JP2009136229A - Method for creating model cell of autoimmune disease or model animal of autoimmune disease, and method for diagnosing autoimmune disease - Google Patents
Method for creating model cell of autoimmune disease or model animal of autoimmune disease, and method for diagnosing autoimmune disease Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal, and a method for diagnosing an autoimmune disease.
自己免疫疾患である肺高血圧症併発混合性結合組織病(以下、「MCTD」ともいう)や、関節リウマチ(以下、「RA」ともいう)の患者では、血管新生因子アンギオポイエチン1(以下、「Ang−1」ともいう)のアミノ酸配列において、269番目にグリシンが挿入されたスプライシングバリアント(以下、「269番目グリシン挿入型スプライシングバリアント」ともいう)が見られることが知られている(特許文献1及び特許文献2を参照)。 In patients with pulmonary hypertension and mixed connective tissue disease (hereinafter also referred to as “MCTD”) and rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as “RA”), which are autoimmune diseases, the angiogenic factor angiopoietin 1 (hereinafter referred to as “angiopoietin 1”). It is known that a splicing variant in which glycine is inserted at position 269 (hereinafter also referred to as “269th glycine insertion type splicing variant”) is found in the amino acid sequence of “Ang-1” (Patent Literature). 1 and Patent Document 2).
MCTD患者は、時として、肺高血圧症(pulmonary hypertension、以下「PH」ともいう)を併発し、患者を死に至らしめることがある。そのため、MCTD等の自己免疫疾患は、早期に発見し、治療することが求められている。 MCTD patients sometimes develop pulmonary hypertension (hereinafter also referred to as “PH”), causing the patient to die. Therefore, autoimmune diseases such as MCTD are required to be detected and treated at an early stage.
MCTDの診断マーカーには、例えば、非特許文献1に記載されているように、抗U1RNP自己抗体を用いることができる。抗U1RNP自己抗体の標的であるU1RNPは、非特許文献2に記載されているように、スプライシング調節因子として機能することが知られている。
As a diagnostic marker for MCTD, for example, as described in Non-Patent Document 1, an anti-U1RNP autoantibody can be used. It is known that U1RNP, which is a target of anti-U1RNP autoantibodies, functions as a splicing regulator as described in Non-Patent
ところで、U1RNPは、抗U1RNP自己抗体のみならず、非特許文献3に記載されているように、核内低分子RNAとタンパクの複合体であるsnRNPに対する自己抗体である抗Sm抗体とも結合することが知られている。抗Sm抗体は、非特許文献4に記載されているように、全身性エリテマトーデス(以下、「SLE」ともいう)患者の一部に、検出されることが知られている。
特許文献1及び特許文献2に開示されているように、MCTD患者やRA患者において、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが有意に多いことは知られている。しかしながら、このスプライシングバリアントが、MCTDやRAの発症にどのように関連しているかは全く知られていない。
As disclosed in Patent Document 1 and
また、非特許文献1に開示されているように、抗U1RNP自己抗体は、MCTDの診断マーカーとして利用可能であることは知られている。しかしながら、抗U1RNP自己抗体が、MCTDの発症に関与しているか否かについては、全く知られていない。 Further, as disclosed in Non-Patent Document 1, it is known that anti-U1RNP autoantibodies can be used as diagnostic markers for MCTD. However, it is not known at all whether anti-U1RNP autoantibodies are involved in the onset of MCTD.
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントと、自己免疫疾患の発症との関係を明らかにすることにより、新たな自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and the object thereof is to clarify a relationship between the 269th glycine insertion type splicing variant of Ang-1 and the onset of autoimmune disease. An object is to provide a method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal, and a method for diagnosing an autoimmune disease.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、抗U1RNP自己抗体のようなU1RNPの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質が、遺伝子のスプライシング異常を引き起こすことにより、自己免疫疾患の病態が形成されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that a substance that inhibits the gene splicing control function of U1RNP, such as an anti-U1RNP autoantibody, causes abnormal gene splicing, thereby forming a disease state of an autoimmune disease. The present invention has been found uniquely and the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following industrially useful inventions.
(1)U1RNPの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入することにより自己免疫疾患を発症させることを特徴とする自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。 (1) A method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal, which causes an autoimmune disease to develop by introducing a substance that inhibits the gene splicing function of U1RNP into cultured cells or experimental animals.
(2)上記U1RNPの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質は、U1RNPを認識する自己抗体であることを特徴とする(1)に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。 (2) The method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal according to (1), wherein the substance that inhibits the gene splicing function of U1RNP is an autoantibody that recognizes U1RNP.
(3)上記自己抗体は、抗U1RNP自己抗体又は抗Sm抗体であることを特徴とする(1)又は(2)に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。 (3) The method for producing an autoimmune disease model cell or autoimmune disease model animal according to (1) or (2), wherein the autoantibody is an anti-U1RNP autoantibody or anti-Sm antibody.
(4)上記自己免疫疾患は、肺高血圧症併発混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、肺高血圧症、又は関節リウマチであることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。 (4) The autoimmune disease is pulmonary hypertension concurrent mixed connective tissue disease, systemic lupus erythematosus, pulmonary hypertension, or rheumatoid arthritis, according to any one of (1) to (3) A method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal.
(5)U1RNPによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、遺伝子スプライシングの異常が起こっているか否かを検出することを特徴とする自己免疫疾患の診断方法。 (5) A method for diagnosing an autoimmune disease, comprising detecting whether gene splicing abnormality has occurred in a gene whose splicing is controlled by U1RNP.
本発明にかかる自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法では、以上のように、U1RNPの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入する。それゆえ、該培養細胞及び実験動物に自己免疫疾患の病態を形成させることができるという効果を奏する。 In the method for producing an autoimmune disease model cell or autoimmune disease model animal according to the present invention, a substance that inhibits the gene splicing function of U1RNP is introduced into cultured cells or experimental animals as described above. Therefore, there is an effect that the cultured cells and experimental animals can be caused to form a pathology of an autoimmune disease.
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。 An embodiment of the present invention will be described as follows, but the present invention is not limited to this.
