JP2009165401A - Method for determining target substance - Google Patents
Method for determining target substance Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009165401A JP2009165401A JP2008006761A JP2008006761A JP2009165401A JP 2009165401 A JP2009165401 A JP 2009165401A JP 2008006761 A JP2008006761 A JP 2008006761A JP 2008006761 A JP2008006761 A JP 2008006761A JP 2009165401 A JP2009165401 A JP 2009165401A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- sample
- target substance
- target
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法に関する。 The present invention provides a target that can more accurately determine the ratio of target substance amounts between samples when quantifying target substance amounts in two or more samples containing biologically related substances of a plurality of species. The present invention relates to a method for quantifying substances.
遺伝子解析は、近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。遺伝子解析は、通常、試料中に、解析対象である標的遺伝子と相同的な塩基配列を有する核酸が存在するか否かを検出することにより行われるが、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に低い場合には、解析対象となる標的塩基配列を有する核酸を増幅して解析を行うことが多い。このような核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。例えば、遺伝病、疾病感受性、癌等の診断において、異常細胞特異的なｍＲＮＡ等の標的核酸をＰＣＲ増幅して検出する方法が、広く用いられている。 Gene analysis has been widely applied in many fields such as medical treatment, academic research, and industry with the recent progress of gene manipulation technology and gene recombination technology. Genetic analysis is usually performed by detecting whether or not a nucleic acid having a base sequence homologous to the target gene to be analyzed exists in a sample. When the amount of nucleic acid is very small or the concentration of nucleic acid in a sample is very low, analysis is often performed by amplifying a nucleic acid having a target base sequence to be analyzed. For amplification of such nucleic acids, the PCR (Polymerase Chain Reaction) method is most commonly used. For example, in the diagnosis of genetic diseases, disease susceptibility, cancer and the like, a method for detecting a target nucleic acid such as abnormal cell-specific mRNA by PCR amplification is widely used.
特に、近年、糞便、唾液や血液等の体液、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等の生体試料中に含まれる核酸を回収し、各試料間の核酸の特徴を比較することによって、癌や、細菌（原核生物）・ウィルス・寄生虫等による感染症等の疾患を診断することが行われている。例えば、薬剤に対する応答反応として、チミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量が増大することを利用して、癌細胞における薬剤耐性の獲得の有無を調べるために、患者から採取した癌細胞に抗癌剤を投与した後、定量的ＰＣＲを行うことによりチミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量を測定し、抗癌剤投与前後における該発現量を相対的に比較する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、口腔癌患者と健常人の唾液からそれぞれＲＮＡを回収し、その中のｍＲＮＡの発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて比較することにより、口腔癌の早期発見を行う試みがなされている。その他、感染症の発見・診断を行うために、糞便等の生体試料からＲＮＡウィルスを定量的に検出し、感染症が疑われる患者のものと健常人のものとを比較することも行われている。 In particular, in recent years, nucleic acids contained in biological samples such as feces, bodily fluids such as saliva and blood, mucous membranes such as oral mucosa and uterine mucosa, and mucus are collected, and the characteristics of the nucleic acids between each sample are compared, thereby enabling cancer. Diagnosis of diseases such as infections caused by bacteria (prokaryotes), viruses, parasites and the like has been carried out. For example, an anticancer drug was administered to a cancer cell collected from a patient in order to examine the presence or absence of drug resistance in the cancer cell by utilizing the increase in the expression level of thymidylate synthase mRNA as a response reaction to the drug. Subsequently, a method is disclosed in which the expression level of thymidylate synthase mRNA is measured by performing quantitative PCR, and the expression levels before and after administration of the anticancer agent are relatively compared (for example, see Non-Patent Document 1). . In addition, attempts have been made to detect oral cancer at an early stage by collecting RNA from the saliva of oral cancer patients and healthy individuals, and comparing the expression profiles of mRNA therein using a microarray. In addition, in order to detect and diagnose infectious diseases, RNA viruses are quantitatively detected from biological samples such as feces and compared with those of patients suspected of infectious diseases and those of healthy individuals. Yes.
このような生体試料には、核酸、タンパク質、脂質、ビタミン類等の低分子化合物等の多種多様な生体関連物質が含まれている。このため、生体試料を用いた核酸解析においては、予め、該生体試料から核酸を回収する場合が多い。一方で、多くの生体試料には、該生体試料が採取された対象である動物以外にも、細菌やウィルスといった様々な生物及び該生物由来の生体関連物質も含まれている。このため、例えば、ヒトから採取された生体試料から、生物種ごとに分離することなく核酸を回収した場合には、ヒト由来の核酸と、細菌やウィルスのようなヒト以外の生物種由来の核酸とが混合された状態で回収される。特に、糞便や唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等には細菌が多く存在するため、これらの生体試料から回収された核酸には、圧倒的に細菌由来の成分が多く含まれており、ヒト由来の生体関連物質は非常に少量である場合が多い。 Such biological samples contain a wide variety of biological substances such as nucleic acid, protein, lipid, low molecular weight compounds such as vitamins. For this reason, in nucleic acid analysis using a biological sample, nucleic acid is often collected from the biological sample in advance. On the other hand, many biological samples include various organisms such as bacteria and viruses and biologically related substances derived from the organisms, in addition to the animal from which the biological sample was collected. For this reason, for example, when nucleic acids are collected from a biological sample collected from a human without separation for each species, nucleic acids derived from humans and nucleic acids derived from species other than humans such as bacteria and viruses And are collected in a mixed state. In particular, since there are many bacteria in feces, saliva, sputum, oral mucosa, uterine mucosa, etc., the nucleic acids collected from these biological samples are overwhelmingly rich in bacteria-derived components, In many cases, the amount of the bio-related substance derived therefrom is very small.
核酸解析においては、他の解析・検出方法と同様に、解析対象である試料中の標的核酸の濃度（存在量）が非常に重要である。このため、ヒト由来の標的核酸が等量含まれている２の試料のうち、一方の試料には細菌由来の核酸が比較的少量含まれており、他方の試料中には非常に大量に含まれている場合には、前者の試料からは標的核酸を検出することができ、後者の試料からは検出することができない、という問題が生じてしまう。また、細菌を多く含む試料中には、細菌由来の分解酵素等も大量に存在する。このため、試料中の核酸がこれらの分解酵素の影響を受けて損なわれやすく、試料間のバラツキが大きくなりやすいという問題もある。特に、ヒト等の動物から剥離された上皮細胞や該上皮細胞由来の生体関連物質は、細菌や細菌の分解酵素等から身を守る術に乏しく、より影響を受けやすい。 In nucleic acid analysis, as in other analysis / detection methods, the concentration (abundance) of the target nucleic acid in the sample to be analyzed is very important. For this reason, of the two samples containing equal amounts of human-derived target nucleic acid, one sample contains a relatively small amount of bacterial-derived nucleic acid and the other sample contains a very large amount. In such a case, the target nucleic acid can be detected from the former sample, but cannot be detected from the latter sample. In samples containing a large amount of bacteria, a large amount of bacteria-derived degrading enzymes and the like are also present. For this reason, there is a problem that the nucleic acid in the sample is easily damaged under the influence of these degrading enzymes, and the variation between the samples tends to increase. In particular, epithelial cells exfoliated from animals such as humans and living body-related substances derived from the epithelial cells are poor in techniques for protecting themselves from bacteria and bacterial degrading enzymes, and are more susceptible to influence.
このため、大量の細菌を含む糞便等の試料のように、複数の生物種が存在し、互いに影響を及ぼしている試料では、初期試料の量、すなわち、解析に用いる試料の重量や容量を規定し、該試料の単位あたりの標的物質を測定した場合であっても、試料の採取や保管状況、解析までに要する時間、解析作業等によって影響され、試料ごとの結果のバラツキが非常に大きくなることが懸念される。特に、標的物質が分解されやすい核酸、特にＲＮＡである場合には、試料中の分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えて解析しなければ、試料間のバラツキを抑えることは困難である。しかしながら、核酸の定量は、通常は核酸の吸光度値を元に推測されており、また吸光度値は分解の度合いを示すものではないため、単に吸光度値に基づき核酸量を規定したとしても、分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えることは困難である。 For this reason, for samples that have multiple species, such as stool samples that contain a large amount of bacteria and that affect each other, specify the amount of initial sample, that is, the weight and volume of the sample used for analysis. Even when the target substance per unit of the sample is measured, it is affected by the sampling and storage status of the sample, the time required for the analysis, the analysis work, etc., and the results vary greatly from sample to sample. There is concern. In particular, in the case where the target substance is a nucleic acid that is easily degraded, particularly RNA, it is difficult to suppress variations between samples unless the analysis is performed with the same number of copies of undegraded RNA molecules in the sample. However, nucleic acid quantification is usually estimated based on the absorbance value of the nucleic acid, and the absorbance value does not indicate the degree of degradation, so even if the amount of nucleic acid is simply defined based on the absorbance value, it is degraded. It is difficult to make copies of RNA molecules that are not present.
