JP2009159945A - Nucleic acid-detecting probe - Google Patents
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Description
本発明は核酸（DNAもしくはRNA）検出方法に関する。より詳しくは、オリゴヌクレオチドプローブと試料（ゲノムDNAやRNA、PCR産物などの一本鎖あるいは二本鎖核酸）とを特
異的にハイブリダイズさせる工程を含む遺伝子検出法に関する。
The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid (DNA or RNA). More specifically, the present invention relates to a gene detection method including a step of specifically hybridizing an oligonucleotide probe and a sample (single-stranded or double-stranded nucleic acid such as genomic DNA, RNA, or PCR product).
遺伝子の発現量を高感度かつ広範なダイナミックレンジで分析することは、遺伝子の機能解析や疾病の研究や診断において極めて重要な役割を果たす。例えば肝炎、HIV、結核
菌、性感染症などの感染症検査では、感染拡大の回避や効果的な治療のため、初期段階で感染病原体の遺伝子を定量する必要がある。また製薬分野では創薬ターゲットを同定したり、薬効を評価するため、疾病特異的に変動する遺伝子を定量する必要がある。
Analyzing gene expression levels with high sensitivity and a wide dynamic range plays an extremely important role in gene function analysis and disease research and diagnosis. For example, infectious disease tests such as hepatitis, HIV, Mycobacterium tuberculosis, and sexually transmitted diseases, it is necessary to quantify the genes of infectious agents at an early stage in order to avoid the spread of infection and effective treatment. In the pharmaceutical field, it is necessary to quantify genes that vary in a disease-specific manner in order to identify drug discovery targets and evaluate drug efficacy.
遺伝子を定量するには、対象となる遺伝子をPCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBA法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）、LAMP法（Loop mediated isothermal amplification）などで増幅してから検出するのが一般的である。検出に用いられるプローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beaconプローブ、Quenchingプローブなどがある。このうちTaqManプローブによる検出には、5'→3'exo活性をもつ酵素を使用する必要がある。そのため、5'→3'exo活性をもつDNAポリメラーゼ酵素を使用するPCR増幅法には適用できるが、鎖置換活性を持つが5'→3'exo活性を持たないDNAポリメラーゼやRNAポリメラーゼを使用する必要がある、恒温増幅法であるNASBA法やLAMP法では使用できない。そのため、LAMP法あるいはNASBA法で使用できる検出プローブは、Molecular BeaconプローブとQuenchingプローブとなる。 In order to quantify genes, it is common to detect the target gene after amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), LAMP (Loop mediated isothermal amplification), etc. It is. Examples of probes used for detection include TaqMan probes, Molecular Beacon probes, Quenching probes, and the like. Of these, detection with a TaqMan probe requires the use of an enzyme having 5 ′ → 3′exo activity. Therefore, it can be applied to PCR amplification method using DNA polymerase enzyme with 5 '→ 3'exo activity, but use DNA polymerase or RNA polymerase with strand displacement activity but not 5' → 3'exo activity. It cannot be used with the NASBA method or the LAMP method, which is a constant temperature amplification method. Therefore, detection probes that can be used in the LAMP method or NASBA method are a Molecular Beacon probe and a Quenching probe.
Molecular Beaconプローブでは、標的核酸にハイブリダイズする配列を設計することのほかに、標的核酸が存在しない場合にはステム配列が安定したヘアピン構造をとるように設計する必要がある。安定したヘアピン構造をとることができないとクエンチングが不完全になりバックグラウンドの上昇を生じるからである。これを防ぐために標的核酸にハイブリダイズする配列とステム配列とを慎重に設計する必要が生じ、その結果、プローブ配列の設計の自由度が限られるといった問題がある。 In the molecular beacon probe, in addition to designing a sequence that hybridizes to the target nucleic acid, it is necessary to design the stem sequence to have a stable hairpin structure when the target nucleic acid does not exist. This is because if the stable hairpin structure cannot be taken, quenching becomes incomplete and the background increases. In order to prevent this, it is necessary to carefully design the sequence that hybridizes to the target nucleic acid and the stem sequence. As a result, there is a problem that the degree of freedom in designing the probe sequence is limited.
一方、Quenchingプローブは、プローブの5'末端か3'末端を蛍光体で標識し、プローブ
が標的核酸に結合した際に蛍光体が標的核酸配列中のグアニンと相互作用することによって蛍光が消光する現象を利用している。標的核酸が存在すると、蛍光が消光し、存在しない場合には蛍光が消光しないため、標的核酸の有無を判定できる。しかし、グアニンと相互作用して消光する蛍光体はPacific Blue、 TAMRA、CR6G、 BODIPY FLなどに限られており、多色検出には適さない。また、標的核酸配列中のグアニンと相互作用する位置にプローブを必ず設計しなければならず、設計の自由度に制約が生じるといった問題もある。
Quenching probes, on the other hand, label the 5 'or 3' end of the probe with a fluorophore, and when the probe binds to the target nucleic acid, the fluorophore interacts with the guanine in the target nucleic acid sequence to quench the fluorescence. The phenomenon is used. When the target nucleic acid is present, the fluorescence is quenched. When the target nucleic acid is not present, the fluorescence is not quenched. Therefore, the presence or absence of the target nucleic acid can be determined. However, phosphors that interact with guanine and quench are limited to Pacific Blue, TAMRA, CR6G, BODIPY FL, etc., and are not suitable for multicolor detection. In addition, the probe must be designed at a position where it interacts with guanine in the target nucleic acid sequence, and there is a problem that the degree of freedom in design is limited.
本発明の主な目的は、5'→3'exo活性を持たないDNAポリメラーゼを用いる核酸増幅法での検出に適用可能な、設計の自由度の高いプローブを提供することである。 The main object of the present invention is to provide a probe with a high degree of design flexibility applicable to detection by a nucleic acid amplification method using a DNA polymerase having no 5 ′ → 3′exo activity.
上記課題を解決するため、発明者らは、第一プローブと第二プローブをそれぞれ蛍光体と消光体（クエンチャー）で標識し、標的核酸にタンデムにハイブリダイズさせることで、蛍光体からの蛍光シグナルを消光させ、標的核酸の存在の有無を判定する方法を見出した。 In order to solve the above-mentioned problems, the inventors label the first probe and the second probe with a phosphor and a quencher, respectively, and hybridize the target nucleic acid in tandem to obtain fluorescence from the phosphor. The present inventors have found a method for quenching a signal and determining the presence or absence of a target nucleic acid.
本発明では、標的核酸にハイブリダイズする第一プローブと、第一プローブと0〜10塩
基、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるように、第一プロー
ブの3'末端側にハイブリダイズする第二プローブを用いる。第一プローブの3'末端には消光体が標識され、第二プローブの5'末端側には蛍光体、3'末端側には第二プローブの伸長を防ぐためにリン酸あるいはアミノ基が標識されている。
In the present invention, the first probe that hybridizes to the target nucleic acid, and the 3 ′ end of the first probe so as to produce a gap of 0 to 10 bases, preferably 0 to 3 bases, most preferably 1 base with the first probe. A second probe that hybridizes to the side is used. The 3 'end of the first probe is labeled with a quencher, the 5' end of the second probe is labeled with a phosphor, and the 3 'end is labeled with a phosphate or amino group to prevent extension of the second probe. ing.
反応液中に標的核酸が存在しない場合には、第一プローブと第二プローブは反応液中にそれぞれ独立して存在しており、反応液からは第一プローブ由来の蛍光が検出される。一方、標的核酸が存在する場合には、第一プローブと第二プローブは標的核酸にハイブリダイズする。このとき、第一プローブと第二プローブは上記したようなギャップを生じるようにタンデムにハイブリダイズするため、第一プローブの3'末端に標識された消光体と、第二プローブの5'末端に標識された蛍光体が接近し、蛍光共鳴エネルギートランスファーにより、蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。 When the target nucleic acid is not present in the reaction solution, the first probe and the second probe are present independently in the reaction solution, and fluorescence derived from the first probe is detected from the reaction solution. On the other hand, when the target nucleic acid is present, the first probe and the second probe hybridize to the target nucleic acid. At this time, since the first probe and the second probe hybridize in tandem so as to generate the gap as described above, the quencher labeled at the 3 ′ end of the first probe and the 5 ′ end of the second probe The labeled phosphor approaches and the fluorescence signal from the phosphor is quenched by fluorescence resonance energy transfer.
核酸増幅反応の過程では、反応進行に伴って標的核酸が生成されるため、第一プローブと第二プローブが徐々に増幅産物にハイブリダイズしていく。つまり、時間の経過に伴って反応液中からの蛍光シグナル量は減少することになる。従来のMolecular BeaconプローブやTaqManプローブでは標的核酸の増幅に伴って蛍光シグナル量が増加し、蛍光シグナル量がある閾値よりも大きくなるタイミングは反応開始前の標的核酸の存在量に依存する。一方、本発明の核酸検出用プローブでは、標的核酸の増幅に伴って蛍光シグナル量が減少する。蛍光シグナル量がある閾値よりも小さくなるタイミングは反応開始前の標的核酸の存在量に依存する。従って、蛍光シグナルの絶対値から蛍光シグナルの減少量を算出してプロットすることによって、従来のMolecular BeaconプローブやTaqManプローブと同様に検量線を作製して、標的核酸の定量をすることが可能となる。 In the course of the nucleic acid amplification reaction, the target nucleic acid is generated as the reaction proceeds, so the first probe and the second probe gradually hybridize to the amplification product. That is, the amount of fluorescence signal from the reaction solution decreases with time. In the conventional Molecular Beacon probe and TaqMan probe, the amount of fluorescence signal increases with the amplification of the target nucleic acid, and the timing at which the amount of fluorescence signal exceeds a certain threshold depends on the amount of target nucleic acid present before the start of the reaction. On the other hand, in the probe for nucleic acid detection of the present invention, the amount of fluorescence signal decreases as the target nucleic acid is amplified. The timing at which the amount of fluorescent signal becomes smaller than a certain threshold depends on the amount of target nucleic acid present before the start of the reaction. Therefore, by calculating and plotting the amount of decrease in the fluorescence signal from the absolute value of the fluorescence signal, it is possible to create a calibration curve in the same way as the conventional Molecular Beacon probe and TaqMan probe and quantify the target nucleic acid. Become.