<I.自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法>
本発明にかかる自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法(以下、単に「モデル動物作製方法」ともいう)は、U1RNPの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質(以下、「U1RNP阻害物質」ともいう)を、培養細胞又は実験動物に導入する工程(以下、「U1RNP阻害物質導入工程」ともいう)を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
<I. Method for producing autoimmune disease model cell or autoimmune disease model animal>
The method for producing an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal according to the present invention (hereinafter also simply referred to as “model animal production method”) comprises a substance that inhibits the gene splicing control function of U1RNP (hereinafter referred to as “U1RNP inhibitor substance”). As long as it includes a step (hereinafter also referred to as “U1RNP inhibitor introduction step”) for introducing the cells into cultured cells or experimental animals, and other specific configurations are not particularly limited.
上記U1RNP阻害物質導入工程を含む構成によれば、U1RNPによりスプライシングが制御される遺伝子に対して、遺伝子スプライシング異常を誘発させることができる。その結果、上記培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患の病態を形成させることができる。 According to the configuration including the U1RNP inhibitor introduction step, a gene splicing abnormality can be induced for a gene whose splicing is controlled by U1RNP. As a result, pathological conditions of autoimmune diseases can be formed in the cultured cells or experimental animals.
つまり、本発明にかかるモデル動物の作製方法は、U1RNP阻害物質を用いて、培養細胞又は実験動物における遺伝子スプライシング異常を誘発させて、該培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患を発症させるものである。 That is, the method for producing a model animal according to the present invention induces gene splicing abnormalities in cultured cells or experimental animals using U1RNP inhibitors, thereby causing autoimmune diseases in the cultured cells or experimental animals. .
本発明にかかるモデル動物作製方法により作製されたモデル細胞又はモデル動物は、自己免疫疾患の病態が形成されている。そのため、該モデル細胞又はモデル動物を用いることにより、自己免疫疾患の診断方法や治療方法、並びに診断キットや治療薬剤の開発に用いることができる。 The model cell or model animal produced by the model animal production method according to the present invention has a pathological condition of an autoimmune disease. Therefore, by using the model cell or model animal, it can be used for the development of diagnostic methods and therapeutic methods for autoimmune diseases, diagnostic kits and therapeutic drugs.
本発明にかかるモデル動物作製方法によって発症させることが可能な自己免疫疾患は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、肺高血圧症併発混合性結合組織病(以下、「MCTD」ともいう)、全身性エリテマトーデス、肺高血圧症、及び関節リウマチ(以下、「RA」ともいう)等を挙げることができる。 The autoimmune disease that can be caused by the model animal production method according to the present invention is not particularly limited. Specifically, for example, pulmonary hypertension concurrent mixed connective tissue disease (hereinafter also referred to as “MCTD”), systemic lupus erythematosus, pulmonary hypertension, and rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as “RA”), etc. Can do.
上記U1RNP阻害物質は、特に限定されるものではないが、U1RNPに結合して、U1RNPの遺伝子スプライシング制御機能を阻害するものであることが好ましく、U1RNPと相乗的に標的遺伝子に結合するもの、より詳しくはU1RNPと相乗的に標的遺伝子に結合するものであることがより好ましい。このようなU1RNP阻害物質としては、具体的には、例えば、U1RNPを認識する自己抗体を挙げることができる。また、該自己抗体としては、例えば、抗U1RNP自己抗体、抗Sm抗体等を挙げることができる。 The U1RNP inhibitor is not particularly limited, but is preferably one that binds to U1RNP and inhibits the gene splicing control function of U1RNP, and binds to the target gene synergistically with U1RNP, Specifically, it is more preferable that the target gene is synergistically bound to U1RNP. Specific examples of such U1RNP inhibitors include autoantibodies that recognize U1RNP. Examples of the autoantibodies include anti-U1RNP autoantibodies and anti-Sm antibodies.
なお、本明細書において、「遺伝子スプライシング制御機能」とは、RNAがスプライシングされる際、そのスプライシングを制御する機能を指す。 In the present specification, “gene splicing control function” refers to a function of controlling splicing when RNA is spliced.
上記U1RNP阻害物質を投与する対象となる培養細胞及び実験動物は特に限定されるものではない。該実験動物は、非ヒト動物であることが好ましい。非ヒト動物としては、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。これらの中で、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類が好ましく、マウス又はラットがより好ましい。上記培養細胞としては、上記例示した実験動物由来の培養細胞、及びヒト由来の培養細胞を挙げることができる。 The cultured cells and experimental animals to be administered with the U1RNP inhibitor are not particularly limited. The experimental animal is preferably a non-human animal. The non-human animal is preferably a vertebrate, and more preferably a mammal. Examples of mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs, cats and the like. Among these, rodents such as mice, rats and guinea pigs are preferable, and mice or rats are more preferable. Examples of the cultured cells include cultured cells derived from the experimental animals exemplified above and cultured cells derived from humans.
上記U1RNP阻害物質によって、スプライシング異常が誘発される遺伝子は特に限定されるものではなく、U1RNPによってスプライシングが制御されている遺伝子であればよい。このような遺伝子としては、以下に示すU1RNP結合コンセンサスRNA配列を有する遺伝子を挙げることができる。
U1RNP結合コンセンサスRNA配列:5’-AGGUAAGU-3'
上記遺伝子として、より具体的には、例えば、血管新生因子アンギオポイエチン1(以下、「Ang−1」ともいう)遺伝子等を挙げることができる。
The gene in which splicing abnormality is induced by the U1RNP inhibitor is not particularly limited as long as it is a gene whose splicing is controlled by U1RNP. Examples of such a gene include a gene having a U1RNP binding consensus RNA sequence shown below.
U1RNP binding consensus RNA sequence: 5'-AGGUAAGU-3 '
More specifically, examples of the gene include an angiogenic factor angiopoietin 1 (hereinafter also referred to as “Ang-1”) gene.
Ang−1遺伝子のゲノム配列は、例えば、NCBIアクセション番号NM_001146に登録されている。Ang−1のmRNA(cDNA)には、少なくとも2つのスプライシングバリアントが存在する。 The genome sequence of the Ang-1 gene is registered under NCBI accession number NM_001146, for example. There are at least two splicing variants in Ang-1 mRNA (cDNA).
