JP2009148187A - 塩基配列判定方法、塩基配列判定システム及び塩基配列判定プログラム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 第1検出用電極、第2検出用電極、コントロール電極を備えるチップカートリッジ11、第1検出用電極から第1検出信号、第2検出用電極から第2検出信号、コントロール電極からコントロール信号を取得する測定系12、チップカートリッジ11に薬液を送液する送液系13、測定系12及び送液系13を制御する制御機構15、第1検出信号の平均値からコントロール信号の平均値を減算し、コントロール信号の平均値で除算した値をX座標、第2検出信号の平均値からコントロール信号の平均値を減算し、コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とし、原点からX座標及びY座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を角度判定基準と比較しDNAの型を判定する型判定モジュールを含むコンピュータ16を備える。
【選択図】 図7
Description
第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記複数の第1検出用電極及び第2検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップに、サンプル核酸を含む薬液を供給する段階と、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する段階と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とする段階と、
前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とする段階と、
原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出する段階と、
前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較する段階
とを含み、前記角度と前記角度判定基準との大小関係により、前記サンプル核酸の型を判定することを特徴とする塩基配列判定方法である。
第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップを装着して使用され、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する測定系と、
前記チップに、薬液を送液する送液系と、
前記測定系及び送液系を制御する制御機構と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とし、前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とし、原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出し、前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較し、前記角度と前記角度判定基準との大小関係により、前記サンプル核酸の型を判定する型判定モジュールを含むコンピュータ
とを備えることを特徴とする塩基配列判定システムである。
第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップにサンプル核酸を含む薬液を供給された後、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する手順と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とし、前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とし、原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出する手順と、
前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較する手順
とを含む処理をコンピュータに実行させ、これにより前記コンピュータに、前記サンプル核酸の型が、野生型、ヘテロ型、変異型、若しくは判定不能と判断させるための塩基配列判定プログラムである。
(塩基配列判定システム)
本発明の実施の形態に係る塩基配列判定システムは、図7に示すように、チップカートリッジ11と、このチップカートリッジ11と電気的に接続される測定系12、チップカートリッジ11に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系13及びチップカートリッジ11の温度制御を行う温度制御機構14等を備える。図7の測定系12は、図1に示すように、対極502の入力に対して参照極561,562の電圧をフィードバック(負帰還)させることにより、セル内の電極や溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加する3電極方式のポテンシオ・スタットであり、検出チップ21の端子C,R,Wに接続されている。図1の検出チップ21は、図7のチップカートリッジ11に備えられている。