試料中の標的物質を定量する場合に、試料ごとの結果のバラツキを抑えるために、例えば、既知濃度の物質を内部標準品として添加して測定を行うことがある。これにより、添加した内部標準品の測定値から、標的物質量を算出することができるため、測定操作による影響を排除し得るばかりではなく、標的物質の絶対量を得ることができる。しかしながら、該方法は、比較的均質な試料であって安定性の高い標的物質を定量する場合には有効であるものの、試料の採取や保管状況等による影響を排除することはできず、細菌を多く含む試料を用いた場合に信頼に足る定量結果を得ることは困難である。 When quantifying a target substance in a sample, in order to suppress variation in the results of each sample, for example, a substance having a known concentration may be added as an internal standard to perform measurement. Thereby, since the target substance amount can be calculated from the measured value of the added internal standard product, not only the influence by the measurement operation can be eliminated, but also the absolute amount of the target substance can be obtained. However, although this method is effective for quantifying a target substance that is a relatively homogeneous sample and has high stability, it cannot eliminate the influence of the sample collection or storage conditions, etc. It is difficult to obtain a reliable quantitative result when a sample containing a large amount is used.
試料間の標的物質量を比較する場合に、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を排除し、より信頼性の高い定量結果を得るために、全ての試料にほぼ同量含まれていることが期待できる標的物質以外の物質を標準物質とし、該標準物質により測定値をノーマライズする、すなわち、該標準物質の測定値に基づき標的物質の測定値を補正することがある。標的物質が核酸であり、試料間の標的核酸量を比較する方法として、例えば、（１）標的核酸がある特定の遺伝子由来のｍＲＮＡであり、複数の試料間の標的核酸量を比較する場合に、各試料中のＲＮＡ量を、ハウスキーピング遺伝子由来のｍＲＮＡ量によりノーマライズさせて解析する方法が開示されている（例えば、非特許文献２参照。）。ハウスキーピング遺伝子は、個々の生理状態とは無関係に全ての細胞で構成的に発現しており、そのｍＲＮＡは全ての細胞にほぼ同じ量で存在すると考えられる。例えば、癌組織から得られたＲＮＡと正常組織から得られたＲＮＡの間で、標的ＲＮＡの発現量の差を見る場合、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ、ｒＲＮＡ等のヒト遺伝子由来のＲＮＡを標準ＲＮＡとすると、各試料中の総ＲＮＡ量に対する標準ＲＮＡ量の比はほぼ一致すると考えられるため、癌組織から検出された標準ＲＮＡの総量と、正常組織から検出された標準ＲＮＡの総量から、各試料中の総ＲＮＡ量の比を推定し、該推定に基づき検出された標的ＲＮＡ量を補正することにより、より確からしい定量結果を得ることができる。その他、（２）ノーマライズに複数の標準物質を用いる方法等も開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。 When comparing the amount of target substance between samples, almost the same amount is included in all samples in order to eliminate the effects of differences in initial sample quality and sample preparation methods, and to obtain more reliable quantitative results. In some cases, a substance other than the target substance that can be expected to be used is used as a standard substance, and the measurement value is normalized by the standard substance, that is, the measurement value of the target substance is corrected based on the measurement value of the standard substance. As a method for comparing the amount of target nucleic acid between samples when the target substance is a nucleic acid, for example, (1) When the target nucleic acid is mRNA derived from a specific gene and the amount of target nucleic acid between multiple samples is compared A method is disclosed in which the amount of RNA in each sample is normalized by the amount of mRNA derived from a housekeeping gene and analyzed (see, for example, Non-Patent Document 2). The housekeeping gene is constitutively expressed in all cells regardless of the individual physiological state, and the mRNA is considered to be present in almost the same amount in all cells. For example, when the difference in the expression level of a target RNA is observed between RNA obtained from cancer tissue and RNA obtained from normal tissue, the housekeeping gene GAPDH (glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase), beta-actin When the RNA derived from a human gene such as rRNA is used as the standard RNA, the ratio of the standard RNA amount to the total RNA amount in each sample is considered to be almost the same. Therefore, the total amount of standard RNA detected from the cancer tissue and the normal tissue By estimating the ratio of the total RNA amount in each sample from the total amount of standard RNA detected from the sample, and correcting the target RNA amount detected based on the estimation, a more reliable quantitative result can be obtained. In addition, (2) a method of using a plurality of standard substances for normalization is also disclosed (for example, see Non-Patent Document 3).
上記（１）及び（２）の方法では、ヒトの特定の遺伝子由来の核酸を標的物質として定量する場合に、測定値をノーマライズするために、ハウスキーピング遺伝子等のヒト由来の核酸を標準物質として用いている。このように、標準物質として標的物質と同じ生物種・同じ分子種の生体関連物質を用いることにより、試料の採取や保管状況、調製方法等による影響を効果的に排除し得ると考えられる。
各組織からそれぞれ採取された試料間の比較等、比較的類似した試料間での比較に用いられる場合には、上記（１）及び（２）の方法によっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得ることが期待できる。しかしながら、試料中に元々少数しか存在していない生物種由来の標的物質を定量する場合には、標準物質を標的物質と同じ生物種の生体関連物質とした場合には、標準物質自体が検出されない場合が多いという問題がある。この場合には、そもそも標準物質として機能することはできず、例え標的物質が検出されていたとしても補正することができず、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることはできない。 When used for comparison between relatively similar samples such as comparison between samples collected from each tissue, the difference in the initial quality and analysis of the samples can also be achieved by the methods (1) and (2) above. It can be expected that variations in measurement results due to the influence of operations and the like can be corrected appropriately. However, when quantifying a target substance derived from a biological species that is originally present in a small amount in the sample, if the standard substance is a biologically related substance of the same species as the target substance, the standard substance itself is not detected. There is a problem that there are many cases. In this case, it cannot function as a standard substance in the first place, and even if a target substance is detected, it cannot be corrected, and it is highly reliable that accurately reflects the target substance amount ratio between samples. Quantitative results cannot be obtained.
例えば、ヒト口腔細胞において、癌化により特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現量が亢進されるという知見に基づき、標的遺伝子の発現量が一定値以上である場合に陽性（癌）と判断する場合であって、標準遺伝子としてヒトハウスキーピング遺伝子を用いた場合には、唾液から直接核酸を抽出し、唾液中に含まれている標的遺伝子由来核酸量を測定したとしても、同時に測定した標準遺伝子由来核酸が検出されないことによって、標的遺伝子由来核酸量の検出結果の信頼性や定量性に問題が生じ、癌の診断ができないおそれがある。 For example, in human oral cells, when the expression level of a specific gene (target gene) is enhanced due to canceration, if the expression level of the target gene is a certain value or more, it is determined to be positive (cancer) However, when a human housekeeping gene is used as a standard gene, nucleic acid is extracted directly from saliva, and even if the amount of target gene-derived nucleic acid contained in saliva is measured, it is derived from the standard gene measured at the same time. If the nucleic acid is not detected, there is a problem in the reliability and quantitativeness of the detection result of the target gene-derived nucleic acid amount, and there is a possibility that cancer cannot be diagnosed.
