JP2009165352A

JP2009165352A - ACYL-CoA:ETHANOL O-ACYLTRANSFERASE/ESTERASE GENE AND USE THEREOF

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Publication number: JP2009165352A
Application number: JP2006049122A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Nakao; 嘉宏中尾; Yukiko Kodama; 由紀子児玉; Tomoko Fujimura; 朋子藤村
Original assignee: Suntory Liquors Ltd
Current assignee: Suntory Liquors Ltd
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2009-07-30
Also published as: WO2007097094A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a brewing yeast having a controlled ester-producing ability, to provide a method for producing an alcoholic drink using the same and having an increased or decreased ester content with the yeast. <P>SOLUTION: An acyl-CoA:ethanol O-acyltransferase/esterase gene is transferred through a vector to obtain a transformant yeast for producing an alcoholic drink excellent in flavor, and the yeast is used to produce the alcoholic drink. More concretely, a yeast in which the ester synthesis ability contributing to the flavor of a product is obtained by regulating the expression amount of a gene EEB1 encoding EEb1p which is the acyl-CoA:ethanol O-acyltransferase/esterase in a brewing yeast, in particular, non-ScEEB1 gene characteristic of beer yeast, and the yeast is used to produce the alcoholic drink. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEeb1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnon-ScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。 The present invention relates to an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene and uses thereof, and more particularly, to a brewing yeast that produces liquor with excellent flavor, liquor produced using the yeast, a production method thereof, and the like. More specifically, the present invention controls the expression level of the gene EEB1 encoding Eeb1p, an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase of brewing yeast, particularly the non-ScEEB1 gene characteristic of beer yeast. The yeast which controlled the production | generation ability of the ester which contributes to the flavor of a product by this, the manufacturing method of liquor using the said yeast, etc.

酒類においてエステルは重要な重要な香り成分の１つである。清酒やワイン、ウイスキーなどではエステルの増加は酒に華やかな香りをもたらし、官能的に高い評価をもたらすことが知られている。一方ビールにおいてはエステルは重要な香気成分ではあるが、過剰なエステルはエステル臭として嫌われる。従って酒の種類によってエステル生成量を適度に制御することが重要である。
これまでに、酒のエステル含量を高める目的でエステル高生産酵母が育種されている。酵母に変異処理を施し、(または施さずに)エステル高生産酵母を効率よく分離するために，セルレニン等の脂肪酸合成酵素を阻害する薬剤含有培地で、カプロン酸を高生産する能力のある菌株を取得する方法、及び５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン等のロイシンアナログ含有培地で、イソアミルアルコール、酢酸イソアミルを高生産する菌株を取得する方法（特許文献１：特開2002-253211号公報）、３位が水酸化されたプレグナン骨格を有するステロイドを含有する培地で生育した菌株を取得する方法（特許文献２：特開2002-191355号公報）等がすでに報告されている。 Esters are one of the important and important scent components in liquors. It is known that in sake, wine, whiskey, etc., an increase in ester brings a gorgeous fragrance to the sake, giving a high sensory evaluation. On the other hand, ester is an important aroma component in beer, but excess ester is disliked as an ester odor. Therefore, it is important to appropriately control the amount of ester produced depending on the type of liquor.
So far, high ester-producing yeast has been bred for the purpose of increasing the ester content of sake. In order to efficiently isolate yeast with high ester production by performing mutation treatment on yeast (or without it), a strain containing a drug-inhibiting medium that inhibits fatty acid synthase such as cerulenin is used to produce a strain capable of producing caproic acid at a high level. And a method for obtaining a strain that highly produces isoamyl alcohol and isoamyl acetate in a medium containing leucine analog such as 5,5,5-trifluoro-DL-leucine (Patent Document 1: JP 2002-253211 A). Publication) A method for obtaining a strain grown on a medium containing a steroid having a pregnane skeleton hydroxylated at the 3-position (Patent Document 2: JP 2002-191355 A) has already been reported.