検出チップ21は、図2に示すように、SNP1検出用電極である作用極551,SNP2検出用電極である作用極552,コントロール電極である作用極553と、これらの作用極551,552,553に対する参照極561,562及び対極502が検出チップ上に配列された電極ユニットを用いている。即ち、測定系12は、作用極551,552,553に対する参照極561,562の電圧を、ある所定の特性に設定されるように対極502の電圧を変化させ、挿入剤の電気化学的反応による電流(以下において「電気化学的電流」と言う。)を電気化学的に測定する。
本発明の実施の形態に係る塩基配列判定方法は、先ず、塩基配列判定の目的とされる標的塩基配列(サンプルDNA)581,582,583(図9〜11参照。)と相補的な塩基配列を有するプローブDNA571,572について、それぞれ作用極551,552に固定化させる。即ち、図3(a)に示すように、作用極551は、図9に示した塩基配列CTGAG……を有する標的塩基配列(サンプルDNA)581とは相補的な塩基配列GACTC……を有するプローブDNA571が固定化される電極である。なお、本実施形態では、サンプルDNA,プローブDNAと記載しているが、DNA以外にPNA,RNA等、他の核酸をサンプルもしくはプローブとして用いても良い。図3(a)では、SNP位置の塩基を、下から3番目のCとしたSNP="G"検出用電極である。
又、図3(b)に示すように、作用極552は、図10に示した塩基配列CTTAG……を有する標的塩基配列(サンプルDNA)582とは相補的な塩基配列GAATC……を有するプローブDNA572が固定化される電極である。図3(b)も、SNP位置の塩基を、下から3番目のAとしたSNP="T"検出用電極である。
一方、図3(c)に示すように、作用極553は、標的塩基配列(サンプルDNA)581,582とは相補的関係のない塩基配列CAGTG……を有するプローブDNA(コントロールDNA)573が固定化されるコントロール電極である。これらの作用極551,552,553は、セル内の反応電流を検出する電極として機能する。なお、作用極551,552,553に固定化されるプローブDNA571,572,573の種類は 例示に過ぎないが、作用極551,552,553に固定化されるプローブDNAの種類は、それぞれ異なる塩基配列を有するサンプルDNAを検出するように設計されていれば良く、それぞれの作用極に固定化されるプローブの種類は単一である必要はない。
Vw=Iw・Rw ……(1)
となる。この端子Oから得られる電気化学信号は、図7に示す制御機構15に出力される。作用極551,552,553は複数あるため、端子W及び端子Oは、作用極551,552,553のそれぞれに対応して複数設けられる。複数の端子Oからの出力は後述する信号切替部により切り替えられ、AD変換されることにより各作用極551,552,553からの電気化学信号をデジタル値としてほぼ同時に取得することができる。なお、端子W及び端子Oの間のトランス・インピーダンス増幅器511などの回路は、複数の作用極551,552,553で共有しても良い。この場合、配線501aに複数の端子Wからの配線を切り替えるための信号切替部を備えれば良い。
図7の塩基配列判定システムを構成するチップカートリッジ11は、図4及び5に示すように、カセット上蓋711、カセット下蓋712、パッキン713(シール部材)及び基板714からなるカセットを構成している。カセット上蓋711及びカセット下蓋712の内表面同士を対向させ、かつこれらカセット上蓋711及びカセット下蓋712の間にパッキン713及び基板714を狭んだ状態で固定している。カセット上蓋711の外表面から内表面にかけて、断面が略円形のノズル差込孔722及び723が貫通して形成されている。このノズル差込孔722及び723の内径は、送入及び送出ポート752,753、及び図6のバルブユニット705のノズル707,708、の外径よりも若干大きく設定されており、例えば3.2mm程度である。図4に示すように、カセット上蓋711の外表面から内表面にかけて断面が略長方形の電気コネクタ用ポート724及び725が貫通して形成されている。この電気コネクタ用ポート724及び725の各々には、後述する電気コネクタが挿着され使用される。更に、外表面には内表面にかけてシール検出孔726が貫通して形成されている。このシール検出孔726は、シールの有無の検出に用いられる。即ち、カセット(検出チップ)21の外表面のシール検出孔726の表面から電気コネクタ用ポート724及び725の表面にかけてシールが貼付された状態で、カセット(検出チップ)21へ薬液(試料)を注入し、カセット(検出チップ)21に薬液(試料)を注入した後にシールが剥がすが、そのシールの有無の検出する。カセット(検出チップ)21に、シールが貼付された状態で、薬液(試料)を注入することにより、たとえ薬液(試料)溶液が誤って電気コネクタポート724若しくは725上に滴下しても、シールで被覆されているため、実際のポート724若しくは725内には液が侵入することがなく、電気的に短絡してしまう等の不具合を発生させる心配を生じないようにしている。
図5に示すように、カセット上蓋711の内表面側には、所定の深さでかつ基板714の断面形状とほぼ同じ断面形状を有する基板位置決め溝が設けられており、この基板位置決め溝の周囲は内表面で囲まれている。基板位置決め溝はノズル差込孔722及び723、電気コネクタ用ポート724及び725にオーバーラップして形成されている。基板位置決め溝にあわせて基板714をはめ込むことにより、基板714をカセット上蓋711に位置決め配置することができる。基板位置決め溝の深さは基板714の厚さとほぼ同じになるように形成されている。
