JP2009095284A - Indole oxidase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インドール酸化活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質の製造方法及び該タンパク質を使用したインジゴ関連化合物の生産方法に関する。 The present invention relates to a protein having indole oxidation activity, a gene encoding the protein, a method for producing the protein, and a method for producing an indigo-related compound using the protein.
インジゴ関連化合物は工業的には染料として知られ、古くから織物の染色剤として利用されている。また、食品添加物や顔料、抗菌剤や抗腫瘍剤など薬品の原料としても利用されている。インジゴの製造は古くは植物から採取される天然インジゴが唯一の原料であったが、19世紀にインジゴを化学的に合成する手法が開発された。一方、日本における藍染めの一部には、インジゴを生産する微生物を利用した染色法が現在も利用されている。 Indigo-related compounds are industrially known as dyes and have long been used as textile dyes. It is also used as a raw material for drugs such as food additives, pigments, antibacterial agents and antitumor agents. Indigo was originally made from natural indigo extracted from plants, but in the 19th century, a method for chemically synthesizing indigo was developed. On the other hand, dyeing methods using indigo-producing microorganisms are still used for some indigo dyeings in Japan.
微生物酵素を用いたインジゴ関連化合物の合成は、環境低負荷型の技術として注目されている。インドールの微生物変換に関わるいくつかの遺伝子・酵素が既に報告されている(非特許文献1〜4参照)。
これまでに図1に示すような経路でのインドールからインジゴ関連化合物の合成が報告されている。これらの反応は微生物の生産するジオキシゲナーゼ、あるいはモノオキシゲナーゼにより進行することが知られている。
Synthesis of indigo-related compounds using microbial enzymes has attracted attention as a low environmental load technology. Several genes and enzymes related to indole microbial conversion have already been reported (see Non-Patent Documents 1 to 4).
So far, the synthesis of indigo-related compounds from indole via the route shown in FIG. 1 has been reported. These reactions are known to proceed by dioxygenase or monooxygenase produced by microorganisms.
インドールの物質変換に関わる微生物遺伝子・酵素が既に報告されているが、それら全てが複数のタンパク質(サブユニット)が結合することで機能する酵素(マルチコンポーネント酵素)であり、酵素を製造するには複数の遺伝子を共発現することが必要である。しかし、複数の遺伝子を共発現するためには、高度な技術と多くの労力を要する。例えば、インドールの酸化に関わる遺伝子がオペロンを形成している場合には、オペロンの上流に強力なプロモーターと、全ての遺伝子の上流にmRNAへの転写に必要なリボソームバインディングサイト(以下「RBS」とも示す)を挿入する必要がある。また、インドールの酸化に関わる遺伝子がオペロンを形成していない場合には、複数のベクターを利用して、各遺伝子を宿主へ導入する必要がある。このような微生物を培養する場合に、ベクターを宿主内で安定的に保持するために、複数の抗生物質を添加した選択培地を利用しなければならない。 Microbial genes and enzymes related to indole substance conversion have already been reported, but all of them are enzymes (multicomponent enzymes) that function by combining multiple proteins (subunits). It is necessary to co-express multiple genes. However, co-expression of multiple genes requires advanced techniques and a lot of effort. For example, when a gene involved in indole oxidation forms an operon, a strong promoter upstream of the operon and a ribosome binding site (hereinafter referred to as `` RBS '') necessary for transcription into mRNA upstream of all genes. Need to be inserted). In addition, when a gene involved in indole oxidation does not form an operon, it is necessary to introduce each gene into a host using a plurality of vectors. When culturing such microorganisms, a selective medium to which a plurality of antibiotics are added must be used in order to stably maintain the vector in the host.
