JP2009143890A - 診断におけるttkおよび癌における治療標的としてのttk - Google Patents
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Abstract
【解決手段】癌細胞の増殖を低減する方法であって:癌細胞と、該細胞中のチロシンスレオニンキナーゼ(TTK)ポリペプチド活性を低減するのに有効な量の薬剤とを接触させる工程、を包含し、ここで、該癌細胞におけるTTKポリペプチド活性の低減は、該細胞の増殖を低減する、方法。
【選択図】なし
Description
本発明の分野は、疾患の診断および癌の処置ならびに抗癌剤の同定に関する。
有糸分裂チェックポイント遺伝子は、発達におけるそれらの役割および疾患(例えば、癌)におけるそれらの潜在的な役割について広く研究されるようになった。有糸分裂チェックポイントは、適切な細胞分裂を確実にするための多くの異なる機構を含む。例えば、紡錘体集合チェックポイントは、中期板での染色体の不適切な整列に応じて、後期の開始のタイミングを調節する。欠陥が検出される場合、紡錘体への正確な双極付着が達成されるまで、細胞周期のさらなる進行を停止するようシグナルが伝達される。出芽酵母において最初に同定された、いくつかの哺乳動物紡錘体チェックポイント関連タンパク質は、近年同定され、そして部分的に特徴付けられている。これらのタンパク質は、後期の開始前の有糸分裂の初期段階において、全ての活性なヒトセントロメア(ネオセントロメアを含む)と関連する。チェックポイントタンパク質複合体(BUB1、BUBR1、BUB3、MAD2)に関連するタンパク質、後期促進複合体(Tsg24、p55CDC)、および有糸分裂チェックポイント制御に関連する他のタンパク質(ERK1、3F3/2エピトープ、hZW10)は、活性なセントロメアのみと特異的に会合することが見出されており、このことは、活性なセントロメアのみが紡錘体チェックポイントに関与することを示唆する。Saffery Rら、Hum Genet.107:376−84(2000)。
本発明は、TTKの発現レベルの検出による癌性細胞の同定方法、ならびに哺乳動物の癌におけるこれらの遺伝子の示差的な発現を利用した診断方法、予後方法、および治療方法を提供する。このような方法は、例えば、合理的な治療の基礎として、特定の治療に対して応答する被験体の能力を決定するのに有用であり得る。さらに、本発明は、これらの遺伝子が関与する癌におけるこれらの遺伝子の活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ、およびTTKの活性を阻害することにより腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する:
(項目1)
癌細胞の増殖を低減する方法であって:
癌細胞と、該細胞中のチロシンスレオニンキナーゼ(TTK)ポリペプチド活性を低減するのに有効な量の薬剤とを接触させる工程、
を包含し、ここで、該癌細胞におけるTTKポリペプチド活性の低減は、該細胞の増殖を低減する、方法。
(項目2)
前記TTK活性の低減が、TTKポリペプチドレベルの低減の結果である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記薬剤が、TTKアンチセンスポリヌクレオチドである、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記TTKアンチセンスポリヌクレオチドが、ウイルスベースのベクターに含まれる、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記TTK活性の低減が、TTKポリヌクレオチドレベルの低減の結果である、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記薬剤が、TTKに特異的に結合するモノクローナル抗体である、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記TTKポリペプチドが、配列番号14のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
癌細胞の増殖を低減する候補薬剤を同定するアッセイであって:
候補薬剤の存在下でTTKポリペプチド活性を検出する工程;および
候補薬剤の存在下での該TTKポリペプチド活性と、該候補薬剤の非存在下でのTTKポリペプチド活性とを比較する工程、
を包含し、ここで、該候補薬剤の非存在下でのTTK活性に対する該候補薬剤の存在下でのTTK活性の低減は、該候補薬剤が癌細胞の増殖を低減することを示す、アッセイ。
(項目9)
前記検出工程が、配列番号26のポリペプチドを基質として使用する、項目8に記載のアッセイ。
(項目10)