先ず、カセット上蓋711の内表面のパッキン位置決め溝にあわせて、かつノズル差込孔722及び723に送入ポート752及び送出ポート753が挿通するように、パッキン713をパッキン位置決め溝に嵌挿する。次に、基板714を、その主面、即ち電極ユニット761、パッド762及び763が形成された面がカセット上蓋711側に向くように、基板位置決め溝に位置決め配置する。次に、カセット下蓋712を、その内表面742がカセット上蓋711側に向くように、又ねじ孔747a〜747d及びねじ孔727a〜727dの位置が対応するようにカセット上蓋711上に載置する。そして、ねじ孔747a〜747d及びねじ孔727a〜727dにねじ770a〜770dを螺挿する。これにより、カセット上蓋711及びカセット下蓋712が螺着され、かつカセット上蓋711及びカセット下蓋712間にはパッキン713及び基板714が狭着固定され、カセット(検出チップ)21が完成する。この完成した状態では、ノズル差込孔722からノズル差込孔723にかけて、折れ曲がり形状の流路が形成される。
冒頭で、一部言及したが、本発明の実施の形態に係る塩基配列判定システムは、図7に示すように、測定ユニット10と、測定ユニット10に接続された制御機構15と、制御機構15に接続されたコンピュータ16とを備える。測定ユニット10は、チップカートリッジ11と、このチップカートリッジ11と電気的に接続される測定系12、チップカートリッジ11に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系13及びチップカートリッジ11の温度制御を行う温度制御機構14等を備える。
図7に示したコンピュータ16は、図8に示すように、操作者からのデータや命令などの入力を受け付ける入力装置304と、SNPの型が2種の内のどちらであるか、又、それがホモ型であるかヘテロ型であるかを判定するか、もしくは核酸の存在の有無を検出する中央処理装置(CPU)300と、判定結果を出力する出力装置305及び表示装置306と、塩基配列の判定に必要な所定のデータなどを格納したデータ記憶部(図示省略)と、塩基配列判定プログラムなどを格納したプログラム記憶部(図示省略)とを備える。
CPU300は、ノイズ除去モジュール301,電流波形判定モジュール302,ピーク電流検出モジュール310,グループ正常判定モジュール320,検査有効性判定モジュール325、有無判定モジュール330及び型判定モジュール340を備える。
y[n]=(x[n]+x[n+1]+x[n+2]+x[n+3]+x[n+4])/5 ……(2)
が、図15(b)に示す移動平均値となる。移動平均により、図15(a)に示すような変動が図15(b)に示すように平準化(スムージング)され、全体的な傾向を分析するが容易になる。
電流波形判定モジュール302は、図16のフローチャートに示した手順に従って、図2に示したSNP1検出用電極551,SNP2検出用電極552,コントロール電極553を介してそれぞれ測定された電流波形(電流−電圧特性)のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの検出信号(電流波形)の正常・異常を判定し、異常な検出信号を演算対象外とする。
ピーク電流検出モジュール310は、電圧値算出部311,ベースライン近似部312,ピーク電流値演算部313を備え、図18及び図19のフローチャートに示した手順に従い、SNP1検出用電極551,SNP2検出用電極552,コントロール電極553を介して測定される電流(検出信号)から、バックグラウンド電流を差し引いて、挿入剤591に起因する真の電気化学的電流(真の検出信号)のピーク値(ピーク電流値)を求める。
検査有効性判定モジュール325は、図32に示すフローチャートに示す一連の手順に従い、検査が有効であるかどうかを判定する。即ち、図4に示す基板714上に複数配列される電極ユニット761にそれぞれ含まれる複数のポジティブ・コントロール用電極(作用極)554から検出されるポジティブ・コントロール電流と、ネガティブ・コントロール用電極(作用極)555から検出されるネガティブ・コントロール電流とを所定の基準値と大小関係比較を行い、ネガティブ・コントロール電流が所定の基準よりも小さく、ポジティブ・コントロール電流が所定の基準よりも大きい場合に、当該検査が有効である、との判断を行い、その後の判定モジュールでの演算に移行する。
図14に示すフローチャートを用いて、本発明の実施の形態に係る塩基配列判定方法を説明する。なお、以下に述べる塩基配列判定方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の塩基配列判定方法により、実現可能であることは勿論であるが、いずれにせよ、図3に示すようなプローブDNA571,572,573が固定化されたチップカートリッジ11にサンプルDNA581,582,583を含む薬液(試料)を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、バッファによる洗浄、挿入剤の導入による電気化学反応を経て測定系12を用いて図13に示すような電気化学的電流の電流−電圧特性を求めることが基礎となる。電気化学的電流の電流−電圧特性から、各プローブDNA571,572,573のハイブリダイゼーション反応に定量的に対応するピーク電流値を算出する。そして算出されたピーク電流値を統計的にデータ処理し、これにより核酸の存在の有無を判定し、或いは核酸の一塩基多型の型判定をする。
