JP2009159862A - 組換え微生物バイオセンサー - Google Patents
組換え微生物バイオセンサー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009159862A JP2009159862A JP2007340804A JP2007340804A JP2009159862A JP 2009159862 A JP2009159862 A JP 2009159862A JP 2007340804 A JP2007340804 A JP 2007340804A JP 2007340804 A JP2007340804 A JP 2007340804A JP 2009159862 A JP2009159862 A JP 2009159862A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- crti
- gene
- transformed
- red
- freshwater
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
【解決手段】被検物質の存在下に、フィトエン不飽和化酵素(CrtI)遺伝子が破壊され、CrtIを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターとその下流に作動可能に連結されたCrtI遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断する。
【選択図】なし
Description
(1)実験材料
使用した培地を表1に、プラスミドを表2に、リンカーDNA(配列番号1、2)及びプライマー(配列番号3〜15)を表3にそれぞれ示す。また、pGEMT(登録商標)ベクターシステムI(Promega社製)のプロトコールに従って形質転換した大腸菌JM109形質転換株の培養はLB培地(表1参照)を用い、培地には必要に応じてアンピシリン(Amp)、カナマイシン(Km)、クロラムフェニコール(Cp)を各終濃度が50μg/mL、30μg/mL、又は100μg/mLとなるよう添加した。また形質転換過程の一時的な培養にはSOC培地(表1参照)を用いた。
レポーター遺伝子として使用するcrtI(上流193bp及びORFを含む領域)(配列番号16)を、ロドシュードモナス・パルストリスNo.7(Fujii et al.(1983) Agric. Biol. Chem. 47, 2747-2753)のトータルDNAを鋳型として、プライマーKpnI−crtIA(配列番号4)及びNdeI−SD−crtIS(配列番号3)を用いて、Pfx50(登録商標)DNAポリメラーゼ(Invitrogen社製)、LA Taq with GCバッファー(TaKaRa社製)、TaqDNAポリメラーゼ(Roche社製)を用い、各プロトコールに従ってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。得られたPCR断片をMinElute(登録商標)PCR精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、TAクローニングによりpGEM−T(登録商標)(Promega社製)にプロトコールに従い挿入してpGEMcrtIとし、大腸菌JM109に導入して形質転換した。形質転換株をLB/アンピシリン/IPTG/X−Galプレート上で、青/白カラーセレクションによりスクリーニングを行った。選抜された形質転換株からプラスミドpGEMcrtIを抽出し、制限酵素SphI処理によりcrtIの挿入方向を確認した。crtIがプラスミド上のlacZの転写方向と逆に挿入されたpGEMcrtIを選抜した。
1)5’−PstI−arsR−NdeI−3’断片の作製
オペレーター及びプロモーターと推測される配列を上流に含むarsRのクローニングのためにpSENSE−As(H. Fujimoto, et al., (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol.,73, 332-338)を鋳型として表3記載のプライマーttt−PstI−Pars−arsRF(配列番号5)及び5’−CrtA SDR(配列番号6)を用いて上記同様にPCRにより増幅し、得られたPCR産物をMinElutePCR精製キットを用いて精製し、次いで制限酵素PstIとNdeIの処理を行い、5’−PstI−arsR−NdeI−3’断片を作製した。
上記5’−NdeI−crtI−SalI−3’断片の作製時に用いたpGEMcrtIを制限酵素SphIで処理し、バッファーのNaCl濃度を調整後、制限酵素PstIで処理した。続いてcrtI断片を除くため電気泳動を行い、3.0kb付近のバンドを回収し、上記MinEluteゲル抽出キットを用いて、DNA断片を精製した。次に上流にSphIサイト、下流にPstIサイトの粘着末端を付加したターミネーター配列(Ω)(表3参照)を有するリンカーDNAをpGEMT付属のT4DNAリガーゼを用いて挿入してpGEMΩとし、大腸菌JM109に導入して形質転換した。コロニーPCRにより選抜した形質転換株からプラスミド(pGEMΩ)を抽出し、BssHII及びSphI処理を行い簡易的に挿入の確認後、上記と同様の方法のシークエンス反応により配列を確認した。
上記1)で得た5’−PstI−arsR−NdeI−3’断片を、上記2)で得たpGEMΩへ挿入してpGEMΩParsRとし、大腸菌JM109に導入して形質転換した。コロニーPCRにより選抜した形質転換株よりpGEMΩParsRを抽出した。pGEMΩParsRを鋳型にプライマーM13−Fwd(配列番号7) 及びM13−Rev(配列番号8)を用いて上記同様にPCRにより増幅し、得られたPCR産物を精製後、NdeI及びSphI処理を行い、5’−SphI−Ω−arsR−NdeI−3’断片を得た(図3参照)。
