JP2009106268A - Method for introducing amino acid to target protein or target peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法に関する。さらには、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入するためのキットおよび、前記アミノ酸を導入する方法もしくは導入キットを用いて非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for introducing an amino acid into a target protein or target peptide. Furthermore, the present invention relates to a kit for introducing an amino acid into a target protein or peptide, and a method for producing a non-natural protein or non-natural peptide using the above-described method for introducing or introducing an amino acid.
タンパク質の機能解析などの目的のため、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変することが、遺伝子工学的な手法により、比較的古くから行われている。また、天然のアミノ酸のみならず、非天然のアミノ酸をタンパク質へ導入することも行われている。非天然アミノ酸導入により、タンパク質の構造・機能の解析のみならず、何らかの機能を人工的に付加した人工的なタンパク質の作製も可能になる。 For the purpose of protein function analysis and the like, it has been performed for a long time by genetic engineering techniques to arbitrarily recombine amino acid sequences of naturally occurring proteins to modify their structures. Furthermore, not only natural amino acids but also non-natural amino acids are introduced into proteins. By introducing non-natural amino acids, not only the analysis of protein structure and function but also the production of artificial protein with some function added artificially becomes possible.
機能性基をタンパク質表面に導入する場合、一般に用いられるのがタンパク質の特定残基への化学修飾である。また、近年タンパク質中のアミノ酸残基の置換が可能となったため、タンパク質合成系を拡張することで、アミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸をタンパク質中に導入することが可能となった。 When a functional group is introduced on the surface of a protein, chemical modification to a specific residue of the protein is generally used. Further, since substitution of amino acid residues in proteins has become possible in recent years, it has become possible to introduce desired unnatural amino acids having an amino skeleton into proteins by extending the protein synthesis system.
タンパク質合成系を用いずに、酵素的に非天然アミノ酸をtRNAに結合させる方法が開示されている（非特許文献１および２）。目的タンパク質と非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたtRNAとを、ロイシル／フェニルアラニルタンパク質転移酵素の存在下で混合すると、目的タンパク質のN末端だけに非天然アミノ酸が転移することが見出された。 A method for enzymatically binding a non-natural amino acid to tRNA without using a protein synthesis system has been disclosed (Non-patent Documents 1 and 2). It was found that when the target protein and tRNA aminoacylated with an unnatural amino acid were mixed in the presence of leucyl / phenylalanyl protein transferase, the unnatural amino acid was transferred only to the N-terminus of the target protein.
また、tRNAの3'末端に様々な非天然アミノ酸を結合させる酵素として、アミノアシルtRNA合成酵素変異体が作製されている（非特許文献３）。かかる酵素を用いて、翻訳系により非天然アミノ酸をタンパク質もしくはペプチドに導入する方法が開示されている（特許文献１）。
従来のアミノ酸導入方法では、導入するアミノ酸をtRNAの3'末端に予めアミノアシル化した分子（アミノアシルtRNA）を作製し、それを単離する必要があった。アミノアシルtRNAの作製には、導入するアミノ酸の誘導体化（多段階の有機合成反応）が必要であり、操作が非常に煩雑かつ専門知識が必要であった。得られるアミノアシルtRNAの量は極めて限定され、原料が希少であるため、導入するアミノ酸を付与させた目的タンパク質を大スケールで作製することが不可能であった。また、酵素的にタンパク質へアミノ酸を導入する場合には、反応時にtRNA分子が徐々に蓄積し、酵素反応を徐々に阻害することにもなりかねないという問題点があった。 In the conventional amino acid introduction method, it is necessary to prepare a molecule (aminoacyl tRNA) in which the amino acid to be introduced is aminoacylated in advance at the 3 ′ end of tRNA and to isolate it. Preparation of aminoacyl-tRNA required derivatization of the amino acid to be introduced (multi-step organic synthesis reaction), and the operation was very complicated and specialized knowledge was required. Since the amount of aminoacyl-tRNA obtained is extremely limited and the raw materials are scarce, it was impossible to produce the target protein to which the amino acid to be introduced was added on a large scale. In addition, when amino acids are enzymatically introduced into proteins, tRNA molecules are gradually accumulated during the reaction, which may gradually inhibit the enzyme reaction.
本発明の課題は、高効率・簡便かつ低コストに、アミノ酸を目的タンパク質または目的ペプチドに導入する方法を提供することであり、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入のスケールアップを可能にする方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for introducing an amino acid into a target protein or target peptide with high efficiency, simplicity and low cost, and a method for enabling scale-up of amino acid introduction into the target protein or target peptide Is to provide.
本願発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、１）目的タンパク質または目的ペプチド、２）導入するアミノ酸、３）tRNA、４）アミノアシルtRNA合成酵素、５）アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を、同じ混合液中に、単一の容器内に存在させることにより、本発明の課題が解決されることを見出し、本発明を達成した。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the inventors of the present application have found that 1) target protein or target peptide, 2) amino acid to be introduced, 3) tRNA, 4) aminoacyl tRNA synthetase, and 5) aminoacyl tRNA protein transferase are the same. The present invention has been achieved by finding that the problem of the present invention can be solved by making the mixture present in a single container.
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．少なくとも以下を含む混合溶液を用いて、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法：
１）目的タンパク質または目的ペプチド、
２）導入するアミノ酸であり、フッ素を含有するアミノ酸、
３）tRNA、
４）アミノアシルtRNA合成酵素、
５）アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。
２．混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとtRNAのモル比が、30：1〜1：1である前項１に記載の方法。
３．混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素のモル比が、100：1〜2：1である前項１または２に記載の方法。
４．アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素が、ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素である前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．目的タンパク質または目的ペプチドのN末端が塩基性アミノ酸であり、導入するアミノ酸が目的タンパク質または目的ペプチドのN末端に導入される、前項４に記載の方法。
６．アミノアシルtRNA合成酵素が、アミノアシルtRNA合成酵素の変異体である前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．フッ素を含有するアミノ酸が、以下から選択される少なくとも１以上のアミノ酸である前項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
2-アミノ-3-(4-フルオロメトキシ-フェニル)-プロピオン酸；
2-アミノ-3-[4-(2-フルオロ-エトキシ)-フェニル]-プロピオン酸。
８．少なくとも以下を含む前項１〜７のいずれか１項に記載の方法に用いる、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入用キット：
１）tRNA、
２）アミノアシルtRNA合成酵素、
３）アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。
９．前項１〜７のいずれか１項に記載の方法または前項８に記載のキットを用いる、非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法。
That is, this invention consists of the following.
1. A method for introducing an amino acid into a target protein or target peptide using a mixed solution containing at least the following:
1) target protein or target peptide,
2) Amino acid to be introduced and containing fluorine,
3) tRNA,
4) Aminoacyl tRNA synthetase,
5) Aminoacyl tRNA protein transferase.
2. 2. The method according to item 1 above, wherein the molar ratio of the target protein or peptide and tRNA in the mixed solution is 30: 1 to 1: 1.
3. 3. The method according to item 1 or 2, wherein the molar ratio of the target protein or target peptide and aminoacyl tRNA synthetase in the mixed solution is 100: 1 to 2: 1.
4). 4. The method according to any one of items 1 to 3, wherein the aminoacyl tRNA protein transferase is leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase.
5). 5. The method according to item 4 above, wherein the N-terminus of the target protein or target peptide is a basic amino acid, and the amino acid to be introduced is introduced into the N-terminus of the target protein or target peptide.
6). 6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the aminoacyl tRNA synthetase is a mutant of an aminoacyl tRNA synthetase.
7). 7. The method according to any one of items 1 to 6, wherein the fluorine-containing amino acid is at least one or more amino acids selected from the following:
2-Amino-3- (4-fluoromethoxy-phenyl) -propionic acid;
2-Amino-3- [4- (2-fluoro-ethoxy) -phenyl] -propionic acid.
8). A kit for introducing an amino acid into a target protein or peptide, which is used in the method according to any one of items 1 to 7 including at least the following:
1) tRNA,
2) aminoacyl-tRNA synthetase,
3) Aminoacyl tRNA protein transferase.
9. A method for producing a non-natural protein or a non-natural peptide using the method according to any one of items 1 to 7 or the kit according to item 8 above.
本発明の方法（以下、「Nexta系」とも称する）によれば、tRNAのアミノアシル化、アミノ酸の目的タンパク質への転移反応が引き続いて起こり（図１参照）、アミノアシルtRNAは系中で自発的に作製されるため、アミノアシルtRNAを単離する必要がなくなり、操作が非常に簡便となった。また、導入するアミノ酸の誘導体化等の煩雑な操作も不要となった。さらに、転移反応中にこれまでは副生成物として蓄積されていたtRNAが、本手法においては触媒として働き、再利用されるため、高価なtRNA分子は少量しか必要とされなくなった。したがって、タンパク質導入の大幅なスケールアップおよびコスト削減が可能となった。 According to the method of the present invention (hereinafter also referred to as “Nexta system”), aminoacylation of tRNA and transfer reaction of amino acid to the target protein occur (see FIG. 1), and aminoacyl tRNA is spontaneously generated in the system. Since it was produced, it was not necessary to isolate aminoacyl-tRNA, and the operation became very simple. Moreover, complicated operations such as derivatization of the amino acid to be introduced are no longer necessary. Furthermore, since tRNA, which has been accumulated as a by-product during the transfer reaction, acts as a catalyst and is reused in this method, only a small amount of expensive tRNA molecules are required. Therefore, the scale-up and cost reduction of protein introduction became possible.