本発明の課題は、このような製法上の欠点を内包しない新規なインドール酸化酵素を見いだすとともに、該酵素をコードする遺伝子を提供して、遺伝子工学的手法によりインドール酸化酵素を効率的に製造する点にあり、さらに、該酵素を用いたインドールの酸化によって有用なインジゴ関連化合物を製造する点にある。 An object of the present invention is to find a novel indole oxidase that does not include such a manufacturing defect, and to provide a gene encoding the enzyme to efficiently produce the indole oxidase by a genetic engineering technique. In addition, a useful indigo-related compound is produced by oxidation of indole using the enzyme.
本発明者らは、インドール酸化酵素を製造するためには、複数の遺伝子の共発現が必要であるという問題点を解決すべく鋭意検討した結果、本発明者が構築したメタゲノムライブラリーから抽出して得たDNA中に単一のタンパク質で活性を有する新規インドール酸化酵素をコードする遺伝子を見いだすとともに、該遺伝子を発現して新規インドール酸化酵素を得ることに成功し、さらに、該酵素を用いてインジゴ関連化合物を安定して効率的に合成し得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなる、インドール酸化活性を有するタンパク質。
(2)上記(1)に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(3)以下の(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドからなるインドール酸化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列において、1または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド
(c)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(4)上記(2)または(3)に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を含むベクター。
(5)上記(4)記載のベクターを含む形質転換体。
(6)上記(5)に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からインドール酸化活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、インドール酸化活性を有するタンパク質の製造方法。
(7)上記(5)に記載の形質転換体または上記(1)に記載の酵素とインドール化合物とを接触させることを特徴とする、インジゴ関連化合物の製造方法。
(8)インジゴ関連化合物が、インジゴ、インジルビン、イサチン及びそれらの誘導体からなる群から選択される1またはそれ以上の化合物であることを特徴とする、上記(7)に記載の方法。
As a result of intensive studies to solve the problem that co-expression of a plurality of genes is necessary for producing indole oxidase, the present inventors have extracted from a metagenomic library constructed by the present inventors. In the obtained DNA, a gene encoding a novel indole oxidase having activity with a single protein was found, and the gene was successfully expressed to obtain a novel indole oxidase. It has been confirmed that indigo-related compounds can be synthesized stably and efficiently, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
(1) A protein having indole oxidation activity consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or consisting of a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 .
(2) A gene encoding the protein according to (1) above.
(3) A gene encoding a protein having indole oxidation activity comprising the following polynucleotide (a), (b) or (c):
(A) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence (b) one or several in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the base sequence complementary to the base sequence (C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) 4) A vector comprising at least one gene selected from the genes described in (2) or (3) above.
(5) A transformant comprising the vector according to (4) above.
(6) A method for producing a protein having indole oxidation activity, comprising culturing the transformant according to (5) above and collecting a protein having indole oxidation activity from the obtained culture.
(7) A method for producing an indigo-related compound, comprising contacting the transformant according to (5) or the enzyme according to (1) above with an indole compound.
(8) The method according to (7) above, wherein the indigo-related compound is one or more compounds selected from the group consisting of indigo, indirubin, isatin and derivatives thereof.
本発明により新規のインドール酸化活性を有するタンパク質(以下、単にインドール酸化酵素という場合がある。)及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。本発明のインドール酸化酵素は、単一のコンポーネントでからなることから、該酵素を遺伝子工学的手法で生産する際、該酵素をコードする遺伝子は単一のプロモーターによって遺伝子発現を調節することができる。一方、複数のサブユニットからなる従来のインドール酸化酵素は、その生産において複数のベクターを利用して遺伝子を宿主に導入して共発現しなくてはならず、宿主内での遺伝子の安定性に問題があったが、本発明によれば、このような従来法の問題点が解消され、本発明の上記遺伝子を導入した微生物の培養による酵素の製造はより効率的でかつ容易であり、インジゴ関連化合物を合成する上で極めて有利である。
以下に本発明を詳細に説明する。
The present invention provides a protein having a novel indole oxidation activity (hereinafter sometimes simply referred to as indole oxidase) and a gene encoding the protein. Since the indole oxidase of the present invention consists of a single component, when the enzyme is produced by genetic engineering techniques, the gene encoding the enzyme can regulate gene expression by a single promoter. . On the other hand, a conventional indole oxidase consisting of a plurality of subunits must be co-expressed by introducing a gene into a host using a plurality of vectors in the production thereof, and the stability of the gene in the host is increased. However, according to the present invention, the problems of the conventional method are solved, and the production of the enzyme by culturing the microorganism into which the above gene of the present invention has been introduced is more efficient and easy. This is very advantageous for the synthesis of related compounds.