pMG105ベクターをSphI処理した後、バッファーのNaCl濃度を調整し、SalI処理を行った。続いてプラスミドのセルフライゲーションを防ぐ目的で両制限酵素サイト間の塩基対を除くための電気泳動を行い5.6kb付近のバンドを分別・回収し、上記同様MinEluteゲル抽出キットを用いてDNA断片を精製した。次に5’−NdeI−crtI−SalI−3’断片及び5’−SphI−Ω−arsR−NdeI−3’ 断片をpMG105ベクターとライゲーションさせたpMG105ΩParsRcrtIを用いて大腸菌JM109を形質転換した。上記青/白カラーセレクション及びコロニーPCRにより選抜した形質転換株よりプラスミド(pMG105ΩParsRcrtI)(図4参照)を抽出した。
CrtI遺伝子を発現する機能を喪失させた、ロドシュードモナス・パルストリスNo.711はゲノム上のcrtIをKmRと置換した変異株であるため、カナマイシン以外に感受性のある抗生物質を選択する必要があった。本研究室においてカナマイシン、アンピシリン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンを用いた薬剤耐性試験の結果、クロラムフェニコールに対し感受性が見られたため、クロラムフェニコールを利用することにより、センサープラスミド導入後のスクリーニングを行うことにした。そこでpMG105ΩParsRcrtI中にクロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)を挿入することにした。
(1)形質転換
上記pMG105ΩParsRcrtICmRをセンサープラスミドとしてロドシュードモナス・パルストリスNo.711を形質転換した。対数増殖期(OD600:0.5)の状態にある−80℃にて保存していたロドシュードモナス・パルストリスNo.711を氷上で融解し、菌体は70μL、DNAは1〜2μL(〜1μg)用いた。パラメーター設定はジーンパルサーを25μF、1.25kV/mmに、パルスコントローラーは250Ωとし、タイムコンスタント値は4.6〜4.8msecになった。直ちに氷上へ移し30分間置き、ビタミン溶液(Vitamin solution:表1参照)を0.5%(v/v)添加した4CyMOM(表1参照)(抗生物質非添加)5mLに植菌し、30℃にて明条件で試験管内で24時間培養した。24時間後、遠心分離により(6,000rpm、5分間)集菌した。エレクトロポレーション時の残存プラスミドを除く目的で、集菌した菌体を2回洗浄(4CyMOM1mLに懸濁し、遠心分離後上清を除去)した。洗浄後、4CyMOM100μLに懸濁したものを基準とし、100倍希釈、1,000倍希釈、10,000倍希釈した希釈液100μLを4CyMOM寒天培地(Cp100μg/mL、200μg/mL)に撒き、30℃にて明条件で培養しスクリーニングした。なお、コロニーが確認できるまで1週間程度要した。
寒天培地上に緑、赤、白及び中心が緑で縁が赤色をした4種類のコロニーが出現したので、各クローンからプラスミド及びトータルDNAを抽出し、PCRによりヒ素応答性CrtI発現ユニット構造を調べた(図5参照)。またPCRにより形質転換が成功したと考えられる株を選抜後、それらのクローンを用いてヒ素検出試験を行った。結果を表4に示す。いずれのクローンにおいてもヒ素添加による色変化は認められなかった。この原因としてヒ素非添加時においてもNo.711形質転換株が背景色として赤色を呈したことが考えられる。
Color R:赤色、G:緑色、W:白色、R/G:中心が緑で縁が赤色
PCR ○:電気泳動において目的の長さのバンド検出
×:電気泳動において目的の長さとは異なるバンド検出
△:電気泳動において目的の長さのバンドが微かに検出
―:実施せず
As ×:ヒ素検出試験において色調変化なし
―:実施せず
ロドシュードモナス・パルストリスNo.711形質転換株がヒ素非添加時に寒天培地上で赤くなった原因として、
1)センサープラスミド導入後にセンサープラスミドがNo.711のゲノムDNAにインテグレートしたため、CrtIがParsではなく内在性crtIプロモーターの制御下で発現した、
2)センサープラスミド上にParsと共に内在性のcrtIプロモーターが含まれていたため、内在性crtIプロモーターの制御下でcrtIが発現した、
3)CrtI発現ユニット上流に挿入したターミネーターが機能せず、センサープラスミド上においてリードスルーが起きた事によりCrtIが発現した、といった可能性があると結論づけた。
実施例1において構築したプラスミドでは、ロドシュードモナス・パルストリスNo.7株由来のcrtIのORF及びその上流193bpが用いられている。crtIのORFのみを使用することで内在性crtIプロモーターがセンサープラスミド内に配置される可能性を排除することとした。
(1)実験材料
使用したプライマー(配列番号17〜25)を表5に、プラスミドを表6に示す。
crtIのORFの上流193bpを除くことで、内在性のSD配列も除かれると推測できるので、人工的にSD配列を付加し、さらに転写制御のより強いコンストラクトを目的とし、arsRの終止コドンとcrtIの開始コドンの間にオペレーターを人工的に付加するなどして、図6に示すようにプライマーCrtI−NdeI−SDlessF(配列番号18)とnon−crtIA(配列番号20)を用いて「SD−less」を、プライマーCrtI−NdeI−SDF1(配列番号17)とnon−crtIA(配列番号20)を用いて「SD」を、プライマーNdeI−arsopeSDF1(配列番号19)とnon−crtIA(配列番号20)を用いて「operator」の3種類のセンサープラスミドの構築を試みた。先に構築したセンサープラスミド(pMG105ΩParsRcrtICmR)を鋳型に、目的のコンストラクトに合わせた上記プライマーの組合せを用いて(図6参照)、PCRによりcrtIのORFを増幅させ、得られた増幅断片を精製し、TAクローニングによりpGEM−Tベクターへ挿入し、大腸菌JM109を形質転換した。上記青/白カラーセレクションにより形質転換株のスクリーニングを行い、選抜した形質転換株よりプラスミドを抽出し、制限酵素BamHI、NdeI処理によりcrtIの挿入方向を確認した。crtIがベクター上のlacZの転写方向と逆に挿入されたプラスミドを選抜し、NdeI及びSalI処理を行った。続いて電気泳動を行い、1.5kb付近のバンドを回収し、精製して、5’−NdeI−SD−less−crtI−SalI−3’、5’−NdeI−SD−crtI−SalI−3’、5’−NdeI−operator−crtI−SalI−3’を得た。