本発明においてペプチドとは、２個以上のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するものをいい、分子量5000以上のペプチドをタンパク質という。また、本明細書においてタンパク質とは、例えば生体内で産生された場合には、生体内で何らかの機能・活性を示し得るペプチドを指す。
本発明において用いられる「目的タンパク質」もしくは「目的ペプチド」は、アミノ酸を導入する対象となるタンパク質もしくはペプチドを指す。目的タンパク質もしくは目的ペプチドは、天然のものであっても、非天然のものであっても、どちらでも用いることができる。
天然のタンパク質もしくはペプチドは、例えば種々の生物の生体内から単離して得ることができる。また、遺伝子工学的手法や有機合成などの自体公知の手法を用いて、産生することも可能である。非天然のタンパク質もしくはペプチドも同様に、遺伝子工学的手法や、有機合成などの自体公知の手法を用いて、産生することが可能である。
さらに、用いるアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素などの条件に応じて、目的タンパク質もしくは目的ペプチドには、特定の位置に、特定のアミノ酸が存在することが好ましい。例えば、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素として、ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素（以下、「L/F転移酵素」とも称する）を使用する場合、目的タンパク質もしくは目的ペプチドのN末端に、塩基性のアミノ酸（例えばリジンもしくはアルギニン）が存在している必要がある。
In the present invention, a peptide means a peptide having an amino acid sequence containing two or more amino acids, and a peptide having a molecular weight of 5000 or more is called a protein. Moreover, in this specification, protein refers to the peptide which can show a certain function and activity in the living body, for example, when produced in the living body.
The “target protein” or “target peptide” used in the present invention refers to a protein or peptide to which an amino acid is to be introduced. The target protein or peptide can be used regardless of whether it is natural or non-natural.
Natural proteins or peptides can be obtained, for example, by isolation from the living body of various organisms. Moreover, it can also be produced using a technique known per se such as a genetic engineering technique or organic synthesis. Similarly, a non-natural protein or peptide can be produced using a genetic engineering technique or a technique known per se such as organic synthesis.
Furthermore, it is preferable that a specific amino acid is present at a specific position in the target protein or target peptide depending on conditions such as the aminoacyl tRNA protein transferase used. For example, when leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase (hereinafter also referred to as “L / F transferase”) is used as an aminoacyl tRNA protein transferase, a basic amino acid is present at the N-terminus of the target protein or peptide. (Eg lysine or arginine) must be present.
「導入するアミノ酸」は、天然のアミノ酸でも非天然のアミノ酸でもどちらも使用することができる。「天然アミノ酸」とは、天然に存在する20種類のアミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。さらに詳細には、非天然アミノ酸とは、同一分子内にアミノ基とカルボン酸基を有する天然に存在しない人工のあらゆる化合物を指す。非天然アミノ酸は、種々の化合物をアミノ酸骨格（アミノ酸中のカルボン酸基、アミノ基、およびこれらを連結する部分を含むものをさす）に結合させることにより作製することができる。本発明の非天然アミノ酸には、既に、公知の非天然アミノ酸に加えて、将来得られるであろう非天然アミノ酸も含まれる。 As the “amino acid to be introduced”, either a natural amino acid or a non-natural amino acid can be used. "Natural amino acid" means 20 kinds of naturally occurring amino acids. “Non-natural amino acid” means an amino acid other than natural amino acids. More specifically, an unnatural amino acid refers to any non-naturally occurring artificial compound that has an amino group and a carboxylic acid group in the same molecule. Non-natural amino acids can be prepared by bonding various compounds to an amino acid skeleton (referring to a carboxylic acid group in an amino acid, an amino group, and those containing a linking part thereof). The unnatural amino acid of the present invention includes unnatural amino acids that will be obtained in the future in addition to known unnatural amino acids.
例えば、非天然アミノ酸として、蛍光物質等の種々の標識物をアミノ酸骨格に結合させたり、放射性同位元素等をアミノ酸に取り込ませたものを用いることもでき、これにより該標識物を取り込んだ標識化タンパク質もしくはペプチドが得られる。それぞれの標識物に応じた方法を用いて、該標識化タンパク質を直接的に、または標識物が酵素基質または抗原性物質である場合などは酵素化学的手法または酵素免疫化学的手法などの間接的手法により、検出および精製することができ、医学、薬学、高分子化学、生化学等に関連する様々な技術分野において様々な用途への利用が期待される。また、非天然アミノ酸として、バイオ直交性を有するアミノ酸を用いることができる。かかるバイオ直交性を有するアミノ酸を導入されたタンパク質やペプチドは、当該導入された位置特異的に、用途に応じてさらなる化学修飾が可能となる。 For example, as a non-natural amino acid, various labels such as fluorescent substances can be bound to an amino acid skeleton, or a radioisotope or the like incorporated into an amino acid can be used, thereby labeling the label by incorporating the label. A protein or peptide is obtained. Using a method according to each label, the labeled protein is directly or indirectly such as an enzyme chemical method or an enzyme immunochemical method when the label is an enzyme substrate or an antigenic substance. It can be detected and purified by techniques, and is expected to be used for various applications in various technical fields related to medicine, pharmacy, polymer chemistry, biochemistry, and the like. Moreover, an amino acid having bioorthogonality can be used as the unnatural amino acid. Such a protein or peptide into which an amino acid having bioorthogonality is introduced can be further chemically modified depending on the intended use, in a position-specific manner.
また「導入するアミノ酸」として、フッ素を含有するアミノ酸を用いることができる。フッ素を含有するアミノ酸は、アミノ酸骨格を有する化合物においてフッ素が導入された化合物を意味するが、当該フッ素の核種は問わない。フッ素を含有するアミノ酸としては、図２に示す番号１４（2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニルアラニン），１９，２７のアミノ酸が例示されるがこれらに限定されるものではない。フッ素を含有するアミノ酸として特に好ましいものは、１９と２７のアミノ酸である。 As the “amino acid to be introduced”, an amino acid containing fluorine can be used. An amino acid containing fluorine means a compound in which fluorine is introduced in a compound having an amino acid skeleton, but the nuclide of the fluorine is not limited. Examples of the amino acid containing fluorine include, but are not limited to, amino acids of No. 14 (2,3,4,5,6-pentafluorophenylalanine), 19, and 27 shown in FIG. Particularly preferred amino acids containing fluorine are the 19 and 27 amino acids.
本発明において導入するアミノ酸は、使用するアミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素によって適宜選択することができる。例えば、図２に示すアミノ酸番号１〜２および４〜２８（番号３は番号２８のアミノ酸においてXがI（ヨウ素）であるもの）から選択することができるが、特にこれらに限定されない。アミノアシルtRNA合成酵素として大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素変異体（294番目のアラニンがグリシンに置換：Ala294→Gly）、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素としてロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素を用いる場合は、図２の番号１，４，６〜８，１１，１２，１６，１８，１９，２５，２６，２７，２８のアミノ酸を使用することができ（各アミノ酸の名称については下記表１を参照）、さらに好ましくは図２の番号４，６，７，１１，１２，１６，１８，１９，２５，２６，２７，２８のアミノ酸を使用することができる。
図２に記載のアミノ酸の入手方法は、実施例１を参照されたい。図２の番号２７のアミノ酸は、CSPS Pharmaceuticals社（カタログ番号：51504）もしくはAmatek Chemical社（カタログ番号：A-0080）より購入することができ、Aurora Screening Library社、Ambinter Stock Screening Collection社、Enamine Screening Library社、Nanosyn Compound Library社などから購入することもできる。
The amino acid introduced in the present invention can be appropriately selected depending on the aminoacyl tRNA synthetase and aminoacyl tRNA protein transferase used. For example, it can be selected from amino acid numbers 1-2 and 4-28 shown in FIG. 2 (number 3 is an amino acid of number 28 where X is I (iodine)), but is not particularly limited thereto. When using a phenylalanyl tRNA synthetase mutant derived from E. coli as an aminoacyl tRNA synthetase (294th alanine is replaced by glycine: Ala294 → Gly) and leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase as an aminoacyl tRNA protein transferase, The amino acids of numbers 1, 4, 6 to 8, 11, 12, 16, 18, 19, 25, 26, 27, and 28 in FIG. 2 can be used (refer to Table 1 below for the names of each amino acid). More preferably, amino acids of numbers 4, 6, 7, 11, 12, 16, 18, 19, 25, 26, 27, and 28 in FIG. 2 can be used.
