JP2009102394A - モラクセラ(ブランハメラ)カタルハリスのポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ポリペプチド、更に特に、モラクセラ(ブランハメラ)カタルハリス〔Moraxella(Branhamella) catarrharis〕の感染の予防、診断及び/又は処置に用いることができるモラクセラ(ブランハメラ)カタルハリスのポリペプチドに関する。
【選択図】図2
Description
国際公開第WO 00/78968号パンフレットは、Moraxella catarrhalis のゲノムからのヌクレオチド配列を開示する。
平成14年11月15日国際出願日の請求の範囲翻訳文は以下の通りである。
[請求項1]
分離されたポリヌクレオチドであって:
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有し;
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有し;
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有し;
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み;
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得;
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み;
(g)配列番号1、3又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項2]
分離されたポリヌクレオチドであって:
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有し;
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有し;
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有し;
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含み;
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得;
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含み;
(g)配列番号1又は3から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項3]
前記ポリヌクレオチドがDNAである請求項1記載のポリヌクレオチド。
[請求項4]
前記ポリヌクレオチドがDNAである請求項2記載のポリヌクレオチド。
[請求項5]
前記ポリヌクレオチドがRNAである請求項1記載のポリヌクレオチド。
[請求項6]
前記ポリヌクレオチドがRNAである請求項2記載のポリヌクレオチド。
[請求項7]
分離されたポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;
前記ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項8]
請求項1記載のポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;
前記ポリペプチドが配列番号2又は4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項9]
請求項2記載のポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;
前記ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項10]
請求項1記載のポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;
前記ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項11]
請求項2記載のポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;
前記ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項12]
分離されたポリヌクレオチドであって、配列番号1、3又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項13]
分離されたポリヌクレオチドであって、配列番号1又は3から選ばれる配列を含む配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項14]
ベクターであって、請求項1記載のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが発現調節領域に操作可能に連結していることを特徴とするベクター。
[請求項15]
ベクターであって、請求項2記載のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが発現調節領域に操作可能に連結していることを特徴とするベクター。
[請求項16]
宿主細胞であって、請求項14記載のベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする宿主細胞。
[請求項17]
宿主細胞であって、請求項15記載のベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする宿主細胞。
[請求項18]
ポリペプチドの製造方法であって、請求項16記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養することを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
[請求項19]
ポリペプチドの製造方法であって、請求項17記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養することを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
[請求項20]
分離されたポリペプチドであって:
(a)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチド;
(e)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド;
(f)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってN末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
