JPWO2007097093A1 - Branched amino acid transporter gene and use thereof - Google Patents
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Abstract
本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化能が制御された醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターであるＢａｐ３ｐをコードする遺伝子ＢＡＰ３、特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現量を制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。The present invention relates to a branched amino acid transporter gene and use thereof, and more particularly, to a brewer's yeast with controlled ability to assimilate a branched amino acid, alcoholic beverages produced using the yeast, a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to branched amino acid assimilation by controlling the expression level of the gene BAP3 encoding Bap3p, which is a branched amino acid transporter of brewing yeast, particularly the nonScBAP3 gene characteristic of brewer's yeast. The present invention relates to a yeast with controlled ability, a method for producing alcoholic beverages using the yeast, and the like.
Description
本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化性を制御した醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターであるＢａｐ３ｐをコードする遺伝子ＢＡＰ３、特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現量を制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。 The present invention relates to a branched amino acid transporter gene and use thereof, and more particularly to a brewer's yeast in which branched amino acid assimilation is controlled, alcoholic beverages produced using the yeast, a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to branched amino acid assimilation by controlling the expression level of the gene BAP3 encoding Bap3p, which is a branched amino acid transporter of brewing yeast, particularly the nonScBAP3 gene characteristic of brewer's yeast. The present invention relates to a yeast with controlled ability, a method for producing alcoholic beverages using the yeast, and the like.
一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの酒類の開発において重要である。
しかしながら、アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用するためには、アミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低いＧａｐ１や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター（分枝アミノ酸トランスポーターＢａｐ２、ＬｇＢａｐ２、Ｂａｐ３、アルギニントランスポーターＣａｎ１、プロリントランスポーターＰｕｔ４等（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１２６９：２７５−２８０，１９９５、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３４５５−３４６２，２００１、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０：６０３−６１３，１９９８、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ３６：３１７−３２８，１９９９）が知られている。
これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子（ｇａｐ１，ｓｈｒ３，ｃａｎ１，ｐｕｔ４，ｕｇａ４）の変異を有する酵母を用いた例（特開２００１−３２１１５９号公報）や分枝アミノ酸トランスポーターＢＡＰ２を高発現させた例（特開２０００−３１６５５９号公報）が報告されている。In general, amino acids are important as a taste component of alcoholic beverages, and are known to be important factors affecting quality. Therefore, it is important for the development of new types of alcoholic beverages to control the amount of amino acids according to the desired liquor quality.
However, since amino acids are assimilated as a nitrogen source by yeast during fermentation, it is extremely difficult to control the amino acid content at the end of fermentation.
In order for yeast to use extracellular amino acids as a nitrogen source, it is essential to incorporate amino acids into the cells. It has been clarified that such amino acid uptake involves an amino acid transporter present in the cell membrane of yeast.
As the amino acid transporter of yeast, Gap1 having low substrate specificity and many amino acid transporters having different substrate specificities (branched amino acid transporter Bap2, LgBap2, Bap3, arginine transporter Can1, proline transporter Put4, etc. (Biochim Biophys Acta) 1269: 275-280, 1995, Appl Environ Microbiol.67: 3455-3462, 2001, Mol Microbiol 30: 603-613, 1998, Curr Genet 36: 317-328, 1999).
Examples of using yeast having a mutation of a gene involved in amino acid incorporation (gap1, shr3, can1, put4, uga4) in order to control the amino acid content in alcoholic beverages (JP 2001-321159 A) In addition, an example of highly expressing the branched amino acid transporter BAP2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-316559) has been reported.
上記のような状況下、酒類中のアミノ酸組成を改変し、特徴ある品質を有する酒類を製造するために、アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から分枝アミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、分枝アミノ酸の資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に存在する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７ａ）以下の（ｘ）〜（ｚ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）以下の（ｊ）〜（ｍ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｊ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｍ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（９）上記（８）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１０）上記（７）に記載のベクターが導入された酵母。
（１１）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、分枝アミノ酸の資化能が増強された上記（１０）に記載の酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって分枝アミノ酸の資化能が向上した上記（１１）に記載の酵母。
（１３）（Ａ）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、（Ｂ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、（Ｃ）プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制するようにした酵母。
（１４）上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８）配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法。
（１８ａ）上記（１８）に記載の方法によって、分枝アミノ酸資化能が高い酵母を選別する方法。
（１８ｂ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法で、被検酵母を評価し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量が高いあるいは低い酵母を選別する、分枝アミノ酸資化能の高いあるいは低い酵母を選別する方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２０）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２３）上記（１０）〜（１２）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分枝アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、分枝アミノ酸の資化を制御することができるため、酒類中のアミノ酸組成を改変することができ、特徴ある品質を有する酒類の製造が可能となる。Under the circumstances as described above, in order to produce an alcoholic beverage having a characteristic quality by modifying the amino acid composition in the alcoholic beverage, a yeast with controlled utilization of amino acids has been desired.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors succeeded in identifying and isolating a gene encoding a branched amino acid transporter from brewer's yeast. In addition, a transformed yeast in which the obtained gene was introduced into yeast and expressed was produced, and it was confirmed that the utilization of branched amino acids was promoted, thereby completing the present invention.