前記検出工程が、TTKリン酸化に感受性の配列番号26のフラグメントを基質として使用する、項目8に記載のアッセイ。
(項目11)
前記フラグメントが、配列番号27または28のポリペプチドを含む、項目10に記載のアッセイ。
(項目12)
前記ポリペプチドフラグメントがビオチン化されている、項目10に記載のアッセイ。
(項目13)
前記TTKポリペプチドが、バキュロウイルス系、細菌系、酵母系、および哺乳動物系からなる群より選択される系を用いた発現の産物である、項目8に記載のアッセイ。
(項目14)
前記TTKポリペプチドが、バキュロウイルス系を用いた発現の産物である、項目13に記載のアッセイ。
(項目15)
前記TTKポリペプチドが、配列番号14のアミノ酸配列を含む、項目8に記載の方法。
(項目16)
TTK活性を低減する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
TTKをコードするポリヌクレオチドの増大した発現を示す癌細胞と、候補薬剤とを接触させる工程;および
TTKポリペプチド活性に対する該候補薬剤の効果を決定する工程、
を包含し、ここで、TTK活性の低減は、該薬剤がTTK活性を低減し、該癌細胞の増殖を阻害することを示す、方法。
(項目17)
前記TTK活性の低減が、TTKポリペプチドレベルの低減の結果である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記TTK活性の低減が、TTK mRNAレベルの低減の結果である、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記候補薬剤が、TTKアンチセンスポリヌクレオチドである、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記TTKアンチセンスポリヌクレオチドが、ウイルスベースのベクターに含まれる、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記癌細胞が、乳癌細胞である、項目16に記載の方法。
(項目22)
前記癌細胞が、結腸癌細胞である、項目16に記載の方法。
(項目23)
TTKポリペプチドが、配列番号14のアミノ酸配列を含む、項目16に記載の方法。
(項目24)
TTK活性が、TTKをコードするポリヌクレオチドの発現を検出することにより検出される、項目18に記載の方法。
(項目25)
被験体における卵巣癌以外の癌を検出する方法であって、該方法は:
癌を有する疑いのある被験体から得られた試験細胞におけるTTKポリペプチドの発現レベルを検出する工程;および
該試験細胞におけるTTKポリペプチドの発現レベルと、同一の組織型の正常な非癌細胞における発現レベルとを比較する工程、
を包含し、該正常な非癌細胞における発現レベルに対して有意に増加した、該試験細胞におけるTTKポリペプチドの発現レベルの検出は、該被験体が卵巣癌以外の癌を有することを示す、方法。
(項目26)
前記試験細胞が、結腸細胞である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記試験細胞が、乳房細胞である、項目25に記載の方法。
(項目28)
被験体における卵巣癌以外の癌を検出する方法であって、該方法は:
癌を有する疑いのある被験体から得られた試験細胞におけるTTKポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程;および
該試験細胞におけるTTKポリヌクレオチドの発現レベルと、同一の組織型の正常な非癌細胞における発現レベルとを比較する工程、
を包含し、該正常な非癌細胞における発現レベルに対して有意に増加した、該試験細胞におけるTTKポリヌクレオチドの発現レベルの検出は、該被験体が卵巣癌以外の癌を有することを示す、方法。
(項目29)
前記試験細胞が、結腸細胞である、項目29に記載の方法。
(項目30)
前記試験細胞が、乳房細胞である、項目29に記載の方法。
(項目31)
被験体における卵巣癌以外の癌性疾患の予後を評価する方法であって、該方法は:
被験体の試験癌細胞におけるTTKをコードするポリヌクレオチドの発現を検出する工程、および
該試験癌細胞におけるTTKをコードするポリヌクレオチドの発現レベルと、コントロールの非癌細胞における該ポリヌクレオチドの発現レベルとを比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールの非癌細胞における発現レベルに対する該試験癌細胞におけるTTKの該発現レベルが、該癌性疾患の予後の指標である、方法。
(項目32)
前記発現を検出する工程が、TTKをコードする転写物の検出による、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記試験細胞が、結腸細胞である、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記試験細胞が、乳房細胞である、項目31に記載の方法。