(イ)先ず、チップカートリッジ11にサンプルDNAを含む薬液(試料)を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、挿入剤の導入による電気化学反応による電流−電圧特性を測定系12を用いて、各電極毎に測定する。図4に基板714上に多数の電極ユニット761を模式的に示したが、この多数の電極ユニット761に対応して、プローブDNA571,572,573がそれぞれ固定化されるSNP1検出用電極551,SNP2検出用電極552,コントロール電極553は、等価な電極として多数存在し、それに対応して多数のデータが取得される。ステップS101において、ノイズ除去モジュール301が、プローブDNA571,572,573が固定化された各電極毎に、測定された一群のデータのそれぞれを、平準化(スムージング)により、ノイズを除去する。スムージングは、既に説明したように、図15に示すような、単純移動平均法を用いれば良い。 以降の処理は、すべて平準化処理後のデータに対して演算を行う。
図1の測定系12が測定したチップカートリッジ11における電気化学的電流の信号(電流波形)は、特徴的に、図17に示したような電流−電圧特性の波形をとる。電気信
を発生する物質(挿入剤)に特有の電圧において、図17に示したようなピーク形状を有する電流−電圧特性の波形を持っている。図17では、データ1とデータ2の2種類の電流−電圧特性を示しているが、データ1の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きに比して、データ2の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きの方が大きく、データ2の電流−電圧特性では、ピーク形状が不明確で肩(ショルダー)的な変化を示している。
(a)先ず、ステップS201において、各電極毎に測定された電流波形(電流−電圧特性)のベースラインの傾きを計算する範囲を抽出し、設定する。この範囲の抽出では、設定パラメータとして、範囲下限電圧VLoと範囲上限電圧VHi(VLo < VHi)を入力装置304を用いて設定し、波形判定用電圧範囲記憶部351に格納する。更に、ベースラインの傾きの許容範囲を規定するパラメータとして「傾き下限値(Coef Lo)」と「傾き上限値(Coef Hi)」を設定し、傾き許容範囲記憶部352に格納する。
ステップS103におけるピーク電流検出モジュール310の処理の詳細を、図18及び図19のフローチャートを用いて説明する。ステップS103において、測定系12が測定したそれぞれの電極ユニット761による電流−電圧特性の波形から、それぞれの正味のピーク電流値を検出する段階(ステップ)は、ステップS221〜S223における電流ピークを与える電圧値を算出する段階(図20参照。);ステップS224〜S228におけるベースラインを近似する段階(図21及び図22参照。);及びステップS229〜S230におけるピーク電流値を算出する段階(図23参照。)を、各電極ユニット761のそれぞれの電流−電圧特性に対して実行する手順からなる:
(a)チップカートリッジ11で測定された電気化学的電流の電流−電圧特性が示す電流ピークは、ほぼ一定の電圧範囲に現れる。このため、ステップS221においては、図8に示した入力装置304を用い、予め、ピーク探索電圧値範囲[V1,V2]を設定パラメータとしてピーク探索電圧値範囲記憶部353に格納しておく。即ち、図20に示すように、電気化学的電流のピーク電流探索は、下限値V1〜上限値V2の範囲で行う。先ず、ステップS222において、ピーク電流検出モジュール310の電圧値算出部311は、電気化学的電流の電流(i)−電圧(v)特性の波形を電圧値(v)に対して微分演算する。そして、ステップS223において、電圧値算出部311は、下限値V1〜上限値V2の範囲において、電気化学的電流の微分値(di/dv)が「ゼロクロス」する点の電圧値Vpk1と電流値Ipk1を算出する(図20参照。)。「ゼロクロス」する点とは、電気化学的電流の微分値(di/dv)が正値から負値に変化する点、又は負値から正値に変化する点であり、電流ピークを与える電圧値Vpk1及び電流値Ipk1に対応する。図20には、電圧値の増大に伴い、微分値(di/dv)が負値から正値に変化する点の電圧値Vpk1と電流値Ipk1が示されている。「ゼロクロス値」は、ノイズによる影響やピーク検出範囲(下限値V1〜上限値V2)設定による悪影響を受けないために、負値から正値に転じて連続3点が正値を保持している場合の最初に正値となった点の電圧値を、電圧値Vpk1として採用する。ステップS223において算出された「ゼロクロス値(ゼロクロス電圧値Vpk1,ゼロクロス電流値Ipk1)」は、ゼロクロス値記憶部354に、図4に示した基板714上の、すべての電極ユニット761毎に整理して、格納する。
y = ax+b ……(3)