That is, the present invention relates to a branched amino acid transporter gene present in brewer's yeast, a protein encoded by the gene, a transformed yeast in which the expression of the gene is regulated, and a liquor obtained by using a yeast in which the expression of the gene is regulated. Related to the manufacturing method. Specifically, the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.
(1) A polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a branched amino acid transporter activity A polynucleotide comprising:
(D) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a branched amino acid transporter activity;
(E) a polynucleotide comprising a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a branched amino acid transporter activity A nucleotide; and (f) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and branching amino acid trans A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having porter activity.
(2) The polynucleotide according to (1) above, which is selected from the group consisting of the following (g) to (i):
(G) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and a branched amino acid transporter activity A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having
(H) a polynucleotide comprising a polynucleotide having a amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having branched amino acid transporter activity; i) A branched amino acid transporter that hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions. A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity (3) The polynucleotide according to (1) above, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(4) The polynucleotide according to (1) above, which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(5) The polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, which is DNA.
(6) A protein encoded by the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
(7) A vector containing the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
(7a) The vector according to (7) above, comprising an expression cassette comprising the following components (x) to (z):
(X) a promoter that can be transcribed in a yeast cell (y) the polynucleotide according to any one of (1) to (5), which is bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction; and (z) an RNA molecule Signals that function in yeast for transcription termination and polyadenylation.
(8) A polynucleotide selected from the group consisting of the following (j) to (m):
(J) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above;
(K) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (5) above by an RNAi effect;
(L) a polynucleotide encoding an RNA having an activity of specifically cleaving the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; and (m) the polynucleotide (DNA) described in (5) above A polynucleotide that encodes an RNA that suppresses the expression of a protein by a co-suppression effect.
(9) A vector containing the polynucleotide according to (8) above.
(10) Yeast into which the vector according to (7) is introduced.
(11) The yeast according to (10) above, wherein the ability to assimilate branched amino acids is enhanced by introducing the vector according to (7) above.
(12) The yeast according to (11), wherein the assimilation ability of the branched amino acid is improved by increasing the expression level of the protein according to (6).
(13) (A) By introducing the vector described in (9) above, (B) by disrupting the gene related to the polynucleotide (DNA) described in (5) above, (C) mutating the promoter Yeast which is made to suppress the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) above by adding or by recombining the promoter.
(14) A method for producing an alcoholic beverage using the yeast according to any one of (10) to (12) above.
(15) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.
(16) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.
(17) Alcoholic beverages produced by the method according to any one of (14) to (16) above.
(18) A method for evaluating the ability of a test yeast to assimilate a branched amino acid using a primer or probe designed based on the base sequence of a branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
(18a) A method for selecting yeast having high ability to assimilate branched amino acids by the method described in (18) above.
(18b) A method for producing an alcoholic beverage (for example, beer) using the yeast selected by the method described in (18a) above.
(19) A method for evaluating the ability of a test yeast to assimilate a branched amino acid by culturing the test yeast and measuring the expression level of the branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
(19a) A test yeast is evaluated by the method described in (19) above, and a yeast having a high or low ability to assimilate a branched amino acid is selected by selecting a yeast having a high or low expression level of the branched amino acid transporter gene. How to sort.
(19b) A method for producing an alcoholic beverage (for example, beer) using the yeast selected by the method described in (19a) above.
(20) The test yeast is cultured, the protein according to (6) above is quantified or the expression level of the branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured, A method for selecting a yeast, comprising selecting a test yeast having a production amount of the protein or an expression level of the gene according to the chemical ability.
(21) Reference yeast and test yeast are cultured to measure the expression level of the branched amino acid transporter gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in each yeast, and the gene is expressed at a higher or lower level than the reference yeast. The method for selecting yeast according to (20) above, wherein the test yeast is selected.
(22) The reference yeast and the test yeast are cultured, the protein according to claim 6 in each yeast is quantified, and the test yeast having a larger or smaller amount of the protein than the reference yeast is selected (20) The method for selecting yeast according to 1.
(23) Fermentation for liquor production is performed using any one of the yeast according to (10) to (12) and the yeast selected by the method according to (20) to (22) above, A method for producing an alcoholic beverage, comprising adjusting the branched amino acid content.
According to the method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast of the present invention, since the assimilation of branched amino acids can be controlled, the amino acid composition in the alcoholic beverages can be modified, and the production of alcoholic beverages having characteristic qualities. Is possible.