本発明を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法論に限定されず、当然、それ自体が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、限定することを意図しないこともまた理解されるされるべきである。なぜならば、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
本明細書中に交換可能に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。従って、これらの用語は、一本鎖、二本鎖または多重鎖の、DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA−RNAハイブリッド、あるいはプリン塩基およびピリミジン塩基または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に改変された非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。これらの用語は、さらに、イントロン配列を含むmRNAまたはcDNAを含むが、これらに限定されない(例えば、Niwaら(1999)Cell 99(7):691−702を参照のこと)。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基を含み得る(代表的に、RNAまたはDNA中で見出され得るように)か、あるいは改変もしくは置換された糖または改変もしくは置換されたリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホラミダイトのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホラミデートまたは混合されたホスホラミデート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Peyrottesら(1996)Nucl.Acids Res.24:1841−1848;Chaturvediら(1996)Nucl.Acids Res.24:2318−2323。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド(例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ)、ウラシル、他の糖、および連結基(例えば、フルオロリボースおよびチオエート)、およびヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドはさらに、例えば、標識成分での結合体化によって、重合後に改変され得る。この定義中に含まれる他の型の改変は、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合させるための手段の導入である。
York NY(1994))。ポリメラーゼ連鎖反応技術において実行されるような増幅は、Dieffenbachら、PCR Primer,a Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY(1995)に記載される。
ヒトTTKは、混合された特異的(tyr/thr)キナーゼの活性を示す857アミノ酸タンパク質をコードする有糸分裂チェックポイント遺伝子である。TTKは、急速に増殖する組織(例えば、精巣および胸腺)中で発現される。例えば、Mills GBら、J Biol Chem.267:16000−6(1992)を参照のこと。本発明は、TTKが、マイクロアレイ分析によって検出されたように、正常結腸細胞と比較して、結腸腫瘍細胞中で差示的に発現されるという知見に基づく。差示的な発現は、種々の形態の癌に由来する細胞株において確認され、このことは、より一般的な機構としての癌におけるTTKの関与を示す。さらに、TTKメッセージを「ノックアウト」するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたTTK機能の破壊は、増殖を低減させ、足場非依存的増殖を阻害し、そして癌細胞株(転移性乳癌細胞株(MDA−MB−213)および結腸直腸癌腫細胞株(SW620)を含む)のアポトーシスを誘導した。TTKは、TTKが過剰発現される癌における化学療法のための治療標的であり得ることを、これらのデータは示す。