The present invention is described in detail below.
1. インドール酸化酵素
本発明のインドール酸化酵素はインドールをイサチン、Indoxyl 3-oxindoleを経由してインジゴあるいはインジルビンに変換する反応を触媒するものであり、その推定反応経路は図1に示される。
本発明のインドール酸化酵素は、単一のコンポーネントからなり、そのアミノ酸配列は配列番号1に示される。しかしこれのみではなく、インドール酸化活性を有するものである限り、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変位型インドール酸化酵素も包含する。
1. Indole Oxidase The indole oxidase of the present invention catalyzes a reaction for converting indole into indigo or indirubin via isatin and Indoxyl 3-oxindole, and its estimated reaction path is shown in FIG.
The indole oxidase of the present invention consists of a single component, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1. However, as long as it has indole oxidation activity, not only this but a displacement type indole oxidase comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Is also included.
2.インドール酸化酵素遺伝子
本発明の端緒となったインドール酸化酵素遺伝子はコークス炉廃水処理に用いる活性汚泥から構築されたメタゲノムライブラリーを使用して単離されたものである。
このように単離されたインドール酸化酵素遺伝子の具体的な塩基配列は、配列番号2に示されるが、本発明のインドール酸化酵素遺伝子は、配列番号2に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、配列番号2に示される塩基配列と相補の塩基配列、あるいはこれらの塩基配列により導き出されるアミノ酸配列情報から容易に得られるポリヌクレオチドを含む。
これらポリヌクレオチドとしては、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるインドール酸化酵素をコードするポリヌクレオチド、あるいは、該アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する変異型インドール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが挙げられ、さらに、配列番号2に示される塩基配列において、1または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるものであって、インドール酸化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも挙げられる。なお、本発明のポリヌクレオチドとはDNAまたはRNAを意味する。
2. Indole Oxidase Gene The indole oxidase gene that led to the present invention was isolated using a metagenomic library constructed from activated sludge used for coke oven wastewater treatment.
The specific base sequence of the indole oxidase gene isolated in this way is shown in SEQ ID NO: 2, but the indole oxidase gene of the present invention is not only a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. In addition, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide easily obtained from amino acid sequence information derived from these nucleotide sequences is included.
These polynucleotides include a polynucleotide encoding indole oxidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence. A polynucleotide encoding a mutant indole oxidase, and further comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, A polynucleotide encoding a protein having indole oxidation activity is also included. The polynucleotide of the present invention means DNA or RNA.
このような変異型遺伝子は、例えば、他のインドール酸化活性を持つ細菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。遺伝子への変異の導入法は限定されないが、市販の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan-K(TAKARA社製)やMutan-G(TAKARA社製))などを用いることができる。
Such a mutant gene can be prepared, for example, by performing PCR from a DNA prepared from another bacterium having indole oxidation activity, using a primer designed based on the base sequence of the gene.
In addition, mutants of the gene of the present invention having the above functions or activities can be synthesized by site-directed mutagenesis. The method for introducing a mutation into a gene is not limited, but a mutation introduction kit (for example, Mutan-K (TAKARA) or Mutan-G (TAKARA)) using a commercially available site-directed mutagenesis method is used. Can be used.