See Example 1 for the method of obtaining the amino acids described in FIG. The amino acid number 27 in FIG. 2 can be purchased from CSPS Pharmaceuticals (catalog number: 51504) or Amatek Chemical (catalog number: A-0080), Aurora Screening Library, Ambinter Stock Screening Collection, Enamine Screening. It can also be purchased from Library and Nanosyn Compound Library.
本明細書中における「tRNA」とは、アミノアシルtRNA合成酵素によりアミノアシル化されることが公知であるtRNA、ならびに公知tRNA以外には、本発明にて使用するアミノアシルtRNA合成酵素によるアミノアシル化される機能を有し、かつ本発明にて使用するアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素により、当該非天然アミノアシルtRNAに結合しているアミノアシル基がタンパク質もしくはペプチドに転移される機能を有するtRNAを含む。かかる機能を有するtRNAは、公知のtRNAのクローバーリーフ二次構造と同様の二次構造であってもよいし、クローバーリーフ二次構造をとらなくてもよく、いかなる大きさ及び構造であってもよい。
公知のtRNAの例としては、tRNAPheまたはtRNALeuなどの天然tRNAが含まれる。また、本発明のtRNAには、非天然tRNAも含まれるが、本発明にて使用するアミノアシルtRNA合成酵素によるアミノアシル化される機能を有し、かつ本発明にて使用するアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素により、当該非天然アミノアシルtRNAに結合しているアミノアシル基がタンパク質もしくはペプチドに転移される機能を有するものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、本発明において、非特許文献３に記載のアミノアシルtRNA合成酵素を用いる場合は、tRNAPheを用いることが好ましい。
本発明におけるtRNAは、自体公知の方法により合成して、もしくは市販のものを購入して入手することができる（例えば、天然の大腸菌由来フェニルアラニンtRNA、および、天然の大腸菌由来フェニルアラニンtRNAを含むtRNA粗精製物は、SIGMA社より入手可能）。
In the present specification, “tRNA” means tRNA that is known to be aminoacylated by aminoacyl tRNA synthetase, and functions other than known tRNA that are aminoacylated by aminoacyl tRNA synthetase used in the present invention. And tRNA having a function of transferring an aminoacyl group bound to the non-natural aminoacyl tRNA to a protein or peptide by the aminoacyl tRNA protein transferase used in the present invention. The tRNA having such a function may have a secondary structure similar to the known cloverleaf secondary structure of tRNA, may not have a cloverleaf secondary structure, and may have any size and structure. Good.
Examples of known tRNA include natural tRNA such as tRNA Phe or tRNA Leu . The tRNA of the present invention includes non-natural tRNA, but has the function of being aminoacylated by the aminoacyl tRNA synthetase used in the present invention, and can be produced by the aminoacyl tRNA protein transferase used in the present invention. Any aminoacyl group bound to the non-natural aminoacyl tRNA can be used as long as it has a function of transferring to a protein or peptide. For example, in the present invention, when the aminoacyl tRNA synthetase described in Non-Patent Document 3 is used, it is preferable to use tRNA Phe .
The tRNA in the present invention can be obtained by a method known per se, or can be obtained by purchasing a commercially available product (for example, a crude tRNA containing natural E. coli-derived phenylalanine tRNA and natural E. coli-derived phenylalanine tRNA. (Purified product is available from SIGMA).
アミノアシルtRNA合成酵素（以下、「aaRS」と称することもある）とは、一般的にはリボソームでの遺伝暗号の翻訳における基質となるアミノアシルtRNAの合成を担う酵素である。aaRSはタンパク質を合成するのに使われる20種のアミノ酸に対応した20種類が存在し、例えば、リジン（Lys）に対応するaaRSはリジルtRNA合成酵素と呼ばれる。本発明において用いられるアミノアシルtRNA合成酵素としては、導入する天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸に対して基質特異性を有する野生型のアミノアシルtRNA合成酵素、ならびに、本来のアミノ酸に対する特異性に比べて非天然アミノ酸誘導体等に対して特異性が高められたアミノアシルtRNA合成酵素の変異体を用いることができる。好ましくは、大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素変異体（Ala294→Gly）（非特許文献３）を用いることができる。
本発明におけるアミノアシルtRNA合成酵素は、自体公知の方法により合成して、もしくは市販のものを購入して入手することができる（例えば、天然のアミノアシルtRNA合成酵素はSIGMA社から入手可能）。
An aminoacyl-tRNA synthetase (hereinafter sometimes referred to as “aaRS”) is an enzyme responsible for synthesizing an aminoacyl-tRNA that is a substrate in translation of the genetic code in a ribosome. There are 20 types of aaRS corresponding to 20 types of amino acids used to synthesize proteins. For example, aaRS corresponding to lysine (Lys) is called lysyl tRNA synthetase. The aminoacyl-tRNA synthetase used in the present invention includes a wild-type aminoacyl-tRNA synthetase having a substrate specificity for a natural amino acid or an unnatural amino acid to be introduced, and an unnatural amino acid compared to the specificity for an original amino acid. A variant of an aminoacyl-tRNA synthetase with increased specificity for a derivative or the like can be used. Preferably, E. coli-derived phenylalanyl tRNA synthetase mutant (Ala294 → Gly) (Non-patent Document 3) can be used.
The aminoacyl-tRNA synthetase in the present invention can be synthesized by a method known per se or can be obtained by purchasing a commercially available product (for example, natural aminoacyl-tRNA synthetase can be obtained from SIGMA).
アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素とは、tRNAの3'末端に付加されたアミノ酸をタンパク質のアミノ末端（N末端）へ転移し、遺伝暗号を介することなくペプチド結合形成反応を触媒する酵素をさす。アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素として、天然に存在する野生型酵素のほか、同様の機能を有する変異型転移酵素を用いることもできる。アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素として、好ましくはロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素（L/F転移酵素）を用いることができる。L/F転移酵素は大腸菌由来であり、tRNAに結合しているフェニルアラニンや、ロイシン、メチオニンなどの疎水性アミノ酸を、N末端にリジンやアルギニンを有するタンパク質もしくはペプチドに転移させる反応を触媒する酵素である。アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素は、自体公知の方法（例えば遺伝子工学的手法）により合成して入手することができる。 An aminoacyl-tRNA protein transferase refers to an enzyme that transfers an amino acid added to the 3 ′ end of tRNA to the amino terminus (N-terminus) of the protein and catalyzes a peptide bond formation reaction without passing through the genetic code. As the aminoacyl-tRNA protein transferase, a mutant transferase having a similar function can be used in addition to a naturally occurring wild-type enzyme. As the aminoacyl tRNA protein transferase, leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase (L / F transferase) can be preferably used. L / F transferase is derived from E. coli and is an enzyme that catalyzes the reaction of transferring hydrophobic amino acids such as phenylalanine, leucine, and methionine bound to tRNA to proteins or peptides having lysine or arginine at the N-terminus. is there. The aminoacyl tRNA protein transferase can be obtained by synthesis by a method known per se (for example, a genetic engineering technique).
本発明の方法において用いられる混合溶液中には、反応に好適な緩衝液、塩類などを適宜存在させることができる。緩衝液としては、例えばHepes緩衝液、Tris-酢酸などが挙げられる。実施例では、反応緩衝液A、Bの2液を混合して用いた。A液の組成は、終濃度で、10mM MgCl2、1mM Spermidine、50mM Hepes緩衝液(pH 7.6)、B液の組成は、終濃度で2.5mM ATP、20mM KCl、2mM DTTである。 In the mixed solution used in the method of the present invention, a buffer solution, salts and the like suitable for the reaction can be appropriately present. Examples of the buffer include Hepes buffer and Tris-acetic acid. In the examples, two solutions of reaction buffer A and B were mixed and used. The composition of solution A is 10 mM MgCl 2 , 1 mM Spermidine, 50 mM Hepes buffer (pH 7.6), and the composition of solution B is 2.5 mM ATP, 20 mM KCl, 2 mM DTT at the final concentration.