1つの局面において、本発明は、TTK活性が、同じ細胞型の正常細胞よりも、癌性細胞中で(特に、結腸癌および乳癌中で)より高いレベルで存在することの発見に基づく。この発見は、癌性細胞の同定、ならびにTTKの活性を阻害することによる(例えば、転写レベルもしくは翻訳レベルまたは両方のレベルでTTK発現を阻害することによってか、TTK活性を阻害することなどによる)治療を受け易い腫瘍の同定に対する基礎として作用する。
個体由来の生物学的サンプルを分析して、その被検体由来の生物学的サンプル中のTTK遺伝子産物を検出することによって、その個体が、TTK遺伝子産物(例えば、RNAまたはタンパク質)の増加した発現を有するか否かを決定するための多数の方法が、当該分野で公知である。上記のように、そのような分析の目的は、診断のため、既存の癌の存在を検出するため、癌の型の同定を補助するため、その癌の重篤度または可能な経過を決定する際に医師を補助するため、および/またはその癌の処置を最適にするために、使用され得る。特定の非限定的例において、これらの方法は、癌細胞を検出するため、被検体における癌および癌の重篤度(例えば、腫瘍悪性度、腫瘍負荷など)の診断を容易にするため、被検体の予後の決定を容易にするため、および治療に対するその被検体の応答性を(例えば、例えば、化学療法レジメンの間またはその後の腫瘍負荷を評価することを介して、治療効果の尺度を提供することによって)評価するために、有用である。さらなる実施形態において、これらの方法は、例えば、臨床試験集団に含めるべき患者を選択するため、適切な治療を選択するため(例えば、癌性細胞の発現プロフィールに応じた治療を選択するため)などに、癌細胞の分類または層化のために有用である。
この検出方法は、キットの一部として提供され得る。従って、本発明は、生物学的サンプルにおけるTTK活性の存在および/またはレベルを、例えば、TTKをコードするmRNAおよび/もしくはそれによりコードされるポリペプチドの検出によってかまたはTTK活性を測定することによって、検出するためのキットを提供する。これらのキットを使用する手順は、臨床研究室、実験研究室、医療実施者、または個人によって、実施され得る。癌細胞において差示的に発現されるTTKポリペプチドを検出するための本発明のキットは、このポリペプチドに特異的に結合する部分(特異的抗体であり得る)を含む。癌細胞において差示的に発現されるTTKポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための本発明のキットは、そのようなポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする部分(例えば、プライマー)を含む。TTK活性を検出するための本発明のキットは、TTKによりリン酸化され得るレシピエント基質と、標識ドナー基質とを、含む。このキットは、この手順において有用なさらなる成分(緩衝液、発色試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、標準物、指示書、および説明情報が挙げられるが、これらに限定されない)を、必要に応じて含み得る。
TTK活性の検出のための方法は、発現されるTTK遺伝子またはその対立遺伝子もしくは改変体を示すTTK核酸配列の存在をスクリーニングする工程、およびそのTTKポリペプチドを検出する工程を包含する。この方法は、その核酸配列またはポリペプチドを含むと疑われる個体由来の生物学的サンプルを使用する。生物学的サンプルの例としては、血液、血漿、血清、組織サンプル、腫瘍サンプル、唾液および尿が、挙げられる。
試験サンプル中のTTKポリペプチドの存在または非存在を決定するための、種々の方法が存在する。サンプルは、野生型TTKおよび/またはTTKポリペプチドの1つ以上の特定の改変体(例えば、対立遺伝子改変体)と特異的な、特異的結合メンバー(例えば、抗体(または抗体の混合物))に関する結合パートナーの存在について試験され得る。このような場合、そのサンプルは、特異的結合メンバー(例えば、抗体)と、特異的結合に適切な条件下で接触されることによって、試験され得る。一群の抗体が使用される場合、異なるレポーター標識が、各抗体について使用され得、各結合が決定され得るようにされる。抗TTK抗体を使用するTTKポリペプチドの検出に加えて、TTKポリペプチドもまた、TTK特異的活性アッセイを使用して同定され得る。
結合因子(例えば、抗体または核酸配列)はまた、固体支持体上または診断チップ上の、小さい別個の位置に、および/またはアレイとして、固定され得る。これらのアプローチは、特に価値があり得る。なぜなら、これらは、特に、蛍光標識試薬の使用を介して、優れた感度を提供し得、試験される個体から非常に少量の生物学的サンプルしか必要とせず、そして種々の別個のアッセイが同時に実行され得るのを可能にし得るからである。この後者の利点は、有用であり得る。なぜなら、この利点は、TTKのアッセイと並べて、異なるタンパク質(例えば、オンコジーンまたは腫瘍サプレッサー)のアッセイを提供するからである。従って、さらなる局面において、本発明は、TTK核酸またはTTKポリペプチドと特異的に結合可能な1つ以上の結合因子が、必要に応じてアッセイを実行するために必要な他の試薬とともに固定された、支持体または診断チップを提供する。