を、ゼロクロス電圧値Vpk1と変曲点電圧Vifpの間で求める。例えば、ゼロクロス電圧値Vpk1と変曲点電圧Vifpの間における電流−電圧特性の波形データを、最小二乗法により式(3)のように直線近似する。図21に示す例では、一次式の係数a=-1.397×10-10、定数b=3.396×10-8と求められ、図22に示す例では、一次式の係数a=-2.899×10-11、定数b=4.504×10-9と求められる。更に、ベースライン近似部312はステップS226において、電流−電圧特性の波形と式(3)の近似直線との交点を与える交点電圧Vcrsを図22に示すように求め、この交点電圧Vcrsを交点電圧記憶部356に格納する。そして、ベースライン近似部312はステップS227において、交点電圧Vcrsを起点として、設定パラメータとして規定しているオフセット値だけ電圧を負の方向に遡った(電圧を減少させた)オフセット電圧Vofsを、図22のように求める。求められたオフセット電圧Vofsは、オフセット電圧記憶部357に格納する。更に、ベースライン近似部312は、オフセット電圧Vofsをオフセット電圧記憶部357から、交点電圧Vcrsを交点電圧記憶部356からそれぞれ読み出し、ステップS228において、オフセット電圧Vofsと交点電圧Vcrsの間の電流−電圧特性の波形データのバックグラウンドの接線(ベースライン)となる近似一次式を最小二乗法により、図23に示すように求める。この近似一次式は、式(3)と同様な形式で表現可能で、図23に示す直線近似では、一次式の係数a=-6.072×10-12、定数b=-5.902×10-9と求められる。
Ipk2 =abs(Ipk1−Ibg) ……(4)
式(4)を各電極ユニット761のそれぞれのSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551,SNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552,コントロール電極553のそれぞれの電流−電圧特性に対して適用することにより、各電極ユニット761のそれぞれの電極551,552,553から、それぞれ真の電流値Ipk2が算出される。
以上説明したように、図14のステップS103では、ピーク電流検出モジュール310が、測定系12が測定した各電極ユニット761によるそれぞれの電流−電圧特性のピークを示すゼロクロス電流値Ipk1から、バックグラウンド(ベースライン)の電流値Ibgを差し引いて、各電極ユニット761のそれぞれのSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551,SNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552,コントロール電極553毎に、それぞれの正味の電流値Ipk2が、種々の判定モードで算出され、分類される。
(a)ステップS301では、グループ正常判定モジュール320において、ステップS31における歯抜け判定を行うかどうかの選択を行う。歯抜け判定を行う場合には、ステップS31のステップS302に進む。歯抜け判定を行わない場合には、バラツキ異常を判定するステップS32のステップS305に進む。
ステップS105における検査有効性判定モジュール325の処理の詳細を、図32のフローチャートを用いて説明する。ここでは、図4に示す基板714上に複数配列される電極ユニット761にそれぞれ含まれる複数のポジティブ・コントロール用電極554,ネガティブ・コントロール用電極555からそれぞれ得られる一群の電流値Ipk2のデータについて判定を行う。
図14のステップS106は、図26に示すようにステップS332における検査有効性の判定において検査が有効であると判定された場合は、ステップS333に進み、2種類のアルゴリズムの選択を行う。ステップS332における検査有効性の判定において検査が有効でないと判定された場合は、ステップS334において「検査無効」として、分類結果記憶部369に判定結果を分類して格納し、表示装置306及び出力装置305に出力させ、信号処理を終了する。ステップS333においては、ある核酸が存在するかどうかを判定する有無判定アルゴリズムのフローに進むのか、SNPの型が、野生型ホモ型か、ヘテロ型か、変異型ホモ型か、即ち、例えば、G/Gホモ型であるか、G/Tヘテロ型であるか、又はT/Tホモ型であるか等を判定するSNP型判定アルゴリズムのフローに進むのかを決定する。
図26のステップS333において、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、図27に示すフローチャートの手順で有無判定モジュール330が処理を行う。
図26のステップS333において、SNPの型が、野生型ホモ型か、ヘテロ型か、若しくは変異型ホモ型かを判定するSNP型判定アルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、図28に示すフローチャートの手順で型判定モジュール340が処理を行う。なお、ここでは仮に、SNP1検出用電極551では、SNP="G"を検出,SNP2検出用電極552では、SNP="T"を検出する場合として説明を行うことにする。又、ここでは、SNP1検出用電極551は、野生型SNPを検出するためのプローブDNAが固定されており、SNP2検出用電極552には、変異型SNPを検出するためのプローブDNAが固定されているものとして、説明を行う。勿論、SNP1検出用電極を、変異型SNP検出用として、SNP2検出用電極を野生型SNP検出用として設定してもなんら問題はない。但し、判定基準パラメータの大小関係には注意が必要である。
(a)先ず、型判定モジュール340は、ステップS361では、標的数が2個であるか否かを判定する。SNP="G",SNP="T"の2種を判定しようとしているのであるから、標的数が0個,1個、3個等では、そもそも初期設定が間違っているので、分類結果記憶部369に判定結果を分類して格納し、ステップS381において、表示装置306及び出力装置305に「設定エラー」の出力させる。