NdeI−SD−less−crtI−SalI、NdeI−SD−crtI−SalI、あるいはNdeI−operator−crtI−SalIと実施例1で用いたSphI−ΩParsR−NdeI、SphI及びSalIの両制限酵素の粘着末端を有するpMG103ベクターをライゲーションした。この過程を経て得られた3種類のプラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換した。カラーセレクション及びコロニーPCRにより選抜した形質転換株からプラスミドを抽出した。NdeI、SalI、SpeI処理を行い簡易的にΩParsRcrtI断片の挿入を確認後、シークエンスにより配列の確認をした。次に、各プラスミドをまずSpeI処理を行い精製後、5’−SpeI−CmR−SpeI−3’をプラスミド上のSpeI粘着末端と連結させた。このプラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換した。形質転換株よりプラスミドを抽出しSpeI処理よりCmR断片の挿入の確認後、シークエンスにより配列の確認をした。これらの過程を経て得られたプラスミドをそれぞれSD、SD−less、operatorとする。
各センサープラスミドを用いて上記実施例1−1同様ロドシュードモナス・パルストリスNo.711を形質転換後、寒天培地上のコロニーからプラスミドを抽出し、PCRによりヒ素応答性CrtI発現ユニット構造を調べた。SDとSD−lessを用いた形質転換で得られたコロニーでは、3種類のプライマーの組合せを用いたPCRでSDあるいはSD−less陽性のコロニーが得られたが、3日間の培養後にコロニーの色が赤色に変化した。このため、SD及びSD−lessはセンサープラスミドとして利用しないことにした。一方、operatorを用いた形質転換で得られたコロニーを観察すると、緑、赤、及び中心が緑で縁が赤色の3種類が認められた。各コロニーからプラスミドを熱抽出し、PCRによりoperatorの構造を維持したプラスミドがコロニー中に保持されているか否かを確認した(図7参照)。そのPCRの結果は表7に示す。構築したoperatorを維持していると考えられるコロニー(クローンNo.20、25、及び36)について更に観察を続けた。
Color R:赤色、G:緑色、R/G:中心が緑で縁が赤色
PCR ○:電気泳動において目的の長さのバンド検出
×:電気泳動において目的の長さとは異なるバンド検出
―:実施せず
(1)実験方法
No.36の形質転換株(表7参照)を用いて、培養液中にヒ素を添加することによる色の変化を視覚的に観察することにより、バイオセンサーとしての有用性の有無を確認した。−80℃にて保存のNo.36の形質転換株を、ビタミン溶液を0.5%(v/v)添加した4CyMOM(抗生物質非添加)5mLに植菌し、30℃、明条件下試験管内で48時間前培養した。次に、前培養液の300μLをビタミン溶液を0.5%(v/v)添加した4CyMOM(Km30μg/mL、Cp100μg/mL)50mLに植菌し、30℃にて明条件で36時間本培養を行った。遠心分離により集菌後、菌体を2回洗浄(4CyMOMに懸濁し、遠心分離後、上清を除去)した。洗浄後菌体を、ビタミン溶液を0.5%(v/v)添加した4CyMOM(抗生物質非添加)により希釈し、OD600を0.5に調整したものを試験管に5mL分注し、亜ヒ酸ナトリウムを添加し、30℃にてタングステンランプ照射条件下で培養した。亜ヒ酸ナトリウム添加24時間後の培養液の色調を確認した。
ヒ素(亜ヒ酸ナトリウム)を添加することにより、ヒ素無添加のコントロールと比較して培養液の赤色が濃くなっていたことが目視により確認できた(図8参照)。この結果から、育種されたバイオセンサー株を用いることで24時間以内に色調変化による亜ヒ酸ナトリウムの検出が可能であることが明らかとなった。このことから、転写スイッチを構成するParsとarsRによる転写調節システムがロドシュードモナス・パルストリスNo.711を宿主とした場合においても機能していることが確認できた。
本発明のCrtIをレポーターとしたバイオセンサー(図9(左)参照)と、CrtAをレポーターとし、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィラムを宿主としたバイオセンサー(図9(右)参照)との嫌気的条件における比較を示す。亜ヒ酸を10ppb及び50ppb添加した場合の、本発明によるバイオセンサーのΔE*abは、それぞれ1.85及び1.94であるのに対し、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィルムを宿主としたバイオセンサーによる値は、0.35及び0.71であり、本発明によるCrtIをレポーターとしたバイオセンサーは、特に嫌気条件での亜ヒ酸検出が可能である点が特に優れているといえる。
Claims (9)
- フィトエン不飽和化酵素(CrtI)遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、CrtIを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたCrtI遺伝子とを組み込んだベクターが導入されていることを特徴とする形質転換淡水性紅色細菌。