また、第一プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、第二プローブの5'末端側に消光体を標識しても良い。この場合も標的核酸に対して第一プローブと第二プローブが0〜10塩基
、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるようにハイブリダイズ
し、蛍光体と消光体の相互作用によって蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。この場合も第二プローブの3'末端は第二プローブの伸長を防ぐために標識をしておく。
Alternatively, the phosphor may be labeled on the 3 ′ end side of the first probe, and the quencher may be labeled on the 5 ′ end side of the second probe. In this case as well, the first probe and the second probe are hybridized with respect to the target nucleic acid so that a gap of 0 to 10 bases, preferably 0 to 3 bases, most preferably 1 base is generated. The fluorescence signal from the phosphor is quenched by the action. In this case as well, the 3 ′ end of the second probe is labeled to prevent extension of the second probe.
また、第一プローブと第二プローブが一つのプローブとして繋がっていてもよい。具体的には、第一プローブに相当する配列部分と第二プローブに相当する配列部分が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズするように設計され、それぞれの配列部分が標的核酸にハイブリダイズしない配列部分で繋ぎ合わされており、5'末端側に蛍光体が標識され、3'末端側に消光体が標識されたプローブを用意する。このハイブリダイズしない配列部分の長さは、第一プローブに相当する配列部分と第二プローブに相当する配列部分を足し合わせた長さ以上であり、数百塩基程度の長さである必要がある。好ましくは50〜200塩基
長である。標的核酸が存在しない場合には、プローブは直鎖状となるためプローブの5'末
端と3'末端にそれぞれ標識された蛍光体と消光体は離れており反応液からは蛍光が検出される。標的核酸が存在すると、プローブは5'末端と3'末端が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズし、その結果蛍光体と消光体が接近するため蛍光共鳴エネルギートランスファーにより蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。このように第一プローブと第二プローブが繋がった場合にも、上述の第一プローブと第二プローブを使用する場合と同様に反応進行に伴って標的核酸が生成される様子を計測できる。また、プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、5'末端側に消光体を標識しても良い。
Further, the first probe and the second probe may be connected as one probe. Specifically, the sequence portion corresponding to the first probe and the sequence portion corresponding to the second probe are designed to hybridize in tandem with the target nucleic acid, and each sequence portion does not hybridize to the target nucleic acid. A probe is prepared, which is connected by a portion, labeled with a fluorescent substance on the 5 ′ end side and labeled with a quencher on the 3 ′ end side. The length of the non-hybridized sequence portion is not less than the total length of the sequence portion corresponding to the first probe and the sequence portion corresponding to the second probe, and needs to be about several hundred bases in length. . The length is preferably 50 to 200 bases. In the absence of the target nucleic acid, the probe is linear, and the fluorescent substance and quencher labeled at the 5 ′ end and 3 ′ end of the probe are separated from each other, and fluorescence is detected from the reaction solution. In the presence of the target nucleic acid, the probe hybridizes in tandem with the target nucleic acid at the 5 'and 3' ends. As a result, the fluorescent substance and the quencher come close to each other, so that the fluorescent signal from the fluorescent substance is generated by fluorescent resonance energy transfer. Quenched. Even when the first probe and the second probe are connected in this way, it is possible to measure how the target nucleic acid is generated as the reaction proceeds, as in the case where the first probe and the second probe are used. Further, a fluorescent substance may be labeled on the 3 ′ end side of the probe, and a quencher may be labeled on the 5 ′ end side.
以上のように、本発明によれば、標的配列に対して配列の制約なしにプローブが設計できる。 As described above, according to the present invention, a probe can be designed without any sequence restriction with respect to a target sequence.
また、本発明は、以下の核酸検出プローブキットを提供する。
１つの実施態様において、キットは標的核酸を認識する配列を持つ2種類のオリゴヌク
レオチドプローブからなり、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは標的核酸に対して、0〜10塩基、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるようにタンデムにハイブリダイズする配列を持つ。このギャップを挟んで片方のオリゴヌクレオチドプローブには蛍光体が標識され、もう片方のオリゴヌクレオチドプローブには消光体が標識されている。
The present invention also provides the following nucleic acid detection probe kit.
In one embodiment, the kit comprises two types of oligonucleotide probes having sequences that recognize the target nucleic acid, each oligonucleotide probe being 0 to 10 bases, preferably 0 to 3 bases, most preferred for the target nucleic acid. Preferably, it has a sequence that hybridizes in tandem so as to generate a gap of 1 base. A fluorescent substance is labeled on one oligonucleotide probe across this gap, and a quencher is labeled on the other oligonucleotide probe.
別な実施態様において、第一プローブと第二プローブは繋がった1種類のオリゴヌクレ
オチドプローブからなり、その5'末端と3'末端にはそれぞれ蛍光体と消光体が標識されており、この蛍光体と消光体が近接するように標的核酸にタンデムにハイブリダイズする。
In another embodiment, the first probe and the second probe consist of one linked oligonucleotide probe, and the phosphor and quencher are labeled at the 5 ′ end and 3 ′ end, respectively. And the quencher in close proximity to the target nucleic acid in tandem.
別な実施形態において、前記した蛍光体や消光体をユーザーが標識できるように、オリゴヌクレオチドプローブは末端がアミノ基などの官能基やビオチン修飾がなされたものであってもよい。その場合、キットは官能基と反応するための導入部分を有する蛍光体や消光体を別個に含むことができる。 In another embodiment, the oligonucleotide probe may have a functional group such as an amino group or a biotin modification so that the user can label the above-described phosphor or quencher. In that case, the kit can contain separately the fluorescent substance and quencher which have the introduction part for reacting with a functional group.
キットの必須構成要素は上述したオリゴヌクレオチドプローブであるが、本発明のキットは検出反応に必要な他の試薬、例えば反応緩衝液、基質ヌクレオチド、増幅用プライマー、酵素等を含んでいても良い。 The essential component of the kit is the oligonucleotide probe described above, but the kit of the present invention may contain other reagents necessary for the detection reaction, such as a reaction buffer, a substrate nucleotide, an amplification primer, an enzyme, and the like.
本発明では、標的遺伝子に対して、蛍光体及び消光体で標識された2種類あるいは1種類のオリゴヌクレオチドプローブを作用させ、蛍光共鳴エネルギートランスファーによって生じる蛍光シグナルの変化を検出する。これにより、従来、自由度の高い設計が困難であったMolecular BeaconプローブやQuenchingプローブと同様の機能を有する核酸検出用プローブを、標的遺伝子配列に関わらずに設計できることになる。 In the present invention, two or one type of oligonucleotide probes labeled with a fluorescent substance and a quencher are allowed to act on a target gene to detect a change in fluorescent signal caused by fluorescence resonance energy transfer. This makes it possible to design a nucleic acid detection probe having the same function as a Molecular Beacon probe or Quenching probe, which has conventionally been difficult to design with a high degree of freedom, regardless of the target gene sequence.
以下、図面を参照しながら、本発明について具体的に説明する。
本発明の第1のフローを図1に示す。本発明は核酸配列を検出するプローブであって、標的核酸3の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列を有する第一プローブ1と、第一プローブ1の3'末端から1塩基離れた位置に5'末端が位置するように標的核酸3にハイブ
リダイズする配列を有する第二プローブ2から構成される。第一プローブ1の3'末端にはDABCYLやBHQなどの消光体6が標識されており、第二プローブ2の5'末端にはFAMやCy5などの蛍光体5が標識されている。また、第二プローブの3'末端は、プローブが伸長しないようにリン酸化やアミノ化、あるいはダイデオキシ化などの修飾がなされている（図1にはリン酸7の場合を記載）。第一プローブには1つの消光体が標識されており、第二プローブには1つの蛍光体が標識されている。つまり1つのプローブにつき蛍光体あるいは消光体の標識は１つであることから、プローブ合成が容易となり合成収率が向上する。従来では二重標識が困難で、Molecular BeaconプローブやTaqManプローブには利用できない蛍光体についても本発明によって利用可能となる。例えば、Alexa350、Alexa750やAlexa790のような紫外領域で励起したり、あるいは遠赤外領域で蛍光を発する蛍光体でも利用できるようになる。標的核酸3が存在する場合、例えばPCR反応の進行に伴って標的核酸3の量が反応時間の経過とともに増加してくる場合には、第一プローブ1と第二プローブ2は増幅産物である標的核酸3にハイブリダイズする。第一プローブ1と第二プローブ2は1塩基のギャップを生じるような位置関係で標的核酸にハイブリダイズするように設計されているため、第一プローブ1に標識された消光体6と第二プローブに標識された蛍光体5が接近して蛍光体5からの蛍光が消光される。図1では標的核酸に対して第一プローブ１と第二プローブ2が1塩基のギャップを生じるようにハイブリダイズしているが、ギャップは0塩基（ギャップなし）から10塩基、好ましくは0塩基から3塩基の範囲であれば良い。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to the drawings.