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、標的物質が比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法を提供することを目的とする。 When quantifying the amount of a target substance in two or more samples containing biological substances of a plurality of species, the present invention is a biological substance of a biological species in which the target substance is present in a relatively small amount Even so, there is a target substance quantification method that can properly correct for variations in measurement results due to differences in the initial quality of samples and the effects of analysis operations, etc., and more accurately determine the ratio of target substance amounts between samples. The purpose is to provide.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、標準物質として、標的物質と同一生物種由来の生体関連物質ではなく、細菌等の該試料中に大量に存在する標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を用いることにより、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得るため、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have found that the target substance is the same as the target substance as a standard substance even when the target substance is a biologically related substance of a biological species present in a relatively small amount in the sample. By using a biological material of a biological species that is different from the target material that is present in a large amount in the sample, such as bacteria, rather than a biological material derived from the biological species, Since the variation in the measurement results can be corrected appropriately, the inventors have found that a reliable quantitative result that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples can be obtained, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする標的物質の定量方法を提供するものである。 That is, the present invention is a method for quantifying each target substance contained in two or more samples, each sample containing a standard substance different from the target substance, and the standard substance is the target substance And (a) a step of measuring the amount of standard substance in each sample and determining the ratio of the amount of standard substance in each sample, and (b) the amount of target substance in each sample. And (c) correcting the amount of the target substance in each sample obtained in step (b) by using the ratio of the amount of standard substance in each sample obtained in step (a). The present invention provides a method for quantifying a target substance characterized by comprising:
本発明の標的物質の定量方法により、大量の細菌が存在する試料に含まれている細菌以外の生物種の生体関連物質を標的物質として定量する場合のように、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標的物質と同一生物種の生体関連物質ではなく、異なる生物種由来の生体関連物質を標準物質とすることにより、標準物質が検出されない等の標準物質が機能できない事態の発生を防止しつつ、試料の採取から保存、試料からの生体関連物質の抽出等の一連の工程の影響を加味し、ノーマライズすることができる。このため、本発明の標的物質の定量方法は、糞便試料中の哺乳細胞由来の核酸を定量する場合等、標的物質が、共存する生物種に比べて圧倒的に少量しか試料中に存在していない生物種の生体関連物質であり、試料中に検出限界ギリギリの量しか含まれていない場合に、特に有効である。従来は、試料中に検出限界量程度しか含まれていない標的物質の量を試料間で比較する場合には、該生体試料から生物種ごとに分離して生体関連物質を回収する等の、標的物質を濃縮する工程が必要とされたが、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、信頼性の高い各試料の標的物質量比を、より簡便に得ることができる。 According to the target substance quantification method of the present invention, the target substance is relatively contained in the sample as in the case where a biologically related substance of a species other than bacteria contained in the sample containing a large amount of bacteria is quantified as the target substance. Even a biologically related substance of a biological species present in a small amount can provide a reliable quantitative result that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples. By using a biological substance derived from a different biological species as the standard substance instead of the biological substance of the same species as the target substance, the sample can be prevented from occurring, such as when the standard substance cannot be detected. It can be normalized by taking into account the effects of a series of steps such as collection, storage, and extraction of biologically relevant substances from the sample. For this reason, the target substance quantification method of the present invention has an overwhelmingly small amount of target substance in the sample compared to the coexisting species, such as when quantifying nucleic acid derived from mammalian cells in a stool sample. This is particularly effective when the sample is a biologically-related substance of no biological species, and the sample contains only the limit of detection limit. Conventionally, when comparing the amount of a target substance that is contained only in a detection limit amount in a sample between samples, the target can be separated from the biological sample for each species and collected a biological substance. A process of concentrating substances is required, but by using the target substance quantification method of the present invention, a highly reliable target substance amount ratio of each sample can be obtained more easily.
本発明の標的物質の定量方法は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする。以下、より詳細に説明する。 The target substance quantification method of the present invention is a method for quantifying each target substance contained in two or more samples, and each sample contains a standard substance different from the target substance. A biologically related substance of a biological species different from the target substance, (a) measuring a standard substance amount in each sample and determining a ratio of the standard substance quantity in each sample; and (b) in each sample. The target substance amount in each sample obtained in step (b) is determined by using the ratio of the standard substance amount in each sample obtained in step (a). And a step of correcting. This will be described in more detail below.
本発明において試料とは、生物種の異なる２以上の生体関連物質を含むものである。生物から採取された試料（生体試料）であってもよく、培養細胞等から調製された試料であってもよい。本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料としては、臨床検体等の生体試料であることが好ましい。生体試料が採取される生物は、特に限定されるものではないが、真核生物であることが好ましく、動物であることがより好ましく、哺乳類であることがさらに好ましく、ヒトであることが特に好ましい。該生体試料として、例えば、糞便、唾液や血液等の体液、喀痰、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等がある。特に、該生体試料を採取された生物以外の種類の生物の生体関連物質、例えば原核生物やウィルス等の微生物の生体関連物質を含む生体試料であることが好ましく、真正細菌等の原核生物の生体関連物質をより多く含む生体試料であることが特に好ましい。このような細菌等を多く含む生体試料として、例えば、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等がある。 In the present invention, the sample includes two or more biologically related substances having different biological species. It may be a sample (biological sample) collected from a living organism, or a sample prepared from cultured cells or the like. The sample to be subjected to the target substance quantification method of the present invention is preferably a biological sample such as a clinical specimen. The organism from which the biological sample is collected is not particularly limited, but is preferably a eukaryote, more preferably an animal, still more preferably a mammal, and particularly preferably a human. . Examples of the biological sample include feces, body fluids such as saliva and blood, sputum, mucous membranes such as oral mucosa and uterine mucosa, and mucus. In particular, the biological sample is preferably a biological sample containing a biological related substance of a living organism other than the organism from which the biological sample is collected, for example, a biological biological related material of a microorganism such as a prokaryotic organism or a virus. It is particularly preferable that the biological sample contains more related substances. Examples of such biological samples containing a large amount of bacteria include feces, saliva, sputum, oral mucosa, uterine mucosa and the like.
本発明において生体関連物質とは、生体に関連する物質であり、具体的には、核酸、タンパク質、ビタミン類やホルモン類等の低分子化合物、糖類、脂質類等である。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。タンパク質は、アミノ酸のみからなるタンパク質であってもよく、糖タンパク質やリポタンパク質等のアミノ酸以外の物質を含むものであってもよい。 In the present invention, the biological substance is a substance related to the living body, and specifically, nucleic acids, proteins, low molecular compounds such as vitamins and hormones, saccharides, lipids and the like. The nucleic acid may be DNA or RNA. The protein may be a protein consisting only of amino acids, or may contain substances other than amino acids such as glycoproteins and lipoproteins.
本発明において標的物質とは、試料中に含まれている量を定量する対象である。本発明における標的物質としては、各試料に比較的少量含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。このような生体関連物質は、試料中に大量に存在する生体関連物質よりも、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を受けやすいため、本発明の標的物質の定量方法により好適である。特に、本発明における標的物質としては、試料に比較的少量含まれている生物種の、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であることが好ましい。 In the present invention, the target substance is a target for quantifying the amount contained in a sample. The target substance in the present invention is preferably a biologically related substance of a biological species contained in a relatively small amount in each sample. Such a biological substance is more suitable for the target substance quantification method of the present invention than a biological substance present in a large amount in a sample because it is more susceptible to differences in the initial quality of the sample and the sample preparation method. It is. In particular, the target substance in the present invention is preferably a nucleic acid such as DNA or RNA of a biological species contained in a relatively small amount in the sample.
本発明において標準物質とは、各試料中の標的物質量の測定値を補正するための標準とする物質であり、試料中に含まれている標的物質とは異なる生物種の生体関連物質である。標準物質は、各試料に比較的大量に含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。各試料に一定の割合以上含まれている生物種の生体関連物質であれば、試料の採取等の条件による初期試料の品質のバラツキを抑えられること、及び、各試料にほぼ確実に検出限界量以上含まれていること等が、期待できるためである。すなわち、各試料には、前記標的物質よりも、前記標準物質が多く含まれていることが好ましい。 In the present invention, the standard substance is a standard substance for correcting the measured value of the target substance amount in each sample, and is a biologically related substance of a biological species different from the target substance contained in the sample. . The standard substance is preferably a biologically related substance of a biological species contained in a relatively large amount in each sample. If it is a biologically related substance of a biological species that is contained in a certain percentage or more in each sample, it is possible to suppress variations in the quality of the initial sample due to conditions such as sample collection, and almost surely the detection limit amount for each sample This is because it can be expected to be included. That is, it is preferable that each sample contains more of the standard substance than the target substance.
標準物質と標的物質とは、生物種が異なっていればよく、同種類の生体関連物質であってもよく、異なる種類の生体関連物質であってもよい。例えば、標的物質がＲＮＡである場合に、標準物質はＲＮＡであってもよく、ＤＮＡであってもよく、タンパク質であってもよい。 The standard substance and the target substance only need to be different in biological species, and may be the same type of biological substance or different types of biological substance. For example, when the target substance is RNA, the standard substance may be RNA, DNA, or protein.
生物種ごとに区別した解析が比較的容易であること、解析手法が汎用されていること等から、本発明における標準物質としては、核酸であることが好ましい。このような標準物質として、例えば、各試料に比較的大量に含まれている生物種のｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、リボゾーム関連タンパク質やＲＮＡポリメラーゼ、ハウスキーピング遺伝子等のｍＲＮＡやＤＮＡ等がある。標的物質の種類や量に応じて、適当な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として用いることにより、より適正にノーマライズし得ることが期待できる。このため、標準物質としては、低発現の遺伝子から高発現の遺伝子まで、様々な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを揃えておくことが好ましい。 From the viewpoint of comparatively easy analysis differentiated for each species and the widespread use of analysis techniques, the standard substance in the present invention is preferably a nucleic acid. Examples of such a standard substance include rRNA, rDNA, ribosome-related protein, RNA polymerase, mRNA and DNA of a housekeeping gene, and the like of biological species contained in a relatively large amount in each sample. It can be expected that normalization can be performed more appropriately by using mRNA of a gene having an appropriate expression level as a standard substance according to the type and amount of the target substance. For this reason, it is preferable to prepare mRNAs of genes having various expression levels from low expression genes to high expression genes as standard substances.