- ベクターに組み込まれるCrtI遺伝子が、CrtIをコードする構造遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の形質転換淡水性紅色細菌。
- ベクターに組み込まれるCrtI遺伝子が、CrtIをコードする構造遺伝子及びプロモーター活性を有さないその制御領域からなることを特徴とする請求項1記載の形質転換淡水性紅色細菌。
- 淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌。
- 誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターParsであることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌。
- 被検物質の存在下に、フィトエン不飽和化酵素(CrtI)遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、CrtIを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたCrtI遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断することを特徴とする前記形質転換淡水性紅色細菌をバイオセンサーとして使用する方法。
- 淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターParsであることを特徴とする請求項6又は7記載の方法。
- 誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたCrtI遺伝子とを組み込んだベクターからなるバイオセンサー用ベクター。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007340804A JP2009159862A (ja) | 2007-12-28 | 2007-12-28 | 組換え微生物バイオセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007340804A JP2009159862A (ja) | 2007-12-28 | 2007-12-28 | 組換え微生物バイオセンサー |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009159862A true JP2009159862A (ja) | 2009-07-23 |
Family
ID=40963235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007340804A Pending JP2009159862A (ja) | 2007-12-28 | 2007-12-28 | 組換え微生物バイオセンサー |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009159862A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101270657B1 (ko) | 2011-08-31 | 2013-06-03 | 한국원자력연구원 | 데이노코커스 레디오듀란스를 활용한 색소기반 카드뮴 육안 검출 바이오센서 및 이의 제조 방법 |
WO2023107188A1 (en) * | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Prediction, biosynthesis, and integration as biosensors of molecules with unique light absorbance signatures and their subsequent in-field remote detection using multi or hyper-spectral cameras |
-
2007
- 2007-12-28 JP JP2007340804A patent/JP2009159862A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101270657B1 (ko) | 2011-08-31 | 2013-06-03 | 한국원자력연구원 | 데이노코커스 레디오듀란스를 활용한 색소기반 카드뮴 육안 검출 바이오센서 및 이의 제조 방법 |
WO2023107188A1 (en) * | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Prediction, biosynthesis, and integration as biosensors of molecules with unique light absorbance signatures and their subsequent in-field remote detection using multi or hyper-spectral cameras |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Schäfer et al. | Novel, oxygen-insensitive group 5 [NiFe]-hydrogenase in Ralstonia eutropha | |
Park et al. | Regulation of superoxide stress in Pseudomonas putida KT2440 is different from the SoxR paradigm in Escherichia coli | |