[請求項21]
分離されたポリペプチドであって:
(a)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチド;
(e)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド;
(f)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってN末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
[請求項22]
キメラポリペプチドであって、配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を有する2種又はそれより多いポリペプチドを含み;ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するのを条件とすることを特徴とするキメラポリペプチド。
[請求項23]
キメラポリペプチドであって、配列番号2又は4から選ばれる配列を有する2種又はそれより多いポリペプチドを含んでおり、ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するのを条件とすることを特徴とするキメラポリペプチド。
[請求項24]
薬学組成物であって、請求項20〜23のいずれか一項記載のポリペプチド、及び薬学上許容できる担体、希釈剤又は補助剤を含有することを特徴とする薬学組成物。
[請求項25]
薬学組成物であって、請求項20〜23のいずれか一項記載のポリペプチド及びリポソームを含有することを特徴とする薬学組成物。
[請求項26]
中耳炎、副鼻腔炎、持続性咳、急性喉頭炎の治療上の又は予防的な処置のための方法であって、宿主に、請求項24記載の組成物の治療上の又は予防的な量を投与することを含むことを特徴とする方法。
[請求項27]
モラクセラ・カタルハリスの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ・カタルハリス細菌感染の治療上の又は予防的な処置のための方法であって、前記宿主に、請求項24記載の組成物の治療上の又は予防的な量を投与することを含むことを特徴とする方法。
[請求項28]
モラクセラの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ感染の診断のための方法であって、
(a)宿主から生物学的試料を得ること;
(b)本発明のモラクセラのポリペプチドと反応する抗体又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること;及び
(c)モラクセラの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
を含むことを特徴とする方法。
[請求項29]
モラクセラの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ感染の診断のための方法であって、
(a)宿主から生物学的試料を得ること;
(b)本発明の1種又はそれより多いモラクセラのポリペプチド又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること;及び
(c)モラクセラに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出すること
を含むことを特徴とする方法。
[請求項30]
モラクセラの感染を処置するための方法であって、請求項20〜23のいずれか一項記載のポリペプチドを対象とする抗体を用いることを特徴とする方法。
[請求項31]
薬学組成物の使用であって、請求項24記載の薬学組成物をモラクセラの感染の予防的な又は治療上の処置のための薬の製造に用いることを特徴とする薬学組成物の使用。
[請求項32]
薬学組成物の使用であって、請求項25記載の薬学組成物をモラクセラの感染の予防的な又は治療上の処置のための薬の製造に用いることを特徴とする薬学組成物の使用。
[請求項33]
ポリペプチドを含むキットであって、モラクセラの感染の検出又は診断のための請求項20〜23のいずれか一項記載のポリペプチドを含むことを特徴とするキット。
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有し;
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有し;
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有し;
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み;
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得;
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み;
(g)配列番号1、3又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有し;
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有し;
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有し;
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含み;
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得;
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含み;
(g)配列番号1又は3から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチド;
(e)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド;
(f)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってN末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。
(a)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2又は4から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチド;
(e)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド;