標準物質として用いる生体関連物質は、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。例えば、一遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよく、複数種類の遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよい。より具体的には、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを用いてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡとを組み合わせて用いてもよい。複数種類の生体関連物質を標準物質として用いる場合には、用いる複数種類の生体関連物質が、互いに生物種の異なるホモログ遺伝子であることがより好ましい。例えば、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを標準物質として用いることができる。 One or more types of biological substances may be used as the standard substance. For example, mRNA and DNA of one gene may be used, and mRNA and DNA of multiple types of genes may be used. More specifically, 16S rRNA of a specific bacterium may be used, or a combination of 16S rRNA of a specific bacterium and mRNA of an RNA polymerase gene may be used. When a plurality of types of biological substances are used as standard substances, it is more preferable that the plurality of types of biological substances used are homologous genes having different biological species. For example, 16S rRNA of multiple types of bacteria can be used as a standard substance.
また、標準物質として複数種類の生体関連物質を用いる場合、複数種類の生体関連物質を一括で定量した結果を補正に用いてもよく、それぞれの生体関連物質の定量結果の平均を補正に用いてもよい。より具体的には、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの総量を標準物質量としてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ量の平均値を標準物質量としてもよい。 In addition, when using multiple types of biological substances as standard substances, the results of quantifying multiple types of biological substances may be used for correction, and the average of the quantification results for each biological substance is used for correction. Also good. More specifically, the total amount of 16S rRNA of a plurality of types of bacteria may be used as the standard substance amount, and the average value of the 16S rRNA amount of a specific bacterium and the mRNA amount of the RNA polymerase gene may be used as the standard substance amount.
本発明の標的物質の定量方法は、まず、工程（ａ）として、各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める。各試料中の標準物質量の比は、例えば、一の試料中の標準物質量を１．０とした場合の、他の試料中の標準物質量の比をそれぞれ算出することにより求めることができる。このようにして得られた各試料中の標準物質量の比を、本願明細書においては、補正係数という。 In the target substance quantification method of the present invention, first, as step (a), the amount of standard substance in each sample is measured, and the ratio of the standard substance quantity in each sample is obtained. The ratio of the amount of standard substance in each sample can be obtained, for example, by calculating the ratio of the amount of standard substance in another sample when the amount of standard substance in one sample is 1.0. . The ratio of the standard substance amounts in each sample thus obtained is referred to as a correction coefficient in the present specification.
各試料中の標準物質量は、該標準物質と同一種類の生体関連物質の定量に通常用いられている方法により定量することができる。このような定量方法として、例えば、定量的核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、免疫凝集法、ＥＬＩＳＡ法、吸光度測定法等がある。定量対象である標準物質が核酸である場合には、試料中に微量に存在する核酸を容易に検出し定量することが可能であるため、定量的核酸増幅法を用いて測定することが好ましい。該定量的核酸増幅法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法等がある。また、特異的な検出が比較的簡便に行えることから、プローブ等を用いたハイブリダイゼーション法を用いることも好ましい。このような方法として、例えば、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法等があり、なかでもＴａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法を用いることが好ましい。標準物質がＲＮＡである場合には、逆転写反応により得られたｃＤＮＡに対して定量的ＰＣＲを行うことができる。 The amount of the standard substance in each sample can be quantified by a method usually used for quantifying the same kind of biological substance as the standard substance. Examples of such quantification methods include quantitative nucleic acid amplification methods, hybridization methods, immunoaggregation methods, ELISA methods, and absorbance measurement methods. When the standard substance to be quantified is a nucleic acid, it is preferable to measure using a quantitative nucleic acid amplification method because it is possible to easily detect and quantify a small amount of nucleic acid present in a sample. Examples of the quantitative nucleic acid amplification method include a quantitative PCR method such as real-time PCR. Further, since specific detection can be performed relatively easily, it is also preferable to use a hybridization method using a probe or the like. Such methods include, for example, Taq Man PCR method, microarray method, Northern blot method, dot blot method, etc. Among them, Taq Man PCR method is preferably used. When the standard substance is RNA, quantitative PCR can be performed on the cDNA obtained by the reverse transcription reaction.
また、標準物質として、複数種類の細菌のそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡ量の総和を標準物質量とする場合には、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡごとに特異的なプライマーを用いて、個別にＰＣＲを行い、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をそれぞれ定量した後に総和量を算出してもよく、マルチプレックスＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をまとめて定量してもよい。その他、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに共通するプライマーを用いて、一のＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを同時に増幅してまとめて定量してもよい。 When the total amount of 16S rRNA of each of a plurality of types of bacteria is used as the standard substance, the PCR is performed individually using a specific primer for each 16S rRNA of each bacterium. The total amount may be calculated after each amount of bacteria 16S rRNA is quantified, or the amount of 16S rRNA of each bacterium may be collectively determined by performing multiplex PCR. In addition, 16S rRNA of each bacterium may be simultaneously amplified and quantified by performing one PCR using a primer common to 16S rRNA of each bacterium.
次に工程（ｂ）として、各試料中の標的物質量を測定する。各試料中の標的物質量は、標準物質量の測定法において挙げられた方法を用いて測定することができる。 Next, as a step (b), the amount of the target substance in each sample is measured. The amount of the target substance in each sample can be measured using the method mentioned in the standard substance amount measurement method.
その後、工程（ｃ）として、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する。具体的には、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で算出した補正係数で除する。該補正係数を用いて補正することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られる。 Thereafter, as step (c), the target substance amount in each sample obtained in step (b) is corrected using the ratio of the standard substance amount in each sample obtained in step (a). Specifically, the target substance amount in each sample obtained in step (b) is divided by the correction coefficient calculated in step (a). By correcting using the correction coefficient, a reliable quantitative result that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples can be obtained.
図１は、本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料の一態様の模式図である。（ａ）と（ｂ）は、それぞれヒトの同一の糞便から等重量ずつ異なる部位から採取した試料の模式図である。図中、○は細菌の核酸、△はヒト大腸剥離細胞の核酸、●は食物残渣や分解された核酸等のデブリスを表している。試料（ａ）には、細菌の核酸が２０、ヒトの核酸が２、デブリスが０、それぞれ存在しており、試料（ｂ）には、細菌の核酸が５、ヒトの核酸が１、デブリスが多数、それぞれ存在している。従来法通りに、ヒトの核酸量を、重量当たりの量を定量した場合には、試料（ｂ）には試料（ａ）の１／２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果となる。一方で、細菌のｒＲＮＡ遺伝子を標準物質として定量した場合には、試料（ａ）中の細菌の核酸量を１．０とした場合の試料（ｂ）の補正係数は０．２５であり、該補正係数を用いて補正すると、試料（ｂ）中のヒトの核酸量は４となり、試料（ｂ）には試料（ａ）の２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果が得られる。このように、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、試料の採取から解析までの一連の操作の影響による試料間のバラツキを防止して、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。 FIG. 1 is a schematic view of one embodiment of a sample to be subjected to the target substance quantification method of the present invention. (A) And (b) is a schematic diagram of the sample extract | collected from the site | part from which the same weight each differs from the same human stool. In the figure, ◯ represents bacterial nucleic acid, Δ represents human colon exfoliated cell nucleic acid, and ● represents food residues and debris such as degraded nucleic acid. Sample (a) contains 20 bacterial nucleic acids, 2 human nucleic acids, and 0 debris. Sample (b) contains 5 bacterial nucleic acids, 1 human nucleic acid, and debris. There are many. When the amount of human nucleic acid is quantified as per conventional methods, the amount of human nucleic acid in sample (b) is ½ times that of sample (a). Become. On the other hand, when the bacterial rRNA gene is quantified as a standard substance, the correction coefficient of the sample (b) when the amount of the nucleic acid of the bacteria in the sample (a) is 1.0 is 0.25, When the correction coefficient is used for correction, the amount of human nucleic acid in the sample (b) is 4, and the result that the sample (b) contains twice as much human nucleic acid as the sample (a) is obtained. . In this way, by using the target substance quantification method of the present invention, it is possible to prevent variations between samples due to the influence of a series of operations from sample collection to analysis, and to more accurately determine the target substance amount ratio between samples. A highly reliable quantitative result can be obtained.
