JP2009254547A - Bone regeneration material and its manufacturing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムを用いて生体親和性、細胞接着性に優れた骨再生材料およびその製造方法の技術分野に属するものである。 The present invention belongs to the technical field of a bone regeneration material excellent in biocompatibility and cell adhesiveness using calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite and a method for producing the same.
今日、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下「ＨＡ」と略記する）の前駆体である第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下「ＯＣＰ」と略記する）は、優れた骨伝導能を有すること（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性を有すること（非特許文献２）、そして用量依存的に骨芽細胞の分化を促進すること（非特許文献３）が知られている。そしてＯＣＰとコラーゲンとの複合体は、形態付与性を備えた骨再生材料（人工骨材）であることが知られている（例えば特許文献１参照）。また、ＨＡの前駆体である非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ：以下「ＡＣＰ」と略記する）についてもＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（非特許文献４参照）。さらにまた、同じくＨＡの前駆体である第二燐酸カルシウム（第２燐酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ４：以下「ＤＣＰＡ」と略記する）あるいは第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：以下「ＤＣＰＤ」と略記する））についてもＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（特許文献２及び非特許文献５参照）。
ところが前記ＯＣＰのコラーゲンとの複合体についてみたときに、前記特許文献１に記載の製造方法では、適切な強度を有し、かつ細胞の増殖に適した平均細孔容積の多孔質細孔を有するように製造するのは困難であり、実用化するにはさらに細胞接着性を高めるための検討が必要であり、ここに本発明が解決せんとする課題がある。 However, when looking at the complex of OCP with collagen, the production method described in Patent Document 1 has porous pores having an appropriate strength and an average pore volume suitable for cell growth. Thus, it is difficult to manufacture the device, and in order to put it to practical use, it is necessary to study to further improve cell adhesion, and there is a problem to be solved by the present invention.
本発明は、上記の如き実情に鑑みこれらの課題を解決することを目的として創作されたものであって、請求項１の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料である。
請求項２の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料である。
請求項３の発明は、加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項１または２記載の骨再生材料である。
請求項４の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１記載の骨再生材料である。
請求項５の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法である。
請求項６の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成型体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法である。
請求項７の発明は、加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項４または５記載の骨再生材料の製造方法である。
請求項８の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１記載の骨再生材料の製造方法である。
The present invention has been made in view of the above circumstances and has been created for the purpose of solving these problems. The invention of claim 1 includes calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite and a water-soluble polymer. Or a complex comprising at least one compound selected from among polysaccharides, wherein the complex is changed from 4.1 × 10 −3 MPa to 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 A bone regeneration material characterized in that it is a molded body formed by pressurizing in a range of pressure to form pores having a diameter easily entering cells between × 10 −1 MPa.
The invention of claim 2 is a complex comprising calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite and at least one compound selected from water-soluble polymers or polysaccharides, Pores having an average pore volume in the range of 6.160 cm 3 / g to 4.160 cm 3 / g, forming pores having a diameter that allows easy entry of cells between 4.747 cm 3 / g and 5.820 cm 3 / g A bone regeneration material characterized in that it is a molded body formed by pressing so as to have pores.
A third aspect of the present invention is the bone regeneration material according to the first or second aspect, wherein the pressurization is performed by centrifugation.
The invention of claim 4 is characterized in that the calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite is at least one compound of eighth calcium phosphate, amorphous calcium phosphate and dicalcium phosphate. 3. The bone regeneration material according to any one of 3 above.
The invention of claim 5 comprises a complex comprising calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite and at least one compound selected from water-soluble polymers or polysaccharides. .1 × 10 −3 MPa to 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 × 10 −1 MPa in a range of pressure to form pores with diameters that allow easy entry of cells. A method for producing a bone regeneration material characterized in that a body is obtained.