A first flow of the present invention is shown in FIG. The present invention is a probe for detecting a nucleic acid sequence, the
なお、本発明において利用可能な蛍光体としては、FAM・TET・HEX・Fluorescein・FITC・CR6G・ROX・TAMRA・JOE・Texas Red・Oregon Green・Yakima Yellow・Pacific Blue・Cascade Blue・Cy Dyeシリーズ・CAL Fluorシリーズ・ALEXAシリーズ・Rhodamineシリーズ・BODIPYシリーズ等を挙げることができ、本発明において利用可能な消光体としては、TAMRA・Dabcyl・Eclipse(R) Dark Quencher・BHQシリーズ・DDQシリーズ等をあげることができる。本発明で用いる蛍光体と消光体の組み合わせとしては，ALEXA 350とBHQ-0・FAMとBHQ-1・ROXとBHQ-2・Cy5とBHQ-3・TETとDabcyl・FluoresceinとTAMRA・HEXとDDQＩ・Rhodamine 6GとDDQＩＩ・Yakima YellowとEclipse(R) Dark Quencher等が考えられるが、この組み合わせに限定するものではない。 The phosphors usable in the present invention include FAM, TET, HEX, Fluorescein, FITC, CR6G, ROX, TAMRA, JOE, Texas Red, Oregon Green, Yakima Yellow, Pacific Blue, Cascade Blue, Cy Dye series, CAL Fluor series, ALEXA series, Rhodamine series, BODIPY series, etc. can be mentioned, and examples of quenchers that can be used in the present invention include TAMRA, Dabcyl, Eclipse (R) Dark Quencher, BHQ series, DDQ series, etc. Can do. The combinations of phosphor and quencher used in the present invention include ALEXA 350, BHQ-0, FAM, BHQ-1, ROX, BHQ-2, Cy5, BHQ-3, TET, Dabcyl, Fluorescein, TAMRA, HEX, and DDQI.・ Rhodamine 6G, DDQII, Yakima Yellow, Eclipse (R) Dark Quencher, etc. are possible, but not limited to this combination.
本発明の第2のフローとして、第一プローブ11に蛍光体5を標識し、第二プローブ12に消光体6を標識した形態を図2に示す。図2では第二プローブ12の伸張を防ぐために、第二プ
ローブの3’末端にはアミノ基8を修飾している。この場合も図1の場合と同様に標的核酸3に第一プローブ11と第二プローブ12がハイブリダイズし、蛍光体5と消光体6が接近することによって消光作用が生じる。
As a second flow of the present invention, FIG. 2 shows a form in which the
本発明の第3のフローとして、第一プローブと第二プローブを繋いだ形態を図3に示す。この場合は、第一プローブに相当する配列部分と、第二プローブに相当する部分が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズするように設計され、それぞれの配列部分が標的核酸にハイブリダイズしない第三の配列部分で繋ぎ合わされた直鎖状のオリゴヌクレオチドプローブ15を用いる。オリゴヌクレオチドプローブ15の5'末端と3'末端には蛍光体5と消
光体6がそれぞれ標識されている。標的核酸3が存在しない場合には、オリゴヌクレオチドプローブ15は直鎖状のコンフォーメーションをとるためオリゴヌクレオチドプローブ15の5'末端と3'末端にそれぞれ標識された蛍光体5と消光体6は離れており反応液からは蛍光が検出される。一方、標的核酸3が存在すると、オリゴヌクレオチドプローブ15は5'末端と3'末端が標的核酸3に対してタンデムにハイブリダイズし、その結果蛍光体5と消光体6が接近するため蛍光共鳴エネルギートランスファーにより蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。この場合もまた、プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、5'末端側を消光体で標識しても良い。
As a third flow of the present invention, a form in which the first probe and the second probe are connected is shown in FIG. In this case, the sequence portion corresponding to the first probe and the portion corresponding to the second probe are designed to hybridize in tandem with the target nucleic acid, and each sequence portion does not hybridize to the target nucleic acid. The
本発明の第一プローブと第二プローブを用いれば、PCRで増幅反応を実施する前と実施
した後の溶液の蛍光強度を測定することで標的核酸の有無を判断することができる。このとき、第一プローブと第二プローブのTmは、プライマーのTmよりも5〜10℃程高く設定す
る。アニーリング時に蛍光測定するので、プローブはプライマーよりも先に確実にハイブリダイズするようにするためである。たとえば、後述する〔実施例2〕で使用したプライ
マーのTmは、F側59.0℃、R側57.2℃であり、これに対し、プローブのTmは、第一プローブ65.3℃、第二プローブ66.3℃である。
By using the first probe and the second probe of the present invention, the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by measuring the fluorescence intensity of the solution before and after carrying out the amplification reaction by PCR. At this time, the Tm of the first probe and the second probe is set to be 5 to 10 ° C. higher than the Tm of the primer. Since the fluorescence is measured at the time of annealing, the probe is surely hybridized before the primer. For example, the Tm of the primer used in [Example 2] described later is 59.0 ° C. on the F side and 57.2 ° C. on the R side, whereas the Tm of the probe is 65.3 ° C. of the first probe and 66.3 ° C. of the second probe. is there.
図4のグラフ20は標的核酸のPCR増幅反応前後での蛍光強度を、本発明の第一プローブと第二プローブを用いて測定した結果と、Quenchingプローブを用いて測定した結果を比較
したものである。グラフ20の縦軸は増幅反応前の蛍光強度で規格化した蛍光シグナル量(%)を示している。(a)〜(e)は増幅反応前後の、Quenchingプローブや本発明による第一プローブ由来の蛍光シグナル量をそれぞれ示している。(a)は増幅反応前のQuenchingプローブの蛍光シグナル量、(b)は増幅反応後のQuenchingプローブの蛍光シグナル量を示す。
(a)と(b)を比較すると増幅反応後の蛍光シグナル量が増幅反応前に比べて50%程度に減少している。一方、(c)は第一プローブと第二プローブを用いる系での増幅反応前の蛍光シグナル量、(d)は第一プローブと第二プローブを用いる系での増幅反応後の蛍光シグナル量を示す。(c)と(d)を比較すると増幅反応後の蛍光シグナル量が増幅反応前に比べて45%程度に減少している。この結果から、本発明の第一プローブと第二プローブを用いると、従来法であるQuenchingプローブと同様に標的核酸の有無を判定できることがわかる。また、(e)はコントロールとして第二プローブを含まない（第一プローブだけを用いた）場合の増幅反応後の蛍光シグナル量を示す。(c)と(e)の比較から、増幅反応の前後で蛍光シグナル量はほとんど変化していなかった。この結果から、本発明の核酸検出プローブを機能させるためには消光体を標識した第二プローブを用いることが必要であることがわかる。以上から、本発明の第一プローブと第二プローブを用いることで、標的核酸の有無を判定可能であることが理解できる。
When (a) and (b) are compared, the amount of fluorescence signal after the amplification reaction is reduced to about 50% compared to before the amplification reaction. On the other hand, (c) is the amount of fluorescence signal before the amplification reaction in the system using the first probe and the second probe, and (d) is the amount of fluorescence signal after the amplification reaction in the system using the first probe and the second probe. Show. When (c) and (d) are compared, the amount of fluorescence signal after the amplification reaction is reduced to about 45% compared to before the amplification reaction. From this result, it can be seen that the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by using the first probe and the second probe of the present invention in the same manner as the Quenching probe which is a conventional method. (E) shows the amount of fluorescence signal after the amplification reaction when the second probe is not included as a control (only the first probe is used). From the comparison between (c) and (e), the fluorescence signal amount hardly changed before and after the amplification reaction. From this result, it is understood that it is necessary to use a second probe labeled with a quencher in order to make the nucleic acid detection probe of the present invention function. From the above, it can be understood that the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by using the first probe and the second probe of the present invention.
一般的に、標的核酸が存在しない場合の蛍光強度と、標的核酸が存在する場合の蛍光強度の比が検出プローブの感度を示す指標となる。本発明では、標的核酸が存在しない場合の蛍光強度が大きく、標的核酸が存在する場合の蛍光エネルギートランスファーによる蛍光シグナルの減少を観察する。そこで、蛍光シグナルの減少分を示す指標として、反応開始直後の蛍光強度減少前と、蛍光強度減少後の蛍光強度比を消光率として定義すると、消光率の高いプローブを検出感度に優れたプローブと判定できる。 In general, the ratio of the fluorescence intensity in the absence of the target nucleic acid to the fluorescence intensity in the presence of the target nucleic acid is an index indicating the sensitivity of the detection probe. In the present invention, the fluorescence intensity is high when the target nucleic acid is not present, and a decrease in the fluorescence signal due to fluorescence energy transfer when the target nucleic acid is present is observed. Therefore, as an indicator of the decrease in fluorescence signal, the ratio of fluorescence intensity immediately before the start of the reaction immediately before the decrease in fluorescence intensity and the fluorescence intensity after the decrease in fluorescence intensity is defined as the quenching rate. Can be judged.