糞便中に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、大腸剥離細胞等の消化管上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。このような糞便中に含まれているヒト細胞やヒトの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、大腸癌や炎症性大腸疾患等の診断を行うことが試みられている。また、糞便中のウィルスやウィルスの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、感染症等の診断も試みられている。その他、糞便中に含まれている真核生物として寄生虫等があり、これらを同様に検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、寄生虫の有無の判定をすることも可能である。一方で、糞便は、その半分以上は細菌から構成されていると言われるほど大量の細菌を含んでおり、真核生物やウィルスの細胞や生体関連物質等はごく少量しか含まれてはいない。そこで、糞便を試料とし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質を定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。特に、標的物質がヒトの生体関連物質であり、標準物質が真正細菌の生体関連物質であることがより好ましい。 Examples of eukaryotic cells such as humans and biological substances contained in feces include exfoliated cells from gastrointestinal epithelial cells such as colonic exfoliated cells, and biorelated substances of these cells. Diagnose colorectal cancer, inflammatory bowel disease, etc. by detecting and quantifying human cells and human bio-related substances contained in such stool and comparing them with samples from healthy individuals Has been tried. In addition, diagnosis of infectious diseases and the like has been attempted by detecting and quantifying viruses in feces, virus-related substances, and the like, and comparing them with samples derived from healthy subjects. In addition, there are parasites etc. as eukaryotes contained in feces, and these may be detected and quantified in the same way, and the presence or absence of parasites may be determined by comparing with samples derived from healthy subjects. Is possible. On the other hand, feces contain a large amount of bacteria so that more than half of them are composed of bacteria, and only a very small amount of eukaryotic and viral cells, biological materials, etc. are contained. Therefore, by using the stool as a sample and the standard substance as a prokaryotic organism-related substance, the target substance between samples is quantified by quantifying the target substance eukaryotic or viral organism-related substance using the quantification method of the present invention. A highly reliable quantitative result reflecting the quantitative ratio more accurately can be obtained. In particular, it is more preferable that the target substance is a human biological substance, and the standard substance is an eubacterial biological substance.
例えば、糞便中に多く存在する、大腸菌、大腸菌群、腸球菌、乳酸菌等の腸内細菌の全種類又はその大部分が共通して有する遺伝子（ホモログ遺伝子）又はその一部を標準物質とすることにより、糞便中の大多数の細菌の核酸を、全体的にノーマライズすることが可能である。また、特定の一種類又は数種類の細菌の遺伝子を標準物質として、ノーマライズしてもよい。その他、試料からＤＮＡとＲＮＡを一括で回収し、そのうちの一部で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の標的ＲＮＡの定量検出を行い、残りの一部に存在するＤＮＡを標準物質としてノーマライズすることもできる。ＤＮＡを標準物質として用いる場合、遺伝子のコピー数は数個から数十個になるため、標的物質が低発現のｍＲＮＡである場合等のノーマライズに好適に用いることができる。 For example, a standard substance is a gene (homologue gene) or a part thereof that is common to all or most of enterobacteria such as E. coli, coliforms, enterococci, lactic acid bacteria, etc. This makes it possible to normalize the majority of bacterial nucleic acids in the stool as a whole. Alternatively, normalization may be performed using one or several specific bacterial genes as a standard substance. In addition, DNA and RNA can be collected from a sample at once, and a part of them can be quantitatively detected for target RNA such as quantitative RT-PCR, and the DNA present in the remaining part can be normalized as a standard substance. it can. When DNA is used as a standard substance, the number of gene copies is from several to several tens. Therefore, it can be suitably used for normalization when the target substance is low-expressed mRNA.
唾液や口腔粘膜に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、口腔内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。また、喀痰に含まれている真核生物の細胞等として、主に、口腔や気管内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等があり、子宮粘膜に含まれている真核生物の細胞等として、主に、子宮内膜の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。これらの生体試料中の真核細胞等を検出・定量することにより、各組織の癌や炎症等の疾患の診断をすることができる。また、口腔や気管、子宮は生体外部と直接接する組織であり、これらの生体試料中にウィルスが含まれているか否かにより、ウィルス感染の有無を診断することもできる。一方で、これらの生体試料中には、通常、糞便と同様に細菌が大量に存在している。このため、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等を試料とし、これらの試料中の標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質の量を、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標準物質として用いる原核生物の生体関連物質は、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡやハウスキーピング遺伝子等であることが好ましい。その他、標準物質として、原核生物以外の真核生物を用いてもよい。 Examples of eukaryotic cells and biologically related substances such as humans contained in saliva and oral mucosa mainly include exfoliated cells from oral epithelial cells and biologically related substances of these cells. In addition, eukaryotic cells, etc. contained in sputum mainly include exfoliated cells from epithelial cells in the oral cavity and trachea and bio-related substances of these cells, and the true cells contained in the uterine mucosa. Examples of nuclear cells include exfoliated cells from epithelial cells of the endometrium and biological related substances of these cells. By detecting and quantifying eukaryotic cells and the like in these biological samples, it is possible to diagnose diseases such as cancer and inflammation in each tissue. The oral cavity, trachea, and uterus are tissues that are in direct contact with the outside of the living body, and the presence or absence of virus infection can also be diagnosed based on whether or not viruses are contained in these biological samples. On the other hand, in these biological samples, a large amount of bacteria are usually present in the same manner as feces. For this reason, saliva, sputum, oral mucosa, uterine mucosa, etc. are used as samples, the amount of eukaryotic or viral biological substances that are target substances in these samples, the standard substance as the prokaryotic biological substance, By performing quantification using the quantification method of the present invention, a highly reliable quantification result that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples can be obtained. The prokaryotic organism-related substance used as the standard substance is preferably an eubacterial 16S rRNA or a housekeeping gene. In addition, eukaryotes other than prokaryotes may be used as standard substances.
本発明の定量方法は、糞便等の原核生物を多く含む生体試料中の癌等の疾患マーカーを定量する場合に、特に有効である。標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いてノーマライズすることにより、健常者由来の試料と患者由来の試料のそれぞれに含まれている疾患マーカー（標的物質）量の比をより正確に求めることができるため、疾患の診断の信頼性を向上し得ることが期待できる。特に、標的物質を癌マーカーとし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて癌マーカーを定量することが好ましい。癌診断においては、他の疾患にも増して高い正確性が要求されるが、本発明の定量方法により定量された癌マーカー量に基づき診断することにより、癌診断の精度（特異度）を改善し得ることが期待できる。なお、癌マーカーとは、癌検出の指標となり得る生体関連物質であれば特に限定されるものではなく、公知の癌マーカーを用いることができる。 The quantification method of the present invention is particularly effective when quantifying a disease marker such as cancer in a biological sample containing a large amount of prokaryotes such as feces. The ratio of the amount of disease marker (target substance) contained in each of the sample derived from a healthy subject and the sample derived from a patient by normalizing the standard substance as a prokaryotic biological substance using the quantification method of the present invention. Therefore, it can be expected that the reliability of disease diagnosis can be improved. In particular, it is preferable to quantify the cancer marker using the quantification method of the present invention using the target substance as a cancer marker and the standard substance as a prokaryotic organism-related substance. Cancer diagnosis requires higher accuracy than other diseases, but the diagnosis (specificity) of cancer diagnosis is improved by making a diagnosis based on the amount of cancer marker quantified by the quantification method of the present invention. I can expect to do it. The cancer marker is not particularly limited as long as it is a bio-related substance that can serve as an index for cancer detection, and a known cancer marker can be used.
このように、試料中の標的物質量を、標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を標準物質として補正するという考え方は、標的物質が核酸以外の生体関連物質である場合、例えば、タンパク質が標的物質である場合にも何ら変わりはない。したがって、本発明の定量方法は、タンパク質の発現解析等にも応用することができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質を検出する場合、糞便中の細菌のリボゾームタンパク質を標準物質とし、ＣＥＡやＣＡ１９−９、ＣＤ４４等の定量を行うことができる。なお、タンパク質の検出や定量は、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質の検出は、国際公開第１９９６／００８５１４号パンフレット等で開示されているヒト結腸癌腫関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて検出することもできる。 Thus, the idea of correcting the amount of target substance in a sample using a biologically related substance of a biological species different from the target substance as a standard substance is that the target substance is a biologically related substance other than a nucleic acid. There is no change even if it is a target substance. Therefore, the quantification method of the present invention can also be applied to protein expression analysis and the like. For example, when detecting protein derived from cancer cells in stool, CEA, CA19-9, CD44 and the like can be quantified using ribosomal protein of bacteria in stool as a standard substance. In addition, a well-known method can be used suitably for the detection and quantification of protein. For example, a protein derived from cancer cells in stool can be detected using a monoclonal antibody against a human colon carcinoma-associated antigen disclosed in WO 1996/008514 pamphlet or the like.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、培養細胞であるＭＫＮ４５細胞は、常法により培養した。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example. The cultured cells, MKN45 cells, were cultured by a conventional method.
［実施例１］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号１の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、配列番号２の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１を用いて定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は一人由来のものを１０個分に分取した。その後、グアニジン塩とフェノールを添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、クロロホルムとエタノールを用いて全ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数（ｍＲＮＡ量）を定量した。具体的には、抽出したＲＮＡの一部をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１をそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃１０分間の変性サイクルの後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間を４５サイクルの条件で行った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。
[Example 1]
Using mRNA of 16S rRNA gene of bacteria as a standard substance, mRNA of human GAPDH gene contained in feces was quantified.