TTKによりコードされる全長ポリペプチドまたは部分ポリペプチドは、任意の発現系(例えば、細菌系、酵母系、昆虫系、両性類系、および哺乳動物系を含む)にて発現され得る。そのためのいくつかのベクターおよび宿主細胞が、米国特許第5,654,173号に記載されている。適切なポリヌクレオチド構築物が、例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York)に記載される、標準的組換えDNA技術を使用して、米国Dept.of HHS,National Institute of Health(NIH) Guideline for Recombinant DNA Researchに記載される現行の規制下で、精製される。
036,776、米国特許第4,551,433号、DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)80:21−25;およびSiebenlistら、Cell(1980)20:269に記載される系が、挙げられる。
J.(1985)4:475−479;EP 0 244,234、ならびにWO 91/00357に記載される系が、挙げられる。
本発明はまた、TTK活性を調節する因子、詳細には、罹患した細胞(例えば、TTKが差示的に発現される癌性細胞または前癌性細胞)における異常なTTK活性を低減する因子を、同定するためのスクリーニングアッセイを包含する。このようなアッセイは、インビトロまたはインビボのいずれか実施され得る。
本明細書中に使用される場合、用語「因子」とは、差示的に発現される遺伝子の発現またはその遺伝子産物の生理学的機能を変化させる能力を有する、任意の分子を記載する。一般的に、複数のアッセイ混合物が、異なる因子濃度で並行して実行されて、種々の濃度に対する差示的応答が得られる。代表的には、これらの濃度の1つは、ネガティブコントロール(すなわち、0濃度または検出レベル未満)として役立つ。
広範な種類のインビトロアッセイが、所望の生物学的活性について候補因子をスクリーニングするために使用され得、そのようなアッセイとしては、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−DNA結合アッセイ(例えば、発現に影響する因子を同定するため)、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についての免疫アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、大量の差示的に発現されるポリペプチドの産生を提供することによって、そのポリペプチドに結合するか、そのポリペプチドの作用を調節もしくは模倣する、リガンドまたは基質を同定し得る。さらに、これらのリガンドおよび基質を同定するための方法が、以下に提供される。精製ポリペプチドもまた、3次元結晶構造の決定のために使用され得、この3次元結晶構造は、分子間相互作用、転写調節などのモデリングのために使用され得る。
候補因子は、癌の非ヒト動物モデルにおいて(例えば、癌性細胞が注入された動物において;本明細書中に記載される差示的に発現される遺伝子の発現の変化についてトランスジェニックである(例えば、トランスジェニック「ノックアウト」またはトランスジェニック「ノックイン」である)(差示的に発現される遺伝子産物のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドおよび作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む)動物などにおいて)スクリーニングされ得る。
所望の薬理学的活性を有する化合物が、差示的に発現される遺伝子産物の発現の調節により処置される状態の処置のために、薬理学的に受容可能なキャリア中で、宿主へと投与され得る。その治療剤は、種々の方法で、経口投与、局所投与、非経口投与(例えば、皮下投与、腹腔内投与、ウイルス注入による投与、筋肉内投与など)され得る。経口処置および吸入処置が、特に興味深い。導入方法に依存して、その化合物は、種々の方法で処方され得る。その処方物中に治療活性化合物の濃度は、約0.1重量%から100重量%まで変化し得る。その治療剤は、単回用量でか、または処置経過にわたって多回用量で投与され得る。