一方、遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法ではSaccharomyces cerevisiaeのアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF１を醸造用酵母で高発現させた例（特許文献３：特開平06-062849号公報）や、ATF１の発現を抑制した例（特許文献４：特開平06-253826号公報）、醸造用酵母のエステラーゼ遺伝子EST2を破壊し、エステル量を増加させた例（特許文献５：特開平09-234077号公報）が報告されている。また、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子EEB1を破壊することにより、中鎖脂肪酸エステルが減少することが報告されている(非特許文献１)。一方でEEB1破壊により酢酸エステルが増加することも報告されている(非特許文献２)。
特開2002-253211号公報特開2002-191355号公報特開平06-062849号公報特開平06-253826号公報特開平09-234077号公報 J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006 ASBC 2002 meeting Abstract P-6 、[online]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm＞ On the other hand, in the method of breeding yeast using gene manipulation techniques, an example in which the alcohol acetyltransferase gene ATF1 of Saccharomyces cerevisiae is highly expressed in brewing yeast (Patent Document 3: JP 06-062849 A), and expression of ATF1 (Patent Document 4: Japanese Patent Laid-Open No. 06-253826), an example of destroying the esterase gene EST2 of brewing yeast and increasing the amount of ester (Patent Document 5: Japanese Patent Laid-Open No. 09-234077) It has been reported. It has also been reported that medium chain fatty acid esters are reduced by destroying acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene EEB1 (Non-patent Document 1). On the other hand, it has also been reported that acetate is increased by EEB1 destruction (Non-patent Document 2).
JP 2002-253211 A JP 2002-191355 A JP 06-062849 A Japanese Patent Laid-Open No. 06-253826 JP 09-234077 J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006 ASBC 2002 meeting Abstract P-6, [online], Internet <URL: http://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm>

上述のとおり、製品中のエステル含量を増大させるために、変異株の取得が行なわれているが、その結果予期せぬ発酵遅延や、好ましくない香味成分の増加が認められる場合もあり、実用酵母とするには問題があった。このことから、発酵速度や製品の品質を損なうことなく、望みの量のエステルを生産できる酵母の育種方法が望まれていた。 As described above, mutant strains have been obtained in order to increase the ester content in the product, but as a result, unexpected fermentation delays and undesired increases in flavor components may be observed. There was a problem with it. For this reason, there has been a demand for a yeast breeding method capable of producing a desired amount of ester without impairing the fermentation rate and product quality.

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が減少すること、また、得られた遺伝子の発現を抑制させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が増加、中鎖脂肪酸エステル生成量が減少することを確認して、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have identified and isolated a gene encoding an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase that has an advantageous effect over known proteins from brewer's yeast. Succeeded in doing. In addition, a transformed yeast in which the obtained gene is introduced into the yeast to be expressed is produced, the production amount of acetate ester is decreased, and a transformed yeast in which the expression of the obtained gene is suppressed is produced. The present invention was completed by confirming that the ester production amount increased and the medium chain fatty acid ester production amount decreased.

すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のエステル生成量の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。 That is, the present invention relates to a novel acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene characteristically present in brewer's yeast, a protein encoded by the gene, a transformed yeast in which expression of the gene is regulated, and expression of the gene The present invention relates to a method for controlling the amount of ester produced in a product by using yeast in which the pH is controlled. Specifically, the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.

（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 (1) The polynucleotide according to any one of the following (a) to (f):
(a) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(c) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding
(d) containing a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide;
(e) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide containing nucleotides; and
(f) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and acyl CoA: ethanol O-acyl A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having transferase / esterase activity.

（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。 (2) The polynucleotide according to (1) above, which is any of the following (g) to (i):
(g) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and acyl CoA: ethanol O- A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acyltransferase / esterase activity;
(h) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide; and
(i) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions, and acyl CoA: ethanol A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having O-acyltransferase / esterase activity.
(3) The polynucleotide according to (1) above, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(4) The polynucleotide according to (1) above, which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(5) The polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, which is DNA.
(6) The polynucleotide according to any one of the following (j) to (m):
(j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above;
(k) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (5) above by an RNAi effect;
(l) a polynucleotide encoding an RNA having an activity of specifically cleaving the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; and
(m) A polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (5) above by a co-suppression effect.
(7) A protein encoded by the polynucleotide according to any one of (1) to (4) above.

（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８a）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（３）に記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。 (8) A vector containing the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
(8a) The vector according to (8) above, comprising an expression cassette comprising the following components (a) to (c):
(a) Promoter capable of transcription in yeast cells
(b) the polynucleotide according to any one of (1) to (3) above bound to the promoter in the sense direction or the antisense direction; and
(c) Signals that function in yeast for transcription termination and polyadenylation of RNA molecules.
(9) A vector containing the polynucleotide according to (6) above.