これらの変異型遺伝子により作製される組換えタンパク質が酵素活性を有するか否かは、変異タンパク質をインドールと反応させることによって、図1の反応生成物を生成する機能乃至活性を測定することにより確認することができる。さらに、上記配列番号2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明のインドール酸化酵素遺伝子に含まれる。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性(70-80 % 以上)を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。また、本発明において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、2 x SSC、0.1 % SDS及び50 % ホルムアミドの溶液中で25℃にて加温した後、0.1 x SSC、0.1 % SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件をいう。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、これら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
Whether or not the recombinant protein produced by these mutant genes has enzyme activity is confirmed by measuring the function or activity of generating the reaction product of FIG. 1 by reacting the mutant protein with indole. can do. Furthermore, the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide that hybridizes with a sequence complementary to the sequence under stringent conditions and encodes a protein having each function or activity is also provided. Included in the indole oxidase gene of the invention.
Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, it refers to conditions under which DNA having high homology (70-80% or more) hybridizes. In the present invention, “stringent conditions” refers to, for example, heating in a solution of 2 × SSC, 0.1% SDS and 50% formamide at 25 ° C., and then in a solution of 0.1 × SSC, 0.1% SDS. The conditions for washing at 68 ° C. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and the same stringency can be realized by appropriately selecting these factors.
3.インドール酸化遺伝子を含む組換えベクターと宿主
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに、それ自体周知乃至公知の方法により本発明のインドール酸化遺伝子を連結することにより得られる。
本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。
ベクター中に導入する遺伝子の方向及び順序は、遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。
3. Recombinant Vector Containing Indole Oxidized Gene and Host The recombinant vector of the present invention can be obtained by linking the indole oxidized gene of the present invention to an appropriate vector by a method known per se or known.
The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, such as a plasmid, a cosmid, or a bacteriophage. Further, the host such as Escherichia coli and actinomycetes is not limited as long as the vector functions.
The direction and order of the gene to be introduced into the vector may be arbitrarily selected and sequenced as long as the gene is expressed and the expressed protein can function as an enzyme.
4.本発明のベクターを含む形質転換体:
本発明の形質転換体は、上記ベクターを宿主微生物に導入して形質転換することにより得られるが上記組換えベクターを導入は、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)等のそれ自体周知乃至公知の手法により行えばよい。
また、形質転換に使用する宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば大腸菌、Pseudomonas 菌、Ralstonia菌、Rhizobium菌等が挙げられる。またベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮し用いることによって、高いインドール酸化活性を持つ形質転換微生物を作製することが可能である。
4). Transformant containing the vector of the present invention:
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the above vector into a host microorganism and transforming, but the above recombinant vector can be introduced by electroporation, protoplast method, calcium chloride method (spheroplast method). Such a method may be performed by a known or publicly known method.
The host microorganism used for transformation is not particularly limited as long as it can express the gene of the present invention, and examples thereof include Escherichia coli, Pseudomonas bacteria, Ralstonia bacteria, and Rhizobium bacteria. Moreover, it is possible to produce a transformed microorganism having a high indole oxidation activity by using a combination of a vector, a host, an induction substrate that induces high expression, a promoter, an operator, an enhancer, and the like.
5. インドール酸化酵素の製造方法
本発明において、目的のインドール酸化酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
5. Production Method of Indole Oxidase In the present invention, the target indole oxidase can be obtained by culturing the microorganism having the gene encoding it and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, or disrupted cells. The method of culturing the microorganism of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing microorganisms. As a medium for culturing microorganisms such as actinomycetes and bacteria, any medium that contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and that can efficiently culture microorganisms can be used. Any of synthetic media may be used.
例えば、上記で示した組換え大腸菌の場合は当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてIPTGなどの誘導物質を加えることにより、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜、抗生物質を加えたLB培地(1.0 % ペプトン、0.5 % 乾燥酵母エキス、1.0 % NaClから成る)で37℃、8-12時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいLB培地に容量比1-5 % 植菌、37℃、2-4時間本培養し、IPTGを加えさらに30℃で2-4時間培養する。 For example, in the case of the recombinant E. coli shown above, it is cultured in a nutrient medium usually used in this research field, and if necessary, an inducer such as IPTG is added to increase the enzyme in the nutrient medium in which E. coli can grow. Expression can be performed. Under normal culture conditions, pre-cultured for 8-12 hours at 37 ° C in LB medium (1.0% peptone, 0.5% dry yeast extract, 1.0% NaCl) supplemented with antibiotics. As a seed, inoculate a new LB medium at a volume ratio of 1-5%, main culture at 37 ° C for 2-4 hours, add IPTG, and further culture at 30 ° C for 2-4 hours.