本発明に従うTTKポリペプチドまたはTTKコード核酸は、TTK活性またはTTK機能に影響を与えるかまたはこの活性または機能を調節する分子をスクリーニングする際に使用され得る。このような分子は、治療的および/または予防的状況において有用であり得る。癌を処置または予防する際に潜在的に有用な物質をスクリーニングするための手段が、本発明により提供される。一般に、本発明の方法は、概して、(例えば、TTKポリペプチドもしくは他のTTK遺伝子産物の活性を調節することにより、またはTTK活性をもたらすカスケードにおいてTTKの上流または下流のいずれかで作用する遺伝子産物の活性を標的化することによってTTK活性に影響を及ぼすことにより)特に目的のTTK活性を低減する薬剤を使用して、TTK活性のモジュレーターの同定を可能にするはずである。TTK活性のモジュレーターとして同定された物質は、癌に対する戦いの進歩を示す。なぜなら、これら物質は、インビボでの使用のための医薬品の設計および調査の基本を提供するからである。
TTKの活性を、当該分野で公知の任意の適切なキナーゼアッセイを使用して、測定し得る。例えば(限定ではない)、Hoggら(Oncogene 1994 9:98−96)、Millsら(J.Biol.Chem.1992 267:16000−006)およびTomizawaら 2001(FEBS Lett.2001 492:221−7)、Schmandtら(J.Immunol.1994,152:96−105)において記載される方法が使用され得る。さらに、セリン、スレオニン、およびチロシンキナーゼアッセイは、Ausubelら(Short Protocols in Molecular Biology,1999,unit 17.6)に記載される。
本発明は、癌細胞(特に、乳がん細胞または結腸癌細胞)の増殖を低減するための方法をさらに提供する。一般に、この方法は、正常細胞と比較して異常なレベルでTTKを発現する癌細胞と、(1)TTK(例えば、TTKに対応するアンチセンスポリヌクレオチド)の発現を調節する(一般には低減させる)物質;または(2)そうでなければ、異常なTTK活性を有する癌細胞におけるTTKポリペプチドレベルおよび/もしくはTTK活性を調節する(一般には、低減させる)物質とを接触させることを包含する。
本発明の薬学的組成物は、治療的に有効な量のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド(アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムを含む)、または低分子もしくはTTKの活性を調節する、好ましくは、TTK活性を低減させると同定された他の化合物を含み得る。用語「治療的に有効な量」とは、本明細書中で使用される場合、所望の疾患もしくは状態を処置、改善、または予防する、あるいは検出可能な治療効果もしくは予防効果を示す治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーもしくは抗原レベルにより検出され得る。治療効果はまた、物理的症状(例えば、体温低下)の低減、および/または被験体における腫瘍負荷に対する効果の低減(例えば、腫瘍サイズの低減もしくは腫瘍増殖の阻害)が挙げられる。被験体のための正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康状態、その状態の性質および程度、ならびに投与のための選択された治療剤または治療剤の組み合わせに依存する。従って、予め正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の状況のための有効量は、慣用的な実験法により決定され、臨床医の裁量内にある。本発明の目的に関して、有効用量は、一般に、投与される個体において、約0.01mg/kg〜50mg/kgまたは0.05mg/kg〜約10mg/kg のDNA構築物である。
Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)において入手可能である。そのキャリアまたは他の物質の正確な性質は、投与経路(例えば、経口経路、静脈内経路、皮膚経路もしくは皮下経路、経鼻経路、筋肉内経路、腹腔内経路)に依存し得る。
一旦処方されると、本発明の組成物または本発明の方法を使用して同定された組成物は、(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして)被験体に直接投与され得る。組成物の直接送達は、概して、非経口注射により達成され得る(例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内、腫瘍内または組織の間質空間)。他の投与様式としては、経口および肺投与、坐剤、および経皮適用、針、および遺伝子銃もしくはハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回用量計画または複数回用量計画であり得る。