図5は消光率と、第一プローブと第二プローブのギャップ塩基数の関係を示すグラフで
ある。グラフ25は横軸を第一プローブと第二プローブのギャップ塩基数にとり、縦軸に消光率(%)をプロットしたしている。グラフ25から、ギャップ塩基数が2の時に消光率が最大値をとるが、ギャップ塩基数1や3の場合とほぼ同じであることがわかる。従って、本発明におけるギャップ塩基数は0〜10塩基程度、好ましくは0〜3塩基、より好ましくは1塩基であることがわかる。
FIG. 5 is a graph showing the relationship between the extinction rate and the number of gap bases between the first probe and the second probe. In
本発明では、標的核酸に対して第一プローブと第二プローブが同時にハイブリダイズする必要がある。第一プローブだけ、あるいは第二プローブだけが標的核酸にハイブリダイズしても消光作用は観測されず、標的核酸の有無を判定できないからである。第一プローブと第二プローブが標的核酸に対して同時にハイブリダイズするためには、第一プローブと第二プローブのTm値をできるだけ揃えることが望ましい。 In the present invention, the first probe and the second probe need to hybridize simultaneously with the target nucleic acid. This is because even when only the first probe or only the second probe is hybridized to the target nucleic acid, no quenching effect is observed and the presence or absence of the target nucleic acid cannot be determined. In order for the first probe and the second probe to simultaneously hybridize to the target nucleic acid, it is desirable to align the Tm values of the first probe and the second probe as much as possible.
図6に第一プローブと第二プローブのTm値の差と消光率(%)の関係を示す。グラフ30は第二プローブのTm値と第一プローブのTm値の差（横軸）に対して消光率(%)を縦軸にプロッ
トしたものである。グラフ中の点線で示す消光率52.8%の線は、従来法であるQuenchingプローブで3点測定した場合の平均消光率である。二つのプローブのTm値の差が2℃前後までの場合は、消光率は従来法であるQuenchingプローブの消光率を上回っているが、Tm値の
差が4℃、6℃と大きくなるにつれて、消光率はQuenchingプローブよりも小さくなり、プ
ローブ感度が低下していることがわかる。また、Tm値の差が大きくなるにつれて消光率のばらつきも大きくなり、プローブ動作の再現性も低下していることがわかる。この結果から、2つのプローブのTm値の差は3℃以内とすることが望ましい。
FIG. 6 shows the relationship between the difference in Tm value between the first probe and the second probe and the extinction rate (%).
また、増幅反応実施中に蛍光強度を測定することによって標的核酸の有無をリアルタイムで判定することもできる。リアルタイム計測の結果から、標的核酸の定量も可能である。 In addition, the presence or absence of the target nucleic acid can be determined in real time by measuring the fluorescence intensity during the amplification reaction. The target nucleic acid can also be quantified from the result of real-time measurement.
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
１．材料
1) 実施例1で使用したプライマー
LAMP反応用、フォワード側、内側プライマー
5'-tcc agg ggt ctt aac ttg atg gaa aaa t-3'（配列番号 1）
LAMP反応用、フォワード側、外側プライマー
5'-tcc aga aac gtt tcg-3'（配列番号 2）
LAMP反応用、リバース側、内側プライマー
5'-gga tcc agg ccc aga aaa aaa gac tgt-3'（配列番号 3）
LAMP反応用、リバース側、外側プライマー
5'-agg gct tgg tca ata t-3'（配列番号 4）
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
1. material
1) Primer used in Example 1
For LAMP reaction, forward side, inner primer
5'-tcc agg ggt ctt aac ttg atg gaa aaa t-3 '(SEQ ID NO: 1)
For LAMP reaction, forward side, outer primer
5'-tcc aga aac gtt tcg-3 '(SEQ ID NO: 2)
For LAMP reaction, reverse side, inner primer
5'-gga tcc agg ccc aga aaa aaa gac tgt-3 '(SEQ ID NO: 3)
For LAMP reaction, reverse side, outer primer
5'-agg gct tgg tca ata t-3 '(SEQ ID NO: 4)
2) 実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt cct gg-(BHQ-1)-3'（配列番号 5）
検出用第二プローブ
5'-(FAM)-tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc-(P)-3'（配列番号 6）
2) First probe for detection of oligonucleotide probe used in Example 1
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt cct gg- (BHQ-1) -3 '(SEQ ID NO: 5)
Second probe for detection
5 '-(FAM) -tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc- (P) -3' (SEQ ID NO: 6)
3) 実施例１で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tris-HCl pH8.2 (10 mM), KCl (20 mM), (NH4)2SO4(5 mM), MgSO4 (2 mM), dATP (0.25
mM), dCTP (0.25 mM), dGTP (0.25 mM), dTTP (0.25 mM), TritonX-100 (0.05%), Betaine(250 mM)
3) Composition of the reaction solution used in Example 1 (values in parentheses indicate final concentration values)
Tris-HCl pH8.2 (10 mM), KCl (20 mM), (NH 4 ) 2 SO 4 (5 mM), MgSO 4 (2 mM), dATP (0.25
mM), dCTP (0.25 mM), dGTP (0.25 mM), dTTP (0.25 mM), TritonX-100 (0.05%), Betaine (250 mM)
4) 実施例１で使用した酵素の組成
Bst DNAポリメラーゼ 8U
4) Composition of the enzyme used in Example 1
Bst DNA polymerase 8U
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、LAMP反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダにより検出した。ヒトゲノムDNA100ngを鋳型とし、シトクロムP450遺伝子を増幅するために上記1.に記載のフォワード側内側プライマー、フォワード側外側プライマー、リバース側内側プライマー、リバース側外側プライマーとBst DNAポリメラーゼを用いてLAMP反応を行った。
2. Method In order to confirm whether the target nucleic acid can be detected using the nucleic acid detection probe of the present invention described in FIG. 1, a LAMP reaction was performed, and the amplification product was detected with a fluorescent plate reader. To amplify the cytochrome P450 gene using 100 ng of human genomic DNA as a template, perform a LAMP reaction using the forward inner primer, forward outer primer, reverse inner primer, reverse outer primer and Bst DNA polymerase described in 1 above. It was.
検出用第一プローブは3'末端が消光体であるBHQ-1で標識されており、標的核酸である
シトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有する。また、検出用第二プローブは5'末端が蛍光体であるFAMで標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにリン
酸化されている。また検出用第二プローブはシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有しており、検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハイブリダ
イズするよう設計されている。
The first probe for detection is labeled with BHQ-1 which is a quencher at the 3 ′ end, and has a sequence which hybridizes to the cytochrome P450 gene which is a target nucleic acid. The second probe for detection is labeled with FAM, which is a fluorescent substance, at the 5 ′ end, and the 3 ′ end is phosphorylated to prevent the extension of the probe. The second detection probe has a sequence that hybridizes to the cytochrome P450 gene, and is designed to hybridize with a 1-base gap downstream from the first detection probe.
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、BstDNAポリメラーゼを含む反応液に、鋳型となるヒトゲノムDNAを投入し、60℃に設定したヒートブロックにて90分
間インキュベートした。その後、蛍光プレートリーダにて反応液の蛍光シグナルを測定し
た。
Human genomic DNA used as a template was put into the reaction solution containing the primer, oligonucleotide probe and BstDNA polymerase described in 1. above, and incubated for 90 minutes in a heat block set at 60 ° C. Thereafter, the fluorescence signal of the reaction solution was measured with a fluorescence plate reader.
３．結果
測定結果を図7に示す。グラフ35は様々な条件の反応液に対して蛍光シグナル量（％）
をプロットしたものである。グラフ35中の(a)と(c)は反応前の蛍光シグナル量、(b)と(d)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、(a)で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の(b)の蛍光シグナル量を規格化した。(a)と(b)の反応液には鋳型DNAが含まれているが、(c)と(d)の反応液は鋳型DNAを含まないネガティブコントロールである。(a)と(c)の蛍光シグナルから、鋳型DNAを含む/含まないにかかわらず増幅反応前では蛍光シ
グナル量が同程度に高いことが確認できた。また、(b)の鋳型DNAを含む反応用液では、反応進行により、蛍光シグナル量が減少していた。(d)の鋳型DNAを含まないネガティブコントロールの反応液では、反応が進行しても蛍光シグナル量は減少しなかった。これらの結果から、本発明のプローブの作用によって消光が起こり、標的核酸を検出できることが確認できた。
3. Results The measurement results are shown in FIG.
Are plotted. In
〔実施例2〕
１．材料
1) 実施例2で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-gtc cca tta ttt tcc aga aac gtt tcg-3'（配列番号 7）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-aag tac ttc agg gct tgg tca ata t-3'（配列番号8）
(Example 2)
1. material
1) Primer used in Example 2
For PCR reaction, forward primer
5'-gtc cca tta ttt tcc aga aac gtt tcg-3 '(SEQ ID NO: 7)
For PCR reaction, reverse primer
5'-aag tac ttc agg gct tgg tca ata t-3 '(SEQ ID NO: 8)
2) 実施例2で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt acc tgg-(FAM)-3'（配列番号 9）
検出用第二プローブ
5'-(BHQ-1)-tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc-(NH2)-3'（配列番号 10）
2) First probe for detection of oligonucleotide probe used in Example 2
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt acc tgg- (FAM) -3 '(SEQ ID NO: 9)
Second probe for detection
5 '-(BHQ-1) -tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 10)
3) 実施例2で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA(3.75 mg/mL)
3) Composition of the reaction solution used in Example 2 (values in parentheses indicate final concentration values)
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO 4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA ( 3.75 mg / mL)
4) 実施例2で使用した酵素の組成
TITANIUM Taq ポリメラーゼ2U（Clontech社）
4) Composition of the enzyme used in Example 2
TITANIUM Taq Polymerase 2U (Clontech)
２．方法
図2で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物をリアルタイム検出装置により検出した。ヒトゲノムDNA102〜108コピーを鋳型とし、シトクロムP450遺伝子を増幅するために上記1.に記載のPCR反応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとTITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）を用いてPCR反応を行った。
2. Method In order to confirm whether the target nucleic acid can be detected using the nucleic acid detection probe of the present invention described in FIG. 2, a PCR reaction was performed, and the amplification product was detected by a real-time detection apparatus. In order to amplify cytochrome P450 gene using 10 2 to 10 8 copies of human genomic DNA as a template, PCR reaction was performed using the forward primer for PCR reaction, the reverse primer for PCR reaction and TITANIUM Taq polymerase (Clontech) described in 1. went.