具体的には、NCBIアクセション番号U83508に登録されている塩基配列の第310番目〜第1806番目までをオープンリーディングフレーム(以下、「ORF」ともいう)とするスプライシングバリアントと、NCBIアクセション番号AB084454に登録されている塩基配列の第1番目〜第1494番目までをORFとするスプライシングバリアントである。 Specifically, a splicing variant having an open reading frame (hereinafter also referred to as “ORF”) from the 310th position to the 1806th position of the nucleotide sequence registered in NCBI accession number U83508, and NCBI accession number AB084454 Is a splicing variant in which the first to 1494th base sequences registered in the ORF are ORFs.
前者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、NCBIアクセション番号NP_001137及びAAB50557に登録されているアミノ酸配列からなる。 A protein that is a translation product of the former splicing variant consists of an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_001137 and AAB50557.
一方、後者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、NCBIアクセション番号BAB91325に登録されているアミノ酸配列からなる。 On the other hand, the protein which is the translation product of the latter splicing variant consists of the amino acid sequence registered in NCBI Accession No. BAB91325.
後者のスプライシングバリアントは、NCBIアクセション番号U83508に登録されている塩基配列における第1114番目〜第1116番目の塩基が欠損している点で、前者のスプライシングバリアントと異なる。 The latter splicing variant differs from the former splicing variant in that the 1114th to 1116th bases in the base sequence registered in NCBI Accession No. U83508 are missing.
翻訳産物であるタンパク質における違いで言えば、後者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、NCBIアクセション番号NP_001137及びAAB50557に登録されているアミノ酸配列の第269番目のグリシン残基が欠損している点で、前者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質と異なる。 Speaking of differences in the translation product protein, the translation product of the latter splicing variant is missing the 269th glycine residue of the amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_001137 and AAB50557. In this respect, it differs from the protein that is the translation product of the former splicing variant.
以下、番号U83508に登録されている塩基配列の第310番目〜第1806番目までをORFとするスプライシングバリアント及びその翻訳産物を、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントともいう。 Hereinafter, the splicing variant whose ORF is the 310th to 1806th base sequence registered in the number U83508 and its translation product are also referred to as Ang-1 269th glycine insertion type splicing variant.
一方、NCBIアクセション番号AB084454に登録されている塩基配列の第1番目〜第1494番目までをORFとするスプライシングバリアント及びその翻訳産物を、Ang−1の269番目グリシン欠損型スプライシングバリアントともいう。 On the other hand, the splicing variant whose ORF is the first to 1494th base sequence registered in NCBI Accession No. AB0844454 and its translation product are also referred to as Ang-1 269th glycine-deficient splicing variant.
後述の実施例に記載するように、MCTDや、RAのような自己免疫疾患に罹患している患者では、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントを有する頻度が、健常者と比較して有意に多い。 As described in the examples below, in patients suffering from autoimmune diseases such as MCTD and RA, the frequency of having the 269th glycine insertion-type splicing variant of Ang-1 is higher than that of healthy subjects. Significantly more.
すなわち、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントは、自己免疫疾患の発症要因と1つである。 That is, Ang-1 269th glycine insertion type splicing variant is one of the onset factors of autoimmune disease.
後述の実施例に記載するように、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントは、U1RNPがもつ遺伝子スプライシングの制御機能が阻害されることにより、発生頻度が高くなる。 As described in Examples below, the occurrence frequency of Ang-1 269th glycine insertion type splicing variant is increased by inhibiting the gene splicing control function of U1RNP.
以上、上記U1RNP阻害物質によって、スプライシング異常が誘発される遺伝子の一実施形態について説明した。本発明はこれに限定されるものではない。すなわち、U1RNPによって遺伝子スプライシングが制御されており、U1RNPを阻害することにより、複数のスプライシングバリアントを生じうる遺伝子であればよい。 Hereinabove, one embodiment of the gene in which splicing abnormality is induced by the U1RNP inhibitor has been described. The present invention is not limited to this. That is, any gene may be used as long as gene splicing is controlled by U1RNP and a plurality of splicing variants can be generated by inhibiting U1RNP.
なお、本明細書において、「塩基配列」とは、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドの配列として示される。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、DNA分子又はポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてRNA分子又はポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチドの対応する配列(ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)によって置き換えられる)を意図する。 In the present specification, “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides. Also, a polynucleotide or polynucleotide “base sequence” is intended to be a sequence of deoxyribonucleotides relative to a DNA molecule or polynucleotide, and a corresponding sequence of ribonucleotides relative to an RNA molecule or polynucleotide (wherein Each thymidine deoxynucleotide (T) in the specified deoxynucleotide sequence is intended to be replaced by the ribonucleotide uridine (U)).
本発明において、上記U1RNP阻害物質を、培養細胞又は実験動物に導入する方法は特に限定されるものではなく、導入するU1RNP阻害物質に応じて、適切な方法を選択すればよい。例えば、上記U1RNP阻害物質である抗体を培養細胞に導入する場合、従来公知の細胞内抗体導入試薬を用いて、培養細胞内に上記U1RNP阻害物質を導入することができる。 In the present invention, the method for introducing the U1RNP inhibitor into cultured cells or experimental animals is not particularly limited, and an appropriate method may be selected according to the U1RNP inhibitor to be introduced. For example, when the antibody that is the U1RNP inhibitor is introduced into cultured cells, the U1RNP inhibitor can be introduced into the cultured cells using a conventionally known intracellular antibody introduction reagent.
上記細胞内抗体導入試薬としては、例えば、細胞内抗体導入試薬PULSin(Polyplus transfection社)を挙げることができる。 Examples of the intracellular antibody introduction reagent include intracellular antibody introduction reagent PULSin (Polyplus transfection).
また、別の実施形態として、上記U1RNP阻害物質を実験動物に導入する場合、例えば、経口、直腸、静脈内、非経口、筋肉内及び皮下経路等で、U1RNP阻害物質を実験動物に投与することにより、該U1RNP阻害物質を該実験動物に導入することができる。 In another embodiment, when the U1RNP inhibitor is introduced into an experimental animal, the U1RNP inhibitor is administered to the experimental animal by, for example, oral, rectal, intravenous, parenteral, intramuscular, and subcutaneous routes. Thus, the U1RNP inhibitor can be introduced into the experimental animal.