混合溶液中における、目的タンパク質または目的ペプチド、導入するアミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素の各成分の濃度は、任意に設定可能である。好ましくは、混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとtRNAのモル比は、30：1〜1：1、さらに好ましくは10：1〜4：1である。また、好ましくは、混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素のモル比は、100：1〜2：1、さらに好ましくは50：1〜20：1である。本発明によると、tRNAは系中で再利用されるため少量しか必要とされない。好ましくは、混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドと導入するアミノ酸のモル比は、100：1〜1：1000、より好ましくは25：1〜1：400、さらに好ましくは1：1〜1：120である。導入するアミノ酸は、目的タンパク質または目的ペプチドに比べて少量でも導入可能であり、導入するアミノ酸量が目的タンパク質もしくは目的ペプチドに比べて過剰であっても、本方法の反応系を阻害することはないと考えられる。導入するアミノ酸が貴重な場合はアミノ酸量を少量にし、逆に目的タンパク質もしくは目的ペプチドが貴重な場合は、目的タンパク質もしくは目的ペプチドを少量にして、反応を行うことができる。 The concentration of each component of the target protein or peptide, amino acid to be introduced, tRNA, aminoacyl tRNA synthetase, and aminoacyl tRNA protein transferase in the mixed solution can be arbitrarily set. Preferably, the molar ratio of the target protein or peptide to the tRNA in the mixed solution is 30: 1 to 1: 1, more preferably 10: 1 to 4: 1. Preferably, the molar ratio of the target protein or peptide to the aminoacyl tRNA synthetase in the mixed solution is 100: 1 to 2: 1, more preferably 50: 1 to 20: 1. According to the present invention, tRNA is reused in the system and only a small amount is required. Preferably, the molar ratio of the target protein or peptide to the amino acid to be introduced in the mixed solution is 100: 1 to 1: 1000, more preferably 25: 1 to 1: 400, and even more preferably 1: 1 to 1: 120. It is. The introduced amino acid can be introduced in a small amount compared to the target protein or target peptide, and even if the amount of amino acid to be introduced is excessive compared to the target protein or target peptide, the reaction system of this method is not inhibited. it is conceivable that. When the amino acid to be introduced is precious, the reaction can be carried out with a small amount of amino acid, and conversely, when the target protein or target peptide is precious, the target protein or target peptide can be made small.
温度およびpHなどの反応条件は、使用する酵素などに応じて任意の条件を選択できる。反応温度は、好ましくは約0℃〜50℃、さらに好ましくは約4℃〜37℃である。反応pHは、好ましくは約6〜9、さらに好ましくは約7〜8である。反応時間は、好ましくは約10分以上であり、さらに好ましくは約15分〜120分である。 The reaction conditions such as temperature and pH can be selected arbitrarily depending on the enzyme used. The reaction temperature is preferably about 0 ° C to 50 ° C, more preferably about 4 ° C to 37 ° C. The reaction pH is preferably about 6-9, more preferably about 7-8. The reaction time is preferably about 10 minutes or more, more preferably about 15 minutes to 120 minutes.
本発明の方法は、目的タンパク質または目的ペプチド、導入するアミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、およびアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を含む混合溶液をインキュベーションすることにより反応させる工程、そして、導入するアミノ酸が結合した目的タンパク質または目的ペプチドを回収する工程を含む。
詳細には、まず、導入するアミノ酸を準備する工程を含む。使用するアミノ酸は、１種類でもよいし複数種でもよい。目的タンパク質または目的ペプチド、導入するアミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を含む混合溶液を調製する工程を含む。これらの構成成分は、一度に混合されても良いし、任意の順番で混合されてもよい。次に、混合溶液をインキュベーションすることにより反応させる工程を含む。例えば、37℃、60分間インキュベーションすることにより、反応を進行させる。次に、反応を停止させる工程を含む。例えば、TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液を混合して反応を停止させる。その後、濃縮脱塩処理によりアミノ酸の導入されたタンパク質もしくはペプチド（「非天然タンパク質もしくは非天然ペプチド」と称する。）を回収する工程を含む。例えばZipTip処理により濃縮脱塩処理して非天然タンパク質もしくは非天然ペプチドを精製することができる。
The method of the present invention comprises a step of reacting by incubating a mixed solution containing a target protein or peptide, an amino acid to be introduced, tRNA, aminoacyl tRNA synthetase, and aminoacyl tRNA protein transferase, and the amino acid to be introduced is bound. Recovering the target protein or peptide.
Specifically, it first includes a step of preparing an amino acid to be introduced. One or more amino acids may be used. And a step of preparing a mixed solution containing the target protein or peptide, the amino acid to be introduced, tRNA, aminoacyl tRNA synthetase, and aminoacyl tRNA protein transferase. These components may be mixed at once or in any order. Next, the step of reacting by incubating the mixed solution is included. For example, the reaction is allowed to proceed by incubation at 37 ° C. for 60 minutes. Next, the process of stopping reaction is included. For example, the reaction is stopped by mixing an aqueous solution of TFA (trifluoroacetic acid). Thereafter, a step of recovering a protein or peptide into which an amino acid has been introduced (referred to as “non-natural protein or non-natural peptide”) by concentration desalting treatment is included. For example, it is possible to purify a non-natural protein or a non-natural peptide by concentration desalting treatment by ZipTip treatment.
本発明はさらに、少なくともtRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を含む、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入用キットを対象とする。かかるキットには好ましくは、１種もしくは複数種の導入するアミノ酸が含まれる。各構成成分は、１つの容器中に存在した状態で提供されてもよいし、別個の容器中に分離して存在した状態で提供されても良い。当該キットには、緩衝液、塩類などの必要な試薬が含まれていることも好ましい。
また、本発明は、前記のアミノ酸導入方法もしくは、アミノ酸導入用キットを用いる、非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法をも対象とする。
The present invention is further directed to a kit for introducing an amino acid into a target protein or peptide including at least tRNA, aminoacyl tRNA synthetase, and aminoacyl tRNA protein transferase. Such a kit preferably contains one or more amino acids to be introduced. Each component may be provided in a state where it is present in one container, or may be provided in a state where it is separately present in a separate container. It is also preferred that the kit contains necessary reagents such as buffers and salts.
The present invention is also directed to a method for producing an unnatural protein or unnatural peptide using the amino acid introduction method or the amino acid introduction kit.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these.
（実施例１）導入するアミノ酸の準備
（１）図２の番号１９ O-フルオロメチル-L-チロシン(O-fluoromethyl-L-tyrosine)（以下「fmTyr」と略す）を、下記化学式１に示したスキームに従って合成した（参照：Emmons WD, Ferries AF. J Am Chem Soc 1953; 75: 2257およびJOURNAL OF LABELLED COMPOUNDS AND RADIOPHARMACEUTICALS,J Label Compd Radiopharm 2003; 46: 555.566）。
（２）図２の番号１〜１８、２０〜２２、２４〜２６のアミノ酸の入手方法は、以下の通りである。番号２３のアミノ酸については、後述する。
図２の番号１のアミノ酸はSIGMA社、番号２のアミノ酸はChemika社、番号３のアミノ酸（p-ヨードフェニルアラニン（2-アミノ-3-(4-ヨード-フェニル)-プロピオン酸）、番号２８のアミノ酸においてXがIであるもの）は渡辺化学工業株式会社、番号４のアミノ酸はBACHEM社、番号５のアミノ酸はACROS社、番号６〜９のアミノ酸は渡辺化学工業株式会社、番号１０および１１のアミノ酸は国産化学株式会社、番号１２〜１４のアミノ酸は渡辺化学工業株式会社、番号１５のアミノ酸はACROS社、番号１６のアミノ酸は、渡辺化学工業株式会社より購入した。番号１７のアミノ酸は、Chemistry & Biology, Volume 8, Issue 3, March 2001, Pages 243-252に記載の方法に基づいて合成した。番号１８および２０のアミノ酸は渡辺化学工業株式会社より購入した。番号２１のアミノ酸は、RSP Amino Acids社から購入し、TFA処理をして脱保護（脱Boc）をした。番号２２のアミノ酸は、SIGMA社より購入した。番号２４のアミノ酸は、渡辺化学工業株式会社より購入した。番号２５のアミノ酸は、特開2006-342299号に記載の方法により合成した。番号２６のアミノ酸は渡辺化学工業株式会社より購入した。番号２７のアミノ酸はJ Nucl Med 2002; 43:187-199およびJ Nucl Med 1999; 40:205-212に記載の方法に基づいて合成した。
(2) The method for obtaining amino acids Nos. 1 to 18, 20 to 22, and 24 to 26 in FIG. 2 is as follows. The amino acid number 23 will be described later.
The amino acid number 1 in FIG. 2 is SIGMA, the amino acid number 2 is Chemika, the amino acid number 3 (p-iodophenylalanine (2-amino-3- (4-iodo-phenyl) -propionic acid), number 28 Amino acids with X being I) are Watanabe Chemical Co., Ltd., amino acids No. 4 are BACHEM, amino acids No. 5 are ACROS, amino acids Nos. 6-9 are Watanabe Chemical Industries, Nos. 10 and 11 Amino acids were purchased from Kokusan Chemical Co., Ltd., amino acids 12-14 were purchased from Watanabe Chemical Co., Ltd., amino acids No. 15 were purchased from ACROS, and amino acids No. 16 were purchased from Watanabe Chemical Industries, Ltd. The amino acid number 17 was synthesized based on the method described in Chemistry & Biology, Volume 8, Issue 3, March 2001, Pages 243-252. The amino acids Nos. 18 and 20 were purchased from Watanabe Chemical Co., Ltd. The amino acid number 21 was purchased from RSP Amino Acids, and was deprotected (de-Boc) by TFA treatment. The amino acid number 22 was purchased from SIGMA. The amino acid number 24 was purchased from Watanabe Chemical Co., Ltd. The amino acid number 25 was synthesized by the method described in JP-A-2006-342299. The amino acid number 26 was purchased from Watanabe Chemical Co., Ltd. The amino acid number 27 was synthesized based on the method described in J Nucl Med 2002; 43: 187-199 and J Nucl Med 1999; 40: 205-212.