The invention of claim 6 comprises a complex comprising calcium phosphate, which is a precursor of hydroxyapatite, and at least one compound selected from water-soluble polymers or polysaccharides. Porous fine particles having an average pore volume in the range of 6.160 cm 3 / g to an average pore volume that forms pores having a diameter that easily enters cells between .747 cm 3 / g and 5.820 cm 3 / g A method for producing a bone regeneration material, characterized in that a molded body is obtained by pressing so as to have a hole.
The invention according to claim 7 is the method for producing a bone regeneration material according to claim 4 or 5, wherein the pressurization is performed by centrifugation.
The invention of claim 8 is characterized in that the calcium phosphate which is a precursor of hydroxyapatite is at least one compound of eighth calcium phosphate, amorphous calcium phosphate and dicalcium phosphate. 4. The method for producing a bone regeneration material according to any one of 3 above.
請求項１、２、５または６の発明とすることにより、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムの水溶性高分子または多糖類との複合体について、操作性、形態付与性に優れながら、細胞接着性に優れた成形体になる骨再生材料を簡単に提供することができる。
請求項３または７の発明とすることにより、遠心分離という簡単な操作で形態付与性を付与した成形体ができることになる。
請求項４または８の発明とすることにより、入手が容易なＨＡの前駆体である燐酸カルシウムを用いて細胞接着性に優れた成形体になる骨再生材料を提供することができる。
According to the invention of claim 1, 2, 5, or 6, the complex of calcium phosphate, which is a precursor of hydroxyapatite, with a water-soluble polymer or polysaccharide is excellent in operability and form-imparting properties. It is possible to easily provide a bone regeneration material that becomes a molded article having excellent adhesiveness.
By setting it as invention of Claim 3 or 7, the molded object which provided the form provision property by simple operation called centrifugation will be made.
By using the invention according to claim 4 or 8, a bone regeneration material that becomes a molded article having excellent cell adhesion can be provided using calcium phosphate, which is an HA precursor that is easily available.
本発明は、ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムについて、アルギン酸やコラーゲンに代表される水溶性高分子、多糖類の中から選択される少なくとも１種類の化合物と複合体を生成し、該複合体について加圧することで操作性、形態付与性に優れた骨再生材料を生成できるものであり、この場合に、加圧する際の圧力は、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力から４．１×１０−３ＭＰａの範囲である。圧力が４．１×１０−３ＭＰａよりも小さいと、成形体はボソボソ感が強く脆いものになって形態付与性が乏しくて実用性に欠ける。また３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力を越えると成形体が密になりすぎて細孔の径が小さくなって細胞が入りづらく細胞接着性が低下する。 The present invention produces a complex with at least one compound selected from the group consisting of a water-soluble polymer represented by alginic acid and collagen, and a polysaccharide for calcium phosphate, which is a precursor of HA. By applying pressure, a bone regeneration material excellent in operability and form-imparting property can be generated. In this case, the pressure at the time of pressurization is 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 × 10 −1. The pressure is in the range of 4.1 × 10 −3 MPa from the pressure that forms pores having a diameter that is easy for cells to enter. When the pressure is less than 4.1 × 10 −3 MPa, the molded body has a strong and harsh feeling and is brittle and lacks in form-providing properties and lacks practicality. Moreover, when the pressure which forms the pore of the diameter which is easy to enter the cell between 3.7 * 10 <-2 > MPa and 1.0 * 10 < -1 > MPa is exceeded, a molded object will become too dense and the diameter of a pore will be sufficient. Becomes smaller and it becomes difficult for cells to enter, and cell adhesion decreases.
一方、前記複合材は、前記加圧することで多孔質細孔を有した成形体になるが、この場合、多孔質細孔は、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲であり、６．１６０ｃｍ３／ｇよりも大きいと、成形体はボソボソ感が強く脆いものになって形態付与性が乏しくて実用性に欠け、また４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積よりも小さいと成形体が密になりすぎて細孔の径が小さくなって細胞が入りづらく細胞接着性が低下する。 On the other hand, the composite material becomes a molded body having porous pores by pressurization. In this case, the porous pores are between 4.747 cm 3 / g and 5.820 cm 3 / g. there is a range of 6.160cm 3 / g average pore volume of cells to form pores of incoming easily diameter and greater than 6.160cm 3 / g, molded bodies in brittle strong Bosoboso feeling It is less than the average pore volume that forms pores with diameters that easily enter cells between 4.747 cm 3 / g and 5.820 cm 3 / g. The compact becomes too dense and the pore diameter becomes small, making it difficult for cells to enter and cell adhesion.