本発明には、本発明にかかるモデル動物作製方法を実施するために利用可能な自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製キット(以下、単に「モデル動物作製キット」ともいう)が含まれる。 The present invention includes an autoimmune disease model cell or an autoimmune disease model animal preparation kit (hereinafter also simply referred to as “model animal preparation kit”) that can be used for carrying out the model animal preparation method according to the present invention. It is.
本発明にかかるモデル動物作製キットは、その具体的な構成は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、上記U1RNP阻害物質を含むキットが挙げられる。また、上記U1RNP阻害物質を培養細胞又は実験動物に導入するための試薬や器具を含んでいてもよい。 Although the specific configuration of the model animal production kit according to the present invention is not particularly limited, specific examples include a kit containing the U1RNP inhibitor. Moreover, the reagent and instrument for introduce | transducing the said U1RNP inhibitory substance into a cultured cell or an experimental animal may be included.
このようなモデル動物作製キットによれば、自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫モデル動物を効率よく作製することができる。 According to such a model animal production kit, an autoimmune disease model cell or an autoimmune model animal can be efficiently produced.
<II.自己免疫疾患の診断方法>
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法は、U1RNPによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、遺伝子スプライシングの異常が起こっているか否かを検出する工程(以下、「遺伝子スプライシング異常検出工程」ともいう)を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。なお、上記U1RNPによりスプライシングが制御される遺伝子については、上説したので、ここでは、詳細な説明を省略する。
<II. Diagnosis method of autoimmune disease>
The method for diagnosing an autoimmune disease according to the present invention comprises a step of detecting whether or not gene splicing abnormality has occurred in a gene whose splicing is controlled by U1RNP (hereinafter also referred to as “gene splicing abnormality detection step”). Other specific configurations are not particularly limited as long as they are included. Since the genes whose splicing is controlled by U1RNP have been described above, detailed description thereof is omitted here.
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法によれば、被験者から分離したサンプルを用いて、特定の遺伝子におけるスプライシングの異常を検出するだけで、簡便に自己免疫疾患を発症しているか否かを診断することができる。つまり、本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法は、換言すれば、被験者から分離したサンプルを用いて、自己免疫疾患を診断するためのデータを取得する方法ということもできる。 According to the method for diagnosing an autoimmune disease according to the present invention, it is possible to simply diagnose whether or not an autoimmune disease has developed by simply detecting splicing abnormality in a specific gene using a sample isolated from a subject. can do. In other words, the method for diagnosing an autoimmune disease according to the present invention can also be said to be a method for acquiring data for diagnosing an autoimmune disease using a sample separated from a subject.
上記遺伝子スプライシング異常検出工程は、より具体的には、U1RNPによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、自己免疫疾患の発症要因となる遺伝子スプライシング異常が起こっているか否かを検出する工程である。 More specifically, the gene splicing abnormality detection step is a step of detecting whether or not a gene splicing abnormality that causes an autoimmune disease has occurred for a gene whose splicing is controlled by U1RNP.
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ang−1遺伝子を用いる場合、上記遺伝子スプライシング異常検出工程では、被験者において、上説したAng−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが生じているか否かを検出することが好ましい。 For example, when the Ang-1 gene is used as a target gene for detecting splicing abnormality, whether the above-mentioned Ang-1 269th glycine insertion-type splicing variant occurs in the subject in the gene splicing abnormality detection step. It is preferable to detect whether or not.
上記遺伝子スプライシング異常検出工程において、上記遺伝子におけるスプライシング異常を検出する方法は特に限定されるものではない。 In the gene splicing abnormality detection step, the method for detecting the splicing abnormality in the gene is not particularly limited.
具体的には、例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のmRNA(もしくはcDNA)の塩基配列又はその部分配列を解読することにより、該遺伝子におけるスプライシング異常を検出することができる。 Specifically, for example, the splicing abnormality in the gene can be detected by decoding the base sequence of the mRNA (or cDNA) of the gene to be detected for detecting the splicing abnormality or its partial sequence.
より具体的に説明すると、例えば、まず、被験者の細胞より抽出したmRNAから逆転写反応によってcDNAを作製する。次に、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のcDNA又はその部分領域を、PCR等の従来公知の核酸増幅方法を用いて、増幅させる。その後、得られた核酸増幅産物をダイレクトシークエンスすることによって、又は、サブクローニングしたのち、当該PCR産物部分をシークエンスすることによって、当該遺伝子の特定領域の塩基配列を決定する。 More specifically, for example, first, cDNA is prepared by reverse transcription from mRNA extracted from a subject's cells. Next, the cDNA of the gene to be detected for splicing abnormality or a partial region thereof is amplified using a conventionally known nucleic acid amplification method such as PCR. Thereafter, the base sequence of the specific region of the gene is determined by direct sequencing of the obtained nucleic acid amplification product or by subcloning and then sequencing the PCR product portion.
これにより、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。 Thereby, it is possible to know the presence or absence of splicing abnormality in the gene to be detected for splicing abnormality.
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ang−1遺伝子を用いる場合、NCBIアクセション番号NP_001137又はAAB50557に登録されているアミノ酸配列の第269番目のアミノ酸残基であるグリシン残基をコードする3塩基の有無から、Ang−1遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。 For example, when the Ang-1 gene is used as a target gene for detecting splicing abnormality, the glycine residue which is the 269th amino acid residue of the amino acid sequence registered in NCBI accession number NP_001137 or AAB50557 is encoded. The presence or absence of splicing abnormality in the Ang-1 gene can be determined from the presence or absence of 3 bases.
この場合、上記グリシン残基をコードする3塩基が存在すれば、Ang−1遺伝子においてスプライシング異常が起こっていると判定することができる。一方、上記グリシン残基をコードする3塩基が存在しなければ、Ang−1遺伝子においてスプライシング異常が起こっていないと判定することができる。 In this case, if there are three bases encoding the glycine residue, it can be determined that splicing abnormality has occurred in the Ang-1 gene. On the other hand, if there are no 3 bases encoding the glycine residue, it can be determined that no splicing abnormality has occurred in the Ang-1 gene.