（３）図２の番号２３のアミノ酸は、下記化学式２に示したスキームに従って合成した。
2-ヒドロキシメチル-6-メトキシナフタレンを精製して乾燥した後、フラスコで無水ベンゼン 37 mLに加熱・撹拌しながら溶解し、氷冷した。溶液に、PBr3 5.5 mLを氷冷下で撹拌しながら加えた。暗所室温（約25℃）で24時間静置した。溶液をジエチルエーテル約180 mL／冷蒸留水約120mLの混合物を入れたビーカー中に撹拌しながらゆっくり注ぎ込んだ。混合溶液を分液ロートに入れ、下層（水相）をビーカーに取り、ジエチルエーテルで１回洗った。分液ロート中のエーテル相を蒸留水で３回洗浄した。残ったエーテル相をフラスコにいれ、7gのMgSO4を加えて、水分を除去した。MgSO4をろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧乾燥し、少し黄色がかった白色結晶を得た。結晶を真空ラインで約３時間乾燥させた。収量4.6 g (94%)、2-ブロモメチル-6-メトキシナフタレンを得た。
無水エタノール50.6 mLをフラスコに入れて、シリカゲル乾燥管を付けた。金属ナトリウムをろ紙上で、表面の酸化物などをそぎ落とし、エタノール中に投入した。投入した合計量は予定量（506 mg,1.2当量）を約10％超える程度であった。フラスコにシリカゲル乾燥管をつけ、ナトリウムを溶解した。溶液にアセトアミドマロン酸ジエチル(4.37g)を撹拌しながら溶解した。2-ブロモメチル-6-メトキシナフタレン (4.6g,18.32mmol)を別のフラスコ中でジオキサン 50.6 mLに溶解した。この溶液を前者の溶液に撹拌しながらゆっくり加え、室温で一晩撹拌した。溶媒（エタノールとジオキサン）をエバポレーターで減圧除去した。残渣に酢酸エチル100 mLと5% 硫酸水素カリウム水溶液40 mLを加えた。分液ロートに入れ、よく振り混ぜた後、水相を除去した。除去した水相を20 mLの酢酸エチルで２回抽出した。有機相を一つにまとめて、5% 硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で各２回づつ洗浄した。Na2SO4を入れて乾燥させ、ろ取した。エバポレーターで溶媒を減圧除去した。収量6.9 g（収率 97%）、ジエチル(6-メトキシ-2-ナフチル)アセトアミドマロン酸を得た。
ジエチル(6-メトキシ-2-ナフチル)アセトアミドマロン酸 6.9g (17.8 mmol) をエタノール／ジオキサン＝1／1（v/v%）110ml に懸濁し、1N 水酸化ナトリウム水溶液 73ml (73 mmol) 加えた。60℃で3時間撹拌した。60℃で撹拌しながら1N 塩酸 76 ml を少量ずつ加えた。脱炭酸が始まるので、二酸化炭素の泡が出なくなるまで60℃に保った。ビーカーに蒸留水 約780 ml を入れ、撹拌しながら溶液を少しずつ加えて、室温まで放冷し、一晩冷蔵庫で冷やした。析出物を濾取し（吸引濾過）、水でよく洗浄し、減圧乾燥させ、番号２３のアミノ酸を得た。
(3) The amino acid number 23 in FIG. 2 was synthesized according to the scheme shown in Chemical Formula 2 below.
After 2-hydroxymethyl-6-methoxynaphthalene was purified and dried, it was dissolved in 37 mL of anhydrous benzene with heating and stirring in a flask and cooled with ice. To the solution, 5.5 mL of PBr 3 was added with stirring under ice cooling. It was allowed to stand for 24 hours at room temperature (about 25 ° C) in the dark. The solution was slowly poured into a beaker containing a mixture of about 180 mL diethyl ether / 120 mL cold distilled water with stirring. The mixed solution was put into a separatory funnel, and the lower layer (aqueous phase) was taken in a beaker and washed once with diethyl ether. The ether phase in the separatory funnel was washed three times with distilled water. The remaining ether phase was placed in a flask and 7 g of MgSO 4 was added to remove moisture. MgSO 4 was filtered, and the filtrate was dried under reduced pressure with an evaporator to obtain white crystals having a slightly yellowish color. The crystals were dried on a vacuum line for about 3 hours. Yield 4.6 g (94%), 2-bromomethyl-6-methoxynaphthalene was obtained.
An absolute ethanol 50.6 mL was placed in a flask and a silica gel drying tube was attached. Metal sodium was removed on a filter paper to remove oxides on the surface and put into ethanol. The total amount charged was about 10% above the expected amount (506 mg, 1.2 equivalents). A silica gel drying tube was attached to the flask to dissolve sodium. Diethyl acetamidomalonate (4.37 g) was dissolved in the solution with stirring. 2-Bromomethyl-6-methoxynaphthalene (4.6 g, 18.32 mmol) was dissolved in 50.6 mL dioxane in a separate flask. This solution was slowly added to the former solution with stirring and stirred overnight at room temperature. The solvent (ethanol and dioxane) was removed under reduced pressure using an evaporator. To the residue were added 100 mL of ethyl acetate and 40 mL of 5% aqueous potassium hydrogensulfate solution. After placing in a separatory funnel and shaking well, the aqueous phase was removed. The removed aqueous phase was extracted twice with 20 mL of ethyl acetate. The organic phases were combined and washed twice each in the order of 5% aqueous potassium hydrogen sulfate solution, water, and saturated brine. Na 2 SO 4 was added and dried and collected by filtration. The solvent was removed under reduced pressure using an evaporator. The yield was 6.9 g (97% yield), and diethyl (6-methoxy-2-naphthyl) acetamidomalonic acid was obtained.
6.9 g (17.8 mmol) of diethyl (6-methoxy-2-naphthyl) acetamidomalonic acid was suspended in 110 ml of ethanol / dioxane = 1/1 (v / v%), and 73 ml (73 mmol) of 1N aqueous sodium hydroxide solution was added. . Stir at 60 ° C. for 3 hours. While stirring at 60 ° C., 76 ml of 1N hydrochloric acid was added little by little. Since decarboxylation started, the temperature was kept at 60 ° C. until no bubbles of carbon dioxide appeared. About 780 ml of distilled water was placed in a beaker, the solution was added little by little with stirring, allowed to cool to room temperature, and cooled in the refrigerator overnight. The precipitate was collected by filtration (suction filtration), washed well with water, and dried under reduced pressure to obtain amino acid No. 23.
（実施例２）導入するアミノ酸の量の検討
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 2.0μl(77 pmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 1.0μl、10×アミノアシル化緩衝液B 1.0μl、350 pmol/μl Lys-Bradykinin 1.0μl(350 pmol)、33μM E. coli フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS(Ala294→Gly)） 0.5μl(16.5 pmol)、26μM L/F転移酵素 0.5μl(13 pmol)と、100 mM fmTyrを、0μl、0.77μl(77 nmol)、0.77μl(7.7 nmol)、0.77μl(770 pmol)で変化させた混合溶液（超純水（mQ水）で全量10μlに調節）を作製した。これらの混合溶液を7℃で60分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
なお、10×アミノアシル化緩衝液Aは、0.1 M MgCl2・0.01 M Spermidine/0.5 M HEPES緩衝液（pH 7.6）であり、10×アミノアシル化緩衝液Bは、0.025 M ATP・0.2 M KCl・0.02 M DTT/mQ水である。
(Example 2) Examination of amount of amino acid to be introduced
0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe 2.0 μl (77 pmol), 10 × aminoacylation buffer A 1.0 μl, 10 × aminoacylation buffer B 1.0 μl, 350 pmol / μl Lys-Bradykinin 1.0 μl (350 pmol), 33 μM E. coli phenylalanyl tRNA synthetase (PheRS (Ala294 → Gly)) 0.5 μl (16.5 pmol), 26 μM L / F transferase 0.5 μl (13 pmol), 100 mM fmTyr, 0 μl, 0.77 μl (77 nmol), 0.77 μl (7.7 nmol), and 0.77 μl (770 pmol) mixed solution (adjusted to a total volume of 10 μl with ultrapure water (mQ water)). These mixed solutions were incubated at 7 ° C. for 60 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
In addition, 10 × amino acylation buffer A is 0.1 M MgCl 2 · 0.01 M Spermidine / 0.5 M HEPES buffer (pH 7.6), and 10 × amino acylation buffer B is 0.025 M ATP · 0.2 M KCl · 0.02 M DTT / mQ water.