なお、TITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）はTaqポリメラーゼのN末端欠失変異
体であり、この欠失により5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が取り除かれている。このため、反応液中に含まれる検出用第一プローブと検出用第二プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。検出用第一プローブは3'末端が蛍光体であるFAMで標識されており、標的核酸であるシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有する。また、検出用第二プローブは5'末端が消光体であるBHQ-1で標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。これはシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有しており、検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハイブリダイズするよう設計されている。
TITANIUM Taq polymerase (Clontech) is an N-terminal deletion mutant of Taq polymerase, and this deletion removes 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity. For this reason, the first probe for detection and the second probe for detection contained in the reaction solution hybridize to the amplification product without being decomposed. As a result, the fluorescence is quenched by fluorescence resonance energy transfer between the probes. The first probe for detection is labeled with FAM that is a fluorescent substance at the 3 ′ end, and has a sequence that hybridizes to the cytochrome P450 gene that is the target nucleic acid. The second probe for detection is labeled with BHQ-1 which is a quencher at the 5 ′ end, and the 3 ′ end is aminated to prevent the probe from extending. This has a sequence that hybridizes to the cytochrome P450 gene, and is designed to hybridize with a 1-base gap downstream from the first probe for detection.
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、TITANIUM Taq ポリメラー
ゼを含む反応液に、鋳型となるヒトゲノムDNAを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステ
ップを60回繰り返す熱サイクルを設定したリアルタイムPCR検出装置を用いて反応液の蛍
光シグナル量の時間変化を測定した。
The reaction mixture containing the primer, oligonucleotide probe, and TITANIUM Taq polymerase described in 1. above was charged with human genomic DNA as a template, and a thermal cycle was set up in which the steps of 95 ° C for 20 seconds and 55 ° C for 40 seconds were repeated 60 times. The time change of the fluorescence signal amount of the reaction solution was measured using a real-time PCR detector.
３．結果
測定結果を図8のグラフ40に示す。横軸はサイクル数、縦軸はFAMの蛍光シグナル量を示す。核酸増幅前の発光量を100％、核酸増幅後の発光量を0％として規格化している。グラフ中、初期鋳型濃度が108コピーの場合のFAMの蛍光シグナル量は反応開始後、20サイクル付近で減少を開始した。FAMの蛍光シグナル量はシトクロムP450遺伝子が増幅したことに
より、検出用第一プローブと検出用第二プローブがハイブリダイズして蛍光が消光されたことを示している。蛍光シグナル量の減少が開始されるサイクル数は初期鋳型濃度依存的に増加したことから、本発明のプローブを用いて標的核酸をリアルタイムに検出できることが確認できた。
3. Results The measurement results are shown in the
〔実施例3〕
１．材料
1) 実施例3で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-gca gaa agc gtc tag cca tgg cg-3'（配列番号 11）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-cat ggt gca cgg tct acg aga cc-3'（配列番号 12）
逆転写プライマー
5'-tgc tca tgg tgc acg gtc ta-3'（配列番号 13）
Example 3
1. material
1) Primer used in Example 3
For PCR reaction, forward primer
5'-gca gaa agc gtc tag cca tgg cg-3 '(SEQ ID NO: 11)
For PCR reaction, reverse primer
5'-cat ggt gca cgg tct acg aga cc-3 '(SEQ ID NO: 12)
Reverse transcription primer
5'-tgc tca tgg tgc acg gtc ta-3 '(SEQ ID NO: 13)
2) 実施例3で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
5’-(FAM)-tgtt ggg tcgcg aaag gcc ccttc tca ctg ttc tct cat aga agt gat gag gga aca gag cac tca tct ctt ctc cct gtt aga ctg cta gcc gag tag-(BHQ-1)-3’（配列
番号 14）
下線部が鋳型にハイブリダイズする。
2) Oligonucleotide probe used in Example 3
5 '-(FAM) -tgtt ggg tcgcg aaag gcc ccttc tca ctg ttc tct cat aga agt gat gag gga aca gag cac tca tct ctt ctc cct gtt aga ctg cta gcc gag tag- (BHQ-1) -3' (sequence number 14)
The underlined portion hybridizes to the template.
3) 実施例3で使用した反応液の組成
実施例3では反応液としてGene TaqUniversal Buffer（ニッポンジーン社）を使用した
。反応液は、dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), dTTP (0.2 mM)を含むよう調製した。
3) Composition of reaction solution used in Example 3 In Example 3, Gene Taq Universal Buffer (Nippon Gene) was used as the reaction solution. The reaction solution was prepared to contain dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), and dTTP (0.2 mM).
4) 実施例3で使用した酵素の組成。
Recombinant Taq DNA Polymerase：Gene Taq 0.625U（ニッポンジーン社）
4) Composition of the enzyme used in Example 3.
Recombinant Taq DNA Polymerase: Gene Taq 0.625U (Nippon Gene)
２．方法
図3で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダを用いて検出した。HCVのゲノムRNAを逆転写用プライマーで逆転写して得たcDNA 1ngを鋳型とし、目的配列を増幅するた
めに上記1.に記載のPCR反応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとGene Taq（ニッポンジーン社）を用いてPCR反応を行った。
2. Method In order to confirm whether the target nucleic acid can be detected using the nucleic acid detection probe of the present invention described in FIG. 3, a PCR reaction was performed, and the amplification product was detected using a fluorescent plate reader. In order to amplify the target sequence using 1 ng of cDNA obtained by reverse transcription of HCV genomic RNA with reverse transcription primers, the PCR reaction forward primer, PCR reaction reverse primer and Gene Taq (Nippon Gene) described in 1. PCR reaction was performed using
なお、Gene Taq（ニッポンジーン社）は天然型Taq DNAポリメラーゼのN末端を一部欠失させてあるため、内因性の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有しない。このため、反応液中に含まれる検出用プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。検出用プローブは3'末端が消光体であるBHQ-1で、5'末端が蛍光体であるFAMで標識されている。3'末端から18塩基の配列（gat gag ccg atc gtc aga：配列番号15）と5'末端から18塩基の配列（tgt tgg gtc gcg aaa ggc c：配列番号16）が、1塩基のギャップを空けてタンデムにHCV遺伝子にハイブリダイズするよう設計されている。 Gene Taq (Nippon Gene) has no endogenous 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity because it partially deletes the N-terminus of natural Taq DNA polymerase. For this reason, the detection probe contained in the reaction solution is hybridized to the amplification product without being decomposed. As a result, the fluorescence is quenched by fluorescence resonance energy transfer between the probes. The detection probe is labeled with BHQ-1 which is a quencher at the 3 ′ end and with FAM which is a phosphor at the 5 ′ end. A sequence of 18 bases from the 3 ′ end (gat gag ccg atc gtc aga: SEQ ID NO: 15) and a sequence of 18 bases from the 5 ′ end (tgt tgg gtc gcg aaa ggc c: SEQ ID NO: 16) have a gap of 1 base. Designed to hybridize to the HCV gene in tandem.
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、Gene Taqを含む反応液に鋳型となるcDNAを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステップを40回繰り返す熱サイクルを行った。その後、蛍光プレートリーダにて反応液の蛍光シグナルを測定した。 The template cDNA was put into the reaction solution containing the primer, oligonucleotide probe and Gene Taq described in 1. above, and a thermal cycle was repeated 40 times at 95 ° C. for 20 seconds and 55 ° C. for 40 seconds. Thereafter, the fluorescence signal of the reaction solution was measured with a fluorescence plate reader.
３．結果
測定結果を図9のグラフ45に示す。グラフ45は上記の反応液に対して蛍光シグナル量（
％）をプロットしたものである。グラフ45中の(a)は反応前の蛍光シグナル量を、(b)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、（a）で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の（b）の蛍光シグナル量を規格化した。この結果から、本発明のプローブの
作用によって消光が起こり、標的核酸を検出できることが確認できた。
3. Results The measurement results are shown in
%) Is plotted. In
〔実施例4〕
１．材料
1) 実施例4で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-tcttt ccaag caaca gcag-3’（配列番号 17）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-cgttt gctga tgaac taagt c-3'（配列番号 18）
(Example 4)
1. material
1) Primer used in Example 4
For PCR reaction, forward primer
5'-tcttt ccaag caaca gcag-3 '(SEQ ID NO: 17)
For PCR reaction, reverse primer
5'-cgttt gctga tgaac taagt c-3 '(SEQ ID NO: 18)
2) 実施例4で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5’-caatg accaa atcaa agaaa t-(BHQ-0)-3’（配列番号19）
5’-caatg accaa atcaa agaaa t-(DABCYL)-3’（配列番号 20）
検出用第二プローブ
5’-(ALEXA350)-actcg caagg ttagt gctga g-(NH2)-3’（配列番号 21）
5’-(ALEXA790)-actcg caagg ttagt gctga g-(NH2)-3’（配列番号 22）
2) First probe for detection of oligonucleotide probe used in Example 4
5'-caatg accaa atcaa agaaa t- (BHQ-0) -3 '(SEQ ID NO: 19)
5'-caatg accaa atcaa agaaa t- (DABCYL) -3 '(SEQ ID NO: 20)
Second probe for detection
5 '-(ALEXA350) -actcg caagg ttagt gctga g- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 21)
5 '-(ALEXA790) -actcg caagg ttagt gctga g- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 22)
3) 実施例4で使用した反応液の組成
実施例4では反応液としてGene TaqUniversal Buffer（ニッポンジーン社）を使用した
。反応液は、dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), dTTP (0.2 mM)を含むよう調製した。
3) Composition of reaction solution used in Example 4 In Example 4, Gene Taq Universal Buffer (Nippon Gene) was used as the reaction solution. The reaction solution was prepared to contain dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), and dTTP (0.2 mM).