これらにおいて加圧手段としては遠心分離機やプレス機等の汎用される適宜の加圧手段を採用できるが、遠心分離機による場合、内部に至るまで均一的な加圧ができることになって好適である。
また、ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムは、前述したＯＣＰ、ＡＣＰ、ＤＣＰＡあるいはＤＣＰＤの化合物に代表され、これらＨＡの前駆体である燐酸カルシウムから選択される少なくとも１種類の化合物と水溶性高分子または多糖類とを反応させて複合体を生成することになるが、水溶性高分子としては、例えば、コラーゲン、ポリエチレングリコール、ポリリジン及びポリグルタミン酸等があり、また多糖類としては、例えばアルギン酸、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等がある。そしてこれらから選択された少なくとも１種類の化合物と前述したＨＡの前駆体である燐酸カルシウムとの複合体を形成することになるが、取り扱い易いという観点から、水溶性高分子または多糖類は、ナトリウム塩、またはカリウム塩として反応に用いることが好ましい。
好適な複合体の生成方法は、主に、水溶性高分子または多糖類の水溶液に、カルシウム溶液及びリン酸溶液を添加し、水溶性高分子または多糖類にＨＡの前駆体である燐酸カルシウムを析出させる方法が挙げられる。ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムの析出条件は、当業者により適宜設定できるものであり、例えば、ＯＣＰの析出条件は、Ｙ． Ｈｏｎｄａ ｅｔ． ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ Ｂ， ＤＯＰ １０．１００２／ｊｂｍｂ， ｐａｇｅ ２８１−２８９を参考にすることができる。尚、上述の加圧が遠心分離である場合は、この方法で生成された複合体の脱水行程も兼ねることができる。
In these, as the pressurizing means, a suitable general pressurizing means such as a centrifuge or a press can be adopted. However, in the case of using a centrifuge, it is preferable because uniform pressurization can be achieved up to the inside. is there.
In addition, calcium phosphate which is a precursor of HA is represented by the above-mentioned OCP, ACP, DCPA or DCPD compound, and at least one compound selected from calcium phosphate which is a precursor of HA and a water-soluble polymer. Alternatively, a complex is produced by reacting with a polysaccharide. Examples of water-soluble polymers include collagen, polyethylene glycol, polylysine, and polyglutamic acid. Examples of polysaccharides include alginic acid and hyaluron. Acid and chondroitin sulfate. Then, a complex of at least one compound selected from these and calcium phosphate which is the precursor of HA described above is formed. From the viewpoint of easy handling, the water-soluble polymer or polysaccharide is sodium. It is preferable to use for reaction as a salt or potassium salt.
A preferred method for producing a complex is mainly to add a calcium solution and a phosphate solution to an aqueous solution of a water-soluble polymer or polysaccharide, and to add calcium phosphate, which is a precursor of HA, to the water-soluble polymer or polysaccharide. The method of making it precipitate is mentioned. Precipitation conditions for calcium phosphate, which is a precursor of HA, can be set as appropriate by those skilled in the art. Honda et. al. Journal of Biomedical Materials Research Part B, DOP 10.1002 / jbmb, page 281-289 can be referred to. In addition, when the above-mentioned pressurization is centrifugation, it can also serve as a dehydration process of the complex produced by this method.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定して解釈してはならない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. However, the present invention should not be interpreted as being limited to these examples.