また、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の特定領域(好ましくは、スプライシング異常により塩基配列に変化が生じる領域)における塩基配列の相違を、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって検出することができる。 In addition, a difference in base sequence in a specific region of a gene to be detected for splicing abnormality (preferably, a region where the base sequence changes due to splicing abnormality) can be detected by using an oligonucleotide probe.
このような方法によれば、例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ang−1遺伝子を用いる場合、NCBIアクセション番号NP_001137又はAAB50557に登録されているアミン酸配列の第269番目のアミノ酸残基であるグリシン残基をコードする3塩基の有無を知ることができる。 According to such a method, for example, when the Ang-1 gene is used as a target gene for detecting splicing abnormality, the 269th amino acid of the amino acid sequence registered in NCBI accession number NP_001137 or AAB50557 The presence or absence of 3 bases encoding the residue glycine residue can be known.
このようにプローブに用いる方法としては、例えば、Ang−1遺伝子の特定領域の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してDNAチップを構成し、当該DNAチップを遺伝子型解析用に用いる実施形態が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、スプライシング異常により塩基配列に変化が生じる領域を含む7〜50ヌクレオチドであることが好ましく、10〜30ヌクレオチドであることがより好ましく、15〜25ヌクレオチドであることがさらに好ましい。 As a method for using the probe in this manner, for example, an oligonucleotide consisting of a base sequence of a specific region of the Ang-1 gene is immobilized on a chip to form a DNA chip, and the DNA chip is used for genotype analysis. A form is mentioned. In this case, the length of the oligonucleotide probe is preferably 7 to 50 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides, and more preferably 15 to 25 nucleotides including a region where the base sequence changes due to splicing abnormality. More preferably it is.
上記遺伝子スプライシング異常検出工程の別の実施形態として、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列又はその部分配列を解読することにより、該遺伝子におけるスプライシング異常を検出することができる。 As another embodiment of the gene splicing abnormality detection step, detecting a splicing abnormality in the gene by decoding the amino acid sequence of a protein which is a translation product of a gene to be detected for splicing abnormality or a partial sequence thereof Can do.
より具体的に説明すると、この実施形態では、例えば、まず、被験者の細胞や組織より、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を抽出する。その後、必要に応じて、該タンパク質を精製し、一般的なタンパク質のシークエンス方法に準じ、該タンパク質のアミノ酸配列を決定する。 More specifically, in this embodiment, for example, first, a protein that is a translation product of a gene to be detected for splicing abnormality is extracted from a cell or tissue of a subject. Thereafter, the protein is purified as necessary, and the amino acid sequence of the protein is determined according to a general protein sequencing method.
こうして決定したアミノ酸配列をもとに、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子におけるスプライシング異常の有無を検出することができる。 Based on the amino acid sequence determined in this manner, it is possible to detect the presence or absence of splicing abnormality in a gene to be detected as a splicing abnormality.
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ang−1遺伝子を用いる場合、NCBIアクセション番号NP_001137又はAAB50557に登録されているアミン酸配列の第269番目のアミノ酸残基であるグリシン残基の有無から、Ang−1遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。 For example, when the Ang-1 gene is used as a target gene for detecting splicing abnormality, the glycine residue which is the 269th amino acid residue of the amino acid sequence registered in NCBI accession number NP_001137 or AAB50557 The presence or absence of splicing abnormality in the Ang-1 gene can be known from the presence or absence.
この場合、上記グリシン残基が存在すれば、Ang−1遺伝子においてスプライシング異常が起こっていると判定することができる。一方、上記グリシン残基が存在しなければ、Ang−1遺伝子においてスプライシング異常が起こっていないと判定することができる。 In this case, if the glycine residue is present, it can be determined that splicing abnormality has occurred in the Ang-1 gene. On the other hand, if the glycine residue does not exist, it can be determined that no splicing abnormality has occurred in the Ang-1 gene.
また、別の方法として、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の各スプライシングバリアントを特異的に認識する抗体を作製し、ELISA法やウェスタンブロット法などの免疫化学的手法を用いて、スプライシング異常を検出することもできる。 As another method, an antibody that specifically recognizes each splicing variant of a protein that is a translation product of a gene to be detected for splicing abnormality is prepared, and an immunochemical method such as ELISA or Western blotting is used. It can also be used to detect splicing abnormalities.
さらに、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を単離し、直接又は必要に応じ、酵素等で切断し、アミノ酸の等電点を指標にしてスプライシング異常を検出したり、質量分析により測定される質量の差からスプライシング異常を検出したりすることもできる。 Furthermore, a protein that is a translation product of a gene to be detected for splicing abnormality is isolated, cleaved directly or as necessary with an enzyme or the like, and splicing abnormality is detected using the isoelectric point of the amino acid as an index, Splicing abnormalities can also be detected from the difference in mass measured by analysis.
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法では、上説したスプライシング異常の検出方法を単独で行ってもよいし、複数の方法を行ってもよい。 In the method for diagnosing an autoimmune disease according to the present invention, the splicing abnormality detection method described above may be performed alone or a plurality of methods may be performed.
本発明には、本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法を実施するために利用可能な自己免疫疾患の診断キットも含まれる。 The present invention also includes an autoimmune disease diagnostic kit that can be used to carry out the autoimmune disease diagnostic method of the present invention.
本発明にかかる自己免疫疾患の診断キットの構成は特に限定されるものではなく、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子又はその翻訳産物であるタンパク質において、特定の塩基又はアミノ酸の有無を検出できる試薬を少なくとも含んでいればよい。 The configuration of the diagnostic kit for autoimmune disease according to the present invention is not particularly limited, and a reagent capable of detecting the presence or absence of a specific base or amino acid in a gene that is a target for detecting splicing abnormality or a protein that is a translation product thereof As long as it contains at least.