<Quantification of reference material and calculation of correction factor>
The same sample was subdivided, and the bacterial nucleic acid in the stool sample was subjected to quantitative PCR using primers having base sequences common to 16S rRNA genes of various bacterial species, and the number of copies of the bacterial 16S rRNA gene was measured. . Specifically, quantitative PCR was performed using a forward primer 1 for 16S rRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer 1 for 16S rRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2.
First, about 1 g of stool of a healthy person was quickly collected into a 5 mL tube after stool collection, frozen with liquid nitrogen, and stored at −80 ° C. Feces were collected into 10 pieces from one person. Thereafter, a guanidine salt and phenol were added, homogenized using a homogenizer, and then total RNA was extracted using chloroform and ethanol. CDNA was synthesized from the RNA by reverse transcription reaction, and real-time PCR was performed using the cDNA as a template to quantify the copy number (mRNA amount) of the bacterial 16S rRNA gene. Specifically, a part of the extracted RNA was reverse-transcribed using River Script II (registered trademark) (reaction volume 20 μL, Wako Pure Chemical Industries) and random primers to obtain about 20 μL cDNA solution. Furthermore, 12.5 μL of 2 × TaqMan PCR master mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems) was added to 1 μL of the cDNA solution, and final concentrations of 16S rRNA forward primer 1 and 16S rRNA reverse primer 1 were respectively obtained. Was added to 900 nmol, and a PCR solution was prepared so that the final volume was 25 μL. The PCR solution was subjected to SYBR green PCR analysis using ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems). The thermal cycle of PCR was performed under conditions of 45 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds after a denaturation cycle at 95 ° C. for 10 minutes. The quantification was performed based on the result of fluorescence intensity obtained using a dilution series with a standard plasmid of known concentration as a template.
表１の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料１−１〜１０は、同一の糞便から等量採取した試料であるにもかかわらず、１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。 The left column of Table 1 shows the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample (in about 1 g of stool) obtained as a result of real-time PCR, and the right column shows the copy number of bacterial 16S rRNA in sample 1-1. The ratio (correction coefficient) of the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample calculated as 0.0 is shown. Although Samples 1-1 to 10 were samples collected from the same stool, the amount of rRNA in 1 g of stool showed a maximum 2.3-fold difference.
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号３の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用フォワードプライマーと配列番号４の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用リバースプライマーを用いた以外は、全て細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表１記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
<Quantification and correction of target substance>
Instead of the forward primer 1 for 16S rRNA and the reverse primer 1 for 16S rRNA, a forward primer for human GAPDH having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer for human GAPDH having the base sequence of SEQ ID NO: 4 were used. The copy number of human GAPDH was calculated in the same manner as the calculation of the copy number of bacterial 16S rRNA. The human GAPDH copy number after correction was calculated by dividing the obtained human GAPDH copy number by the correction factor shown in Table 1.
表２の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表１記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表２左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．２０〜２．９０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは１．１８〜１．３２×１０３と最大で１．１２倍の開きであり、より各試料間のバラツキが少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
The left column of Table 2 shows the number of copies of human GAPDH in each sample (in about 1 g of stool) obtained as a result of real-time PCR, the middle column shows the correction factor described in Table 1, and the right column shows human GAPDH after correction. The number of copies (the number of copies described in the left column divided by the correction coefficient described in the middle column) is shown respectively. The variation in the amount of human GAPDH (the number of GAPDH copies described in the left column of Table 2) in each sample before correction was 1.20 to 2.90 × 10 3 , whereas the variation after correction was 1.18. The maximum opening was 1.12 × 10 3 and 1.12 times the maximum, and the variation among the samples was further reduced.
From these results, it is clear that by using the quantification method of the present invention, a reliable quantification result more accurately reflecting the target substance amount ratio between samples can be obtained.
［実施例２］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人５名の糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号５の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、配列番号６の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２、及び、５’末端が６−ＦＡＭ、３’末端がＴＡＭＲＡでそれぞれ標識された１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによる定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は５名からそれぞれ分取した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、１μＬの各ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２をそれぞれ最終濃度が２００ｎＭとなるように、また、１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを最終濃度が１００ｎＭとなるように、それぞれ添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。調製したＰＣＲ溶液を用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行い、各ＰＣＲ溶液の６−ＦＡＭの蛍光強度を解析することにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
[Example 2]
Using mRNA of 16S rRNA gene of bacteria as a standard substance, mRNA of human GAPDH gene contained in feces was quantified.
<Quantification of reference material and calculation of correction factor>
Quantitative PCR using nucleic acids derived from bacteria in stool samples of 5 healthy individuals was performed using primers having base sequences common to 16S rRNA genes of various bacterial species, and the copy number of bacterial 16S rRNA genes was measured. Specifically, the forward primer 2 for 16S rRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 5, the reverse primer 2 for 16S rRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 6, and the 6′-FAM at the 5 ′ end and the 3 ′ end at the 3 ′ end Quantitative PCR by TaqMan PCR was performed using a TaqMan probe for 16S rRNA labeled with TAMRA.
First, about 1 g of stool of a healthy person was quickly collected into a 5 mL tube after stool collection, frozen with liquid nitrogen, and stored at −80 ° C. Feces were collected from 5 persons. Thereafter, after preparing cDNA solutions in the same manner as in Example 1, 12.5 μL of 2 × TaqMan PCR master mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems) was added to 1 μL of each cDNA solution, and forward primer for 16S rRNA. 2 and 16S rRNA reverse primer 2 were added to a final concentration of 200 nM, and 16S rRNA TaqMan probe was added to a final concentration of 100 nM, respectively, so that the final volume was 25 μL. A solution was prepared. TaqMan PCR was performed using the prepared PCR solution, and the 6-FAM fluorescence intensity of each PCR solution was analyzed to calculate the copy number of bacterial 16S rRNA.
表３の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料２−１〜５の約１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で３．９倍の開きが見られた。 The left column in Table 3 shows the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample (in about 1 g of stool) obtained as a result of real-time PCR, and the right column shows the bacterial 16S rRNA in sample 1-1 of Example 1. The ratio (correction coefficient) of the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample calculated with a copy number of 1.0 is shown. The amount of rRNA in about 1 g of feces of Samples 2-1 to 5 was found to be 3.9 times as large as the maximum.
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料２−１〜５の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表３記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
<Quantification and correction of target substance>
In the same manner as in Example 1, the number of copies of human GAPDH in each sample of Samples 2-1 to 5 was calculated. The human GAPDH copy number after correction was calculated by dividing the obtained human GAPDH copy number by the correction coefficient shown in Table 3.
表４の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表３記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表４左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．９０〜８．５０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは０．９１〜１．７６×１０３と最大で１．９倍の開きであり、同一被験者由来の試料間の比較である実施例１の結果に比べるとバラツキは大きかったが、補正をすることにより、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
The left column of Table 4 shows the copy number of human GAPDH in each sample (about 1 g of stool) obtained as a result of real-time PCR, the middle column shows the correction factor described in Table 3, and the right column shows human GAPDH after correction. The number of copies (the number of copies described in the left column divided by the correction coefficient described in the middle column) is shown respectively. The variation in the amount of human GAPDH (the number of GAPDH copies described in the left column of Table 4) in each sample before correction was 1.90 to 8.50 × 10 3 , whereas the variation after correction was 0.91. It is 1.9 times as large as ˜1.76 × 10 3 , and the variation was large compared to the result of Example 1, which is a comparison between samples derived from the same subject. There was less variation between each sample.
From these results, it is clear that by using the quantification method of the present invention, a reliable quantification result more accurately reflecting the target substance amount ratio between samples can be obtained.
［実施例３］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、採取後一定期間経過した唾液中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、採取後の時間経過の異なる唾液試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。
まず、健常人の唾液を、採取後速やかに５ｍＬチューブに約１ｍＬずつ分取した。唾液は一人由来のものを３個分（試料３−１〜３）に分取した。それぞれの唾液試料に、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合し、試料３−１は直ちに、試料３−２は室温で３時間静置した後、試料３−３は室温で８時間静置した後、それぞれＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、全ＲＮＡを抽出した。その後、該ＲＮＡの一部を用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
[Example 3]
Using mRNA of 16S rRNA gene of bacteria as a standard substance, mRNA of human GAPDH gene contained in saliva after a certain period of time was collected.
<Quantification of reference material and calculation of correction factor>
The same sample is subdivided, and bacteria-derived nucleic acids in saliva samples with different time courses after collection are subjected to quantitative PCR using primers having base sequences common to 16S rRNA genes of various bacterial species. The gene copy number was measured.