（１０）上記（８）又は（９）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）上記（８）に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が低下した上記(１０)に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。（１３）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が低下した上記（１１）に記載の醸造用酵母。 (10) A transformed yeast introduced with the vector according to (8) or (9) above.
(11) The yeast for brewing according to (10) above, wherein ester production ability is reduced by introducing the vector according to (8) above.
(12) The polynucleotide according to (5) above by introducing the vector according to (9) above or by destroying the gene related to the polynucleotide (DNA) according to (5) above ( Brewing yeast in which expression of DNA) is suppressed. (13) The yeast for brewing according to (11), wherein ester production ability is reduced by increasing the expression level of the protein according to (7).

（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８)配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
（１８a）上記（１８）に記載の方法によって、エステル生成能が高い、あるいは低い酵母を選別する方法。
（１８b）上記（１８a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。 (14) A method for producing an alcoholic beverage using the yeast according to any one of (10) to (13) above.
(15) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.
(16) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.
(17) Alcoholic beverages produced by the method according to any one of (14) to (16) above.
(18) A method for evaluating the ester-producing ability of a test yeast using a primer or probe designed based on the base sequence of an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
(18a) A method for selecting yeast having high or low ester-producing ability by the method described in (18) above.
(18b) A method for producing an alcoholic beverage (for example, beer) using the yeast selected by the method described in (18a) above.

（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
（２０）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２０ａ）被検酵母を培養して、エステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を測定し、目的とするエステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２３）上記（１０）〜（１３）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。 (19) A method for evaluating the ester-producing ability of a test yeast by culturing the test yeast and measuring the expression level of an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1. .
(20) The test yeast is cultured, and the protein described in (7) above is quantified or the expression level of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured. A method for selecting a yeast, comprising selecting a test yeast having the protein amount or the gene expression amount according to the ester production ability.
(20a) The test yeast is cultured, and the ester-forming ability or acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity is measured, and the target ester-producing ability or acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity is measured. A method for selecting yeast, wherein a yeast test is selected.
(21) The reference yeast and the test yeast are cultured, and the expression level of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in each yeast is measured. The method for selecting yeast according to (20) above, wherein a test yeast having high expression or low expression is selected.
(22) The reference yeast and the test yeast are cultured, the protein according to (7) above in each yeast is quantified, and the test yeast having a larger or smaller amount of the protein than the reference yeast is selected (20 ) Selection method of yeast. That is, the yeast according to (20) above, wherein a plurality of yeasts are cultured to quantify the protein according to (7) in each yeast, and a test yeast having a large or small amount of the protein is selected among them. How to choose.
(23) Fermentation for liquor production is performed using any one of the yeast described in (10) to (13) above and the yeast selected by the method described in (20) to (22) above, A method for producing alcoholic beverages, characterized in that the amount of ester production is adjusted.

本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、エステル含量を制御することができるため、香味に優れた酒類を製造することが可能となる。 According to the method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast of the present invention, since the ester content can be controlled, it is possible to produce alcoholic beverages with excellent flavor.

本発明者らは、酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を増大もしくは減少させることによって、エステルの量を制御することが可能であると考えた。本発明者らは、このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードするnonScEEB1遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。 The inventors thought that the amount of ester could be controlled by increasing or decreasing the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity of the yeast. Based on the beer yeast genome information decoded by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-283169, the present inventors have conducted research based on such an idea, and based on the beer yeast genome information decoded by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-283169, A nonScEEB1 gene encoding transferase / esterase was isolated and identified. This base sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the protein encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2.

１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えばSaerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。 1. Polynucleotide of the Present Invention First, the present invention provides (a) a polynucleotide containing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (specifically, DNA, hereinafter, these are also simply referred to as “DNA”); And (b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The DNA of interest in the present invention is not limited to DNA encoding the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene derived from the brewer's yeast, and encodes a protein functionally equivalent to this protein. Contains other DNA. Examples of the functionally equivalent protein include (c) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and acyl CoA: Examples include proteins having ethanol O-acyltransferase / esterase activity. As such a protein, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-3 30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-21 20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 A protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added, and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity And the like. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better. Such proteins include (d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% More than 89%, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more of the amino acid sequence, and acyl CoA: ethanol O-acyl Examples include proteins having transferase / esterase activity. In general, the larger the homology value, the better. The acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity can be measured, for example, by the method of Saerens et al. (J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006).

また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。 The present invention also relates to (e) hybridization with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity. A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having; and (f) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a stringent condition Also included are polynucleotides that contain a polynucleotide that hybridizes underneath and encodes a protein having acyl-CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity.

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。 Here, “polynucleotide (DNA) that hybridizes under stringent conditions” means DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method or the like using all or a part of the above as a probe. As a hybridization method, for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.

本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。 In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol supplied with the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.

これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 Other than this, as DNA that can be hybridized, when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA and BLAST, about 60% or more of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; About 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82 % Or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8 % Or more and 99.9% or more of DNA having the identity.
The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 90). 5873, 1993). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to score = 50 and wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.

さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。 Furthermore, the polynucleotide of the present invention is (j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; (k) the above (5) (1) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (1) by an RNAi effect; (l) an activity that specifically cleaves the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to (5) above; And (m) a polynucleotide encoding RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) above by a co-suppression effect. These polynucleotides are incorporated into a vector, and can further suppress the expression of the polynucleotides (DNA) (a) to (i) above in a transformed cell into which the vector has been introduced. Therefore, it can be suitably used when it is preferable to suppress the expression of the DNA.

本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。 In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to a transcription product of DNA” refers to so-called antisense DNA. Antisense technology is known as a method for suppressing the expression of a specific endogenous gene, and is described in various literatures (for example, Hirashima and Inoue: Shinsei Kagaku Kougaku Kenkyu 2 Nucleic acid IV Gene replication and expression (Japan) Pp.319-347, 1993, etc.). The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the expression of the gene can be effectively suppressed. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, more preferably 95% or more, with respect to the transcription product of the target gene. The length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more.

本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。 In the present specification, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by RNAi effect” refers to a polynucleotide for suppressing the expression of an endogenous gene by RNA interference (RNAi). “RNAi” refers to a phenomenon in which, when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. . Examples of RNA used herein include double-stranded RNA that causes RNA interference of 21 to 25 bases in length, such as dsRNA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), or shRNA (short hairpin RNA). . Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as a liposome, and can also be locally expressed using a vector capable of producing the double-stranded RNA. Methods for preparing and using such double-stranded RNA (dsRNA, siRNA or shRNA) are known from many literatures (Japanese Patent Publication No. 2002-516062; US Publication No. 2002 / 086356A; Nature Genetics). , 24 (2), 180-183, 2000 Feb .; Genesis, 26 (4), 240-244, 2000 April; Nature, 407: 6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol. 16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99 (8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296 (5567), 550-553 , 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99: 9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46, 2002 May 15 etc.).

本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。 In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having an activity of specifically cleaving a transcript of DNA” generally refers to a ribozyme. A ribozyme is an RNA molecule having catalytic activity, which inhibits the function of the gene by cleaving the target DNA transcript. Various known literatures can also be referred to for ribozyme design (eg, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323). : 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992 etc.). In addition, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by co-suppression” refers to a nucleotide that inhibits the function of the target DNA by “co-suppression”.

本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。 In the present specification, “co-suppression” refers to the expression of a foreign gene and a target endogenous gene introduced by introducing a gene having a sequence identical or similar to the target endogenous gene into a cell by transformation. Both are phenomena that are suppressed. Various known literatures can also be referred to for designing a polynucleotide having a co-suppression effect (for example, Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996, etc.) reference).

２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。 2. Protein of the present invention The present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (i). A preferred protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase It is a protein having activity. Such a protein includes an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and acyl CoA: ethanol O- Examples include proteins having acyltransferase / esterase activity. Examples of such a protein include a protein having an amino acid sequence having homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity. Such proteins are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like.

本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。 The deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence It means that there are amino acid residue deletion, substitution, insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; group C: asparagine, glutamine; group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E : Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.

また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 The protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also.

３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）又は上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。 3. Next, the present invention provides a vector containing the polynucleotide described above. The vector of the present invention contains the polynucleotide (DNA) described in any of (a) to (i) above or the polynucleotide described in any of (j) to (m) above. In addition, the vector of the present invention usually contains (a) a promoter capable of being transcribed in yeast cells; (b) any one of the above (a) to (i) bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction. The described polynucleotide (DNA); and (c) with respect to transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, configured to include an expression cassette comprising as a component a signal that functions in yeast. In the present invention, when the protein of the present invention is highly expressed in beer brewing described later, the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of the above (a) to (i) is promoted. These polynucleotides are introduced in the sense direction with respect to the promoter. In addition, in the brewing of beer described later, when the expression of the protein of the present invention is suppressed, the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of the above (a) to (i) is suppressed. A polynucleotide is introduced in the antisense orientation relative to the promoter. Moreover, when suppressing the expression of the protein of the present invention, it can be introduced into a vector so that the polynucleotide described in any of (j) to (m) above can be expressed. In the present invention, the expression of the DNA or the protein can be suppressed by destroying the target gene (DNA). Gene disruption involves adding or deleting single or multiple bases within a region involved in the expression of a gene product in a target gene, such as the coding region or promoter region, or deleting these entire regions. Can be performed. Such gene disruption methods can be referred to known literature (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979), Methods in Enzymology, 101, 202 (1983), (See Kaihei 6-35826).

酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。 As a vector used for introduction into yeast, any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type) can be used. For example, the YEp type vector is YEp24 (JR Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983), and the YCp type vector is YCp50 (MD Rose et al., Gene, 60, 237 YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) is known as a YIp type vector and can be easily obtained.

酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中のアミノ酸や糖、高級アルコールやエステルなどの濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。 As a promoter / terminator for regulating gene expression in yeast, any combination can be used as long as it functions in brewing yeast and is not affected by the concentration of amino acids, sugars, higher alcohols, esters, etc. in the mash. Good. For example, a promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), a promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), and the like can be used. These genes have already been cloned and are described in detail, for example, in M. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982), and can be easily obtained by known methods.

形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセスカールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセスセレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。 As a selection marker used for transformation, an auxotrophic marker cannot be used in the case of yeast for brewing, so geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 337 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (Hyogo, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et al., Gene, 101, 149, 1991) Is available. The vector constructed as described above is introduced into the host yeast. Examples of the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces. In the present invention, beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus W34 / 70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453, NCYC456, etc. Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used. Furthermore, whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90, wine yeasts such as association wines No. 1, 3 and 4, etc., sake yeasts such as association yeast sake nos. 7 and 9 can be used. However, the present invention is not limited to this. In the present invention, beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used.

酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。 As a yeast transformation method, a publicly known method can be used. For example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, lithium acetate method “J. Bacteriology, 153, p163 (1983) ”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, etc. However, the present invention is not limited to this.
More specifically, the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium “Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)” etc.), and the value of OD600nm is 1-6. Incubate to. The cultured yeast is collected by centrifugation, washed, and pretreated with alkali ion metal ions, preferably lithium ions, at a concentration of about 1-2 M. The cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 μg). Polyethylene glycol, preferably about 4,000 daltons of polyethylene glycol, is added to a final concentration of about 20% to 50%. After standing at about 30 ° C. for about 30 minutes, the cells are heated at about 42 ° C. for about 5 minutes. Preferably, the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes. Thereafter, the transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker. In addition, regarding general cloning techniques, “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” and the like can be referred to.

４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつエステル含量が増加、あるいは減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でエステル含量を制御した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつエステル含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、エステル含量を増加させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。 4). Process for producing liquor of the present invention and liquor obtained by the process The vector of the present invention described above is introduced into a yeast suitable for brewing the liquor to be produced, and the yeast is used to increase the desired liquor and the ester content. Alternatively, it is possible to produce a liquor that is reduced and excellent in flavor. Examples of alcoholic beverages to be targeted include, but are not limited to, beer-taste drinks such as beer and sparkling wine, wine, whiskey, and sake. In the present invention, if necessary, by using a brewing yeast in which the expression of a target gene is suppressed, an alcoholic beverage whose ester content is controlled with a desired alcoholic beverage can be produced. That is, alcohol production using the yeast introduced with the vector of the present invention described above, the yeast in which the expression of the polynucleotide (DNA) of the present invention described above is suppressed or the yeast selected by the yeast evaluation method of the present invention described below. By performing fermentation for the purpose of the above and adjusting (increasing or decreasing) the amount of ester produced, it is possible to produce an alcoholic beverage with the desired alcoholic beverage and with the ester content adjusted (increased or decreased).
In producing these alcoholic beverages, a known method can be used except that the brewer's yeast obtained in the present invention is used instead of the parent strain. Accordingly, the raw materials, production equipment, production management, etc. may be exactly the same as in the conventional method, and the cost for producing an alcoholic beverage with an increased ester content is not increased. That is, according to the present invention, alcoholic beverages with excellent flavor can be produced using existing facilities without increasing costs.

５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。 5. Method for Evaluating Yeast of the Present Invention The present invention uses a primer or probe designed based on the base sequence of an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, The present invention relates to a method for evaluating ester production ability. A general method of such an evaluation method is known, and is described in, for example, WO01 / 040514, JP-A-8-205900, and the like. Hereinafter, this evaluation method will be briefly described.
First, the genome of the test yeast is prepared. As the preparation method, any known method such as Hereford method or potassium acetate method can be used (for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)). Using the obtained genome as a target, using the primer or probe designed based on the base sequence (preferably ORF sequence) of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene, Alternatively, it is examined whether a specific sequence exists for the gene. The primer or probe can be designed using a known method.

遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のエステル生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。 Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known technique. For example, a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used as one primer, and the upstream or downstream of this sequence is used as the other primer. A polynucleotide containing a part or all of the sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used to amplify a yeast nucleic acid by PCR, and the presence or absence of the amplified product and the molecular weight of the amplified product are determined. Measure the size. The number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, preferably 15 to 25 bp. In addition, the base number of the sandwiched portion is usually suitably 300 to 2000 bp.
The reaction conditions for the PCR method are not particularly limited. For example, conditions such as denaturation temperature: 90 to 95 ° C., annealing temperature: 40 to 60 ° C., extension temperature: 60 to 75 ° C., cycle number: 10 times or more should be used. Can do. The obtained reaction product is separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. This method predicts and evaluates the ester-producing ability of the yeast depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include a specific portion of the DNA molecule. Further, by analyzing the base sequence of the amplified product, it is possible to predict and evaluate the above performance more accurately.

また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価することもできる。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択することによって酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。 In the present invention, the test yeast is cultured, and the expression level of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured to thereby determine the ester-producing ability of the test yeast. Can also be evaluated. The acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene expression level is measured by culturing the test yeast and quantifying the mRNA or protein that is the product of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene. Is possible. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. For example, mRNA can be quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein can be quantified by, for example, western blotting (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
Further, the test yeast is cultured, the expression level of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured, and the gene expression level according to the target ester production ability By selecting this yeast, a yeast suitable for brewing a desired liquor can be selected. Alternatively, a reference yeast and a test yeast may be cultured, the gene expression level in each yeast may be measured, and the gene expression levels of the reference yeast and the test yeast may be compared to select a desired yeast. Specifically, for example, the reference yeast and the test yeast are cultured, and the expression level in each yeast of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured. In addition, a yeast suitable for brewing alcoholic beverages can be selected by selecting a test yeast with high or low expression of the gene.

あるいは、被検酵母を培養して、エステル生成能の高いまたは低い、あるいはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。エステル生成能は、例えば、J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991やJ. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006に記載の方法によって測定することができる。アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えば、Saerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセスカールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
Alternatively, by culturing a test yeast and selecting a yeast having a high or low ester-producing ability, or a high or low acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity, a suitable yeast for brewing a desired alcoholic beverage. A yeast test can be selected. In these cases, the test yeast or the reference yeast is, for example, a yeast into which the above-described vector of the present invention has been introduced, a yeast in which expression of the above-described polynucleotide (DNA) of the present invention is suppressed, or a mutation treatment. Yeast, naturally mutated yeast, and the like may be used. The ester-forming ability can be measured, for example, by the method described in J. Am. Soc. Brew. Chem. 49: 152-157,1991 and J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006. Acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity can be measured, for example, by the method of Saerens et al. (J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006). For the mutation treatment, any method such as a physical method such as ultraviolet irradiation or radiation irradiation, a chemical method by chemical treatment such as EMS (ethyl methanesulfonate) or N-methyl-N-nitrosoguanidine may be used. (For example, see Taiji Oshima, Biochemical Experimental Method 39 Yeast Molecular Genetics Experimental Method, p67-75, Academic Publishing Center, etc.).
The yeast that can be used as the reference yeast or the test yeast includes any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces. In the present invention, beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus W34 / 70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453, NCYC456, etc. Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used. Furthermore, wine yeasts such as association wines No. 1, 3 and 4 can be used, and sake yeasts such as association yeast sakes No. 7 and 9 can be used, but are not limited thereto. In the present invention, beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used. The reference yeast and the test yeast may be selected from the above yeasts in any combination.

以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates the detail of this invention, this invention is not limited to a following example.

実施例１：新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ（nonScEEB1）遺伝子のクローニング
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、nonScEEB1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScEEB1_for（配列番号：３）／nonScEEB1_rv（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセスパストリアヌスバイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScEEB1の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.4kb）を取得した。 Example 1: Cloning of a novel acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase (nonScEEB1) gene As a result of searching using a comparative database described in JP-A-2004-283169, a novel acyl CoA specific to brewer's yeast: ethanol An O-acyltransferase / esterase gene, nonScEEB1, was found (SEQ ID NO: 1). Based on the obtained base sequence information, primers nonScEEB1_for (SEQ ID NO: 3) / nonScEEB1_rv (SEQ ID NO: 4) for amplifying the full-length gene are designed, and the genome decoding strain Saccharomyces pastorianus byhen stephan 34/70 strain A DNA fragment (approximately 1.4 kb) containing the full-length gene of nonScEEB1 was obtained by PCR using the chromosomal DNA of (sometimes abbreviated as “W34 / 70 strain”) as a template.