4) 実施例4で使用した酵素の組成。
Recombinant Taq DNA Polymerase：Gene Taq 0.625U（ニッポンジーン社）
4) Composition of the enzyme used in Example 4.
Recombinant Taq DNA Polymerase: Gene Taq 0.625U (Nippon Gene)
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダを用いて検出した。バクテリオ
ファージphiX174ゲノムDNAを鋳型とし、目的配列を増幅するために上記1.に記載のPCR反
応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとGene Taq（ニッポンジーン
社）を用いてPCR反応を行った。
2. Method In order to confirm whether the target nucleic acid can be detected using the nucleic acid detection probe of the present invention described in FIG. 1, a PCR reaction was performed, and the amplification product was detected using a fluorescent plate reader. In order to amplify the target sequence using bacteriophage phiX174 genomic DNA as a template, PCR reaction was performed using the PCR reaction forward primer, PCR reaction reverse primer and Gene Taq (Nippon Gene) described in 1. above.
なお、Gene Taq（ニッポンジーン社）は天然型Taq DNAポリメラーゼのN末端を一部欠失させてあるため、内因性の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有しない。このため、反応液中に含まれる検出用プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。 Gene Taq (Nippon Gene) has no endogenous 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity because it partially deletes the N-terminus of natural Taq DNA polymerase. For this reason, the detection probe contained in the reaction solution is hybridized to the amplification product without being decomposed. As a result, the fluorescence is quenched by fluorescence resonance energy transfer between the probes.
配列番号19で示す検出用第一プローブは3'末端が消光体であるBHQ-0で標識されており
、標的核酸であるバクテリオファージphiX174ゲノムにハイブリダイズする配列を有する
。また配列番号21で示す検出用第二プローブは5'末端が蛍光体であるALEXA350で標識されており、3’末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。配列番号21で示す
検出用第二プローブはバクテリオファージphiX174ゲノムにハイブリダイズする配列を有
しており、配列番号19で示す検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハ
イブリダイズするよう設計されている。
The first probe for detection shown in SEQ ID NO: 19 is labeled with BHQ-0, which is a quencher at the 3 ′ end, and has a sequence that hybridizes to the bacteriophage phiX174 genome, which is the target nucleic acid. In addition, the second probe for detection shown in SEQ ID NO: 21 is labeled with ALEXA350, which is a fluorescent substance, at the 5 ′ end, and the 3 ′ end is aminated in order to prevent extension of the probe. The second probe for detection shown in SEQ ID NO: 21 has a sequence that hybridizes to the bacteriophage phiX174 genome, and hybridizes with a gap of 1 base downstream from the first probe for detection shown in SEQ ID NO: 19. It is designed as follows.
また、配列番号20で示す検出用第一プローブは、配列番号19で示す検出用第一プローブと同じ塩基配列であり、3’末端が消光体であるDABCYLで標識されている。配列番号22で
示す検出用第二プローブは、配列番号21で示す検出用第二プローブと同じ塩基配列であり、5'末端が蛍光体であるALEXA790で標識されており、3’末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。配列番号20の検出用第一プローブと配列番号22の検出用第二プローブを組み合わせて用いる場合も、配列番号19の検出用第一プローブと配列番号21の検出用第二プローブを組み合わせて用いる場合と同様に、バクテリオファージphiX174ゲノムに検出用第一プローブの下流側に検出用第二プローブが1塩基のギャップを空けてハイブリダイズする。
Further, the first probe for detection shown by SEQ ID NO: 20 has the same base sequence as the first probe for detection shown by SEQ ID NO: 19, and the 3 ′ end is labeled with DABCYL which is a quencher. The second probe for detection shown in SEQ ID NO: 22 has the same base sequence as the second probe for detection shown in SEQ ID NO: 21, the 5 ′ end is labeled with a fluorescent ALEXA790, and the 3 ′ end is the probe. Aminated to prevent elongation. When the first probe for detection of SEQ ID NO: 20 and the second probe for detection of SEQ ID NO: 22 are used in combination, or when the first probe for detection of SEQ ID NO: 19 and the second probe for detection of SEQ ID NO: 21 are used in combination Similarly, the second probe for detection hybridizes to the bacteriophage phiX174 genome with a gap of one base downstream from the first probe for detection.
上記1.に記載のプライマー、検出用第一プローブと検出用第二プローブ（配列番号19と配列番号21の組み合わせ、あるいは配列番号20と配列番号22の組み合わせ）、Gene Taqを含む反応液に鋳型となるcDNAを投入し、95℃15秒間と60℃60秒間のステップを45回繰り返す熱サイクルを行った。その後、蛍光光度計にて反応液の蛍光シグナルを測定した。 The reaction mixture containing the primer described in 1 above, the first probe for detection and the second probe for detection (a combination of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21 or a combination of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22), and Gene Taq Then, a thermal cycle in which the steps of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 60 seconds were repeated 45 times was performed. Thereafter, the fluorescence signal of the reaction solution was measured with a fluorometer.
３．結果
測定結果を図10のグラフ50に示す。グラフ50は上記の反応液に対して蛍光シグナル量（％）をプロットしたものである。グラフ50中の(a)は反応前の蛍光シグナル量を、(b)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、（a）で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の（b）の蛍光シグナル量を規格化した。グラフ中、グレーで示すバーは配列番号19と配列番号21の組み合わせを使用した反応溶液の反応前と終了後の蛍光強度を、蛍光光度計を用いて励起波長345 nmで励起し、400〜500 nmの波長範囲の蛍光強度を測定したものである。一方、白で示すバーは配列番号20と配列番号22の組み合わせを使用した反応溶液の反応前と終了後の蛍光強度を、蛍光光度計を用いて励起波長790 nmで励起し、800〜850 nmの波長範囲の蛍光強度を測定したものである。グレー、白いずれのバーも反応前の蛍光強度に比べて、反応終了後の蛍光強度が半分以下に消光されていた。これらの結果から、本発明では、紫外光で励起可能なALEXA350のような蛍光体や遠赤外領域の蛍光色素であるALEXA790のような蛍光体も利用可能であることが確認できた。
3. Results The measurement results are shown in the
〔実施例5〕
１．材料
1) 実施例5で使用したプライマー
PCR反応用センスプライマー
5'-tgcta tgtca cttcc ccttg gttct ctca-3’（配列番号 23）
PCR反応用アンチセンスプライマー
5'-agtgg gggga catca agcag ccatg caaa-3'（配列番号 24）
Example 5
1. material
1) Primer used in Example 5
Sense primer for PCR reaction
5'-tgcta tgtca cttcc ccttg gttct ctca-3 '(SEQ ID NO: 23)
Antisense primer for PCR reaction
5'-agtgg gggga catca agcag ccatg caaa-3 '(SEQ ID NO: 24)
2) 実施例5で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5’-ctgcagaatgggacaggit-(DABCYL)-3’（配列番号 25）
5’-gaggaagctgcagaatgg-(DABCYL)-3’（配列番号 26）
5’-aagataccatcaatgagg-(DABCYL)-3’（配列番号 27）
5’-cagaatgggatagggt-(DABCYL)-3’（配列番号 28）
検出用第二プローブ
5’-(ALEXA350)-acagccagtacatgcag-(NH2)-3’（配列番号 29）
5’-(ALEXA430)-gatagattgcatcccagt-(NH2)-3’（配列番号 30）
5’-(ALEXA594)-aggctgcagaatggga-(NH2)-3’（配列番号 31）
5’-(ALEXA790)- acacccagtacatgcagggc-(NH2)-3’（配列番号 32）
2) First probe for detection of oligonucleotide probe used in Example 5
5'-ctgcagaatgggacaggit- (DABCYL) -3 '(SEQ ID NO: 25)
5'-gaggaagctgcagaatgg- (DABCYL) -3 '(SEQ ID NO: 26)
5'-aagataccatcaatgagg- (DABCYL) -3 '(SEQ ID NO: 27)
5'-cagaatgggatagggt- (DABCYL) -3 '(SEQ ID NO: 28)
Second probe for detection
5 '-(ALEXA350) -acagccagtacatgcag- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 29)
5 '-(ALEXA430) -gatagattgcatcccagt- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 30)
5 '-(ALEXA594) -aggctgcagaatggga- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 31)
5 '-(ALEXA790)-acacccagtacatgcagggc- (NH 2 ) -3' (SEQ ID NO: 32)
3) 実施例5で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA(3.75 mg/mL)
3) Composition of reaction solution used in Example 5 (values in parentheses indicate final concentration values)
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO 4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA ( 3.75 mg / mL)
4) 実施例5で使用した酵素の組成。
TITANIUM Taq ポリメラーゼ2U（Clontech社）
4) Composition of the enzyme used in Example 5.
TITANIUM Taq Polymerase 2U (Clontech)
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸のジェノタイピングが可能
かを確認するために、PCR反応を行い、増幅産物をリアルタイム検出装置により検出した
。HIV-1ウイルスゲノムRNAを鋳型とし、gag領域を増幅するために上記1.に記載のPCR反応用センスプライマー、PCR反応用アンチセンスプライマーとTITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）を用いてPCR反応を行った。
2. Method In order to confirm whether or not genotyping of a target nucleic acid was possible using the nucleic acid detection probe of the present invention described in FIG. 1, a PCR reaction was performed, and an amplification product was detected by a real-time detection apparatus. To amplify the gag region using HIV-1 virus genomic RNA as a template, perform PCR reaction using the PCR reaction sense primer, PCR reaction antisense primer and TITANIUM Taq polymerase (Clontech) described in 1. It was.