Z1=(X1−Xc1)/Xc1 ……(5)
同様に、SNP2検出用電極552の電流値の平均値X2と対応するコントロール電極(C2)554の電流値の平均値Xc2を平均値・標準偏差記憶部360から読み出し、SNP2検出用電極552の電流値の平均値X2とコントロール電極(C2)556の電流値の平均値Xc2との差(X2−Xc2)をコントロール電極(C2)556の電流値の平均値Xc2で除算した値Z2(規格化されたSNP2電流増加量)を算出する:
Z2=(X2−Xc2)/Xc2 ……(6)
そして、算出したZ1及びZ2を、規格化座標記憶部365に格納し、ステップS366に進む。
図14,図16,図18−19,図25−28、図32に示した一連の判定操作は、図14,図16,図18−19,図25−28、図32と等価なアルゴリズムのプログラムにより、図8に示した塩基配列判定システムを制御して実行できる。このプログラムは、本発明の塩基配列判定システムを構成するコンピュータシステムのプログラム記憶装置(図示省略)に記憶させれば良い。又、このプログラムは、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存し、この記録媒体を塩基配列判定システムのプログラム記憶装置に読み込ませることにより、本発明の一連の判定操作を実行することができる。ここで、「コンピュータ読取り可能な記録媒体」とは、例えばコンピュータの外部メモリ装置、半導体メモリ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどのプログラムを記録することができるような媒体などを意味する。具体的には、フレキシブルディスク、CD−ROM,MOディスク、カセットテープ、オープンリールテープ、メモリカード、ハードディスク、リムーバブルディスクなどが「コンピュータ読取り可能な記録媒体」に含まれる。
上記のように、本発明は上記の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
11…チップカートリッジ
12…測定系
13…送液系
14…温度制御機構
15…制御機構
16…コンピュータ
21…検出チップ
300…CPU
301…ノイズ除去モジュール
301,…ノイズ除去モジュール
302…電流波形判定モジュール
303…バス
304…入力装置
305…出力装置
306…表示装置
310…ピーク電流検出モジュール
311…電圧値算出部
312…ベースライン近似部
313…ピーク電流値演算部
320…グループ正常判定モジュール
325…有効性判定モジュール
330…有無判定モジュール
340…型判定モジュール
351…波形判定用電圧範囲記憶部
352…許容範囲記憶部
353…ピーク探索電圧値範囲記憶部
354…ゼロクロス値記憶部
355…変曲点記憶部
356…交点電圧記憶部
357…オフセット電圧記憶部
358…ベースライン電流値記憶部
360…平均値・標準偏差記憶部
361…グループ正常判定記憶部
362…SLL記憶部
363…ESLL記憶部
364…MIR記憶部
365…規格化座標記憶部
366…ベクトル長記憶部
367…角度記憶部
368…角度パラメータ記憶部
369…分類結果記憶部
403,413,423,433、441,445,454…電磁弁
454…送液ポンプ
500…保護回路
501a,502a,503a,511a,511b,512a,512b,513a,513b…配線
502…対極
510…電圧パターン発生回路
511…トランス・インピーダンス増幅器
512…反転増幅器
513…電圧フォロア増幅器
550…有無検出用電極(作用極)
551…SNP1検出用電極(作用極)
552…SNP2検出用電極(作用極)
553…コントロール電極(作用極)
554…ポジティブ・コントロール電極(作用極)
555…ネガティブ・コントロール電極(作用極)
556…SNP2検出用電極に対応するコントロール電極(作用極)
561,562…参照極
571,572,573…プローブDNA
581,582,583…サンプルDNA
591…挿入剤
703…電気コネクタ
705…バルブユニット
707,708…ノズル
710…プローブユニット
711…カセット上蓋
712…カセット下蓋
713…パッキン
714…基板
722,723…ノズル差込孔
724,725…電気コネクタ用ポート
726…シール検出孔
727a〜727d,728a,728b,747a〜747d、748a,748b…孔
742…内表面
746…シール検出孔
749…カセット種類判別用孔
752,753…送出ポート
756,757…流路
761…電極ユニット
762,763…パッド
781,782…バルブボディ
789…カセット種類判別用ピン
Rff…フィードバック抵抗
Rf,Rw,Rs…抵抗
Claims (8)
- 第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記複数の第1検出用電極及び第2検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップに、サンプル核酸を含む薬液を供給する段階と、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する段階と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とする段階と、