＜実施例１＞
アルギン酸ナトリウム（０．２ｗｔ％）のリン酸緩衝液溶液を調製した。次いで、この溶液を７０℃に保ちつつ、この溶液に０．０８ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液を一定速度で滴下した。その後、析出したスラリーを純水で懸濁した後、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で４回遠心分離することにより、スラリーを精製した。この精製物に純水を加えて再度懸濁させた。この懸濁物を、１，０００ｒｐｍ、５分の条件（４．１×１０−３ＭＰａに相当）で遠心分離（微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１Ｓ、遠心半径：８．１ｃｍ、株式会社トミー精工製）して加圧成形して成形体を得た。そして、この成形体を直径４ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの専用の型枠で型抜き成型した。この成型物を約１２時間凍結乾燥（ＥＹＥＬＡ，ＦＤＵ−１２００型）した。この凍結乾燥物を、１２０℃、２時間で、乾熱滅菌することにより、ＯＣＰ／アルギン酸複合体の目的とする成形体を製造した。
<Example 1>
A phosphate buffer solution of sodium alginate (0.2 wt%) was prepared. Next, while maintaining the solution at 70 ° C., 0.08 mol / L calcium acetate aqueous solution was dropped into the solution at a constant rate. Then, after suspending the deposited slurry with pure water, the slurry was purified by centrifuging four times under conditions of 3,000 rpm and 5 minutes. Pure water was added to the purified product and suspended again. This suspension was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes (corresponding to 4.1 × 10 −3 MPa) (micro high-speed cooling centrifuge MX-301S, centrifugal radius: 8.1 cm, Tommy Seiko Co., Ltd.) To obtain a molded body. And this molded object was die-molded and molded with a dedicated mold having a diameter of 4 mm and a thickness of 0.5 mm. This molded product was freeze-dried (EYELA, FDU-1200 type) for about 12 hours. The freeze-dried product was sterilized by dry heat at 120 ° C. for 2 hours to produce a desired molded product of the OCP / alginate complex.
＜実施例２＞
遠心分離の条件を、１，０００ｒｐｍから３，０００ｒｐｍ（３．７×１０−２ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
<Example 2>
An OCP / alginic acid composite molded body was produced in the same manner as in Example 1 except that the centrifugation conditions were changed from 1,000 rpm to 3,000 rpm (equivalent to 3.7 × 10 −2 MPa).
＜比較例１＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから５，０００ｒｐｍ（１．０×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
<Comparative Example 1>
The OCP / alginate composite molded body was the same as in Example 1 except that the centrifugal separation conditions during pressure molding were changed from 1,000 rpm to 5,000 rpm (corresponding to 1.0 × 10 −1 MPa). Manufactured.
＜比較例２＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍ（４．１×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
<Comparative example 2>
The OCP / alginate composite molded body was the same as in Example 1 except that the centrifugal separation conditions during pressure molding were changed from 1,000 rpm to 10,000 rpm (corresponding to 4.1 × 10 −1 MPa). Manufactured.
＜比較例３＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから１５，０００ｒｐｍ（９．２×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
<Comparative Example 3>
The OCP / alginate composite molded body was the same as in Example 1 except that the centrifugal separation conditions during pressure molding were changed from 1,000 rpm to 15,000 rpm (corresponding to 9.2 × 10 −1 MPa). Manufactured.
以上の実施例１並びに２、及び比較例１〜３の製造条件は、表１の通りとなる。以下、これらの実施例及び比較例を０．２系と称す。尚、実施例１並びに２、及び比較例１〜３で得られた成形体は、全てＯＣＰ／アルギン酸複合体であることを、ＦＴ−ＩＲ（ＦＲＥＥＸＡＣＴ−ＩＩ，ＨＯＲＩＢＡ）測定と、ＸＲＤ（ＭｉｎｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）測定により確認した。 The manufacturing conditions of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 3 are as shown in Table 1. Hereinafter, these Examples and Comparative Examples are referred to as 0.2 series. It should be noted that the molded products obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 3 were all OCP / alginic acid composites, FT-IR (FREEXACT-II, HORIBA) measurement, and XRD (MiniFlex, (Rigaku Corporation) confirmed by measurement.