培養後、目的の酵素のタンパク質が菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより当該酵素タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。目的のタンパク質が得られたか否かは、SDS-PAGE等により確認することができる。 When the protein of the target enzyme is produced after culturing, the enzyme protein is extracted by crushing the microbial cell. When the target protein is produced outside the cells, the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, The target protein can be isolated and purified from Whether or not the target protein has been obtained can be confirmed by SDS-PAGE or the like.
6. インジゴ関連化合物の生産方法:
本発明のインジゴ関連化合物の生産方法は、上記の微生物及び/又は酵素を利用して行うことを特徴とするものであり、具体的には、上記微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び/又は上記単離した酵素とインドール類化合物とを接触させる方法である。
本発明において、分解対象となるインドール類化合物としては、限定されるものではないが、例えば、インドール及びその誘導体等が挙げられる。しかし、酵素と反応する基質はその活性を示す限り限定するものではない。
6. Production method of indigo related compounds:
The indigo-related compound production method of the present invention is characterized in that it is carried out using the above-mentioned microorganism and / or enzyme. Specifically, the cultured cell or resting cell of the above-mentioned microorganism and / or This is a method of bringing the isolated enzyme into contact with an indole compound.
In the present invention, the indole compound to be decomposed is not limited, and examples thereof include indole and derivatives thereof. However, the substrate that reacts with the enzyme is not limited as long as it shows its activity.
培養菌体又は休止菌体を用いる場合は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてインドール類化合物の酸化反応に供する。緩衝液としては種々の緩衝液を使用でき、また緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌懸濁液の濃度は、600ナノメートルの濁度で1-2が好適であり、必要に応じて増減できる。一方、上述のように単離・精製したインドール酸化酵素を使用する場合には、適当な緩衝液、水等に懸濁して調製した酵素懸濁液としてインドール類化合物の酸化反応に供する。 When cultured cells or resting cells are used, they are subjected to an indole compound oxidation reaction as a cell suspension prepared by suspending in an appropriate buffer. Various buffers can be used as the buffer, and water, a medium, or the like can be used instead of the buffer. The concentration of the bacterial suspension is preferably 1-2 at a turbidity of 600 nanometers, and can be increased or decreased as necessary. On the other hand, when the indole oxidase isolated and purified as described above is used, the indole compound is subjected to an oxidation reaction as an enzyme suspension prepared by suspending in an appropriate buffer solution, water or the like.
これらの酸化反応に好適な条件は、インドール類化合物を基質として本発明のインドール酸化酵素、あるいは該酵素を含有する菌体懸濁液を作用させた後、例えば、インドール類化合物の分解率を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などを使用して測定することにより、選定できる。この測定においては必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明においては、特にこれらの実施例に限定されるものではない。
Conditions suitable for these oxidation reactions include, for example, increasing the degradation rate of indole compounds after allowing the indole oxidase of the present invention or a cell suspension containing the enzyme to act on the indole compounds as a substrate. It can be selected by measuring using liquid chromatography (HPLC) or the like. In this measurement, other analysis methods may be used together if necessary.
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not particularly limited to these examples.