そのような試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、及び抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数が組み合わされて含まれていてもよい。さらに、本発明にかかる自己免疫疾患の診断キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。 Examples of such a reagent include a primer, a probe, and an antibody. These reagents may be included singly or in combination of two or more. Furthermore, the diagnostic kit for autoimmune diseases according to the present invention can be obtained by combining other reagents in addition to the reagents exemplified above.
具体的には、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のmRNA(cDNA)を用いて、スプライシング異常を検出するキットとしては、当該遺伝子もしくはその一部の特定領域、好ましくはスプライシング異常により塩基配列が変化する領域を増幅できるように設計されたプライマーや、特定のスプライシングバリアントに特異的にハイブリダイズするプローブを含み、さらに、制限酵素、マクサムギルバート法及びサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬などを1つ以上組み合わせたキットが挙げられる。 Specifically, as a kit for detecting splicing abnormality using mRNA (cDNA) of a gene to be detected for splicing abnormality, the nucleotide sequence of the gene or a part thereof, preferably due to splicing abnormality, is used. Includes primers designed to amplify variable regions and probes that specifically hybridize to specific splicing variants, and can be used for sequencing, such as restriction enzymes, Maxam Gilbert and Sanger methods A kit in which one or more reagents are combined can be used.
なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、dATP、dUTP、dTTP、dGTP、DNA合成酵素、RNA合成酵素、プローブなど標識するために使用する試薬(例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物及び酵素基質及び発色団)等を挙げることができる。さらに、適当な緩衝液及び洗浄液等が含まれていてもよい。 Such a reagent is appropriately selected and employed depending on the detection method employed. For example, reagents used for labeling such as dATP, dUTP, dTTP, dGTP, DNA synthase, RNA synthase, and probes (for example, In the case where the label is biotin, an avidin enzyme conjugate, enzyme substrate and chromophore) can be used. Furthermore, an appropriate buffer solution and washing solution may be contained.
また、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を用いて該遺伝子のスプライシング異常を検出するキットとしては、例えば、特定のスプライシングバリアントを特異的に認識する抗体を含み、さらに、当該抗体を用いて、スプライシング異常により変化するアミノ酸残基の有無を検出するために用いる試薬や器具などを1つ以上組み合わせたキットが挙げられる。 Further, as a kit for detecting a splicing abnormality of a gene using a protein that is a translation product of a gene to be detected as a splicing abnormality, for example, an antibody that specifically recognizes a specific splicing variant, Examples of the kit include a combination of one or more reagents and instruments used for detecting the presence or absence of an amino acid residue that changes due to splicing abnormality using the antibody.
かかる試薬としては、例えば、抗体を標識するために使用する試薬(例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物及び酵素基質及び発色団)、上記抗体を1次抗体として用いる場合、それに対応する2次抗体、ブロッキング試薬等を挙げることができる。また、かかる器具としては、例えば、タイタープレート等を挙げることができる。さらに、適当な緩衝液や洗浄液などが含まれていてもよい。 Examples of such a reagent include a reagent used for labeling an antibody (for example, when the label is biotin, an avidin enzyme conjugate and an enzyme substrate and a chromophore), and when the above antibody is used as a primary antibody, Corresponding secondary antibodies, blocking reagents and the like can be mentioned. Moreover, as such a tool, a titer plate etc. can be mentioned, for example. Furthermore, an appropriate buffer solution or washing solution may be contained.
このようなキットによれば、簡便に自己免疫疾患を診断するためのデータを取得することができる。医療従事者は、本発明にかかるキットを用いて得られたデータに基づいて、被験者が自己免疫疾患を発症していることを診断することができる。 According to such a kit, data for diagnosing an autoimmune disease can be easily obtained. The medical staff can diagnose that the subject develops an autoimmune disease based on the data obtained using the kit according to the present invention.
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the configurations described above, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the technical means disclosed in different embodiments are appropriately combined. The obtained embodiment is also included in the technical scope of the present invention.
本発明について、実施例、並びに図1〜図3に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、及び改変を行うことができる。 Although this invention is demonstrated more concretely based on an Example and FIGS. 1-3, this invention is not limited to this. Those skilled in the art can make various changes, modifications, and alterations without departing from the scope of the present invention.
〔実施例1:Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度解析〕
MCTD患者及びRA患者において認められるAng−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度を解析した。
[Example 1: Frequency analysis of the 269th glycine insertion type splicing variant of Ang-1]
The frequency of Ang-1 269th glycine insertion splicing variant observed in MCTD patients and RA patients was analyzed.
具体的には、MCTDもしくはRA患者末梢血から常法によりトータルRNAを抽出、逆転写反応を行いoligo dTプライマーによる1st strand cDNAを合成した。これを鋳型に用い、Ang−1エクソン4−5にかけて設定した下記のプライマー及び下記条件による2段階RT−PCRによりAng−1のcDNAの一部分を単離した。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示す通りである。
センスプライマーF1:5'-CCACCACAACAGTGTCCTT-3'(配列番号1)
センスプライマーF2:5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3'(配列番号2)
アンチセンスプライマーR1:5'-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3'(配列番号3)。
Specifically, total RNA was extracted from peripheral blood of MCTD or RA patients by a conventional method, reverse transcription reaction was performed, and 1st strand cDNA using oligo dT primer was synthesized. Using this as a template, a part of the Ang-1 cDNA was isolated by two-step RT-PCR under the following primers and conditions set for Ang-1 exon 4-5. In addition, the primer used for said reaction is as showing below.
Sense primer F1: 5'-CCACCACAACAGTGTCCTT-3 '(SEQ ID NO: 1)
Sense primer F2: 5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Antisense primer R1: 5′-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 3).
また、2段階RT−PCRの条件は、以下の通りである。まず、第1段階目のRT−PCRにおける反応液は、500μg/ml鋳型cDNA 1μl、Buffer II(ABI社)5μl、25mM MgCl2(ABI社)3μl、2mM dNTP(ABI社)5μl、10pmol/μlプライマー(センスプライマーF1及びアンチセンスプライマーR1)1μl、AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (ABI社)0.5μl、及び滅菌水33.5μlを混合して調製した。 The conditions for the two-step RT-PCR are as follows. First, the reaction solution in RT-PCR in the first step was 500 μg / ml template cDNA 1 μl, Buffer II (ABI) 5 μl, 25 mM MgCl 2 (ABI) 3 μl, 2 mM dNTP (ABI) 5 μl, 10 pmol / μl. It was prepared by mixing 1 μl of primers (sense primer F1 and antisense primer R1), 0.5 μl of AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (ABI), and 33.5 μl of sterilized water.