Schwarze et al. | Requirements for construction of a functional hybrid complex of photosystem I and [NiFe]-hydrogenase | |
EP1728866B1 (en) | Luciferase expression cassettes and methods of use | |
Shin | Development of highly-sensitive microbial biosensors by mutation of the nahR regulatory gene | |
Kasai et al. | Identification of natural rubber degradation gene in Rhizobacter gummiphilus NS21 | |
Sonnenschein et al. | Development of a genetic system for Marinobacter adhaerens HP15 involved in marine aggregate formation by interacting with diatom cells | |
Boyer et al. | Purification, cloning and sequencing of an enzyme mediating the reductive dechlorination of 2, 4, 6-trichlorophenol from Desulfitobacterium frappieri PCP-1 | |
Muhr et al. | A fluorescent bioreporter for acetophenone and 1-phenylethanol derived from a specifically induced catabolic operon | |
WO2008127496A2 (en) | Heavy metal biosensor | |
ZA200503757B (en) | New expression system from Rhodococcus | |
JP2009159862A (ja) | 組換え微生物バイオセンサー | |
KR20160056149A (ko) | 재설계 유전자회로와 세포 간 상호작용을 이용한 유해 환경물질의 감지방법 | |
WO2006022235A1 (ja) | 紅色非硫黄細菌の色素合成遺伝子を利用したバイオセンサー及びかかるバイオセンサーの作成方法 | |
KR101493392B1 (ko) | 혈청 보체를 이용한 바이오리포터 균주의 민감성 증진 | |
Jaubert et al. | Control of peripheral light-harvesting complex synthesis by a bacteriophytochrome in the aerobic photosynthetic bacterium Bradyrhizobium strain BTAi1 | |
Harker et al. | Application of genetic engineering to the field of bioremediation | |
KR101270657B1 (ko) | 데이노코커스 레디오듀란스를 활용한 색소기반 카드뮴 육안 검출 바이오센서 및 이의 제조 방법 | |
Park et al. | Construction of transformant reporters carrying fused genes using pcbC promoter of Pseudomonas sp. DJ-12 for detection of aromatic pollutants | |
JP5213709B2 (ja) | Mtbeの分解経路で活性を有するポリペプチドおよびその使用 | |
CA2510657A1 (fr) | Polypeptides ayant une activite dans la voie de degradation du mtbe et leurs utilisations | |
KR101598907B1 (ko) | 재설계된 감지 단백질을 이용한 유해 방향족 화합물 검출용 인공바이오센서 및 이의 제조방법 | |
Applegate Sr | Construction of recombinant bacteria to elucidate catabolic regulation and critical catabolic reactions of phenanthrene metabolism by the NAH system | |
JP2012044944A (ja) | トルエン検出方法 | |
Ng | Genetic systems encoding heavy metal resistance and/or transport in Achromobacter sp. strain AO22 and their applications in environmental biotechnology |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101224 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20101224 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20110201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110210 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110401 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110421 |