JP2009209076A - 低比重リポ蛋白質受容体の発現制御方法及び発現増強剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】LDLRの発現を制御するための方法であって、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、LDLRの発現量を増加させる、発現制御方法。該発現制御方法においては、ZFP36ファミリーの発現抑制によって、LDLRのmRNAを安定化することで、LDLRの発現量を増加させることが可能である。
【選択図】図7
Description
この発現制御方法においては、ZFP36ファミリーの発現抑制によって、低比重リポ蛋白質受容体のmRNAを安定化することで、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることが可能である。
ZFP36ファミリーの発現抑制のためには、RNA干渉又はアンチセンス法を好適に採用することができる。
具体的には、配列番号1〜6記載の塩基配列を有する低分子干渉性RNAを標的細胞内に導入し、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、前記標的細胞における低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることができる。
この医薬組成物を適用可能な高脂血症関連疾患としては、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌が挙げられる。
さらに、本発明は、低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤製造のためZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNA、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターの使用をも提供するものである。
1.LDLR mRNAに結合するシスエレメント結合因子の単離同定
これまでにLDLR mRNAの3’非翻訳領域(UTR)内の特定領域が、mRNAの安定性制御に関与していることが報告されている(”Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins.”Nature Medicine, 2004, Vol.10, No.12, p.1344-1351・Fig.2f参照)。そこで、この領域に結合し、LDL mRNAの安定性制御に関与しているシスエレメント結合因子を単離することを目的として、当該領域部分をベイトとした免疫沈降を行い、これに結合したタンパク質の同定を行った。
LDL mRNAをin vitro translationにより合成した。5’末端にT7 promoter 配列を持つプライマーを用いてPCRによりLDLR mRNA (配列番号10)の2677-3585bp領域の増幅を行い、MEGAscript T7 キット (Cat.No.1333, Ambion)を用い、添付プロトコールに従ってRNAの合成を行った。合成されたLDL mRNAの3’末端にFlag-hydrazideを共有結合させる反応を行い、LDLR mRNAの3’末端をFlag標識した。標識mRNAをQiagen社のRNeasy Mini Kit(Cat.No.74106)を用いて精製した。なお、mRNAのFlag標識は、公知の手法(”Programmable ribozymes for mischarging tRNA with nonnatural amino acids and their applications to translation.” Methods, 2005, Vol,36, No.3, p.239-244参照)に従って行った。
精製後のFlag標識LDLR mRNA 10pmolを抗Flag抗体ビーズ(Cat.No.F2426, Sigma)と混合、4℃で1時間反応を行った。その後、10%FBS 含有DMEM培地で培養した293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgを加えさらに、4℃で1時間反応を行った。非結合タンパク質を洗い流した後、RNA及びRNA結合タンパク質をFlagペプチドで溶出させた。溶出させて得た試料をリジルエンドペプチダーゼ処理し、公知の手法(”A direct nanoflowliquid chromatography-tandem mass spectrometry system for interaction proteomics.” Analytical Chemistry, 2002, Vol.74, No.18, p.4725-4733参照)に従って解析を行った。マススペクトロメーターには、LC-MS/MS(QSTAR XL, アプライドバイオシステム)を用いた。
LC-MS/MSにより「ZFP36L1」及び「ZFP36L2」が同定された。ZFP36ファミリーは、AREに結合してmRNAを不安定化し、分解を促進する機能を有することが報告されている(”Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease.” Molecular Cell Biology, 2003, Vol.23, No.11, p.3798-812参照)。
2.ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNA 3’UTRに対する特異性の検討
ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNA 3’UTRに対する特異性を検討するため、Actin-mRNAに加えて、Histone mRNA(GenBank Accession No.BC001629)とHNRNPA2B1(GenBank Accession No.NM_002137)の3’UTRについても同様にベイトを合成し、ZFP36L1及びZFP36L2の結合能の評価を行った。
実施例1中「1−(1).LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従い、Histone mRNA(配列番号12)の39-549bp領域とHNRNPA2B1(hnA/B) mRNA(配列番号13)の39-549bp領域についても、Flag標識mRNAを調製した。hnA/B mRNAの3’UTRには、Actinと同様に、少なくとも一箇所の「AUUUAペンタマー」が存在している。他方、Histone mRNAの3’UTRにはAREは存在しない。
実施例1中「1−(2).免疫沈降・タンパク質同定」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識mRNAを抗Flag抗体ビーズと混合・反応を行った後、MycタグをフューズしたZFP36L1及びZFP36L2(Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2)を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgと混合し反応を行なった。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。
ウェスタンブロットの結果を「図2」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。
3.ZFP36L1及びZFP36L2が結合するAREの同定
図1に示した領域において、ZFP36L1及びZFP36L2が結合するAREを同定するため、ARE1〜3を欠失させたベイトを合成し、ZFP36L1及びZFP36L2の結合能の評価を行った。