図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はＯＤ６６０の値を示している。
図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図４は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はＯＤ６６０の値を示している。
図５は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図６は、ビール試験醸造におけるバリンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はバリン濃度（ｍＭ）を示している。
図７は、ビール試験醸造におけるロイシンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はロイシン濃度（ｍＭ）を示している。
図８は、ビール試験醸造におけるイソロイシンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はイソロイシン濃度（ｍＭ）を示している。FIG. 1 is a diagram showing the change over time in the amount of yeast grown in beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the value of OD660.
FIG. 2 is a diagram showing the change over time in the amount of extract consumed in beer test brewing. The horizontal axis indicates fermentation time, and the vertical axis indicates appearance extract concentration (w / w%).
FIG. 3 is a diagram showing the expression behavior of the nonScBAP3 gene in yeast during beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the detected signal luminance.
FIG. 4 is a diagram showing the change over time in the amount of yeast grown in beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the value of OD660.
FIG. 5 is a diagram showing changes over time in the amount of extract consumed in beer test brewing. The horizontal axis indicates fermentation time, and the vertical axis indicates appearance extract concentration (w / w%).
FIG. 6 is a diagram showing the change with time of valine in beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the valine concentration (mM).
FIG. 7 is a diagram showing the change over time of leucine in beer test brewing. The horizontal axis indicates fermentation time, and the vertical axis indicates leucine concentration (mM).
FIG. 8 is a diagram showing the change over time of isoleucine in beer test brewing. The horizontal axis represents fermentation time, and the vertical axis represents isoleucine concentration (mM).
本発明者らは、酵母の分枝アミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よく分枝アミノ酸を資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開２００４−２８３１６９に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有の分枝アミノ酸トランスポーターをコードするｎｏｎ−ＳｃＢＡＰ３遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするＤＮＡは、上記のビール酵母由来の分枝アミノ酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列と約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上。９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、分枝アミノ酸トランスポーター活性は、例えば（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１２６９：２７５−２８０，１９９５）に記載の方法によって測定することができる。
また、本発明は、（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、（ｊ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｋ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｌ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；又は（ｍ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記（ａ）〜（ｉ）のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスＤＮＡのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上：新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７，１９９３などを参照）。アンチセンスＤＮＡの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。
本明細書中、「ＤＮＡの発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、２１〜２５塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号公報；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），１８０−１８３，２０００ Ｆｅｂ．；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），２４０−２４４，２０００ Ａｐｒｉｌ；Ｎａｔｕｒｅ，４０７：６８０２，３１９−２０，２００２ Ｓｅｐ．２１；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），９４８−９５８，２００２ Ａｐｒ．１５；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），５５１５−５５２０，２００２ Ａｐｒ．１６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），５５０−５５３，２００２ Ａｐｒ．１９；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９，６０４７−６０５２，２００２ Ａｐｒ．３０；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），４９７−５００，２００２ Ｍａｙ；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），５００−５０５，２００２ Ｍａｙ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：１０，ｅ４６，２００２ Ｍａｙ １５等参照）。
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいい、ターゲットとするＤＮＡの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２８，１９８８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４９，１９８６；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３：７３３，１９９０；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３８７５，１９９１；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１２５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １８６：１２７１，１９９２など参照）。また、「ＤＮＡの発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるＤＮＡの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Ｓｍｙｔｈ ＤＲ：Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７９３，１９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ Ｒ：Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：８１０，１９９６など参照）。
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｉ）のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター；（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）；及び（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（ｊ）〜（ｍ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（ＤＮＡ）を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４９５１（１９７９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０２（１９８３）、特開平６−２５３８２６号公報など参照）。また、本発明においてはプロモーターに変異を加えることによって、あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。このような変異の導入方法はＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９、４２３８−４２５０（２００１）に、また、プロモーターの変換による遺伝子の発現制御方法は、例えば、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２，５２６６−５２７３（２００６）に記載されている。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８３，１９８３）、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，６０，２３７，１９８７）、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＰ，７６，１０３５，１９７９）が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばＭ．Ｆ．Ｔｕｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，６０３（１９８２）に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７ １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サンカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９４，ｐ１８２（１９９０）”、スフェロプラスト法“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）”、酢酸リチウム法“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１〜６となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約１〜２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するＤＮＡ（約１〜２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約２０％〜５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第３版」、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でアミノ酸の組成を調節した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分岐アミノ酸の含有量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつ分岐アミノ酸含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１３０（１９９０））。得られたゲノムを対象にして、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、ＯＲＦ配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０ｂｐ以上であり、１５〜２５ｂｐであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００ｂｐが適当である。
ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０〜９５℃、アニーリング温度：４０〜６０℃、伸長温度：６０〜７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の分枝アミノ酸資化能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価することもできる。なお、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することによって可能である。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９４−２００３）。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中の分枝アミノ酸濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、分枝アミノ酸資化能の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法３９ 酵母分子遺伝学実験法、ｐ６７−７５、学会出版センターなど参照）。なお、分枝アミノ酸資化能の評価は、例えば、発酵終了後のビールのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（例えば、Ｌ−８８００高速アミノ酸分析計；日立社製）、標準アミノ酸分析カラムＰ／Ｎ８５５−３５０６；日立製作所社製）を用いて分析し、アミノ酸組成中の分枝アミノ酸濃度を評価することによって行うことができる。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ及びサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。The present inventors considered that it is possible to assimilate a branched amino acid more efficiently by increasing the activity of the branched amino acid transporter of yeast. Based on such an idea, research was repeated and the non-ScBAP3 gene encoding a branched amino acid transporter unique to brewer's yeast was isolated based on the brewer's yeast genome information decoded by the method disclosed in JP-A-2004-283169.・ Identified. This base sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the protein encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2.