第1段階目のRT−PCRの反応条件は、95℃で12分の行程を1サイクル行った後、94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で1分の行程を30サイクル行う反応条件とした。 The reaction conditions for the first stage RT-PCR are as follows: one cycle of 12 minutes at 95 ° C followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute. Reaction conditions were set.
第2段階目のRT−PCRは、鋳型として第1段階目のRT−PCRで得られた産物を用い、プライマーとしてセンスプライマーF2及びアンチセンスプライマーR1を用いたことを除いて、反応液組成及び反応条件とも、第1段階目のRT−PCRと同一の条件で行った。 The second stage RT-PCR uses the product obtained in the first stage RT-PCR as a template and uses the sense primer F2 and the antisense primer R1 as primers. The reaction conditions were the same as in the first stage RT-PCR.
得られた断片はABI377型シークエンサー(アプライドバイオシステムズ社)により鎖長解析を行い、269番目グリシン(GGT3塩基)挿入の有無を判定した。 The obtained fragment was subjected to chain length analysis using an ABI377 type sequencer (Applied Biosystems) to determine whether or not the 269th glycine (GGT3 base) was inserted.
その結果、表1に示すように、χ二乗検定の結果、RA患者群及びMCTD患者群では、健常者(表1中、controlと記載)と比較して、269番目グリシン挿入型Ang−1の頻度が有意に高いことが明らかとなった。 As a result, as shown in Table 1, as a result of the chi-square test, in the RA patient group and the MCTD patient group, the 269th glycine insertion type Ang-1 was compared with the healthy subject (described as control in Table 1). The frequency was found to be significantly higher.
なお、図1には、Ang−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの典型例を示す。 In addition, in FIG. 1, the typical example of the 269th glycine insertion type splicing variant of Ang-1 is shown.
〔実施例2:U1RNPタンパク質とAng−1 RNAとの共益的な相互作用の解析〕
実施例1で、RA患者群及びMCTD患者群においてAng−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度が顕著に高いことが明らかとなったため、MCTDの診断マーカーであり、スプライシング調節因子であるU1RNPと結合する抗U1RNP自己抗体と、Ang−1 mRNAとの相互作用を調べた。
[Example 2: Analysis of mutual beneficial interaction between U1RNP protein and Ang-1 RNA]
In Example 1, it became clear that the frequency of Ang-1 269th glycine insertion type splicing variant was remarkably high in RA patient group and MCTD patient group. Therefore, U1RNP is a diagnostic marker for MCTD and a splicing regulator. The interaction between the anti-U1RNP autoantibody that binds to Ang-1 and Ang-1 mRNA was examined.
具体的には、Ang−1のエクソン4からイントロン4の正常配列を有する部分短鎖RNAを、Hex蛍光標識を加えて人工合成した。なお、人工合成したRNAの配列は以下の通りである。
合成RNA:5’-UCCACAACCUUGUCAAUCUUUGCACUAAAGAAGGUGGUAA-3’(配列番号4)。
Specifically, partial short-chain RNA having the normal sequence of intron 4 from exon 4 of Ang-1 was artificially synthesized by adding a Hex fluorescent label. The sequence of artificially synthesized RNA is as follows.
Synthetic RNA: 5′-UCCACAACCUUGUCAAUCUUUGCACUAAAGAAGGUGGUAA-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
上記合成RNAを用いて、Ang−1RNA、U1RNPタンパク質及びIgGの結合反応を37℃で、2時間行った。なお、IgGは、MCTD患者及び健常者末梢血からIgG purification kit-G(同仁堂)を用いて抽出した。また、反応液の組成は、上記合成RNA(配列番号4)を100pmol、リコンビナントU1RNPタンパク質(SCIPAC社)0.15μg、抽出IgG 0.1μg、TEBuffer トータル100μlとした。 Using the synthetic RNA, a binding reaction of Ang-1 RNA, U1RNP protein and IgG was performed at 37 ° C. for 2 hours. IgG was extracted from peripheral blood of MCTD patients and healthy individuals using IgG purification kit-G (Dojindo). The composition of the reaction solution was 100 pmol of the above synthetic RNA (SEQ ID NO: 4), 0.15 μg of recombinant U1RNP protein (SCIPAC), 0.1 μg of extracted IgG, and 100 μl of total TEBuffer.
結合反応後、Microcon YM-100(ミリポア社)により限外濾過を行い、タンパク及び抗体結合RNAを除去した。タンパク質/抗体未結合RNAをABI3130型シークエンサー(アプライドバイオシステムズ社)により鎖長解析を行い蛍光量から半定量解析を行った。 After the binding reaction, ultrafiltration was performed with Microcon YM-100 (Millipore) to remove protein and antibody-bound RNA. The protein / antibody unbound RNA was subjected to chain length analysis using an ABI3130 sequencer (Applied Biosystems), and semiquantitative analysis was performed from the amount of fluorescence.
その結果を図2に示す。なお、図2は、U1RNP及びU1RNP抗体未結合Ang−1RNA量は投入した全RNAの蛍光量に対する比率で示した図である。U1RNPタンパク質にU1RNP抗体価の高い(500以上)患者由来IgG(MCTD High)を加えた場合、抗体価の低い(74.7)患者(MCTD Low)及び健常者2名のIgGを加えた場合と比較して、タンパク質/抗体未結合RNAが減少した。このことから、U1RNPタンパク質とU1RNP抗体とが相乗的にAng−1RNAに結合することが明らかになった。 The result is shown in FIG. FIG. 2 is a graph showing the amount of U1RNP and U1RNP antibody unbound Ang-1 RNA as a ratio to the fluorescence amount of the total RNA input. When a patient-derived IgG (MCTD High) with a high U1RNP antibody titer (500 or more) is added to the U1RNP protein, a patient with a low antibody titer (74.7) (MCTD Low) and two healthy subjects are added with IgG In comparison, protein / antibody unbound RNA was reduced. This revealed that U1RNP protein and U1RNP antibody synergistically bind to Ang-1 RNA.