結果を図３に示す。ＡはfmTyr 0μl、Ｂは0.77μl(77 nmol)、Ｃは0.77μl(7.7 nmol)、Ｄは0.77μl(770 pmol)の結果である。いずれのアミノ酸濃度においても、本発明の方法によりLys-BradykininをfmTyrで標識することができた。fmTyrの量は、標識の対象となるLys-Bradykininに対して約2倍量で十分であると考えられた。 The results are shown in FIG. A is the result of fmTyr 0 μl, B is 0.77 μl (77 nmol), C is 0.77 μl (7.7 nmol), and D is 0.77 μl (770 pmol). At any amino acid concentration, Lys-Bradykinin could be labeled with fmTyr by the method of the present invention. The amount of fmTyr was considered to be sufficient about twice that of Lys-Bradykinin to be labeled.
（実施例３）反応時間の検討
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 4.0μl(154 pmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 2.0μl、10×アミノアシル化緩衝液B 2.0μl、350 pmol/μl Lys-Bradykinin 2.0μl(700 pmol)、1 mM fmTyr 1.54μl(1540 pmol)、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 1.0μl(33 pmol)、26μM L/F転移酵素 1μl(26 pmol)を混合した混合溶液（mQ水で全量20μlに調節）を作製した。これらの混合溶液を、3μl×6本に分注した。37℃で0分間、10分間、20分間、30分間、50分間、80分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 3) Examination of reaction time
0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe 4.0 μl (154 pmol), 10 × aminoacylation buffer A 2.0 μl, 10 × aminoacylation buffer B 2.0 μl, 350 pmol / μl Lys-Bradykinin 2.0 μl (700 pmol), 1 mM fmTyr 1.54 μl (1540 pmol), 33 μM E. coli PheRS (Ala294 → Gly) 1.0 μl (33 pmol), 26 μM L / F transferase 1 μl (26 pmol) mixed solution (mQ water to a total volume of 20 μl) Adjustment). These mixed solutions were dispensed into 3 μl × 6 tubes. Incubation was performed at 37 ° C. for 0 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 50 minutes, and 80 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図４に示す。Ａは0分間、Ｂは10分間、Ｃは20分間、Ｄは30分間、Ｅは50分間、Ｆは80分間の結果を示す。これらの結果より、本発明の方法では20分間で反応が完了すると考えられた。 The results are shown in FIG. A indicates 0 minute, B indicates 10 minutes, C indicates 20 minutes, D indicates 30 minutes, E indicates 50 minutes, and F indicates 80 minutes. From these results, it was considered that the reaction was completed in 20 minutes in the method of the present invention.
（実施例４）導入するアミノ酸の種類の検討
図２に示した番号１〜２６の26種類のアミノ酸について、本発明の方法により、Lys-Bradykininに導入できるかどうかを検討した。
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 16.0μl(614 pmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 8.0μl、10×アミノアシル化緩衝液B 8.0μl、350 pmol/μl Lys-Bradykinin 8.0μl(2800 pmol)、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 4.0μl(132 pmol)、26μM L/F転移酵素 4μl(104 pmol)を混合した混合溶液（mQ水で全量64μlに調節）を作製した。これらの混合溶液を、4μlに分注し、各混合溶液に各種アミノ酸溶液(20 mM) 1μl（終濃度4 mM）を添加し、37℃で90分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。なお、10×アミノアシル化緩衝液Aは、0.1 M MgCl2・0.01 M Spermidine/0.5 M HEPES緩衝液（pH 7.6）であり、10×アミノアシル化緩衝液Bは、0.025 M ATP・0.2 M KCl・0.02 M DTT/mQ水である。
(Example 4) Examination of types of amino acids to be introduced It was examined whether or not the 26 types of amino acids Nos. 1 to 26 shown in Fig. 2 could be introduced into Lys-Bradykinin by the method of the present invention.
0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe 16.0 μl (614 pmol), 10 × aminoacylation buffer A 8.0 μl, 10 × aminoacylation buffer B 8.0 μl, 350 pmol / μl Lys-Bradykinin 8.0 μl (2800 pmol), A mixed solution (adjusted to a total volume of 64 μl with mQ water) was prepared by mixing 4.0 μl (132 pmol) of 33 μM E. coli PheRS (Ala294 → Gly) and 4 μl (104 pmol) of 26 μM L / F transferase. These mixed solutions were dispensed into 4 μl, 1 μl of various amino acid solutions (20 mM) (final concentration 4 mM) was added to each mixed solution, and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS. In addition, 10 × amino acylation buffer A is 0.1 M MgCl 2 · 0.01 M Spermidine / 0.5 M HEPES buffer (pH 7.6), and 10 × amino acylation buffer B is 0.025 M ATP · 0.2 M KCl · 0.02 M DTT / mQ water.
図２の番号１および８のアミノ酸を用いた場合は、Lys-Bradykininのピークとアミノ酸が付加したピークの両方が確認できた。番号３，４，６，７，１１，１２，１６，１８，１９，２５，２６のアミノ酸を用いた場合は、Lys-Bradykininへアミノ酸が付加したピークのみが確認できた。上記以外のアミノ酸はまったく導入できなかった。 When the amino acids 1 and 8 in FIG. 2 were used, both the Lys-Bradykinin peak and the peak added with the amino acid were confirmed. When amino acids of Nos. 3, 4, 6, 7, 11, 12, 16, 18, 19, 25, and 26 were used, only peaks where amino acids were added to Lys-Bradykinin could be confirmed. Amino acids other than those mentioned above could not be introduced at all.
（実施例５）tRNA量の検討
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPheを、2.0μl(77 pmol)、1μl(38.5 pmol)、0.5μl(19.25 pmol)に変化させ、アミノ酸1 mM fmTyr 0.77μl(0.77 nmol)とした以外は、実施例２と同様に混合溶液を調製し、反応を行った。
(Example 5) Examination of tRNA amount
0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe was changed to 2.0 μl (77 pmol), 1 μl (38.5 pmol), 0.5 μl (19.25 pmol) and changed to amino acid 1 mM fmTyr 0.77 μl (0.77 nmol). A mixed solution was prepared and reacted in the same manner as in Example 2.
結果を図５に示す。ＡはtRNAPheを2.0μl(77 pmol)、Ｂは1μl(38.5 pmol)、Ｃは0.5μl(19.25 pmol)の場合の結果を示す。tRNAが2.0μlの場合、60分間で完全にアミノ酸を導入することができた。 The results are shown in FIG. A shows the results when tRNA Phe is 2.0 μl (77 pmol), B is 1 μl (38.5 pmol), and C is 0.5 μl (19.25 pmol). When tRNA was 2.0 μl, amino acids could be completely introduced in 60 minutes.
（実施例６）反応温度の検討
実施例３と同様に、全量20μlの混合溶液を作製した。これらの混合溶液を、5μl×4本に分注した。反応温度を、4℃、15℃、26℃、37℃に変化させ、60分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 6) Examination of reaction temperature In the same manner as in Example 3, a mixed solution having a total amount of 20 µl was prepared. These mixed solutions were dispensed into 5 μl × 4 bottles. The reaction temperature was changed to 4 ° C, 15 ° C, 26 ° C, 37 ° C and incubated for 60 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図６に示す。Ａは4℃、Ｂは15℃、Ｃは26℃、Ｄは37℃の結果を示す。全ての温度で、原料のピークがほとんどみられなくなり、反応が完了したと考えられた。 The results are shown in FIG. A shows 4 ° C, B shows 15 ° C, C shows 26 ° C, and D shows 37 ° C. At all temperatures, almost no raw material peaks were seen, and the reaction was considered complete.
（比較例１）従来法（２工程）によるアミノ酸の導入
mQ水 37.84μl、0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 16.0μl(616 pmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 8.0μl、10×アミノアシル化緩衝液B 8.0μl、100mM fmTyr 6.16μl(616 pmol）、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 4.0μl(132 pmol)を混合した溶液を2本作製し、37℃で60分間インキュベートした。反応終了後、塩を加えた。そして、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理し、さらに、クロロホルム/イソアミルアルコール処理して、EtOH沈殿させた。70% EtOHで除塩し、減圧乾燥した。
一方の溶液に、mQ水 0.875μl、反応緩衝液 0.625μl、350 pmol/μl Lys-Bradykinin 0.5μl(175 pmol)、26μM L/F転移酵素 0.5μl(13 pmol)を混合し、他方の溶液（ネガティブコントロール）には、26μM L/F転移酵素 0.5μl(13 pmol)の代わりにL/F転移酵素の透析時に用いた緩衝液 0.5μlを混合した。なお、反応緩衝液は、1M KCl/1M Tris-HCl（pH7.8）である、37℃で30分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexして混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Comparative Example 1) Introduction of amino acids by conventional method (2 steps)
mQ water 37.84 μl, 0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe 16.0 μl (616 pmol), 10 × aminoacylation buffer A 8.0 μl, 10 × aminoacylation buffer B 8.0 μl, 100 mM fmTyr 6.16 μl (616 pmol), Two solutions mixed with 4.0 μl (132 pmol) of 33 μM E. coli PheRS (Ala294 → Gly) were prepared and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After completion of the reaction, salt was added. Then, it was treated with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and further treated with chloroform / isoamyl alcohol to precipitate EtOH. The solution was desalted with 70% EtOH and dried under reduced pressure.