1. First polynucleotide of the present invention, the present invention is, (a) SEQ ID NO: a polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of one nucleotide sequence; and (b) SEQ ID NO: a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence A polynucleotide containing is provided. The polynucleotide may be DNA or RNA.
The DNA of interest in the present invention is not limited to the above-mentioned polynucleotide encoding a branched amino acid transporter derived from brewer's yeast, and other polynucleotides encoding a protein functionally equivalent to this protein. Including. Examples of functionally equivalent proteins include (c) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and are branched amino acids. Examples include proteins having transporter activity.
As such a protein, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 31, 1 30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-2, 20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 Deletions, substitutions, insertions and / or additions of amino acid residues It consists amino acid sequence, and a protein having a branched amino acid transporter activity. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better. Further, as such a protein, (d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% Above, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more. Examples thereof include proteins having an amino acid sequence having 99.7% or more, 99.8% or more, and 99.9% or more identity, and having a branched amino acid transporter activity. In general, the larger the homology value, the better.
The branched amino acid transporter activity can be measured, for example, by the method described in (Biochim Biophys Acta. 1269: 275-280, 1995).
The present invention also relates to (e) a protein that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has a branched amino acid transporter activity. A polynucleotide containing a polynucleotide; and (f) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein having branched amino acid transporter activity.
Here, “a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions” refers to a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe. As a hybridization method, for example, Molecular Cloning 3rd Ed. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, and the like can be used.
As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology (eg, DNA) can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, according to the protocol attached to the kit, incubation with the labeled probe is performed overnight, and then the membrane is washed with a primary washing buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. After washing, the hybridized polynucleotide (eg, DNA) can be detected.
As other polynucleotides that can be hybridized, when calculated with homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters, the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is about 60%. 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94 % Or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5 % Furthermore, 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or more, can be exemplified a polynucleotide having 99.9% identity.
In addition, the identity of amino acid sequences and base sequences is determined using the algorithm BLAST (proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur. it can. Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to score = 50 and wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.
Furthermore, the polynucleotide of the present invention is (j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; (k) the above (5) (1) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to the RNAi effect; (l) an activity of specifically cleaving the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to (5) above; Or (m) a polynucleotide encoding RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) above by a co-suppression effect. These polynucleotides are incorporated into a vector and can further suppress the expression of the polynucleotides (DNA) (a) to (i) in a transformed cell into which the vector has been introduced. Therefore, it can be suitably used when it is preferable to suppress the expression of the polynucleotide (DNA).
In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to a transcription product of DNA” refers to so-called antisense DNA. Antisense technology is known as a method for suppressing the expression of a specific endogenous gene, and is described in various documents (for example, Hirashima and Inoue: Shinsei Kagaku Kenkyusho 2 Nucleic acid IV gene replication and expression (Japan (See Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin) pp. 319-347, 1993). The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the expression of the gene can be effectively suppressed. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, more preferably 95% or more, with respect to the transcription product of the target gene. The length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
In the present specification, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by RNAi effect” refers to a polynucleotide for suppressing the expression of an endogenous gene by RNA interference (RNAi). “RNAi” refers to a phenomenon in which, when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. . Examples of RNA used here include double-stranded RNA that causes RNA interference of 21 to 25 bases in length, such as dsRNA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), or shRNA (short hairpin RNA). . Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as a liposome, and can be locally expressed using a vector capable of generating the double-stranded RNA. Preparation and use methods of such double-stranded RNA (dsRNA, siRNA or shRNA) are known from many literatures (Japanese Patent Publication No. 2002-516062; US Publication No. 2002 / 086356A; Nature Genetics). , 24 (2), 180-183, 2000 Feb .; Genesis, 26 (4), 240-244, 2000 April; Nature, 407: 6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol. 16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 99 (8), 5515-5520, 2002 Apr.16; Science, 296 (5567), 550-553. , 2002 Apr. 19; c Natl.Acad.Sci.USA, 99: 9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500,2002 May; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 500. −505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46, 2002 May 15, etc.).