(f)配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってN末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;
cys, ser, tyr, thr;
val, ile, leu, met, ala, phe;
lys, arg, orn, his;及び
phe, tyr, trp, his。
また、好ましい置換には、相当するL-アミノ酸についてのD-鏡像異性体の置換が包含される。
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物(complement)のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;前記ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;前記ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;前記ポリペプチドが配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし;前記ポリペプチドが配列番号2又は4から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
(a)宿主から生物学的試料を得ること;
(b)本発明のMoraxellaのポリペプチドと反応する抗体又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること;及び
(c) Moraxellaの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
によることができる。
(a)宿主から生物学的試料を得ること;
(b)本発明の1種又はそれより多いMoraxellaのポリペプチド又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること;及び
(c) Moraxellaに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
のように行うことができる。
(a)宿主から生物学的試料を得ること;
(b)本発明のポリペプチド又はその断片をコード化するDNA配列を有する1種又はそれより多いDNAプローブを生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること;及び
(c) Moraxellaの細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したDNAプローブを検出すること
を含む。
(a)本発明のポリペプチド又はその断片と反応する抗体を検出可能なラベルで標識化すること;
(b)標識化した抗体又は標識化した断片を宿主に投与すること;及び
(c) Moraxellaの存在を示す宿主中の特異的に結合した標識化抗体又は標識化断片を検出すること
を含む。
この例はSHB-MC100遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴付けを例示する。
M. catarrhalis SHB-MC100(配列番号1)遺伝子のコード領域を、PCR〔DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer(DNAサーマル・サイクラー・ジーンアンプ・PCRシステム2400パーキンエルマー), San Jose(サンノゼ),CA(カリフォルニア州)所在〕によって、M. catarrhalisの株ETSU C-2のゲノムDNA から、追加の制限酵素認識部位(restriction site)NdeI(CATATG) 及びNotI(GCGGCCGC)のための塩基伸長(base extension)を含む次のオリゴ:DMAR529(5'-GGGACTTCCATATGCAGTCGCAGAACATCAGCCG-3’)及びDMAR530(5’-ATTATATAGCGGCCGCAAGCCAATGCGTGCCATTTC-3’)を用いて増幅させた。PCR生成物をアガロースゲルから、QIAquick gel extraction kit(QIAクイックゲル抽出キット)を製造者の指示に従い用いて精製し〔Qiagen(チエンゲン社)、Chatsworth(チャッツワース)、CA所在〕、及びNdeI及びNotI〔Amersham Pharmacia Biotech, Inc.(アマシャムファルマシアバイオテク社), Baie d’Urfe(ベーダーフェ), Canada(カナダ国)所在〕を用いて消化した。pET21b(+)ベクター〔Novagen(ノバゲン社), Madison(マディソン), WI(ウィスコンシン州)〕をNdeI及びNotIで消化し、及びアガロースゲルから、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いて精製した。NdeI-NotI PCR生成物をNdeI-NotI pET21b(+)発現ベクターにリゲートした。リゲート生成物を、E. coli株DH5α[φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+) deoR thi-1 supE44 λ ̄gyrA96 relA1]〔Gibco BRL(ギブコBRL社), Gaithersburg(ゲイサーズバーグ), MD(メリーランド州)〕中に、Simanis(シマニス)〔Hanahan(ハナハン), D.のDNA Cloning(DNAクローニング)、1985年、D. M. Glover(グラバー)(編)、109-135頁〕の方法に従って転換させた。SHB-MC100遺伝子を含む組換えpET21b(+)プラスミド(rpET21b(+))を、Qiagen kitを用いて精製し、及びDNA挿入断片(insert)を配列決定した〔Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit(タック・ダイ・デオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンシング・キット), ABI(アプライドバイオシステムズ社), Foster City(フォスターシティ), CA〕。
この例はSHB-MC101遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴付けを例示する。
M. catarrhalisのSHB-MC101遺伝子(配列番号3)のコード領域を、PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer)によって、M. catarrhalisの株ETSU C-2から、追加の制限酵素認識部位NdeI(CATATG)及びXhoI(CTCGAG)のための塩基伸長を含む次の:表1に示すDMAR614及びDMAR615のオリゴを用いて増幅させた。SHB-MC101遺伝子の発現ベクター中へのクローニング及び配列決定のために用いる方法は、例1に記載した方法と同様である。