＜実施例３＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は実施例１と同様に行った。
<Example 3>
The same operation as in Example 1 was conducted except that the concentration of sodium alginate was changed from 0.2 wt% to 0.4 wt%.
＜実施例４＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は実施例２と同様に行った。
<Example 4>
The same operation as in Example 2 was conducted except that the concentration of sodium alginate was changed from 0.2 wt% to 0.4 wt%.
＜比較例４＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例１と同様に行った。
<Comparative example 4>
The same operation as in Comparative Example 1 was conducted except that the concentration of sodium alginate was changed from 0.2 wt% to 0.4 wt%.
＜比較例５＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例２と同様に行った。
<Comparative Example 5>
The same operation as in Comparative Example 2 was conducted except that the concentration of sodium alginate was changed from 0.2 wt% to 0.4 wt%.
＜比較例６＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例３と同様に行った。
<Comparative Example 6>
The same procedure as in Comparative Example 3 was performed except that the concentration of sodium alginate was changed from 0.2 wt% to 0.4 wt%.
以上の実施例３並びに４、及び比較例４〜６の製造条件は、表２の通りとなる。以下、これらの実施例及び比較例を０．４系と称す。尚、実施例３並びに４、及び比較例４〜６で得られた成形体は、全てＯＣＰ／アルギン酸複合体であることを、ＦＴ−ＩＲ、（ＦＲＥＥＸＡＣＴ−ＩＩ，ＨＯＲＩＢＡ）測定と、ＸＲＤ（ＭｉＮｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）測定により確認した。 The production conditions of Examples 3 and 4 and Comparative Examples 4 to 6 are as shown in Table 2. Hereinafter, these Examples and Comparative Examples are referred to as 0.4 series. It should be noted that the molded products obtained in Examples 3 and 4 and Comparative Examples 4 to 6 were all OCP / alginic acid composites, FT-IR, (FREEXACT-II, HORIBA) measurement, and XRD (MiNiFlex). , Rigaku Corporation) confirmed by measurement.
＜実験例１：ＳＥＭ観察＞
各実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の断面の構造を評価した。具体的には、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を、技工用メスで切断した。この切断面の構造について、ＳＥＭ観察（ｅ−ＳＥＭ，株式会社マルトー）により評価した。
<Experimental example 1: SEM observation>
The cross-sectional structure of the OCP / alginic acid composite molded body of each example and comparative example was evaluated. Specifically, the OCP / alginic acid composite molded bodies of Example 2, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were cut with a scalpel. The structure of this cut surface was evaluated by SEM observation (e-SEM, Marto).
図１は、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の切断面のＳＥＭ画像（５００倍）である。高倍率の観察においては、明確な違いは確認できないが、実施例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成型体は、空隙のある部位と、密で空隙のない部位が確認された。一方、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成型体は、ある程度、空隙の分布が、均等になっていることが確認された。 FIG. 1 is an SEM image (500 times) of a cut surface of a molded body of the OCP / alginic acid composite of Example 2, Comparative Example 1 and Comparative Example 2. In the observation at high magnification, a clear difference could not be confirmed, but in the molded body of OCP / alginic acid composite of Example 2, a site with voids and a site with dense voids were confirmed. On the other hand, it was confirmed that the OCP / alginic acid composite moldings of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 had a uniform distribution of voids to some extent.
図２は、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の切断面のＳＥＭ画像（１００倍）である。実施例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体は、その構造が、密な部分と、疎な部分が混在したものであることが確認できた。一方、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体は、構造が全体的に密になっているのが確認できた。 FIG. 2 is a SEM image (100 times) of a cut surface of a molded body of the OCP / alginic acid composite of Example 2, Comparative Example 1 and Comparative Example 2. It was confirmed that the OCP / alginic acid composite molded body of Example 2 had a structure in which a dense portion and a sparse portion were mixed. On the other hand, it was confirmed that the OCP / alginic acid composite molded bodies of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were dense as a whole.