In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having an activity of specifically cleaving a DNA transcript” generally refers to a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity, which inhibits the function of the gene by cleaving the target DNA transcript. Various known documents can also be referred to for the design of ribozymes (eg, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323). Nucl. Acids Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Commun 186: 1271, 1992, etc.). Further, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by co-suppression effect” refers to a nucleotide that inhibits the function of the target DNA by “co-suppression”.
In the present specification, “co-suppression” refers to the expression of a foreign gene and a target endogenous gene introduced by introducing a gene having a sequence identical or similar to the target endogenous gene into a cell by transformation. Both are phenomena that are suppressed. Various known literatures can also be referred to for designing a polynucleotide having a co-suppression effect (for example, Myth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martinensen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996, etc.) reference).
2. Protein of the present invention The present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (i). A preferred protein of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having a branched amino acid transporter activity. is there.
Such a protein includes an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has a branched amino acid transporter activity. The protein which has is mentioned. Examples of such a protein include a protein having an amino acid sequence having homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a branched amino acid transporter activity.
Such proteins are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad”. Sci. USA, 79, 6409 (1982), “Gene, 34, 315 (1985)”, “Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA”. , 82, 488 (1985) "and the like.
The deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one or more amino acid sequences in the same sequence It means that there are deletion, substitution, insertion and / or addition of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; group C: asparagine, glutamine; group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E : Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.
The protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. .
3. Transformed yeast vector and were introduced it the present invention Next, the present invention provides a vector comprising the polynucleotide described above. The vector of the present invention contains the polynucleotide (DNA) described in any of the above (a) to (i). In addition, the vector of the present invention is usually (x) a promoter that can be transcribed in yeast cells; (y) any one of the above (a) to (i) that is bound to the promoter in the sense direction or the antisense direction. The described polynucleotide (DNA); and (z) with respect to transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, configured to include an expression cassette comprising as a component a signal that functions in yeast.
In the present invention, in the brewing of beer described later, when the protein of the present invention is highly expressed, the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of the above (a) to (i) is promoted. These polynucleotides are introduced in the sense direction with respect to the promoter. In addition, in the brewing of beer described later, when the expression of the protein of the present invention is suppressed, the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of the above (a) to (i) is suppressed. A polynucleotide is introduced in the antisense orientation relative to the promoter. Moreover, when suppressing the expression of the protein of the present invention, it can be introduced into a vector so that the polynucleotide described in any of (j) to (m) above can be expressed. In the present invention, the expression of the polynucleotide (DNA) or the expression of the protein can be suppressed by destroying the target gene (DNA). Gene disruption involves adding or deleting single or multiple bases within a region involved in the expression of a gene product in a target gene, such as the coding region or promoter region, or deleting these entire regions. Can be performed. For such gene disruption techniques, known literature can be referred to (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979), Methods in Enzymology, 101, 202 (1983)). (See Kaihei 6-253826). In the present invention, the expression level of the target gene can also be controlled by adding a mutation to the promoter or by recombining the promoter by homologous recombination. A method for introducing such a mutation is described in Nucleic Acids Res. 29, 4238-4250 (2001), and a method for controlling the expression of a gene by converting a promoter is described in, for example, Appl Environ Microbiol. 72, 5266-5273 (2006).
As a vector used for introduction into yeast, any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type) can be used. For example, YEp24 (J.R. Broach et al., Experimental Manufacture of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) is used as a YEp type vector, and YCp50 (se.R. et al. , Gene, 60, 237, 1987), YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) is known as a YIp type vector and is easily obtained. be able to.
As a promoter / terminator for regulating gene expression in yeast, any combination may be used as long as it functions in brewing yeast and is not affected by components in mash. For example, a promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), a promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), and the like can be used. These genes have already been cloned. F. Tuite et al. , EMBO J. et al. 1,603 (1982), and can be easily obtained by known methods.
As a selection marker used for transformation, since an auxotrophic marker cannot be used in the case of brewing yeast, geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (Ashigaki, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et al., Gene, 101, 149, 1991), etc. Is available.
The vector constructed as described above is introduced into the host yeast. Examples of the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces (Saccharomyces). In the present invention, beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus W34 / 70, Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used. Furthermore, whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90, wine yeasts such as association wines Nos. 1, 3, and 4 and sake yeasts such as association yeast sakes Nos. 7 and 9 can be used. However, the present invention is not limited to this. In the present invention, beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used.
As a yeast transformation method, a publicly known method can be used. For example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, lithium acetate method “J. Bacteriology,” 153, p163 (1983) ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, etc., but is not limited thereto.