この例は、M. catarrhalisの遺伝子のCMVプラスミドpCMV-GHにおけるクローニングを例示する。
M. catarrhalisのポリペプチドのDNAコード領域を、プラスミドベクターpCMV-GH〔Tang(タン)等, Nature, 1992年, 356:152〕においてサイトメガロウイルス(CMV)プロモータの転写調節下にあるヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子の下流の相(phase downstream)に挿入した。CMVプロモータは、E. coli細胞中で非機能性のプラスミドであるが、真核細胞中へのプラスミドの投与の際、活性である。また、ベクターはアンピシリン耐性遺伝子を組み込む。
この例は、M. catarrhalisのポリペプチド抗原に対する免疫反応を誘発するためのDNAの使用を例示する。
8匹のメスのBALB/cマウス〔Charles River(チャールズリバー), St-Constant(セントコンスタント), Quebec, Canada〕の群を、50μgの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)−発現プラスミドpCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)の存在下に、SHB-MC100(配列番号1)及びSHB-MC101(配列番号3)の遺伝子をコード化する組換えpCMV-GHの50μgで、2又は3週の間隔で100μLの3回の筋肉内注射によって免疫化した。コントロールとして、マウスの群に、50μgのpCMV-GH-GM-CSFの存在下の50μgのpCMV-GHを注入した。血液試料を、眼窩の洞(orbital sinus)から各免疫化に先立って及び3回目の注射後の7日に収集した。血清抗体応答を、対応するHis-Tag標識化したM. catarrhalisの組換えポリペプチドを被覆抗原として用いるELISAによって決定した。これらのHis-tag標識化したM. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産及び精製を例5において示す。
この例は、M. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産及び精製を例示する。
SHB-MC100(配列番号1)及びSHB-MC101(配列番号3)の遺伝子を有する組換えpET21プラスミドを用い、E. coli株BL21(DE3)[F- ompT hsdSB(r- Bm- B) gal dcm (DE3)](Novagen)をエレクトロポレーション〔Gene Pulser II apparatus(ジーン・パルサーII装置), BIO-RAD Labs(バイオラド・ラボラトリーズ社), Mississauga(ミシサーガ), Canada〕によって形質転換した。このE. coli株において、組換えポリペプチドの発現を制御するT7プロモータはT7 RNAポリメラーゼ(λDE3プロファージ上に存在)によって特異的に認識され、その遺伝子はイソプロピル-β-d-チオ-ガラクトピラノシド(IPTG)によって誘導可能なlacプロモータの制御下にある。形質転換体BL21(DE3)/rpET21を、37℃において250rpmで撹拌しながら、1mL当たり100μgのカルベニシリン〔Sigma-Aldrich Canada Ltd.(シグマ−アルドリッチ・カナダ社), Oakville(オークビル), Canada所在〕を含有するLBブロス(培養液)(ペプトン10g/L,酵母抽出物5g/L, NaCl 10g/L)中で、A600が0.5の値に達するまで増殖させた。His-標識付けされたM. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産を誘導するため、細胞を追加の3時間、1mMの終濃度のIPTGの存在下にインキュベートした。500mLの培養物から誘導された細胞を遠心分離によってペレット化し、及び-70℃で凍らせた。
この例は、His-標識付けした(tagged)M. catarrhalisの組換えSHB-MC100ポリペプチドと、ヒト口蓋扁桃及びM. catarrhalisの抗原性調製物(antigenic preparation)で免疫化した後のマウスから収集した血清中に存在する抗体との反応性を例示する。
表3に示すように、SHB-MC100のHis-標識付け組換えポリペプチドは、正常ヒト口蓋扁桃中に存在する抗体によって免疫ブロットにおいて認識された。これは、普通にM. catarrhalisに接触したヒトが、このポリペプチドに特異的な抗体を発生させることを示す。これらの特定のヒト抗体は、M. catarrhalisの感染に対する保護に関与している。加えて、免疫ブロットは、また、マウスモデルにおいて有意な肺クリアランスを誘導する膜ポリペプチドの豊富なM. catarrhalisの抗原性調製物で免疫化されたマウスから収集した血清もまた、このポリペプチドを認識する抗体を発生させることを明らかにした。これらの結果は、このポリペプチドが、マウスを感染に対して保護し、及びそれが対応するSHB-MC100のHis-標識付け組換えポリペプチドと反応する抗体を誘導するM. catarrhalisの抗原性調製物中に存在することを示す。
2His-標識付け組換えポリペプチドの分子量をSDS-PAGE後に評価した。
3ヒト口蓋扁桃からの抽出物を希釈しないで免疫ブロッティングを行った。
4膜ポリペプチドの豊富なM. catarrhalisの抗原性調製物での免疫化後に収集したマウス血清をプールし及び1/500に希釈して免疫ブロッティングを行った。これらのマウスはM. catarrhalisの負荷(challenge)に対して保護された。
この例は、SHB-MC100及びSHB-MC101ポリペプチドの抗体のM. catarrhalis株の表面での到達性を例示する。