本発明はまた、TTKプロモーターの活性を調節し、TTK発現のレベルを増大または低減させる物質のスクリーニング方法において、TTKプロモーターおよび/またはエンハンサー領域の核酸配列の全てまたは一部の使用を提供する。このアッセイは、治療目的および/または予防目的のための抗癌剤を同定するために行われ得る。プロモーター活性のレベル(すなわち、転写を開始する能力)は、例えば、プロモーターからの転写により生成されるmRNAの量を評価することにより、またはプロモーターからの転写により生成されるmRNAの翻訳により生成されるタンパク質産物の量を評価することにより、定量可能である。発現系に存在する特定のmRNAの量は、例えば、このmRNAとハイブリダイゼーションし得、かつ標識された特定のオリゴヌクレオチドを使用して決定され得るか、またはPCRのような特異的増幅反応において使用され得る。レポーター遺伝子の使用は、タンパク質産物を参照することにより、プロモーターの決定を容易にする。
サンプル中のTTKレベルは、一体化疾患情報システムにおいて使用されて、提唱される患者介入、臨床試験の設計、薬物動態分析の実施、および種々の患者についての経時的な疾患進行を示すことのような分析が補助され得る。例えば、本発明の方法に従って決定されたTTK情報は、2000年8月22日にHerrenらに発行された米国特許第6,108,635号に記載されるもののようなシステムにおいて使用され得る。このようなシステムは、複数の位置において患者に与えられる医学的処置の結果を収集するためのものであり得る。例えば、1998年2月3日にYokotaらに発行された米国特許第5,713,350号を参照のこと。
正常組織および癌組織を、レーザー捕獲微小切開(laser capture microdissection)(LCM)技術を使用して、患者から取り出した。この技術は、当該分野において周知である(例えば、
を参照のこと)。表1(実施例の最終頁の後に挿入される)は、サンプルを単離した各患者についての情報を提供し、以下を含む:患者IDおよびPath ReportID(同定の目的のために患者および病理報告に割り当てられた数);腫瘍の解剖学的位置(AnatomicalLoc);原発性腫瘍サイズ;原発性腫瘍等級;組織病理学的等級;腫瘍が浸潤した局所部位(局所浸潤)の記載;リンパ節転移の存在(リンパ節転移);リンパ節転移の発生(試験されたリンパ節の数に対する転移ポジティブなリンパ節の数として提供される)(リンパ節転移の発生);局所リンパ節等級;腫瘍およびその局在から離れた部位への転移の同定または検出(Distant Met&Loc);離れた転移の記載(Description Distant Met);離れた転移の等級(Distant Met Grade);および患者または腫瘍についての一般的所見(所見)。腺腫を、任意の患者においては記載しなかった:腺腫形成異常(病理学者によって過形成と記載される)は、患者ID番号695に記載された。結節外伸長(extranodal extension)を、2人の患者(患者ID番号784および791)において記載した。リンパ管浸潤を、7人の患者(患者ID番号128、278、517、534、784、786および791)において記載した。クローン病様の浸潤を、7人の患者(患者ID番号52、264、268、392、393、784、および791)において記載した。
cDNAプローブを、実施例1に記載した患者細胞より単離した総RNAから調製した。LCMは実質的に相同な細胞サンプルを提供するための特定の細胞型の単離を提供するので、同様に純粋なRNAサンプルを提供した。
を用いて、TTKを増幅した。PCR産物を、増幅が、内部標準との比較で増幅の直線相に入った時点でのサイクルに基づいて、製造業者によって供給されるソフトウェアを使用して定量した。量における小さな差異または第一鎖cDNA反応における総テンプレートを、順方向プライマー
を用いて別々の定量的PCR反応で増幅したアクチンの量に正規化することによって排除した。正常組織におけるTTK mRNAレベルについての結果を、図1に示す;腫瘍細胞株におけるTTK mRNAレベルについての結果を、図2に示す。分析した細胞株の簡単な記載を、以下の表に提供する。
TTKは、正常細胞に発現された(図1)。胸腺および精巣は、TTKについての遺伝子を最も高度に発現した正常組織として同定された。しかし、多くの癌細胞は、ほとんどの野生型組織と比べて有意に増加したレベルのTTK発現を示した(図2)。