More specifically, the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium “Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”), and the value of OD 600 nm is 1 to 6. Incubate to. The cultured yeast is collected by centrifugation, washed, and pretreated with alkali metal ions, preferably lithium ions, at a concentration of about 1-2 M. The cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 μg). Polyethylene glycol, preferably about 4,000 daltons, is added to a final concentration of about 20% to 50%. After standing at about 30 ° C. for about 30 minutes, the cells are heated at about 42 ° C. for about 5 minutes. Preferably, the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes. Thereafter, the transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker. For other general cloning techniques, see “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” and the like.
4). The method for producing the liquor of the present invention and the liquor obtained by the production method The above-described vector of the present invention is introduced into a yeast suitable for brewing the liquor to be produced, and by using the yeast, an alcoholic beverage characterized by the amino acid composition is obtained. Can be manufactured. Moreover, the yeast selected by the yeast evaluation method of the present invention described below can also be used. Examples of alcoholic beverages to be targeted include, but are not limited to, beer-taste drinks such as beer and sparkling wine, wine, whiskey, and sake. In the present invention, an alcoholic beverage whose amino acid composition is adjusted with a desired alcoholic beverage can also be produced by using a brewing yeast in which the expression of a target gene is suppressed as necessary. That is, alcoholic beverages are produced using a yeast introduced with the above-described vector of the present invention, a yeast in which expression of the above-described polynucleotide (DNA) of the present invention is suppressed, or a yeast selected by the following yeast evaluation method of the present invention. Thus, by adjusting (increasing or decreasing) the content of branched amino acids, it is possible to produce alcoholic beverages with the desired alcohol content and with the adjusted (increased or decreased) branched amino acid content.
In producing these alcoholic beverages, a known method can be used except that the brewer's yeast obtained in the present invention is used instead of the parent strain. Therefore, the raw materials, production equipment, production management, etc. may be exactly the same as in the conventional method, and there is no increase in cost for producing alcoholic beverages with a reduced fermentation period. That is, according to the present invention, the existing facility can be used and manufactured without increasing the cost.
5). Method for Evaluating Yeast of the Present Invention The present invention relates to branched amino acid assimilation of a test yeast using a primer or probe designed based on the base sequence of a branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1. It relates to a method for evaluating performance. A general method of such an evaluation method is known, and is described in, for example, WO01 / 040514, JP-A-8-205900, and the like. Hereinafter, this evaluation method will be briefly described.
First, the genome of the test yeast is prepared. As the preparation method, any known method such as Hereford method or potassium acetate method can be used (for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)). Using the obtained genome as a target, the primer or probe designed based on the base sequence (preferably the ORF sequence) of the branched amino acid transporter gene is used to identify the gene or the gene in the genome of the test yeast. To see if a specific sequence exists. The primer or probe can be designed using a known method.
Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known technique. For example, a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used as one primer, and the upstream or downstream of this sequence is used as the other primer. A polynucleotide containing a part or all of the sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used to amplify a yeast nucleic acid by PCR, and the presence or absence of the amplified product and the molecular weight of the amplified product are determined. Measure the size. The number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, and preferably 15 to 25 bp. Moreover, 300-2000 bp is suitable for the base number of the part to pinch | interpose normally.
Reaction conditions of the PCR method are not particularly limited. For example, denaturation temperature: 90 to 95 ° C., annealing temperature: 40 to 60 ° C., extension temperature: 60 to 75 ° C., cycle number: 10 times or more, and the like are used. Can do. The obtained reaction product is separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. According to this method, the ability to assimilate branched amino acids of the yeast is predicted and evaluated depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include a specific portion of the DNA molecule. Further, by analyzing the base sequence of the amplified product, it is possible to predict and evaluate the above performance more accurately.
In the present invention, the test yeast is cultured, and the expression level of the branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured to evaluate the ability of the test yeast to assimilate the branched amino acid. You can also The expression level of the branched amino acid transporter gene can be measured by culturing the test yeast and quantifying mRNA or protein that is a transcription product of the branched amino acid transporter gene. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. mRNA can be quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein can be quantified by, for example, Western blotting (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). In addition, by measuring the branched amino acid concentration in the fermentation broth obtained when the test yeast is cultured, the expression level of the gene in the test yeast can be predicted.
Furthermore, the test yeast is cultured, the expression level of the branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured, and the yeast having the gene expression level according to the target branched amino acid assimilation ability By selecting, yeast suitable for brewing the desired liquor can be selected. Alternatively, a reference yeast and a test yeast may be cultured, the gene expression level in each yeast may be measured, and the gene expression levels of the reference yeast and the test yeast may be compared to select a desired yeast. Specifically, for example, the reference yeast and the test yeast are cultured, and the expression level of the branched amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in each yeast is measured, and the gene is higher than the reference yeast. By selecting a test yeast that is expressed or lowly expressed, a yeast suitable for brewing a desired alcoholic beverage can be selected.