In one solution, 0.875 μl of MQ water, 0.625 μl of reaction buffer, 350 pmol / μl Lys-Bradykinin 0.5 μl (175 pmol), 26 μM L / F transferase 0.5 μl (13 pmol) were mixed, and the other solution ( Negative control) was mixed with 0.5 μl of the buffer used for dialysis of L / F transferase instead of 0.5 μl (13 pmol) of 26 μM L / F transferase. The reaction buffer was 1M KCl / 1M Tris-HCl (pH 7.8), which was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, vortexed and mixed, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図７に示す。L/F転移酵素が存在しなかったもの（ネガティブコントロール）では転移反応が起こらなかった（Ａ）。L/F転移酵素を添加したものは転移反応が起こり、Lys-BradykininをfmTyrで標識することができた（Ｂ）。Lys-Bradykininが残ったのは、fmTyr-tRNAPheがLys-Bradykininに対して少量であり、不足したためと考えられた。 The results are shown in FIG. In the case where L / F transferase was not present (negative control), no transfer reaction occurred (A). When L / F transferase was added, transfer reaction occurred and Lys-Bradykinin could be labeled with fmTyr (B). Lys-Bradykinin remained because fmTyr-tRNA Phe was a small amount compared to Lys-Bradykinin.
（実施例７）野生型L/F転移酵素によるアミノ酸の導入
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 4.0μl(153.5 pmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 2.0μl、10×アミノアシル化緩衝液B 2.0μl、350 pmol/μl Lys-Bradykinin 2.0μl(700 pmol)、1 mM feTyr（番号２７のアミノ酸） 1.54μl(1540 pmol)、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 1.0μl(33 pmol)、26μM L/F転移酵素（WT） 1μl(26 pmol)を混合した混合溶液（mQ水で全量20μlに調節）を作製した。これらの混合溶液を、3μl×6本に分注した。37℃で0分間、10分間、20分間、30分間、50分間、80分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 7) Introduction of amino acids by wild type L / F transferase
0.025 OD / μl E. coli tRNA Phe 4.0 μl (153.5 pmol), 10 × aminoacylation buffer A 2.0 μl, 10 × aminoacylation buffer B 2.0 μl, 350 pmol / μl Lys-Bradykinin 2.0 μl (700 pmol), 1 mM feTyr (amino acid number 27) 1.54 μl (1540 pmol), 33 μM E. coli PheRS (Ala294 → Gly) 1.0 μl (33 pmol), 26 μM L / F transferase (WT) 1 μl (26 pmol) were mixed. A mixed solution (adjusted to a total volume of 20 μl with mQ water) was prepared. These mixed solutions were dispensed into 3 μl × 6 tubes. Incubation was performed at 37 ° C. for 0 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 50 minutes, and 80 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図８に示す。Ａは0分間、Ｂは10分間、Ｃは20分間、Ｄは30分間、Ｅは50分間、Ｆは80分間の結果を示す。これらの結果より、本発明の方法では30〜50分間でアミノ酸の導入がほぼ完了すると考えられた。 The results are shown in FIG. A indicates 0 minute, B indicates 10 minutes, C indicates 20 minutes, D indicates 30 minutes, E indicates 50 minutes, and F indicates 80 minutes. From these results, it was considered that the introduction of amino acids was almost completed within 30 to 50 minutes in the method of the present invention.
（実施例８）tRNA量の検討
10×アミノアシル化緩衝液A 2.0μL、10×アミノアシル化緩衝液B 2.0μL、0.35 nmol/μL Lys-Bradykinin 2.0μL(0.70nmol)、33μM E. coli フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS(Ala294→Gly)） 1.0μL(33pmol)、26μM L/F転移酵素（WT） 1.0μL(26pmol)、0.70mM O-メチルチロシン(O-metyltyrosine 図２の番号１２のアミノ酸（以下「mTyr」と略することもある）) 4.0μL(2.8nmol)混合溶液（mQ水で全量16μLに調節）を作製した。これを4μLで4本に分注し、各種濃度のE. coli tRNAPhe(0.10 O.D./μL、0.025 O.D./μL、6.3×10-3O.D./μL、1.6×10-3O.D./μL)を1.0μL(0.15nmol、39pmol、9.6pmol、2.4pmol)ずつ加えた。 これら混合溶液を37℃で60分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 8) Examination of tRNA amount
10 × aminoacylation buffer A 2.0 μL, 10 × aminoacylation buffer B 2.0 μL, 0.35 nmol / μL Lys-Bradykinin 2.0 μL (0.70 nmol), 33 μM E. coli phenylalanyl tRNA synthetase (PheRS (Ala294 → Gly )) 1.0 μL (33 pmol), 26 μM L / F transferase (WT) 1.0 μL (26 pmol), 0.70 mM O-methyltyrosine (O-metyltyrosine) No. 12 amino acid (hereinafter abbreviated as “mTyr”) A)) A 4.0 μL (2.8 nmol) mixed solution (adjusted to a total volume of 16 μL with mQ water) was prepared. Dispense this into 4 tubes at 4 μL, and add 1.0 concentration of E. coli tRNA Phe (0.10 OD / μL, 0.025 OD / μL, 6.3 × 10 −3 OD / μL, 1.6 × 10 −3 OD / μL) at various concentrations. μL (0.15 nmol, 39 pmol, 9.6 pmol, 2.4 pmol) was added. These mixed solutions were incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図９に示す。ＡはtRNAPheを0.15nmol、Ｂは39pmol、Ｃは9.6pmol、Ｄは2.4pmolの場合の結果を示す。tRNAが9.6pmolの場合、60分間で完全にアミノ酸を導入することができた。 The results are shown in FIG. A shows the results when tRNA Phe is 0.15 nmol, B is 39 pmol, C is 9.6 pmol, and D is 2.4 pmol. When tRNA was 9.6 pmol, amino acids could be completely introduced in 60 minutes.
（実施例９）反応時間の検討
10×アミノアシル化緩衝液A 2.5μL、10×アミノアシル化緩衝液B 2.5μL、0.35 nmol/μL Lys-Bradykinin 2.5μL(0.88nmol)、33μM E. coli フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS(Ala294→Gly)） 1.25μL(41pmol)、26μM L/F転移酵素 1.25μL(33pmol)、0.35mM mTyr 5.0μL(1.8nmol)、 0.025 O.D./μL E. coli tRNAPhe 5.0μL(0.19nmol)混合溶液（mQ水で全量20μLに調節）を作製した。これを5μLで5本に分注し、これら混合溶液を37℃で所定の時間(0分間、1分間、5分間、10分間、20分間)反応した。反応後、終濃度が3%になるようTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 9) Examination of reaction time
10 × aminoacylation buffer A 2.5 μL, 10 × aminoacylation buffer B 2.5 μL, 0.35 nmol / μL Lys-Bradykinin 2.5 μL (0.88 nmol), 33 μM E. coli phenylalanyl tRNA synthetase (PheRS (Ala294 → Gly )) 1.25 μL (41 pmol), 26 μM L / F transferase 1.25 μL (33 pmol), 0.35 mM mTyr 5.0 μL (1.8 nmol), 0.025 OD / μL E. coli tRNA Phe 5.0 μL (0.19 nmol) mixed solution (mQ water) To adjust the total volume to 20 μL). This was dispensed into 5 pieces at 5 μL, and these mixed solutions were reacted at 37 ° C. for a predetermined time (0 minutes, 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes). After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図１０に示す。Ａは0分間、Ｂは1分間、Ｃは5分間、Ｄは10分間、Ｅは20分間の結果を示す。これらの結果より、本発明の方法では20分間で反応が完了すると考えられた。 The results are shown in FIG. A is 0 minute, B is 1 minute, C is 5 minutes, D is 10 minutes, and E is 20 minutes. From these results, it was considered that the reaction was completed in 20 minutes in the method of the present invention.