なお、TITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）はTaqポリメラーゼのN末端欠失変異
体であり、この欠失により5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が取り除かれている。このため、反応液中に含まれる検出用第一プローブと検出用第二プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。
TITANIUM Taq polymerase (Clontech) is an N-terminal deletion mutant of Taq polymerase, and this deletion removes 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity. For this reason, the first probe for detection and the second probe for detection contained in the reaction solution hybridize to the amplification product without being decomposed. As a result, the fluorescence is quenched by fluorescence resonance energy transfer between the probes.
配列番号25、26、27、28で示す検出用第一プローブは3'末端が消光体であるDABCYLで標識されており、それぞれHIV-1ウイルスゲノムのサブタイプA、B、C、CRFs (Circulating Recombinant forms) AE標的核酸であるgag領域にハイブリダイズする配列を有する。また、配列番号29、30、31、32で示す検出用第二プローブはそれぞれの5'末端が蛍光体であるALEXA350、ALEXA430、ALEXA594、ALEXA790で標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。またこれらはそれぞれHIV-1ウイルスゲノムのサブタイプA、B、C、CRFs (Circulating Recombinant forms) AE標的核酸であるgag領域にハイブリダイズする配列を有しており、同じサブタイプにハイブリダイズする検出用第一プローブの下流側にハイブリダイズするよう設計されている。つまり、サブタイプAに対して配列番号25の検出用第一プローブの下流側に配列番号29の検出用第二プローブがハイブリダイズし、サブタイプBに対して配列番号26の検出用第一プローブの下流側に配列番号30の検出用第二プローブがハイブリダイズし、サブタイプCに対して配列番号27の検出用第一プローブの下流側に配列番号31の検出用第二プローブがハイブリダイズし、CRFs AEに対して配列番号28の下流側に配列番号32の検出用第二プローブがハイブリダイズする。 The first probes for detection shown in SEQ ID NOs: 25, 26, 27, and 28 are labeled with DABCYL, which is a quencher at the 3 ′ end, respectively, and subtypes A, B, C, and CRFs (Circulating of the HIV-1 virus genome). Recombinant forms) It has a sequence that hybridizes to the gag region that is an AE target nucleic acid. In addition, the second probes for detection shown in SEQ ID NOs: 29, 30, 31, and 32 are labeled with fluorescent substances ALEXA350, ALEXA430, ALEXA594, and ALEXA790 at their 5 'ends, and the 3' ends extend the probe. Aminated to prevent. Each of these has a sequence that hybridizes to the gag region, which is a subtype A, B, C, CRFs (Circulating Recombinant forms) AE target nucleic acid of the HIV-1 virus genome, and hybridizes to the same subtype. It is designed to hybridize downstream of the first probe. That is, the second probe for detection of SEQ ID NO: 29 hybridizes downstream of the first probe for detection of SEQ ID NO: 25 to subtype A, and the first probe for detection of SEQ ID NO: 26 to subtype B The second probe for detection of SEQ ID NO: 30 hybridizes to the downstream side of SEQ ID NO: 30, and the second probe for detection of SEQ ID NO: 31 hybridizes to the downstream of the first probe for detection of SEQ ID NO: 27 to subtype C. The second probe for detection of SEQ ID NO: 32 hybridizes to CRFs AE downstream of SEQ ID NO: 28.
上記1.に記載のプライマー、検出用第一プローブと検出用第二プローブ（配列番号25と配列番号29の組み合わせ、配列番号26と配列番号30の組み合わせ、配列番号27と配列番号
31の組み合わせ、あるいは配列番号28と配列番号32の組み合わせ）、TITANIUM Taq ポリ
メラーゼを含む反応液に、鋳型となるHIV-1ウイルスゲノムを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステップを40回繰り返す熱サイクル条件にてPCRを実施し、それぞれ白色光源で励起して得られる55℃での蛍光強度を中心波長440 nm全値幅30 nm（ALEXA350用）、中心波長540 nm全値幅30 nm（ALEXA430用）、中心波長620 nm全値幅30 nm（ALEXA594用）、もしくは中心波長810 nm全値幅30 nm（ALEXA790用）のバンドパスフィルターを通じて1サイクルごとに測定した。
The primer described in 1. above, a first probe for detection and a second probe for detection (a combination of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 29, a combination of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO:
31), or a combination of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 32), and the reaction mixture containing TITANIUM Taq polymerase is charged with the HIV-1 virus genome as a template, followed by a step of 95 ° C for 20 seconds and 55 ° C for 40 seconds. PCR was carried out under repeated heat cycle conditions, and the fluorescence intensity at 55 ° C obtained by excitation with a white light source was center wavelength 440 nm,
３．結果
測定結果を図11に示す。図11のグラフはいずれも横軸はPCRサイクル数、縦軸は相対蛍
光シグナル強度を示す。図11のA（グラフ60）は配列番号25と配列番号29の組み合わせでHIV-1サブタイプAを、B（グラフ61）は配列番号26と配列番号30の組み合わせでHIV-1サブ
タイプBを、C（グラフ62）は配列番号27と配列番号31の組み合わせでHIV-1サブタイプCを、D（グラフ63）は配列番号28と配列番号32の組み合わせでHIV-1 CRFs AEを検出した結果を示す。AからDいずれのグラフでも10サイクル目以降で蛍光シグナル強度は減少を開始した。蛍光シグナル強度はHIV-1ウイルスゲノムRNAが増幅したことにより、検出用第一プローブと検出用第二プローブがハイブリダイズして蛍光が消光されたことを示している。4種類の蛍光体の蛍光波長は、ALEXA350が440 nm、ALEXA430が540 nm、ALEXA594が620 nm、ALEXA790が810 nmと最小でも80 nm以上離れているため、お互いの蛍光体由来の蛍光の漏れこみの影響が少ない状態での蛍光検出が可能であることが確認できた。従来のDNAシーケンサでは4種類の蛍光体の蛍光波長はおよそ20 nm程度しか離れていないが、この20 nm程度の差でもお互いの蛍光体の漏れこみの影響を考慮すればジェノタイピング可能である。このことから、本発明の検出プローブを使用することで440〜800 nmの範囲の蛍光波長をもつ蛍光体を組み合わせて10種類以上のマルチプレックス検出が可能であるといえる。
3. Results The measurement results are shown in FIG. In each graph of FIG. 11, the horizontal axis represents the number of PCR cycles, and the vertical axis represents the relative fluorescence signal intensity. In FIG. 11, A (graph 60) is the combination of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 29, and HIV-1 subtype A is B (graph 61), and the combination of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 30 is HIV-1 subtype B. , C (graph 62) is the combination of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 31, and HIV-1 subtype C is detected in D (graph 63), and the combination of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 32 is the result of detecting HIV-1 CRFs AE Indicates. In any graph from A to D, the fluorescence signal intensity started to decrease after the 10th cycle. The fluorescence signal intensity indicates that the fluorescence was quenched by hybridization of the first probe for detection and the second probe for detection due to amplification of the HIV-1 viral genomic RNA. The fluorescence wavelengths of the four types of phosphors are 440 nm for ALEXA350, 540 nm for ALEXA430, 620 nm for ALEXA594, and 810 nm for ALEXA790. It was confirmed that it was possible to detect fluorescence in a state where there was little influence of. In the conventional DNA sequencer, the fluorescence wavelengths of the four types of phosphors are only about 20 nm apart, but genotyping is possible even with the difference of about 20 nm considering the influence of the leakage of each other's phosphors. From this, it can be said that by using the detection probe of the present invention, it is possible to detect 10 or more types of multiplexes by combining phosphors having fluorescence wavelengths in the range of 440 to 800 nm.
本発明によれば、標的核酸の有無を2種類のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダ
イゼーションによる反応液の蛍光強度の変化で判定できる。また、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは設計の自由度が高く、さまざまな蛍光体に対して適用可能であることから、微量核酸の増幅反応実施時のリアルタイム検出においても、複数種類の標的核酸を同時に複数の蛍光体で検出するマルチプレックス検出を容易とする。従って、本発明は、微量核酸の増幅を必要とする遺伝子診断などの医療分野、ライフサイエンス分野などにおいて有用である。
According to the present invention, the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by the change in the fluorescence intensity of the reaction solution due to the hybridization of two types of oligonucleotide probes. In addition, since the oligonucleotide probe according to the present invention has a high degree of freedom in design and can be applied to various phosphors, a plurality of types of target nucleic acids can be simultaneously used in real-time detection during the amplification reaction of a small amount of nucleic acid. Multiplex detection using a plurality of phosphors is facilitated. Therefore, the present invention is useful in the medical field such as genetic diagnosis that requires amplification of a small amount of nucleic acid, the life science field, and the like.