Alternatively, a test yeast suitable for brewing a desired liquor can be selected by culturing the test yeast and selecting a yeast having a high or low ability to assimilate branched amino acids.
In these cases, as the test yeast or the reference yeast, for example, a yeast introduced with the above-described vector of the present invention, a yeast that has been subjected to a mutation treatment, a naturally-mutated yeast, or the like can be used. For the mutation treatment, any method such as a physical method such as ultraviolet irradiation or radiation irradiation, or a chemical method by chemical treatment such as EMS (ethyl methanesulfonate) or N-methyl-N-nitrosoguanidine may be used. (See, for example, edited by Taiji Oshima, Biochemical Experimental Method 39 Yeast Molecular Genetics Experimental Method, p67-75, Academic Publishing Center). In addition, evaluation of branched amino acid assimilation ability, for example, the amino acid composition of beer after the end of fermentation, amino acid analyzer (for example, L-8800 high-speed amino acid analyzer; manufactured by Hitachi), standard amino acid analysis column P / N855- 3506; manufactured by Hitachi, Ltd.) and evaluating the branched amino acid concentration in the amino acid composition.
The yeast that can be used as the reference yeast or the test yeast includes any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake, and the like. Specific examples include yeasts such as the genus Saccharomyces (for example, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces carlsbergensis). Saccharomyces carlsbergensis NCYC453, NCYC456, etc., Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1954, NBRC1954, B Furthermore, whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90, wine yeasts such as association wines Nos. 1, 3, and 4 and sake yeasts such as association yeast sakes Nos. 7 and 9 can be used. However, the present invention is not limited to this. In the present invention, beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used. The reference yeast and test yeast may be selected from the above yeast group in any combination.
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子（ｎｏｎＳｃＢＡＰ３）のクローニング
特開２００４−２８３１６９に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーｎｏｎＳｃＢＡＰ３＿Ｆ（配列番号：３）／ｎｏｎＳｃＢＡＰ３＿Ｒ（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン３４／７０株（「Ｗ３４／７０株」と略記することがある）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってｎｏｎＳｃＢＡＰ３の全長遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
上記のようにして得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子断片を、ＴＡクローニングによってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の塩基配列をサンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２１５，１９８１）で分析し、塩基配列を確認した。
実施例２：ビール試醸中のｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスＷ３４／７０株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したｍＲＮＡをビール酵母ＤＮＡマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 １２．６９％
麦汁容量 ７０Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 ８．６ｐｐｍ
発酵温度 １５℃
酵母投入量 １２．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したｍＲＮＡをビオチンラベルして、特開２００４−２８３１６９に記載のビール酵母ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（ＧＣＯＳ；ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．０、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子が発現していることを確認した。
実施例３：ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株の作製
実施例１に記載のｎｏｎＳｃＢＡＰ３／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ消化し、タンパク質コード領域全長を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ処理したｐＹＣＧＰＹＮｏｔに連結させ、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現ベクターｎｏｎＳｃＢＡＰ３／ｐＹＣＧＰＹＮｏｔを構築した。ｐＹＣＧＰＹＮｏｔはＹＣｐ型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子ＰＹＫ１のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子Ｇ４１８ｒを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平０７−３０３４７５に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン３４／７０株を形質転換した。ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選択した。
実施例４：ビール試験醸造におけるアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例３で得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １５℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）（図４）、エキス消費量（図５）、分枝アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）（図６、７及び８）の経時変化を調べた。図６、７及び８に示すようにｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株では親株に比べて分枝アミノ酸の資化が促進されていた。また、表１に示すように、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株を用いて製造したビールのアミノ酸組成は、親株を用いて製造したビールに比べてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンなどの分枝アミノ酸が減少し、またグルタミン酸、グリシン、アラニン等が増加しており、異なる特徴を示していた。
文献（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｙｅａｓｔ．１５ １５４１（１９９９））の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド（ｐＦＡ６ａ（Ｇ４１８ｒ），ｐＡＧ２５（ｎａｔ１），ｐＡＧ３２（ｈｐｈ））をテンプレートとしたＰＣＲによって遺伝子破壊用断片を作製する。
作製した遺伝子破壊用断片でＷ３４／７０株あるいは胞子クローンＷ３４／７０−２株を形質転換する。形質転換は特開平０７−３０３４７５に記載された方法で行い、選択薬剤の濃度はそれぞれジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）３００ｍｇ／Ｌ、ノーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌとする。
実施例６：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例５で得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １５℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
実施例４と同様に、発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量及び各種アミノ量の経時変化を調べる。EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates the detail of this invention, this invention is not limited to a following example.