（実施例１０）導入するアミノ酸の量の検討
10×アミノアシル化緩衝液A 2.5μL、10×アミノアシル化緩衝液B 2.5μL、0.35 nmol/μL Lys-Bradykinin 2.5μL(0.88nmol)、33μM E. coli フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS(Ala294→Gly)） 1.25μL(41pmol)、26μM L/F転移酵素 1.25μL(33pmol)、0.025 O.D./μL E. coli tRNAPhe 5.0μL(0.19nmol)混合溶液（mQ水で全量20μLに調節）を作製した。これを4μLで5本に分注し、mQ水 1μL、またはmTyr(88μM、0.18mM、0.35mM、0.70mM)を1.0μL(88pmol、0.18nmol、0.35nmol、0.70nmol)ずつ加えた。 これら混合溶液を37℃で60分間インキュベートした。反応後、終濃度が3%になるようTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 10) Examination of amount of amino acid to be introduced
10 × aminoacylation buffer A 2.5 μL, 10 × aminoacylation buffer B 2.5 μL, 0.35 nmol / μL Lys-Bradykinin 2.5 μL (0.88 nmol), 33 μM E. coli phenylalanyl tRNA synthetase (PheRS (Ala294 → Gly )) A mixed solution of 1.25 μL (41 pmol), 26 μM L / F transferase 1.25 μL (33 pmol), 0.025 OD / μL E. coli tRNA Phe 5.0 μL (0.19 nmol) (adjusted to a total volume of 20 μL with mQ water) was prepared. 4 μL of this was dispensed into 5 tubes, and 1 μL of mQ water or 1.0 μL (88 pmol, 0.18 nmol, 0.35 nmol, 0.70 nmol) of mTyr (88 μM, 0.18 mM, 0.35 mM, 0.70 mM) was added. These mixed solutions were incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図１１に示す。ＡはmTyr 0μl、Ｂは88pmol、Ｃは0.18nmol、Ｄは0.35nmol、Ｅは0.70nmolの結果である。いずれのアミノ酸濃度においても、本発明の方法によりLys-BradykininをmTyrで標識することができた。mTyrの量は、標識の対象となるLys-Bradykininに対して等量で十分であると考えられた。 The results are shown in FIG. A is mTyr 0 μl, B is 88 pmol, C is 0.18 nmol, D is 0.35 nmol, and E is 0.70 nmol. At any amino acid concentration, Lys-Bradykinin could be labeled with mTyr by the method of the present invention. The amount of mTyr was considered to be sufficient for Lys-Bradykinin to be labeled.
（実施例１１）反応温度の検討
10×アミノアシル化緩衝液A 2.0μL、10×アミノアシル化緩衝液B 2.0μL、0.35 nmol/μL Lys-Bradykinin 2.0μL(0.70nmol)、33μM E. coli フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS(Ala294→Gly)） 1.0μL(33pmol)、26μM L/F転移酵素 1.0μL(26pmol)、0.35mM mTyr 4.0μL(1.4nmol)、 0.025 O.D./μL E. coli tRNAPhe 4.0μL(0.15nmol)混合溶液（mQ水で全量20μLに調節）を作製した。これを5μLで4本に分注し、これら混合溶液を所定の温度(4℃、15℃、26℃、37℃)で20分間反応した。反応後、終濃度が3%になるようTFAを加え、vortexにより混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Example 11) Examination of reaction temperature
10 × aminoacylation buffer A 2.0 μL, 10 × aminoacylation buffer B 2.0 μL, 0.35 nmol / μL Lys-Bradykinin 2.0 μL (0.70 nmol), 33 μM E. coli phenylalanyl tRNA synthetase (PheRS (Ala294 → Gly )) 1.0 μL (33 pmol), 26 μM L / F transferase 1.0 μL (26 pmol), 0.35 mM mTyr 4.0 μL (1.4 nmol), 0.025 OD / μL E. coli tRNA Phe 4.0 μL (0.15 nmol) mixed solution (mQ water) To adjust the total volume to 20 μL). This was dispensed into 4 pieces at 5 μL, and these mixed solutions were reacted at a predetermined temperature (4 ° C., 15 ° C., 26 ° C., 37 ° C.) for 20 minutes. After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, mixed by vortex, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図１２に示す。Ａは4℃、Ｂは15℃、Ｃは26℃、Ｄは37℃の結果を示す。全ての温度で、本発明の方法によりLys-BradykininをmTyrで標識することができた。 The results are shown in FIG. A shows 4 ° C, B shows 15 ° C, C shows 26 ° C, and D shows 37 ° C. At all temperatures, Lys-Bradykinin could be labeled with mTyr by the method of the present invention.
（比較例２）従来法（２工程）によるアミノ酸の導入
mQ水 13.2μL、0.025 O.D./μL E. coli tRNAPhe 16.0μL(0.62nmol)、10×アミノアシル化緩衝液A 8.0μL、10×アミノアシル化緩衝液B 8.0μL、20mM O-メチルチロシン(mTyr) 30.8μL(0.62μmol）、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 4.0μl(0.13nmol)を混合した溶液を2本作製し、37℃で60分間インキュベートした。反応終了後、塩を加えた。そして、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理し、さらに、クロロホルム/イソアミルアルコール処理して、EtOH沈殿させた。70% EtOHで除塩し、減圧乾燥した。乾燥後、一方に、反応緩衝液 1.5μL、0.35nmol/μL Lys-Bradykinin 0.5μL(0.18nmol)、26μM L/F転移酵素 0.5μL(13pmol)を混合し、他方（ネガティブコントロール）には、26μM L/F転移酵素の代わりにL/F転移酵素の透析時に用いた緩衝液 0.5μLを混合し、37℃で30分間インキュベートした。なお、反応緩衝液は、0.33M KCl/83mM Tris-HCl（pH8.0）である。反応後、終濃度が3%になるようにTFAを加え、vortexして混合し、卓上遠心機で1分間遠心した。目的ペプチドをZipTipC18処理（脱塩処理）し、マトリックス(CHCA)を含む溶出液で溶出し、MALDI-TOF-MASSで確認した。
(Comparative Example 2) Introduction of amino acids by conventional method (2 steps)
mQ water 13.2 μL, 0.025 OD / μL E. coli tRNA Phe 16.0 μL (0.62 nmol), 10 × aminoacylation buffer A 8.0 μL, 10 × aminoacylation buffer B 8.0 μL, 20 mM O-methyltyrosine (mTyr) 30.8 Two solutions were prepared by mixing 4.0 μl (0.13 nmol) of μL (0.62 μmol) and 33 μM E. coli PheRS (Ala294 → Gly), and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After completion of the reaction, salt was added. Then, it was treated with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and further treated with chloroform / isoamyl alcohol to precipitate EtOH. The solution was desalted with 70% EtOH and dried under reduced pressure. After drying, mix 1.5 μL of reaction buffer, 0.35 nmol / μL Lys-Bradykinin 0.5 μL (0.18 nmol), 26 μM L / F transferase 0.5 μL (13 pmol) on one side, and 26 μM on the other (negative control) Instead of L / F transferase, 0.5 μL of the buffer used for dialysis of L / F transferase was mixed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction buffer is 0.33M KCl / 83 mM Tris-HCl (pH 8.0). After the reaction, TFA was added to a final concentration of 3%, vortexed and mixed, and centrifuged for 1 minute in a tabletop centrifuge. The target peptide was treated with ZipTip C18 (desalted), eluted with an eluate containing a matrix (CHCA), and confirmed by MALDI-TOF-MASS.
結果を図１３に示す。L/F転移酵素が存在しなかったもの（ネガティブコントロール）では転移反応が起こらなかった（Ａ）。L/F転移酵素を添加したものは転移反応が起こり、Lys-BradykininをmTyrで標識することができた（Ｂ）。 The results are shown in FIG. In the case where L / F transferase was not present (negative control), no transfer reaction occurred (A). When L / F transferase was added, a transfer reaction occurred, and Lys-Bradykinin could be labeled with mTyr (B).
本発明によれば、高効率・簡便かつ低コストに、アミノ酸を目的タンパク質または目的ペプチドに導入することができる。得られた非天然タンパク質または非天然ペプチドは、それら本来の活性を保ったままであり、さらに、蛍光修飾したり、担体上に固定化したりすることができるため、タンパク質またはペプチドの機能解析や、これらを用いて医薬スクリーニングを行うことが可能になると考えられる。 According to the present invention, an amino acid can be introduced into a target protein or target peptide with high efficiency, simplicity and low cost. The obtained non-natural protein or non-natural peptide retains its original activity, and can be further fluorescently modified or immobilized on a carrier. It will be possible to perform pharmaceutical screening using
Claims (9)
１）目的タンパク質または目的ペプチド、
２）導入するアミノ酸であり、フッ素を含有するアミノ酸、
３）tRNA、
４）アミノアシルtRNA合成酵素、
５）アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。 A method for introducing an amino acid into a target protein or target peptide using a mixed solution containing at least the following:
1) target protein or target peptide,
2) Amino acid to be introduced and containing fluorine,
3) tRNA,
4) Aminoacyl tRNA synthetase,
5) Aminoacyl tRNA protein transferase.
2-アミノ-3-(4-フルオロメトキシ-フェニル)-プロピオン酸；
2-アミノ-3-[4-(2-フルオロ-エトキシ)-フェニル]-プロピオン酸。 The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the fluorine-containing amino acid is at least one amino acid selected from the following:
2-Amino-3- (4-fluoromethoxy-phenyl) -propionic acid;
2-Amino-3- [4- (2-fluoro-ethoxy) -phenyl] -propionic acid.
１）tRNA、
２）アミノアシルtRNA合成酵素、
３）アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。 A kit for introducing an amino acid into a target protein or peptide for use in the method according to any one of claims 1 to 7, comprising at least the following:
1) tRNA,
2) aminoacyl-tRNA synthetase,
3) Aminoacyl tRNA protein transferase.
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