1，11…第一プローブ
2，12…第二プローブ
3…標的核酸
5…蛍光体
6…消光体（クエンチャー）
7…リン酸基
8…アミノ基
15…直鎖状オリゴヌクレオチドプローブ
20，25，30，35，40，45，50，60，61，62，63…グラフ
1, 11 ... First probe
2,12 ... second probe
3. Target nucleic acid
5 ... phosphor
6 ... Quencher
7 ... Phosphate group
8… Amino group
15 ... Linear oligonucleotide probe
20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 61, 62, 63 ... graph
配列番号 1 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワード側，内側の増幅用プライマー
配列番号 2 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワード側，外側の増幅用プライマー
配列番号 3 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバース側，内側の増幅用プライマー配列番号 4 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバース側，外側の増幅用プライマー配列番号 5 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号 6 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号 7 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号 8 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号 9 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号10 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号11 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号12 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号13 -人工配列の説明：本発明に使用する，逆転写用プライマー
配列番号14 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号15 -HCV遺伝子にハイブリダイズする3'末端側配列
配列番号16 -HCV遺伝子にハイブリダイズする5'末端側配列
配列番号 17 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号 18 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号 19 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 20 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 21 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 22 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 23 -人工配列の説明：本発明に使用する，センスプライマー
配列番号 24 -人工配列の説明：本発明に使用する，アンチセンスプライマー
配列番号 25 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 26 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 27 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 28 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 29 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 30 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 31 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 32 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
SEQ ID NO: 1-description of artificial sequence: forward and inner amplification primers used in the present invention SEQ ID NO: 2-description of artificial sequence: forward and outer amplification primers used in the present invention SEQ ID NO: 3- Description of artificial sequence: Reverse side and inner amplification primer sequence number 4 used in the present invention: Description of artificial sequence: Reverse side and outer amplification primer sequence number used in the present invention SEQ ID NO: 5-Description of artificial sequence : First oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 6-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 7-description of artificial sequence: used in the present invention , Forward primer SEQ ID NO: 8-description of artificial sequence: used in the present invention, reverse primer SEQ ID NO: 9-description of artificial sequence: used in the present invention Nucleotide probe SEQ ID NO: 10-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 11-description of artificial sequence: forward primer SEQ ID NO: 12 used in the present invention-description of artificial sequence: Reverse primer SEQ ID NO: 13 used in the present invention: description of artificial sequence: reverse transcription primer SEQ ID NO: 14 used in the present invention: description of artificial sequence: detection oligonucleotide probe SEQ ID NO: 15 used in the present invention -3 'terminal sequence SEQ ID NO: 16 hybridizing to HCV gene-5' terminal sequence SEQ ID NO: 17 hybridizing to HCV gene-Description of artificial sequence: forward primer used in the present invention SEQ ID NO: 18-artificial sequence Description: reverse primer used in the present invention SEQ ID NO: 19-description of artificial sequence: first oligonucleotide for detection used in the present invention Chid probe SEQ ID NO: 20-description of artificial sequence: first oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 21-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 22-artificial Description of sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 23 -Description of artificial sequence: used in the present invention, sense primer SEQ ID NO: 24 -Description of artificial sequence: used in the present invention, anti-antibody Sense primer SEQ ID NO: 25 -Description of artificial sequence: first oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 26 -Description of artificial sequence: First oligonucleotide probe for detection used in the present invention: SEQ ID NO: 27- Description of artificial sequence: first oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 28 -Description of artificial sequence: used in the present invention First oligonucleotide probe for detection SEQ ID NO: 29-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 30-description of artificial sequence: second detection for use used in the present invention Oligonucleotide probe SEQ ID NO: 31-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention SEQ ID NO: 32-description of artificial sequence: second oligonucleotide probe for detection used in the present invention
Claims (16)
前記第1プローブは、前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、
前記第2プローブは、5’末端に、前記第1プローブが3’末端に蛍光体を具備するときには消光体を有し、前記第1プローブが3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有することを特徴とするキット。 A nucleic acid analysis kit comprising a first probe and a second probe that hybridize to the same target nucleic acid,
In the first probe, the hybridizing region of the first probe to the target nucleic acid is 3 ′ end side than the hybridizing region of the second probe to the target nucleic acid, and the 3 ′ end Having a phosphor or quencher,
The second probe has a quencher at the 5 ′ end when the first probe has a phosphor at the 3 ′ end, and has a phosphor when the first probe has a quencher at the 3 ′ end. Kit characterized by that.
特徴とする請求項1に記載のキット。 2. The hybridizing region of the first probe to the target nucleic acid and the hybridizing region of the second probe to the target nucleic acid are separated from each other by 0 to 10 bases in the target nucleic acid. The kit according to 1.
とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 1 to 3, wherein a difference in melting temperature between the first probe and the second probe is 3 ° C or less.
1) 同一の標的核酸にハイブリダイズする第1プローブ及び第2プローブを含む反応液の蛍
光を検出する第1検出の工程、
2) 標的核酸に、前記第1プローブと前記第2プローブとをハイブリダイズさせる工程、
3) 前記ハイブリダイズ工程後に、前記反応液の蛍光を検出する第2検出の工程、及び
4) 前記第1検出と前記第2検出との結果を比較することにより、前記標的核酸の量を分析
する工程：
ただし、前記第1プローブは、前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、前記第2プローブは、5’末端に、前記
第1プローブが3’末端に蛍光体を具備するときには消光体を有し、前記第1プローブが3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有する。 Nucleic acid analysis method comprising the following steps:
1) a first detection step of detecting fluorescence of a reaction solution containing a first probe and a second probe that hybridize to the same target nucleic acid;
2) a step of hybridizing the first probe and the second probe to a target nucleic acid,
3) a second detection step of detecting fluorescence of the reaction solution after the hybridization step; and
4) analyzing the amount of the target nucleic acid by comparing the results of the first detection and the second detection:
However, in the first probe, the hybridizing region of the first probe to the target nucleic acid is 3 ′ end side than the hybridizing region of the second probe to the target nucleic acid, and 3 'Has a phosphor or quencher at the end, the second probe has a quencher at the 5' end, and when the first probe has a phosphor at the 3 'end, the first probe has 3 'With a quencher at the end, it has a phosphor.
特徴とする請求項5に記載の核酸分析方法。 6. The hybridizing region of the first probe to the target nucleic acid and the hybridizing region of the second probe to the target nucleic acid are separated from each other by 0 to 10 bases in the target nucleic acid. The nucleic acid analysis method according to 1.
とする請求項5〜7のいずれか１項に記載の核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to any one of claims 5 to 7, wherein a difference in melting temperature between the first probe and the second probe is 3 ° C or less.
って、
前記第1配列は、前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2配列
の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、
前記第2配列は、5’末端に、前記第1配列が3’末端に蛍光体を有するときには消光体を有し、前記第1配列が3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有することを特徴とするキット。 A nucleic acid analysis kit comprising a probe having a structure in which a first sequence and a second sequence that hybridize to the same target nucleic acid are joined by a third sequence that does not hybridize to the target nucleic acid,
In the first sequence, the hybridizing region of the first sequence to the target nucleic acid is 3 ′ end side than the hybridizing region of the second sequence to the target nucleic acid, and the 3 ′ end Having a phosphor or quencher,
The second sequence has a quencher at the 5 ′ end when the first sequence has a phosphor at the 3 ′ end, and has a phosphor when the first sequence has a quencher at the 3 ′ end. Kit characterized by.
る請求項9に記載のキット。 10. The hybridizing region of the first sequence to the target nucleic acid and the hybridizing region of the second sequence to the target nucleic acid are separated by 0 to 10 bases in the target nucleic acid. The kit according to 1.
求項9〜11のいずれか1項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 9 to 11, wherein a difference in melting temperature between the first sequence and the second sequence is 3 ° C or less.
1) 一方の末端を蛍光体で、他方の末端を消光体で標識されたプローブを含む反応液の蛍
光を検出する第1検出の工程、
2) 標的核酸に、前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
3) 前記ハイブリダイズ工程の後に、前記反応液の蛍光を検出する第2検出の工程、
4) 前記第1検出と前記第2検出との結果を比較することにより、前記標的核酸の量を分析
する工程：
ただし、前記プローブは、同一の標的核酸にハイブリダイズする第1配列及び第2配列が標的核酸にハイブリダイズしない第3配列によって繋ぎ合わされた構造を有するプローブ
であって、前記第1配列は、前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、前記第2配列は、5’末端に、前記第1配列が3’末端
に蛍光体を有するときには消光体を有し、前記第1配列が3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有する。 Nucleic acid analysis method comprising the following steps:
1) a first detection step of detecting fluorescence of a reaction solution containing a probe labeled with a phosphor on one end and a quencher on the other end;
2) a step of hybridizing the probe to a target nucleic acid,
3) a second detection step of detecting fluorescence of the reaction solution after the hybridization step;
4) analyzing the amount of the target nucleic acid by comparing the results of the first detection and the second detection:
However, the probe is a probe having a structure in which a first sequence that hybridizes to the same target nucleic acid and a second sequence that are joined by a third sequence that does not hybridize to the target nucleic acid, wherein the first sequence is the The hybridizing region of the first sequence to the target nucleic acid is 3 ′ end side than the hybridizing region of the second sequence to the target nucleic acid, and a phosphor or quencher is provided at the 3 ′ end. The second sequence has a quencher at the 5 ′ end, and when the first sequence has a phosphor at the 3 ′ end, and a phosphor when the first sequence has a quencher at the 3 ′ end. Have
る請求項13に記載の核酸分析方法。 14. The hybridizing region of the first sequence to the target nucleic acid and the hybridizing region of the second sequence to the target nucleic acid are separated from each other by 0 to 10 bases in the target nucleic acid. The nucleic acid analysis method according to 1.
求項13〜15のいずれか１項に記載の核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to any one of claims 13 to 15, wherein a difference in melting temperature between the first sequence and the second sequence is 3 ° C or less.
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| JP2018139536A (en) * | 2017-02-28 | 2018-09-13 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | Oligonucleotides for detecting nucleic acids |
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2008
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| JPWO2014157377A1 (en) * | 2013-03-26 | 2017-02-16 | 株式会社ニッポンジーン | Primer and probe sets used for genetic polymorphism discrimination and their use |
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