上記のようにして得られたnonScEEB1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScEEB1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。 The nonScEEB1 gene fragment obtained as described above was inserted into a pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) by TA cloning. The nucleotide sequence of the nonScEEB1 gene was analyzed by the Sanger method (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981), and the nucleotide sequence was confirmed.

実施例２：ビール試醸中のnonScEEB1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセスパストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。

麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×10⁶cells/mL

発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScEEB1遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScEEB1遺伝子が発現していることを確認した。 Example 2: Analysis of nonScEEB1 gene expression during beer brewing Beer brewing was performed using the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus strain W34 / 70, and mRNA extracted from the brewer's yeast cells during fermentation was detected with a brewer's yeast DNA microarray.

Wort extract concentration 12.69%
Wort capacity 70L
Wort dissolved oxygen concentration 8.6ppm
Fermentation temperature 15 ℃
Yeast input 12.8 × 10 ⁶ cells / mL

The fermentation broth was sampled over time, and changes in the yeast growth amount (FIG. 1) and appearance extract concentration (FIG. 2) over time were observed. At the same time, yeast cells were sampled, and the prepared mRNA was labeled with biotin and hybridized with a brewer's yeast DNA microarray. Signal detection was performed using GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, manufactured by Affymetrix). The expression pattern of the nonScEEB1 gene is shown in FIG. From this result, it was confirmed that the nonScEEB1 gene was expressed in normal beer fermentation.

実施例３：nonScEEB1遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法に従い、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScEEB1_delta_for（配列番号：５）、nonScEEB1_delta_rv（配列番号：６）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセスパストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。 Example 3: Disruption of nonScEEB1 gene According to the method of the literature (Goldstein et al., Yeast. 15 1541 (1999)), plasmids containing drug resistance markers (pFA6a (G418r), pAG25 (nat1), pAG32 (hph)) were obtained. Gene disruption fragments are prepared by PCR as a template. As primers for PCR, nonScEEB1_delta_for (SEQ ID NO: 5) and nonScEEB1_delta_rv (SEQ ID NO: 6) are used.
The spore clone strain (W34 / 70-2) isolated from the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus strain W34 / 70 is transformed with the gene disruption fragment prepared by the method described above. Transformation was performed by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-303475, and YPD plate medium containing Geneticin 300 mg / L or Noseothricin 50 mg / L or Hygromycin B 200 mg / L ( 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar).

実施例４：ビール試験醸造におけるエステル生成量の解析
親株（W34/70-2株）ならびに実施例５で得られるnonScEEB1破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。

麦汁エキス濃度 13％
麦汁容量１L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 5g/L
Example 4: Analysis of ester production amount in beer test brewing A fermentation test using the parent strain (W34 / 70-2 strain) and the nonScEEB1-disrupted strain obtained in Example 5 is performed under the following conditions.

Wort extract concentration 13%
Wort capacity 1L
Wort dissolved oxygen concentration 8ppm
Fermentation temperature 15 ℃
Yeast input 5g / L

発酵もろみを経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。発酵終了時における酢酸エステル濃度の定量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991）を用いて行う。発酵終了時における中鎖脂肪酸エステル濃度は、発酵もろみ上清20ｇに酢酸エチル６０ｇを加え激しく浸透して水層を除去し、200μlまで濃縮した後、ガスクロマトグラフィー（nipponn jozo kyouaishi, 90:919-22,1995）で定量する。 Sampling fermented moromi over time to examine changes in yeast growth (OD660) and extract consumption over time. Quantification of the acetate concentration at the end of the fermentation is performed using headspace gas chromatography (J. Am. Soc. Brew. Chem. 49: 152-157, 1991). At the end of fermentation, the medium-chain fatty acid ester concentration was determined by gas chromatography (nipponn jozo kyouaishi, 90: 919-) after adding 60 g of ethyl acetate to 20 g of the fermented mash and removing the aqueous layer by vigorous permeation. 22, 1995).

以上のようにして、本発明で開示されたビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼの発現量を制御された酵母を用いれば、発酵工程や発酵期間を変えることなく、エステルの生成量を制御することが可能となる。これによって香味に優れた酒類を製造することが可能となる。 As described above, by using a yeast whose acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase expression level specific to brewer's yeast disclosed in the present invention is controlled, without changing the fermentation process and the fermentation period, The generation amount can be controlled. This makes it possible to produce alcoholic beverages with excellent flavor.