〔実施例3:抗U1RNP自己抗体の導入によるAng−1スプライシングのかく乱〕
実施例2で、U1RNPタンパク質とU1RNP抗体とが相乗的にAng−1RNAに結合することが明らかになったため、次に、抗U1RNP自己抗体を培養細胞内へ導入したときのAng−1発現パターンへの影響を調べた。
[Example 3: Disruption of Ang-1 splicing by introduction of anti-U1RNP autoantibodies]
Since it was revealed in Example 2 that the U1RNP protein and the U1RNP antibody synergistically bind to Ang-1 RNA, next, to the Ang-1 expression pattern when the anti-U1RNP autoantibody was introduced into cultured cells. The effect of was investigated.
具体的には、市販抗U1RNP抗体(American Research Products社)を細胞内抗体導入試薬PULSin(Polyplus transfection社)を用いてJurkat細胞に導入した。24時間培養後、常法によりトータルRNAを抽出した。次に、抽出したRNAを用いて逆転写反応を行い、Oligo dTプライマーによる1st stand cDNAを合成した。このcDNAを鋳型に用い、Ang−1エクソン4−5にかけて設定したプライマー及び下記条件による2段階RT−PCRによりAng−1のcDNAの一部分を単離した。 Specifically, a commercially available anti-U1RNP antibody (American Research Products) was introduced into Jurkat cells using the intracellular antibody introduction reagent PULSin (Polyplus transfection). After culturing for 24 hours, total RNA was extracted by a conventional method. Next, reverse transcription reaction was performed using the extracted RNA to synthesize 1st stand cDNA using Oligo dT primer. Using this cDNA as a template, a part of the Ang-1 cDNA was isolated by two-step RT-PCR under the following conditions with primers set for Ang-1 exon 4-5.
なお、上記の反応のプライマーとしては、実施例1で用いたセンスプライマーF1及びF2、並びにアンチセンスプライマーR1を用いた。 In addition, as the primer of said reaction, the sense primers F1 and F2 and the antisense primer R1 which were used in Example 1 were used.
また、2段階RT−PCRの条件は、以下の通りとした。まず、第1段階目のRT−PCRにおける反応液は、500μg/ml鋳型cDNA 10μl、Ex−Buffer(TAKARA社)5μl、2.5mM dNTP(TAKARA社)4μl、10pmol/μlプライマー(センスプライマーF1及びアンチセンスプライマーR1)1μlずつ(計2μl)、Ex−Taq(TAKARA社)0.5μl、及び滅菌水28.75μlを混合して調製した。 The conditions for the two-step RT-PCR were as follows. First, the reaction solution in RT-PCR at the first stage was 10 μl of 500 μg / ml template cDNA, 5 μl of Ex-Buffer (TAKARA), 4 μl of 2.5 mM dNTP (TAKARA), 10 pmol / μl primer (sense primer F1 and Antisense primer R1) was prepared by mixing 1 μl each (total 2 μl), Ex-Taq (TAKARA) 0.5 μl, and sterilized water 28.75 μl.
第1段階目のRT−PCRの反応条件は、94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で2分の行程を35サイクル行う反応条件とした。 The reaction conditions for the first stage RT-PCR were those for 35 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 48 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes.
第2段階目のRT−PCRは、鋳型として第1段階目のRT−PCRで得られた産物1μlを用い、プライマーとしてセンスプライマーF2及びアンチセンスプライマーR1を用い、さらに滅菌水の量を37.75μlとしたことを除いて、反応液組成及び反応条件とも、第1段階目のRT−PCRと同一の条件で行った。 In the second stage RT-PCR, 1 μl of the product obtained in the first stage RT-PCR is used as a template, the sense primer F2 and the antisense primer R1 are used as primers, and the amount of sterile water is 37. The reaction solution composition and reaction conditions were the same as in the first stage RT-PCR except that the volume was 75 μl.
得られた断片はABI3130型シークエンサーにより鎖長解析を行い、269グリシン挿入の有無を判定した。 The obtained fragment was subjected to chain length analysis with an ABI 3130 sequencer to determine the presence or absence of 269 glycine insertion.
その結果、図3に示すように、抗U1snRNP抗体を加えた場合、コントロール抗体を加えた場合と比較して、細胞内への抗体導入に関わらずAng−1の269番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが発現しやすいことが明らかになった。 As a result, as shown in FIG. 3, when the anti-U1 snRNP antibody was added, compared to the case where the control antibody was added, the Ang-1 269th glycine insertion-type splicing variant was observed regardless of antibody introduction into the cell. It became clear that it was easy to express.
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Note that the present invention is not limited to the configurations described above, and various modifications are possible within the scope of the claims, and technical means disclosed in different embodiments and examples respectively. Embodiments and examples obtained by appropriately combining them are also included in the technical scope of the present invention. In addition, all of the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
以上のように、本発明では、U1RNPの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入するため、該培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患を発症させることができる。したがって、本発明は、自己免疫疾患のモデル系の構築に用いることができるだけではなく、該モデル系を用いた自己免疫疾患の治療薬剤の製造開発、自己免疫疾患の診断法や診断キットの製造開発など、医療分野、医薬品分野に広く用いることができる。 As described above, in the present invention, since a substance that inhibits the gene splicing control function of U1RNP is introduced into cultured cells or experimental animals, autoimmune diseases can be caused in the cultured cells or experimental animals. Therefore, the present invention can be used not only for the construction of a model system for an autoimmune disease, but also for the development of a therapeutic agent for an autoimmune disease using the model system, and for the development of a diagnostic method and diagnostic kit for an autoimmune disease. It can be widely used in the medical field and the pharmaceutical field.
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JP2006230241A (en) * | 2005-02-23 | 2006-09-07 | Institute For Rheumatic Diseases Co Ltd | Diagnosis and treatment of pulmonary hypertension by using gene associated with onset of pulmonary hypertension |
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Patent Citations (2)
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