細菌を、1%のブドウ糖を含有する脳心臓滲出物(BHI)のブロス中で8%のCO2雰囲気において37℃で増殖させ、0.650のOD490nmを与えた(〜108CFU/mL)。次いで、抗-SHB-MC100又は抗-SHB-MC101又はコントロールの血清の希薄物を添加し、及び細胞に結合させ、それらを回転させながら2時間4℃でインキュベートした。試料を、阻止緩衝液(blocking buffer)[2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するphosphate-buffered saline(リン酸緩衝食塩水)(PBS)]中で4回洗浄し、及び次に阻止緩衝液中で特異的な希釈された1mLのヤギのフルオレッセイン(FITC)-複合化(conjugated)抗-マウスIgG Fc(ガンマ)断片を添加した。暗所で回転させながらの室温で60分間の付加的なインキュベーションの後、試料を4回阻止緩衝液中で洗浄し、及びPBS緩衝液中の0.25%のホルムアルデヒドを用い18時間4℃で固定した。細胞を、フローサイトメトリ[Epics(R)(エピクス) XL; Beckman Coulter, Inc.(ベックマン・クールター社)]によって分析するまで4℃の暗所で保った。フローサイトメトリの分析は、SHB-MC100-及びSHB-MC101-特異的抗体が、試験されたM. catarrhalisの異種株ETSU 658上のそれらの対応する表面露出されたエピトープを効率的に認識することを明らかにした(表4)。分析されたMoraxellaの10,000個の細胞の70 %より多くが、SHB- MC100-及びSHB-MC101-特異的血清中に存在する抗体でラベルされることが決定された。これらの観察は、SHB-MC100及びSHB-MC101のポリペプチドがその表面で接近可能であり、そこで、それらが抗体によって容易に認識され得ることを明確に示す。抗-M. catarrhalis抗体は、M. catarrhalisの感染に対する保護において重要な役割を担うことが示された。
2蛍光指標を、コントロールマウスの血清について得られた蛍光値によって分けられた免疫血清で細胞をラベルした後に得られた中央(median)蛍光値として計算した。1の蛍光値は、無傷のMoraxella細胞の表面で抗体の結合がなかったことを示した。
3分析された10,000個の細胞の中からのラベル化細胞の%である。
4未免疫の又は見せかけに免疫化した(sham-immunized)マウスから収集した血清を、プールし、1/50に希釈し、及びこのアッセイのための陰性コントロールとして用いた。
5 M. catarrhalis株ETSU-658からの精製した外膜ポリペプチドの20μgで免疫化したマウスから得た血清を、1/1000に希釈し、及び陽性コントロールとしてアッセイに用いた。
この例は抗−組換えポリペプチドマウス血清の殺菌活性を例示する。
細菌を、チョコレート寒天プレート上で平板培養し、及び37℃の8%CO2雰囲気中で16時間インキュベートした。次いで、細菌細胞を、溶菌緩衝液[10%のHanks' Balanced Salt Solution(ハンクスの平衡塩類溶液、HBSS)及び1%の加水分解カゼイン, pH7.3]中で0.25のOD490nmまで再懸濁させ、及び8×104CFU/mLに希釈した。殺菌性のアッセイは、25μLの細菌の懸濁液を50μLの希釈し熱-不活化された試験血清及び15μLのHBSSと混合すること、及び撹拌(200rpm)しながら15分間37℃の8%CO2でのインキュベーションによって行った。次いで、ラビットの補体含有血清を10%の終濃度まで添加し、及び混合物を撹拌しながら(200rpm)、追加の60分間、37℃、8%CO2でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、生細菌の数をチョコレート寒天プレート上で10μLのアッセイの混合物を平板培養することによって決定した。プレートを37℃の8%CO2雰囲気中18〜24時間インキュベートした。コントロールは、免疫化前のマウスから収集した熱-不活化血清及びラビットの補体と共にインキュベートした細菌からなった。M. catarrhalisの株ETSU 658を、血清の殺菌活性を評価するのに用いた。殺菌性の力価は、コントロールと比較した50%又はそれより高い細菌の死滅をもたらす最も高い血清の希釈と定めた。
この例は、精製した組換えポリペプチドでの免疫化によって誘導されるM. catarrhalis の感染に対するマウスの保護を例示する。
8匹のメスのBALB/cマウス(Charles River)の群を、10%のQuilAアジュバント(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下に、組換えSHB-MC100又はSHB-MC101ポリペプチドのいずれかの20μgでか、又は、コントロールとして、PBS中のQuilAアジュバント単独で、2週の間隔の5回、皮下により免疫化した。血液試料を、眼窩の洞から、各免疫化に先立って0、14、28、42、及び56日及び5回目の注射後の14日(70日)に収集した。1週間後、マウスを、およそ1×106 CFUのM. catarrhalisの異種株ETSU 658で肺内に負荷した。M. catarrhalisの負荷接種材料(inoculum)をチョコレート寒天プレート上で平板培養し、CFUを決定し、及び負荷投与量を確かめた。マウスを、感染後5時間でペントバルビタールナトリウム〔EuthanylTM(ユーサネイル)〕の腹腔内注入によって殺した。無傷の肺を切除し、及び組織ホモジナイザ中で均質化した。肺のホモジネートを、CFU決定用の連続希釈物の平板培養によって、細菌クリアランスについて評定した。表5に示すように、負荷後(postchallenge)5時間で回収した細菌の数は、コントロール群と比較されたSHB-MC100又はSHB-MC101のポリペプチドのいずれかで免疫化された群について著しく減少した。 したがって、組換えSHB-MC100及びSHB-MC101のポリペプチドでの免疫化は、マウスの肺からのM. catarrhalisの異種株の急速なクリアランスを促進した。
Claims (1)
- 分離されたポリペプチドであって、
(a)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド、
(b)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド、
(c)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第2のポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド、
(d)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチド、
(e)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド、
(f)配列番号2、4又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分、
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってN末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド、
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを備えることを特徴とするポリペプチド。
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