表面に発現させて、
（３）２日〜４日後に、２本の微小電極を卵母細胞に差し込み、膜内外で電圧を変化させることによって誘起されるイオンの流出もしくは流入を、電流量の変化に置き換えて測定する。
本実施例では、上記方法の（１）の段階でのイオンチャネルcRNAとしてショウジョウバエ・ナトリウムチャネルαサブユニットPara及びβサブユニットTipEを使用した。また、（３）の段階で、前記（実施例２）で取得したＳＫＴＸ１〜３ペプチドを添加し、５分後にイオンチャネルの活性を測定した。
この結果とＳＫＴＸ１〜３ペプチド無添加の状態のイオンチャネルの活性とを比較した。その結果、ＳＫＴＸ１〜３ペプチドは0.1〜10μMの範囲で濃度依存的に効果を示し、10μM以上でショウジョウバエのナトリウムチャネルの活性をほぼ完全に阻害した（図４A，５A，６A）。また、この時ナトリウムチャネルの電位依存性を変化させることはなかった（図４B, ５B，６B）。
（実施例４）ＳＫＴＸ１〜３ペプチドのフタフシコオロギに対する作用
従来のフタフシコオロギを用いた殺虫活性は、「Scorpion toxins affecting insects: Loret. E.P., Methods in Neuroscience Volume 8, Pages 381-395 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、
（１）フタフシコオロギ（平均 0.2g）の中肢と後肢の間に、10 μl用のハミルトンシリンジを用いて、5 μlのPBSに溶解させた80μMペプチド溶液を注入し、
（２）昆虫の変化を５，１５，６０分, １８時間後に観察する
という方法である。
実施例では、この方法に従い本発明のペプチドの殺虫活性を評価した結果、SKTX1では５０％のコオロギで麻痺作用が起き、その麻痺が３０分間以上にわたって持続した。SKTX2では、６０％のコオロギで麻痺作用が起き、その麻痺が１８時間以上にわたって持続した。
したがって、本発明のペプチドの殺虫活性が実証された。
従来のフタフシコオロギを用いた殺虫活性は、「Scorpion toxins affecting insects: Loret. E.P., Methods in Neuroscience Volume 8, Pages 381-395 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、
（１）フタフシコオロギ（平均 0.2g）の中肢と後肢の間に、10 μl用のハミルトンシリンジを用いて、5 μlのPBSに溶解させた80μMペプチド溶液を注入し、
（２）昆虫の変化を５，１５，６０分, １８時間後に観察する
という方法である。
実施例では、この方法に従い本発明のペプチドの殺虫活性を評価した結果、SKTX1では５０％のコオロギで麻痺作用が起き、その麻痺が３０分間以上にわたって持続した。SKTX2では、６０％のコオロギで麻痺作用が起き、その麻痺が１８時間以上にわたって持続した。
したがって、本発明のペプチドの殺虫活性が実証された。
Claims (10)
- ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含む単離されたペプチド；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。 - 前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
- ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸であって、以下の（ａ）〜（ｇ）の何れかの塩基配列を含む核酸；
（ａ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、
（ｂ）（ａ）の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）（ｄ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）（ｄ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。） - 請求項３に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項４に記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主。
- 請求項５に記載の形質転換宿主を用いることを特徴とする、ナトリウムチャネル阻害活性を有する組換えペプチドの製造方法。
- 請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含有するナトリウムチャネル阻害剤。
- 請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含有する殺虫剤。
- 配列番号１３、１５又は１７に示された塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸。
- 請求項９に記載の核酸からなる、ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマー。
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| JPN6013031057; Ｔｏｘｉｃｏｎ ｖｏｌ．３９ ｎｏ．１, 2001, ｐｐ．４３-６０ * |
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