実施例1
コークス炉廃水処理に用いる活性汚泥から複合微生物のDNAを抽出し、メタゲノムライブラリーを構築した。メタゲノムライブラリーは宿主として大腸菌(Escherichia coli)EPI300株とベクターとしてフォスミド(Fosmid)ベクターを利用し、平均約30 kbp の長さのDNAを含むクローンを取得した。
次いで、インドール酸化遺伝子を単離するため、メタゲノムライブラリーを培養したLB(Luria-bertani)寒天培地上にBacillus subtilis を懸濁した0.7 % 寒天を含むLB培地を重層した。メタゲノムクローンの周りにB.subtilis菌の生育阻害による阻止円が形成するクローンを選択分離し、フォスミドDNAを抽出して塩基配列の決定を行った。その中でメタゲノムクローンM103 株から得られたDNAが、Acyl-CoA dehydrogenase遺伝子と相同性がある新規の遺伝子であることが明らかとなり、該遺伝子がインドール酸化酵素をコードする遺伝子と同定し、Indole-catabolizing proteinの略を用い、icpと命名した。
Example 1
A metagenomic library was constructed by extracting the DNA of complex microorganisms from activated sludge used for coke oven wastewater treatment. The metagenomic library used Escherichia coli EPI300 strain as a host and a Fosmid vector as a vector, and clones containing DNA having an average length of about 30 kbp were obtained.
Subsequently, in order to isolate the indole oxidation gene, an LB medium containing 0.7% agar in which Bacillus subtilis was suspended was layered on an LB (Luria-bertani) agar medium in which the metagenomic library was cultured. Clones that formed a blocking circle due to inhibition of growth of B. subtilis around the metagenomic clones were selectively isolated, and fosmid DNA was extracted to determine the nucleotide sequence. DNA obtained therein from metagenome clones M103 strain becomes clear that a novel gene is Acyl-CoA Dehydrogenase gene homology was identified as the gene encoded by the gene is an indole oxidase, I Ndole - using substantially the c atabolizing p rotein, it was named icp.
実施例2
メタゲノムクローン M103 株より単離した icp 遺伝子を含むベクター DNA であるpM103を鋳型に、下記の様に設計したプライマーセットを用いPCRを行い、icp遺伝子をコードするDNA断片の増幅を試みた。PCR反応は、DNA断片10ngと鋳型として、下記の様に設計したプライマーおよびEX-Taq polymerase(タカラバイオ社製)を用いて、94℃10秒、55℃30秒、72℃60秒、30サイクルのPCRを行った。
Example 2
Using pM103, a vector DNA containing the icp gene isolated from the metagenomic clone M103, as a template, PCR was performed using the primer set designed as described below, and amplification of the DNA fragment encoding the icp gene was attempted. PCR reaction was performed at 94 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 60 seconds, 30 cycles using 10 ng of DNA fragment and a primer and EX-Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) designed as follows. PCR was performed.
プライマーセット:
M103F-REC2; 5’-GGAATTCCATATGAACATCCAGAAAGAACCCTTTA(配列番号3)
M103R-REC2; 5’-CGGGATCCTTAGTCGCGTTCGCCCTCGTTGTAT(配列番号4)
Primer set:
M103F-REC2; 5'-GGAATTCCATATGAACATCCAGAAAGAACCCTTTA (SEQ ID NO: 3)
M103R-REC2; 5'-CGGGATCCTTAGTCGCGTTCGCCCTCGTTGTAT (SEQ ID NO: 4)
得られたDNA断片をpCR2.1 TOPO TA クローニングキット(Novagen社製)を利用して、PCR により増幅されたDNA断片の突出末端配列に特異的に結合するTAクローニングベクターであるpCR2.1 TOPO ベクター(Novagen社製)に導入した。pCR2.1 TOPOベクターは開始コドンとするATGとその上流にRBS、さらに上流にLacプロモーターを含むもので、用いる遺伝子をその開始コドンと読み枠に合わせて導入することにより、他菌株からの遺伝子でも効率的な発現が期待できるものである。構築したプラスミドを宿主としてEscherichia coli TOP10株(Novagen社製)へエレクトロポレーション法により形質転換した。 Using the pCR2.1 TOPO TA Cloning Kit (Novagen), the obtained DNA fragment is a pCR2.1 TOPO vector that specifically binds to the overhanging sequence of the DNA fragment amplified by PCR. (Novagen). The pCR2.1 TOPO vector contains ATG as the start codon, RBS upstream, and Lac promoter upstream, and by introducing the gene to be used in accordance with the start codon and reading frame, even genes from other strains can be introduced. Efficient expression can be expected. Using the constructed plasmid as a host, Escherichia coli TOP10 strain (Novagen) was transformed by electroporation.