前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とする段階と、
原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出する段階と、
前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較する段階
とを含み、前記角度と前記角度判定基準との大小関係により、前記サンプル核酸の型を判定することを特徴とする塩基配列判定方法。 - 前記第1プローブは、野生型の遺伝子型を検出するためのプローブとし、前記第2プローブは、変異型の遺伝子型を検出するためのプローブとすることを特徴とする請求項1記載の塩基配列判定方法。
- 前記角度判定基準として、野生型下限値、野生型上限値、ヘテロ型下限値、ヘテロ型上限値、変異型下限値、変異型上限値が設定され、
前記角度が、野生型下限値と野生型上限値の間である場合に、前記サンプル核酸の型を野生型、
前記角度が、ヘテロ型下限値とヘテロ型上限値の間である場合に、前記サンプル核酸の型をヘテロ型、
前記角度が、変異型下限値と変異型上限値の間である場合に、前記サンプル核酸の型を変異型と、
それぞれ判定することを特徴とする請求項2記載の塩基配列判定方法。 - 前記極座標変換により得られる前記ベクトルの長さを、予め定めたベクトル長判定基準と比較する段階と、
前記ベクトルの長さが前記ベクトル長判定基準よりも小さい場合には、判定不能と判断することを特徴とする請求項1記載の塩基配列判定方法。 - 前記角度判定基準が、複数の既知の塩基配列のサンプル核酸の測定データの平均値と標準偏差を用いて定められることを特徴とする請求項3記載の塩基配列判定方法。
- 第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップを装着して使用され、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する測定系と、
前記チップに、薬液を送液する送液系と、
前記測定系及び送液系を制御する制御機構と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とし、前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とし、原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出し、前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較し、前記角度と前記角度判定基準との大小関係により、前記サンプル核酸の型を判定する型判定モジュールを含むコンピュータ
とを備えることを特徴とする塩基配列判定システム。 - 前記コンピュータが、
前記第1検出信号、前記第2検出信号、前記コントロール信号をそれぞれ電流−電圧特性として取得し、該電流−電圧特性のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの電流−電圧特性の正常・異常を判定し、異常な検出信号を演算対象外とする電流波形判定モジュールと、
前記第1検出信号、前記第2検出信号、前記コントロール信号に対応するそれぞれの電流−電圧特性から、それぞれのバックグラウンド電流を差し引いて、それぞれの真の検出信号をピーク電流値として取得するピーク電流検出モジュールと、
前記ピーク電流検出モジュールが算出した真のピーク電流値のデータ群中から、正常グループを抽出するグループ正常判定モジュールと、
抽出された正常データから真のピーク電流値のデータ群を用いて、対象とする核酸の塩基が存在するかどうかを判定する有無判定モジュールもしくはサンプル核酸の一塩基多型を同定する型判定モジュール
とを更に備えることを特徴とする請求項6に記載の塩基配列判定システム。 - 第1プローブがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、前記第1プローブとは塩基配列が異なる第2プローブがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極、前記第1プローブ及び前記第2プローブとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップにサンプル核酸を含む薬液を供給された後、
前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれコントロール信号を、それぞれ取得する手順と、
前記第1検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をX座標とし、前記第2検出信号の平均値から前記コントロール信号の平均値を減算し、前記コントロール信号の平均値で除算した値をY座標とし、原点から前記X座標及び前記Y座標が定める点までのベクトルが正のX軸となす角度を算出する手順と、
前記角度を、予め定めた角度判定基準と比較する手順
とを含む処理をコンピュータに実行させ、これにより前記コンピュータに、前記サンプル核酸の型が、野生型、ヘテロ型、変異型、若しくは判定不能と判断させるための塩基配列判定プログラム。
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