First, about 1 mL each of normal human saliva was collected into a 5 mL tube immediately after collection. Saliva was sampled into three (samples 3-1 to 3) from one person. To each saliva sample, 6 × 10 4 cells of human gastric cancer cell line MKN45 cells highly expressing the cox-2 gene were added and mixed. Sample 3-1 was immediately mixed, and sample 3-2 was 3 at room temperature. After standing for a period of time, Sample 3-3 was allowed to stand at room temperature for 8 hours, and then total RNA was extracted using RNeasy midi kit (manufactured by Qiagen). Thereafter, a cDNA solution was prepared using a part of the RNA in the same manner as in Example 1, and then real-time PCR was performed to calculate the copy number of bacterial 16S rRNA.
表５の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例３の試料３−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料３−１〜３の約１ｍＬの唾液中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。なお、同一の唾液から等量採取した試料であるにもかかわらず、試料３−３に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数が、試料３−１や３−２よりも顕著に少なかったのは、採取後室温で静置されている間に核酸の分解が進行したためと考えられる。 The left column of Table 5 shows the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample (in about 1 mL of saliva) obtained as a result of real-time PCR, and the right column shows the bacterial 16S rRNA in sample 3-1 of Example 3. The ratio (correction coefficient) of the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample calculated with a copy number of 1.0 is shown. The amount of rRNA in about 1 mL of saliva of Samples 3-1 to 3 was observed to be 2.3 times as large as the maximum. Note that the number of 16S rRNA copies contained in Sample 3-3 was significantly smaller than Samples 3-1 and 3-2 in spite of the same amount of sample collected from the same saliva. This is considered to be due to the progress of nucleic acid degradation during standing at room temperature.
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料３−１〜３の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表５記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
<Quantification and correction of target substance>
In the same manner as in Example 1, the copy number of human GAPDH in each sample of Samples 3-1 to 3-1 was calculated. The human GAPDH copy number after correction was calculated by dividing the obtained human GAPDH copy number by the correction coefficient shown in Table 5.
表６の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表５記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表６左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは２．３０〜５．１０×１０６であったのに対し、補正後のバラツキは５．１０〜５．５１×１０６と最大で１．０５倍の開きであり、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料中の細菌による分解の影響等が抑えられ、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
The left column of Table 6 shows the number of copies of human GAPDH in each sample (in about 1 mL of saliva) obtained as a result of real-time PCR, the middle column shows the correction factor described in Table 5, and the right column shows human GAPDH after correction. The number of copies (the number of copies described in the left column divided by the correction coefficient described in the middle column) is shown respectively. The variation in the amount of human GAPDH (the number of GAPDH copies described in the left column of Table 6) in each sample before correction was 2.30 to 5.10 × 10 6 , whereas the variation after correction was 5.10. The opening was 1.05 times as large as ˜5.51 × 10 6, and the variation among the samples was further reduced.
From these results, by using the quantification method of the present invention, the influence of degradation by bacteria in the sample is suppressed, and a reliable quantification result that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples can be obtained. It is clear.
［実施例４］
大腸癌患者由来の糞便中には、ｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡ等が、健常者由来の糞便中よりも多く存在していることが報告されている。これは、大腸癌患者において、ｃｏｘ−２遺伝子が高発現するためと考えられている。そこで、健常人の糞便に対し、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合させたものを、擬似大腸癌患者糞便とし、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、擬似大腸癌患者糞便中に含まれているヒトｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人由来の糞便を、１０ｍＬチューブに約１ｇずつ３本、０．２５ｇずつ３本に分取し、１ｇのものには、ＭＫＮ４５細胞を１×１０、１×１０２、１×１０３ｃｅｌｌｓずつ、０．２５ｇのものには、２、２×１０、２×１０２ｃｅｌｌｓずつ、それぞれ添加して混合した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
[Example 4]
It has been reported that cox-2 gene mRNA and the like are present in stool derived from colorectal cancer patients more than in stool derived from healthy subjects. This is considered because the cox-2 gene is highly expressed in colorectal cancer patients. Therefore, human stomach cancer-derived cell line MKN45 cells that highly express the cox-2 gene and 6 × 10 4 cells added to and mixed with feces of healthy humans were used as feces of pseudo colon cancer patients, Using the mRNA of 16S rRNA gene as a standard substance, the mRNA of human cox-2 gene contained in the feces of pseudo colorectal cancer patients was quantified.
<Quantification of reference material and calculation of correction factor>
The stool from a healthy person is divided into 3 pieces of about 1 g each in a 10 mL tube and 3 pieces each of 0.25 g, and 1 g of MKN45 cells are 1 × 10, 1 × 10 2 , 1 × 10 3 cells. For each 0.25 g sample, 2, 2 × 10, and 2 × 10 2 cells were added and mixed, and then frozen using liquid nitrogen and stored at −80 ° C. Thereafter, a cDNA solution was prepared in the same manner as in Example 1, and then real-time PCR was performed to calculate the copy number of bacterial 16S rRNA.
表７の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。 The left column of Table 7 shows the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample obtained as a result of real-time PCR, and the right column shows the copy number of bacterial 16S rRNA in sample 1-1 of Example 1. Is the ratio (correction coefficient) of the copy number of bacterial 16S rRNA in each sample calculated as.
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号８の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用フォワードプライマーと配列番号９の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用リバースプライマーを用いた以外は、実施例１における細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出した。一試料あたりのヒトｃｏｘ−２のコピー数が１×１０６以上である場合に、大腸癌陽性と判定した。また、得られたヒトｃｏｘ−２のコピー数を、表７記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出し、各試料が大腸癌陽性か陰性かの判定を行った。
<Quantification and correction of target substance>
Instead of the forward primer 1 for 16S rRNA and the reverse primer 1 for 16S rRNA, a forward primer for human cox-2 having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a reverse primer for human cox-2 having the base sequence of SEQ ID NO: 9 are used. The copy number of human cox-2 was calculated in the same manner as the calculation of the copy number of bacterial 16S rRNA in Example 1. When the number of copies of human cox-2 per sample was 1 × 10 6 or more, it was determined that colorectal cancer was positive. In addition, by dividing the obtained copy number of human cox-2 by the correction coefficient described in Table 7, the corrected copy number of human cox-2 was calculated, and whether each sample was positive or negative for colorectal cancer Judgment was made.
表８の左から２列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数を、左から３列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られたコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、左から４列目は表７記載の補正係数を、左から５列目は補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数（左から２列目記載のコピー数を左から４列目記載の補正係数で除したもの）を、左から５列目は補正後のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、それぞれ示したものである。
補正前の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行ったところ、試料４−５は陰性と判定されたが、補正後の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて行うと、試料４−５は陽性と判定することができた。
The second column from the left in Table 8 shows the copy number of human cox-2 in each sample obtained as a result of real-time PCR, and the third column from the left shows the colorectal cancer based on the copy number obtained as a result of real-time PCR. The result of the determination is that the fourth column from the left is the correction coefficient described in Table 7, the fifth column from the left is the corrected human cox-2 copy number (the copy number described in the second column from the left is the copy number from the left The fifth column from the left shows the results of colorectal cancer determination based on the corrected copy number, respectively.
When colon cancer was determined based on the copy number of human cox-2 in each sample before correction, sample 4-5 was determined to be negative, but human cox-2 in each sample after correction was determined to be negative. Based on the number of copies, Sample 4-5 could be determined as positive.
［実施例５］
大腸菌のｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。大腸菌ｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡ量は、配列番号１０の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用リバースプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行うことにより定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一健常人由来の便を、５ｍＬチューブに３ｇ採取し、ＭＫＮ４５細胞を３×１０２ｃｅｌｌｓ添加して混合したものから、０．５ｇと１ｇをそれぞれ５ｍＬチューブに分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、ＤＮＡとＲＮＡを同時に抽出する方法で核酸を回収した。具体的には、各試料をグアニジンチオシアネートの存在下でホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、１ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ８．０）を添加してｖｏｒｔｅｘを用いて攪拌した。その後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をし、得られた水層を分取後、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、４℃で１６，０００×ｇ、５分間の遠心分離処理をし、得られた水層をさらに分取した。その後、得られた水層に０．６倍量のイソプロパノールと１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加して攪拌した後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をすることにより、全核酸を含むペレットを得た。該ペレットに対して５００μＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールでリンスし、風乾後、５０μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）に溶解させることにより、約５０μＬの全核酸溶液を得た。
[Example 5]
Using the genomic DNA of gus A of E. coli as a standard substance, mRNA of human GAPDH gene contained in feces was quantified. The amount of genomic DNA of E. coli gus A was quantified by quantitative PCR using a gus A forward primer having the base sequence of SEQ ID NO: 10 and a gus A reverse primer having the base sequence of SEQ ID NO: 11.