＜実験例２：細胞接着性の評価＞
各実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の細胞接着性を評価した。具体的には、２４ウェルの細胞非接着性プレートの各ウェルに、実施例１〜４及び比較例１〜６のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体をそれぞれ載置した。４．０×１０４ｃｅｌｌ／２００μＬに調製した骨芽細胞様細胞（マウス骨髄由来間質細胞株：ＳＴ−２）の細胞懸濁液（培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ使用）を、各ウェルに２００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で、１００ｒｐｍで６時間振盪させた後、３日間細胞培養を行った。そして、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（同仁化学株式会社）にて細胞数を計測し、複合体の成型体の細胞接着性を評価した。
<Experimental Example 2: Evaluation of cell adhesion>
The cell adhesion of the OCP / alginic acid composites of each Example and Comparative Example was evaluated. Specifically, the OCP / alginic acid composite shaped bodies of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 6 were placed in each well of a 24-well cell non-adhesive plate. A cell suspension of an osteoblast-like cell (mouse bone marrow-derived stromal cell line: ST-2) prepared to 4.0 × 10 4 cells / 200 μL (medium: Minimum Essential Medium, using Eagle) was added to each well. 200 μL each was seeded. After shaking at 100 rpm for 6 hours in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 , cell culture was performed for 3 days. Then, the number of cells was measured with cell counting kit-8 (Dojin Chemical Co., Ltd.), and the cell adhesion of the composite molded body was evaluated.
その結果を図３に示す。図３の結果によれば、細胞の接着性は、０．２系、０．４系ともに、実施例と比較例とから明らかなように、実施例２および４と比較例１および４とのあいだに差があることが認められ、これを加圧する際の圧力でみた場合には、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだに差があり、これは加圧する際の圧力が大きくなると、成形した成形体の細孔（空隙）が小さくなって密になり、この結果、細胞が入りづらくなって細胞の接着性が阻害されることによるものと推定される。このことは、細胞の入りやすい径の細孔を与えるための大きい方の加圧条件が３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにあり、この結果、加圧条件は、から４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧するものとなる。
るといえる。
The result is shown in FIG. According to the results shown in FIG. 3, the cell adhesiveness between Examples 2 and 4 and Comparative Examples 1 and 4 is clear for both 0.2 and 0.4 systems, as is apparent from the Examples and Comparative Examples. It is recognized that there is a difference between them, and when viewed at the pressure when pressurizing this, there is a difference between 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 × 10 −1 MPa, When the pressure during pressurization increases, the pores (voids) of the molded body become smaller and denser. As a result, it is estimated that cells are difficult to enter and cell adhesion is inhibited. The This is because the larger pressure condition for giving pores with a diameter that allows easy entry of cells is between 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 × 10 −1 MPa. The pressure condition is from 4.1 × 10 −3 MPa to 3.7 × 10 −2 MPa and 1.0 × 10 −1 MPa to form pores having diameters that allow easy entry of cells. Pressure is applied in the range.
It can be said.
＜実験例３：構造評価＞
実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の平均細孔容積を水銀圧入法（全自動細孔分布測定装置：ＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ ６０ ユアサアイオニクス株式会社製）により評価した。その結果を表３に示す。
<Experimental Example 3: Structural Evaluation>
The average pore volume of the OCP / alginate composite bodies of Examples and Comparative Examples was evaluated by a mercury intrusion method (fully automatic pore distribution measuring device: PoleMaster 60 Yuasa Ionics Co., Ltd.). The results are shown in Table 3.
表３の結果から、加圧して成形される多孔質細孔は、平均細孔容積として４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだに細胞が入りやすい径の細孔を形成するところがあり、ここから平均細孔容積が６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲までが形態安定性があって細胞の入りやすい多孔質細孔を形成するものであると言える。 The results in Table 3, the porous pores are formed by pressurizing the formation pores tends diameter contains the cells between the 4.747cm 3 / g and 5.820cm 3 / g average pore volume From this point, it can be said that the average pore volume up to the range of 6.160 cm 3 / g forms porous pores that are morphologically stable and easily enter cells.
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