実施例2からの差示的発現パターンを、階層型クラスタリング法をデータセットに適用することによって分析した(Eisen et al(1998)PNAS 95:14863−14868を参照のこと)。簡単には、階層型クラスタリングアルゴリズムは、SokalおよびMichenerの平均連鎖(average−linkage)法(Sokal,RR&Michener,CD(1958)Univ.Kans.Sci.Bull.38,1409−1438)に基づく。これは、クラスタリング相関マトリクスについて開発された。このアルゴリズムの目的は、単純なツリーに全てのエレメントをアセンブリさせる系統樹を計算することである。n個の遺伝子の任意のセットについて、遺伝子の対全てについての類似性スコアを含む上方対角線(upper−diagonal)類似性マトリクスが、計算される。この技術を使用して、4つの群の差示的発現パターンを同定し、そしてクラスターに割り当てた。
TTKについてのさらなる機能的な情報を、アンチセンスノックアウト技術を使用して生成した。癌細胞におけるTTK発現をさらに分析して、腫瘍形成において遺伝子産物の役割および機能(例えば、転移表現型の促進)を確認する。
増殖に対するTTKの効果を、転移性乳癌細胞株(MDA−MB−231 (「231」))、SW620結腸直腸癌細胞または847ヒト不死化繊維芽細胞において評価した。トランスフェクションを、実施例4に記載されるように行った。
コロニー形成に対するTTK発現の効果を、軟寒天(soft agar)アッセイにおいて試験した。細胞上に数時間以内新鮮に層状化して置いた、培地中0.6%寒天2mlの下層を最初に確立することによって、軟寒天アッセイを行った。この細胞層を、0.05%トリプシンを使用して上記のようにトランスフェクトした細胞をプレートから取り出し、培地で2回洗浄することによって下層上に形成させた。細胞を、Coulterカウンターで計数し、培地1ml当たり106個に再懸濁した。10μlアリコートを、(WST1で計数をチェックするために)96ウェルプレート中の培地とともに置くか、または軟寒天アッセイのためにさらに希釈する。2000個の細胞を、2連のウェル中で0.6%寒天下層上、800μlの0.4%寒天中に置く。細胞層寒天が凝固した後、2mlの培地を、上層に滴下し、そしてアンチセンスまたは逆コントロールオリゴを、送達ビヒクルなしに添加する。新鮮な培地およびオリゴを、3〜4日毎に添加する。コロニーを、10日〜3週間で形成させる。コロニー野を、目で計数した。Wst−1代謝値を使用して、開始細胞数における小さな差異を補正し得る。大きな野を、差異の可視記録についてスキャンし得る。
SW620細胞を、増殖アッセイについて記載したようにトランスフェクトした。シスプラチン(cis)存在下での細胞傷害性効果について、同じプロトコルを行ったが、細胞を2μMの薬物の存在下に残した。膜傷害に起因して培地中に放出されるLDH酵素の量を測定することによって、毎日、細胞傷害性をモニタリングした。LDHの活性を、Roche Molecular BiochemicalsからのCytotoxicity Detection Kitを使用して測定した。同一の時間点および処置において培地中に放出されるLDH対ウェル中に存在する総LDHの比(rLDH/tLDH)として、データを提供する。BCL2(抗アポトーシス遺伝子として公知)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび逆コントロールオリゴヌクレオチドを使用するポジティブコントロールは、BCL2のメッセージの消失はコントロールオリゴヌクレオチドでの処置(トランスフェクションに起因するバックグラウンド細胞傷害性)と比較して細胞死の増加を導くことを示す。
本アッセイは、マイクロタイタープレート中に行われ得る。TTKを、バキュロウイルス発現系を使用して、6×Hisタグ化融合タンパク質として精製した。基本的にはTTKキナーゼ緩衝液(50mM Hepes(pH7.4)、2mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM NaF、50mM NaCl、1mM DTTおよび1mg/ml BSAを含む)中20nM TTK(100kDa)20μlを、サンプルマイクロタータープレートのウェル中の20%DMSO中に希釈した候補薬剤5μl、
のような、cdc25由来のビオチン化基質ペプチドの2.8μM溶液10μl、および80nM33P−γATP5μlに添加した。サンプルを、混合し、2時間インキュベートし、そして各反応を、20μlの0.5M EDTA(pH8.0)を使用して停止した。サンプルの50μlを、96ウェルのStreptavidinコート平底フラッシュプレートに移し、このサンプルを、室温で1時間プレートとインキュベートする。プレートのウェルを、250μlのカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水で4回洗浄し、そしてシンチレーション流体をこのサンプルに添加した。TTKの活性を、TTKによって33P−γATPから基質ペプチドへ移された33Pの放出を計算することによって、シンチレーションによって測定した。
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