「図3」に合成したmRNAベイトの構造を示す。図3(A)は、LDLR mRNAの2677-3585bp領域を含むmRNAベイトLDLR 3’UTR-(WT)-Flag)である。また(B)及び(C)は、それぞれARE1部分を欠失させたmRNAベイト(LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flag)とARE2及びARE3を欠失させたmRNAベイト(LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flag)である。各mRNAベイトの合成は、実施例1中「(1)LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従って行った。
実施例2中「2−(2).免疫沈降」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識mRNAを抗Flag抗体ビーズと混合・反応を行った後、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgと混合し反応を行なった。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。
ウェスタンブロットの結果を「図4」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。
4.ZFP36L1及びZFP36L2の機能解析
実施例1〜3の結果から、ZFP36L1及びZFP36L2は、LDLR mRNA 3’UTRのARE1に結合して、LDLR mRNAの安定性制御、特に不安定化及び分解促進、に関与しているものと考えられる。これを確認するため、ARE1〜3を欠失させたLDLR 3’UTRフラグメントを細胞に発現させ、その安定性の評価を行った。
「図3」に示したmRNAベイト(LDLR 3’UTR-(WT)-Flag, LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flag, LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flag)と同様の構造を有するLDLR 3’UTRフラグメント(LDLR 3’UTR-(WT), LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1), LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3))を発現するプラスミドを構築した。
293T細胞を、6-well プレートに8.0×105cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、発現ベクターをリポフェクション(Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen)によって細胞にトランスフェクトした。発現ベクター2.0μgを100μlのOpti-MEMで希釈した。また、4μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後、室温にて5分間静置し、発現ベクターとLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートに加えた。トランスフェクト24時間後に、細胞からトータルRNAを抽出し、定法によりノーザンブロットを行った。プローブは、LDLR mRNA (配列番号10)の2677-3585bp領域についてDIGノーザンスターターキット(Cat.No.2039672, Roche )によりDig ラベルしたアンチセンスRNAを用いた。
ノーザンブロットの結果を「図5」に示す。図(A)は、LDLR 3’UTRフラグメントの検出バンドを示す。また、図(B)には、検出バンド濃度の定量値を、LDLR 3’UTR-(WT)フラグメント(図(A)中レーン1)を100とした相対比によって示す。
5.ZFP36L1及びZFP36L2の発現抑制によるLDLRの発現制御実験
実施例3の結果から、ZFP36L1及びZFP36L2が、LDLR mRNA 3’UTRに存在するARE1に結合し、LDLR mRNAの不安定化及び分解促進に機能しているものと考えられた。このことは、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制し、その機能を抑制することで、LDLR mRNAを安定化し、LDLRの発現量を増強できる可能性を示唆している。そこで、これを確認するため、RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のLDLR発現量の変化について検討を行った。
Hela細胞を、6-well プレートに4.0×105 cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、siRNAをリポフェクション(Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen)によって細胞にトランスフェクトした。siRNAを200pmolを100μlをOpti-MEMで希釈した。また、10μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後室温にて5分間静置し、siRNA希釈液とLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートの各ウェルに加えた。
トランスフェクション60時間後の細胞を回収し抽出したタンパク質を用いてウェスタンブロットを行い、LDLRの発現量を評価した。
ZFP36L1及びZFP36L2のみならず、TTPの発現抑制によっても、同様にLDLR発現量を増加させられるものと考えられた。
Claims (8)
- 低比重リポ蛋白質受容体の発現を制御するための方法であって、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることを特徴とする発現制御方法。
- ZFP36ファミリーの発現抑制によって、低比重リポ蛋白質受容体のmRNAを安定化することを特徴とする請求項1記載の発現制御方法。
- RNA干渉又はアンチセンス法によってZFP36ファミリーの発現を抑制することを特徴とする請求項2記載の発現制御方法。
- 配列番号1〜6記載の塩基配列を有する低分子干渉性RNAを標的細胞内に導入し、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、前記標的細胞における低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることを特徴とする請求項3記載の発現制御方法。
- ZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNAから選択される1以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを含有する低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤。
- 請求項5記載の低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤を含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
- 前記疾患が、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌からなる群より選択される一以上の疾患であることを特徴とする請求項6記載の医薬組成物。
- 低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤製造のためZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNA、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターの使用。
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