本発明の酒類製造法によれば、製品に華やかな香りを付与するエステル含量が増大するため、香味の優れた酒類を製造することが可能となる。また、過剰なエステルが好まれないビールなどの麦芽飲料においてはエステル量が減少し、より好ましい香味の酒類を製造することが可能となる。 According to the method for producing an alcoholic beverage of the present invention, since the ester content imparting a gorgeous fragrance to the product increases, it becomes possible to produce an alcoholic beverage with an excellent flavor. In addition, in malt beverages such as beer where excessive esters are not preferred, the amount of esters is reduced, and it becomes possible to produce alcoholic beverages with a more favorable flavor.

ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。It is a figure which shows the time-dependent change of the yeast growth amount in beer test brewing. The horizontal axis represents the fermentation time, and the vertical axis represents the value of OD660. ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。It is a figure which shows the time-dependent change of the extract consumption in beer test brewing. The horizontal axis represents the fermentation time, and the vertical axis represents the appearance extract concentration (w / w%). ビール試験醸造中の酵母におけるnonScEEB1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。It is a figure which shows the expression behavior of the nonScEEB1 gene in yeast during beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the detected signal luminance.

［配列番号：３］プライマー
［配列番号：４］プライマー
［配列番号：５］プライマー
［配列番号：６］プライマー [SEQ ID NO: 3] Primer [SEQ ID NO: 4] Primer [SEQ ID NO: 5] Primer [SEQ ID NO: 6] Primer

Claims

The polynucleotide according to any one of the following (a) to (f):
(a) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(c) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding
(d) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide;
(e) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide containing nucleotides; and
(f) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and acyl CoA: ethanol O-acyl A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having transferase / esterase activity.

The polynucleotide of any one of the following (g) to (i):
(g) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and acyl CoA: ethanol O- A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acyltransferase / esterase activity;
(h) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase activity A polynucleotide; and
(i) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions, and acyl CoA: ethanol A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having O-acyltransferase / esterase activity.

The polynucleotide according to claim 1, comprising a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1.

The polynucleotide according to claim 1, which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

The polynucleotide according to any one of claims 1 to 4, which is DNA.

The polynucleotide according to any one of the following (j) to (m):
(j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to claim 5;
(k) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to claim 5 by an RNAi effect;
(l) a polynucleotide encoding an RNA having an activity of specifically cleaving the transcript of the polynucleotide (DNA) of claim 5; and
(m) A polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to claim 5 by a co-suppression effect.

A protein encoded by the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5.

A vector containing the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5.

A vector containing the polynucleotide according to claim 6.

A transformed yeast into which the vector according to claim 8 or 9 has been introduced.

The yeast for brewing according to claim 10, wherein ester production ability is reduced by introducing the vector according to claim 8.

The expression of the polynucleotide (DNA) according to claim 5 is suppressed by introducing the vector according to claim 9 or by destroying a gene related to the polynucleotide (DNA) according to claim 5. Brewing yeast.

The brewing yeast according to claim 11, wherein the ester production ability is reduced by increasing the expression level of the protein according to claim 7.

The manufacturing method of liquor using the yeast in any one of Claims 10-13.

The method for producing an alcoholic beverage according to claim 14, wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.

The method for producing an alcoholic beverage according to claim 14, wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.

The liquor manufactured by the method in any one of Claims 14-16.

A method for evaluating the ester-producing ability of a test yeast using a primer or probe designed based on the base sequence of an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.

A method for evaluating the ester-producing ability of a test yeast by culturing the test yeast and measuring the expression level of an acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.

The test yeast is cultured, and the protein according to claim 7 is quantified or the expression level of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured to produce the desired ester A method for selecting yeast, which comprises selecting a test yeast having the protein amount or the gene expression amount according to the ability.

Reference yeast and test yeast are cultured to measure the expression level in each yeast of the acyl CoA: ethanol O-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, and the gene is expressed at a higher level than the reference yeast. Or the yeast selection method of Claim 20 which selects the test yeast which is low expression.

The yeast according to claim 20, wherein the reference yeast and the test yeast are cultured, the protein according to claim 7 in each yeast is quantified, and the test yeast having a larger or smaller amount of the protein than the reference yeast is selected. How to choose.

Fermentation for liquor production is performed using any one of the yeast according to claims 10 to 13 and the yeast selected by the method according to claims 20 to 22, and the ester production amount is adjusted. And a method for producing alcoholic beverages.