実施例3
(1)上記実施例2で得られた組換え大腸菌を3 ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。次いで、この前培養液を種菌として、新しい1 literのLB培地に1 ml植菌し、37℃で一晩培養した。培養後、菌液を250 ml容量の遠心チューブに入れ6,000 rpmで15分遠心し、集菌した。集菌してペレット化した菌体に40 mlのLB培地を加え、菌該ペレットを溶解し、さらに、80 mlのクロロホルムを加え、10分間手動で撹拌した。
この後、8,000 rpmで15分間遠心分離を行い、クロロホルム層(下層)のみをガラスのバイアルに移し、窒素ガス吹きつけによってガラスバイアル中のクロロホルムを気化した。
残留物に量のクロロホルムに加え溶解した。該溶解液は紺色を呈し、赤色と青色の色素を含有していた。
Example 3
(1) The recombinant Escherichia coli obtained in Example 2 was inoculated into 3 ml LB medium and pre-cultured by shaking overnight at 37 ° C. Subsequently, 1 ml of this preculture was inoculated into a new 1 liter LB medium as an inoculum, and cultured overnight at 37 ° C. After culturing, the bacterial solution was placed in a 250 ml centrifuge tube and centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes to collect the cells. 40 ml of LB medium was added to the cells collected and pelleted to dissolve the bacteria, and 80 ml of chloroform was further added, followed by manual stirring for 10 minutes.
Thereafter, centrifugation was performed at 8,000 rpm for 15 minutes, and only the chloroform layer (lower layer) was transferred to a glass vial, and the chloroform in the glass vial was vaporized by blowing nitrogen gas.
The residue was dissolved in an amount of chloroform. The solution was amber and contained red and blue pigments.
(2)シリカゲルカラムを用いて、上記(1)で得られた溶解液中の赤色と青色の2種類の色素を精製し、以下の条件でTLC分析を行った。
固定相カラム; 内径2.7 mm、長さ15 cm、シリカゲル充填
展開溶媒; クロロホルム:ジエチルエーテル= 4 : 1
TLC分析条件 (Merck社 TLCプレート 20×20 シリカゲル60F254)
展開溶媒; クロロホルム : ジエチルエーテル= 1 : 1
(2) Using a silica gel column, two types of red and blue dyes in the solution obtained in (1) above were purified, and TLC analysis was performed under the following conditions.
Stationary phase column; ID 2.7 mm, length 15 cm, packed with silica gel Developing solvent; Chloroform: diethyl ether = 4: 1
TLC analysis conditions (Merck TLC plate 20 × 20 silica gel 60F 254 )
Developing solvent; chloroform: diethyl ether = 1: 1
TLC分析の結果から、icp遺伝子を発現する組換え大腸菌は2種類の色素を生産し、Rf値(Relative to Front)の計測からそれぞれインジゴ、インジルビンと同定された。
この結果は、大腸菌がその菌体中に産生したインドールが、本発明のインドール酸化酵素により酸化され、インジゴ及びインジルビンに変換されたことを示している(図1)。
From the results of TLC analysis, recombinant Escherichia coli expressing the icp gene produced two types of pigments, which were identified as indigo and indirubin from the Rf value (Relative to Front) measurement.
This result shows that the indole produced by Escherichia coli in the cells was oxidized by the indole oxidase of the present invention and converted into indigo and indirubin (FIG. 1).
Claims (8)
(a)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列において、1または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド
(c)配列番号2に示される塩基配列または該塩基配列と相補の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド A gene encoding a protein having indole oxidation activity comprising the following polynucleotide (a), (b) or (c).
(A) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence (b) one or several in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the base sequence complementary to the base sequence (C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence
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