Example 1: Cloning of a branched amino acid transporter gene (nonScBAP3) As a result of searching using a comparative database described in JP-A-2004-283169, a branched amino acid transporter gene unique to brewer's yeast, nonScBAP3 was found (sequence) Number: 1). Based on the obtained base sequence information, primers nonScBAP3_F (SEQ ID NO: 3) / nonScBAP3_R (SEQ ID NO: 4) for amplifying the full-length gene are designed, and the genome decoding strain Saccharomyces pastorianus byhen stephan 34/70 strain A DNA fragment containing the full length gene of nonScBAP3 was obtained by PCR using a chromosomal DNA (sometimes abbreviated as “W34 / 70 strain”) as a template.
The nonScBAP3 gene fragment obtained as described above was inserted into a pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) by TA cloning. The nucleotide sequence of the nonScBAP3 gene was analyzed by the Sanger method (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981), and the nucleotide sequence was confirmed.
Example 2: Analysis of expression of nonScBAP3 gene during brewing of beer Beer brewing was performed using the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus W34 / 70 strain, and mRNA extracted from the brewer's yeast cells during fermentation was detected with a brewer's yeast DNA microarray.
Wort extract concentration 12.69%
Wort capacity 70L
Wort dissolved oxygen concentration 8.6ppm
Yeast input 12.8 × 10 6 cells / mL
The fermentation broth was sampled over time, and changes in the yeast growth amount (FIG. 1) and appearance extract concentration (FIG. 2) over time were observed. At the same time, the yeast cells were sampled, and the prepared mRNA was labeled with biotin and hybridized with the beer yeast DNA microarray described in JP-A-2004-283169. Signal detection was performed using a GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, manufactured by Affymetrix). The expression pattern of nonScBAP3 gene is shown in FIG. From this result, it was confirmed that the nonScBAP3 gene was expressed in normal beer fermentation.
Example 3 Preparation of NonScBAP3 Highly Expressing Strain NonScBAP3 / pCR2.1-TOPO described in Example 1 was digested with restriction enzymes SacI and NotI to prepare a DNA fragment containing the entire protein coding region. This fragment was ligated to pYCGPYNot treated with restriction enzymes SacI and NotI to construct a nonScBAP3 high expression vector nonScBAP3 / pYCGPYNot. pYCGPYNot is a YCp-type yeast expression vector, and the introduced gene is highly expressed by the pyruvate kinase gene PYK1 promoter. The geneticin-resistant gene G418 r is as the selection marker in the yeast, and the ampicillin-resistant gene Amp r as a selective marker in Escherichia coli.
The Saccharomyces pastorianus bihenstephane 34/70 strain was transformed by the method described in JP-A-07-303475 using the high expression vector prepared by the above method. Transformants were selected on YPD plate medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar) containing
Example 4: Measurement of amino acid utilization in beer test brewing A fermentation test using the parent strain and the nonScBAP3 high expression strain obtained in Example 3 was performed under the following conditions.
Wort capacity 1L
Wort dissolved oxygen concentration about 8ppm
The W34 / 70 strain or the spore clone W34 / 70-2 strain is transformed with the prepared gene disruption fragment. Transformation is carried out by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-303475, and the concentration of the selected drug is geneticin (300 mg / L) and noseosthricin (50 mg / L), respectively.
Example 6: Measurement of ammonia and amino acid utilization in beer test brewing A fermentation test using the parent strain and the nonScBAP3-disrupted strain obtained in Example 5 is performed under the following conditions.
Wort capacity 1L
Wort dissolved oxygen concentration about 8ppm
本発明の酒類製造法によれば、酵母の分枝アミノ酸資化能を制御することができるため、分枝アミノ酸含有量が調節された、アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造することが可能となる。
［配列表］
[Sequence Listing]
Claims (23)
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。A polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a branched amino acid transporter activity A polynucleotide comprising:
(D) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a branched amino acid transporter activity;
(E) a polynucleotide comprising a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a branched amino acid transporter activity A nucleotide; and (f) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and branching amino acid trans A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having porter activity.
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。A polynucleotide selected from the group consisting of the following (g) to (i):
(G) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and a branched amino acid transporter activity A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having
(H) a polynucleotide comprising a polynucleotide having a amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having branched amino acid transporter activity; i) A branched amino acid transporter that hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions. A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity.
（ｊ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｍ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。A polynucleotide selected from the group consisting of the following (j) to (m):
(J) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to claim 5;
(K) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to claim 5 by an RNAi effect;
(L) a polynucleotide encoding an RNA having an activity of specifically cleaving the transcript of the polynucleotide (DNA) according to claim 5; and (m) the expression of the polynucleotide (DNA) according to claim 5. A polynucleotide that encodes RNA that suppresses the co-suppression effect.
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