<Quantification of reference material and calculation of correction factor>
3 g of stool from the same healthy person was collected in a 5 mL tube, and 0.5 g and 1 g were each dispensed to a 5 mL tube from 3 × 10 2 cells added and mixed with liquid nitrogen. Frozen and stored at -80 ° C. Thereafter, the nucleic acid was recovered by a method in which DNA and RNA were simultaneously extracted. Specifically, each sample was homogenized using a homogenizer in the presence of guanidine thiocyanate, 1 mL of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1, pH 8.0) was added, and the mixture was stirred using vortex. did. Thereafter, the mixture was centrifuged at 16,000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the obtained aqueous layer was collected, and then an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 16 minutes. Centrifugation treatment was performed at 1,000,000 g for 5 minutes, and the resulting aqueous layer was further separated. Thereafter, 0.6 times the amount of isopropanol and 1/10 times the amount of 3M sodium acetate solution were added to the obtained aqueous layer and stirred, followed by centrifugation at 16,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. By doing this, a pellet containing the total nucleic acid was obtained. The pellet is rinsed with 500 μL of 70% (vol / vol) ethanol, air-dried, and dissolved in 50 μL of RNase free Tris-EDTA buffer (pH 7.4) to obtain about 50 μL of a total nucleic acid solution. It was.
５μＬの該全核酸溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、ｇｕｓ Ａ用リバースプライマーをそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、実施例１と同様にしてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行い、大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡ量を測定した。 To 5 μL of the total nucleic acid solution, 12.5 μL of 2 × TaqMan PCR master mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems) was added, and the final concentrations of gus A forward primer and gus A reverse primer were 900 nmol, respectively. The PCR solution was prepared so that the final volume was 25 μL. The PCR solution was subjected to SYBR green PCR analysis in the same manner as in Example 1 to measure the amount of E. coli gus A genomic DNA.
表９の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を、右欄は、試料５−１中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。 The left column of Table 9 shows the copy number of E. coli gus A genomic DNA in each sample obtained as a result of real-time PCR, and the right column shows the copy number of E. coli gus A genomic DNA in sample 5-1. Represents the ratio (correction coefficient) of the copy number of E. coli gus A genomic DNA in each sample.
＜標的物質の定量と補正＞
５μＬの該全核酸溶液をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液を鋳型とした以外は全て実施例１と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表９記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
<Quantification and correction of target substance>
5 μL of the total nucleic acid solution was reverse-transcribed using River Script II (registered trademark) (reaction volume 20 μL, Wako Pure Chemical Industries) and random primers to obtain about 20 μL of cDNA solution. Further, the copy number of human GAPDH was calculated in the same manner as in Example 1 except that 1 μL of the cDNA solution was used as a template. The human GAPDH copy number after correction was calculated by dividing the obtained human GAPDH copy number by the correction coefficient shown in Table 9.
表１０の左欄はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表９記載の補正係数を、右欄は補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）を、それぞれ示したものである。補正を行うことにより、初期便量の差を補正し、等量のＧＡＰＤＨを検出することができた。 The left column of Table 10 is the copy number of human GAPDH in each sample obtained as a result of real-time PCR, the middle column is the correction factor described in Table 9, the right column is the copy number of human GAPDH after correction (described in the left column) (The number of copies divided by the correction factor described in the middle column). By performing the correction, the difference in the initial stool volume was corrected, and an equal amount of GAPDH could be detected.
本発明の標的物質の定量方法により、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができるため、本発明の標的物質の定量方法は、医療診断のための臨床検査の分野において特に有用であり、遺伝学、分子生物学、生化学等の分野でも利用が可能である。 With the target substance quantification method of the present invention, even if the target substance is a biologically related substance of a biological species that exists in a relatively small amount in the sample, it is a highly reliable quantification that more accurately reflects the target substance amount ratio between samples. Since the results can be obtained, the target substance quantification method of the present invention is particularly useful in the field of clinical tests for medical diagnosis, and can be used in fields such as genetics, molecular biology, and biochemistry. is there.
Claims (19)
各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、
前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、
（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、
（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、
を有することを特徴とする、標的物質の定量方法。 A method for quantifying each target substance contained in two or more samples,
Each sample contains a standard substance that is different from the target substance.
The standard substance is a biological substance of a biological species different from the target substance,
(A) measuring the amount of standard substance in each sample and determining the ratio of the amount of standard substance in each sample;
(B) measuring the amount of target substance in each sample;
(C) correcting the target substance amount in each sample obtained in step (b) using the ratio of the standard substance amount in each sample obtained in step (a);
A method for quantifying a target substance, comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008006761A JP2009165401A (en) | 2008-01-16 | 2008-01-16 | Method for determining target substance |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008006761A JP2009165401A (en) | 2008-01-16 | 2008-01-16 | Method for determining target substance |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009165401A true JP2009165401A (en) | 2009-07-30 |
Family
ID=40967333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008006761A Pending JP2009165401A (en) | 2008-01-16 | 2008-01-16 | Method for determining target substance |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009165401A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017508464A (en) * | 2014-03-03 | 2017-03-30 | インスティトゥート ディンベスティガシオ ビオメディカ デ ジローナ ドクトル ジュゼップ トルエタ | Method, primer and kit for diagnosing colon cancer from human stool samples by quantitative PCR |
-
2008
- 2008-01-16 JP JP2008006761A patent/JP2009165401A/en active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6012066524; Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２００５， Ｖｏｌ．３８， Ｎｏ．４， ｐ．５７９-５８６ * |
| JPN6012066525; Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． ２００５， Ｖｏｌ．５， Ｎｏ．２， ｐ．２２１-２３０ * |
| JPN6012066526; Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００４， Ｖｏｌ．７０， Ｎｏ．７， ｐ．４１６５-４１６９ * |
| JPN6012066527; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ． ２００５， Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．２， ｐ．１０１-１０９ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017508464A (en) * | 2014-03-03 | 2017-03-30 | インスティトゥート ディンベスティガシオ ビオメディカ デ ジローナ ドクトル ジュゼップ トルエタ | Method, primer and kit for diagnosing colon cancer from human stool samples by quantitative PCR |
| JP2020146052A (en) * | 2014-03-03 | 2020-09-17 | フンダシオ インスティトゥート ディンベスティガシオ ビオメディカ デ ジローナ ドクトル ジュゼップ トルエタ | Method, primers and kits for diagnosing colorectal cancer from human fecal samples by quantitative pcr |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2004535771A (en) | Method for determining chemotherapeutic agent dosing regimen based on ERCC1 and TS expression | |
| JPWO2009057695A1 (en) | Method for detecting adenoma or cancer by genetic analysis | |
| KR102178922B1 (en) | Biomarker microRNA let-7 or microRNA-150 for diagnosing diabetic nephropathy and use thereof | |
| EP3489365A1 (en) | Composition for predicting risk of or diagnosing metabolic syndrome or metabolic syndrome associated disorders by using oral bacterial community | |
| WO2018062361A1 (en) | Method for determining onset risk of sporadic colon cancer | |
| JPWO2014136870A1 (en) | Simple detection method for RNA modification, and method for testing type 2 diabetes using the detection method | |
| EP4006151A1 (en) | Esophageal cancer biomarker and use therefor | |
| KR20180113702A (en) | A method for diagnosis of BK virus nephropathy using urine exosome-derived virus miRNA | |
| CN107419008B (en) | Method and kit for accurately diagnosing Parkinson's disease in early stage | |
| WO2017107545A1 (en) | Scap gene mutant and application thereof | |
| CN103820545A (en) | Probes, primers and kits for detecting ABCG2 gene mutations | |
| CN113724862A (en) | Colorectal cancer biomarker and screening method and application thereof | |
| JP5806122B2 (en) | How to detect ulcerative colitis | |
| CN109593849B (en) | Plasma LncRNA marker related to colorectal cancer and application thereof | |
| KR102178919B1 (en) | Biomarker microRNAs for diagnosing diabetic nephropathy and use thereof | |
| CN110637093B (en) | Judgment marker and judgment method for parkinson's disease | |
| CN107326092B (en) | Application of colorectal cancer-related miRNA as biomarker and colorectal cancer detection kit | |
| KR101381894B1 (en) | Serum miRNA as a marker for the diagnosis of lymph node metastasis of gastric cancer | |
| JP2009165401A (en) | Method for determining target substance | |
| WO2011004517A1 (en) | Method for detection of target nucleic acid, and method for testing for colorectal cancer | |
| CN111808961B (en) | Biomarker group for detecting liver cancer and application thereof | |
| US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
| KR102165841B1 (en) | Biomarker microRNA let-7b or microRNA-664a for diagnosing diabetes and use thereof | |
| CN113025707A (en) | Application of biomarker in preparation of product for diagnosing damp-heat spleen-encumbering type 2 diabetes and kit | |
| CN114196747A (en) | Biomarker related to occurrence and development of metabolic-related fatty liver disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121221 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130416 |