JP2009092550A - Method for identifying depression or depressed state - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、うつ病またはうつ状態を同定する方法に関し、特にうつ病またはうつ状態を物質的に同定する方法に関する。 The present invention relates to a method for identifying depression or a depression state, and more particularly to a method for materially identifying depression or a depression state.
うつ病をはじめとする精神疾患の診断や個人の持つ心理的ストレスの査定は、医師や心理士の主観、あるいは症状やストレスを申告する患者や個人の主観に依拠しており、客観的と言いがたい。実際、病気であることによって何らかの有利な点がある場合に症状を過剰に訴える疾病利得や、その反対に精神疾患であると他人に知られることによって蒙る偏見や不都合を避けたくて症状を秘匿することが頻繁に見られるため、正確な診断や査定が困難なケースが非常に多い。 Diagnosis of depression and other mental illnesses and assessment of individual psychological stress depend on the subjectivity of doctors and psychologists, or on the subjectivity of patients and individuals reporting symptoms and stress, and are said to be objective. It's hard. In fact, if you have some advantage of being sick, you can avoid the prejudice or inconvenience caused by the disease gain that overwhelms the symptoms, and conversely that others know that you are mentally ill. In many cases, accurate diagnosis and assessment are difficult.
そこで、医師や心理士の診断を客観的に補足する方法が各種検討されている。例えば、ＷＯ２００４／０８０３１２（うつ病の診断方法、特許文献１）のように、医師や心理士の診断結果をコンピュータ処理することによって患者の症状に表れるノイズをできるだけ除く方法である。 Therefore, various methods for objectively supplementing the diagnosis of doctors and psychologists have been studied. For example, as in WO 2004/08312 (Diagnosis diagnosis method, Patent Document 1), it is a method of removing as much as possible noise appearing in a patient's symptom by computer processing of a diagnosis result of a doctor or a psychologist.
特開２００３−２７４９４９（うつ病薬の標的遺伝子及びその利用、特許文献２）では、うつ病の原因遺伝子を同定することと、うつ病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法が提案されている。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-274949 (depression drug target gene and use thereof, Patent Document 2) proposes identification of a causative gene of depression and a method for screening a drug for treatment and / or prevention of depression. Has been.
うつ病患者に過剰に見られる物質を同定することによって、うつ病を客観的に把握する方法も研究されている。例えば特開２００７−２４８２２（男性の更年期又はうつ病の鑑別方法、特許文献３）の発明では、男性の血液または唾液中に存在するテストステロンおよびコルチゾールの量に基づいてうつ病を鑑別する。特表２００２−５２９７０６（神経精神障害におけるポリグルタミン含有タンパク質、特許文献４）の発明では、ポリグルタミン含有タンパク質をマーカーとして神経精神病を診断する。
しかし、特許文献３や４に記載のテストステロン、コルチゾールおよびポリグルタミン含有タンパク質は、健常者にも検出される。その量は、健常者間で変動するので、上記物質の検出に基づいてうつ病と判断することは難しい。そこで、本発明は、特許文献３や４と同様にうつ病を客観的に同定する方法であるが、従来よりも簡易かつ高精度に同定する方法を提供することにある。 However, the testosterone, cortisol and polyglutamine-containing proteins described in Patent Documents 3 and 4 are also detected by healthy subjects. Since the amount varies between healthy individuals, it is difficult to determine depression based on the detection of the substance. Therefore, the present invention is a method for objectively identifying depression as in Patent Documents 3 and 4, but it is intended to provide a method for identifying with ease and higher accuracy than before.
本発明者らは、上記課題を鋭意研究した結果、うつ病患者の体液にはうつ病患者特有のタンパク質分解産物が含まれることを発見し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ヒトから採取した体液に対して、うつ病またはうつ状態の患者に実質的に特異的に現れるタンパク質分解産物を検出することからなる、うつ病またはうつ状態の同定方法を提供するものである。 As a result of intensive studies on the above problems, the present inventors have found that the body fluid of a depressed patient contains a proteolytic product unique to the depressed patient, thereby completing the present invention. That is, the present invention provides a method for identifying depression or depression, which comprises detecting a proteolytic product that appears substantially specifically in a patient who is depressed or depressed from a body fluid collected from a human. To do.
本明細書において、「うつ状態」とは、抑うつ気分、落ち込み、意欲減退、思考力低下、集中力低下、食欲不振または過食、不眠、ものごとの興味関心がないなどの症状を呈する状態をいい、「うつ病」は、これらの症状が２週間以上続く場合をいう。うつ病の概念は、本来、他の疾患と並存・併記しうる概念であるが、主たる病気と副たる病気に分けて患者の病態を考察するような場合には、副たる病気がうつ病であっても、診断がおろそかになり、うつ状態と表現されることも多い。また、２週間の症状の持続に関して、十分な根拠をもって診断を下せない状況も存在する。このような場合でも、うつ状態と表現されることがある。こうした現状を踏まえ、本発明の同定方法は、うつ病およびうつ状態を検出対象とする。 In this specification, “depressed state” refers to a state of exhibiting symptoms such as depressed mood, depression, reduced motivation, reduced thinking ability, reduced concentration, loss of appetite or overeating, insomnia, and lack of interest in things. “Depression” refers to the case where these symptoms persist for more than 2 weeks. The concept of depression is originally a concept that can coexist with other diseases, but when considering the patient's condition by dividing it into major and minor illnesses, the minor illness is depression. Even so, the diagnosis is neglected and often expressed as depression. There are also situations in which a diagnosis cannot be made with sufficient evidence regarding the persistence of symptoms for two weeks. Even in such a case, it may be expressed as a depressed state. Based on such a current situation, the identification method of the present invention targets depression and a depression state as detection targets.
本明細書において、「うつ病またはうつ状態の患者に実質的に特異的に現れるタンパク質分解産物」という用語は、検出下限が１pmol/LのLC/MS法分析装置において健常者の血漿サンプルには検出されないが、うつ病またはうつ状態の患者の血漿サンプルには検出されるようなタンパク質分解産物を指す意味で使用される。また、前記「分解産物」は、本明細書において、ペプチドームの分解系（Peptidome Degradome）を含む意味で使用される。 In the present specification, the term “proteolytic product that appears substantially specifically in a depressed or depressed patient” refers to a plasma sample of a healthy person in an LC / MS method analyzer with a detection limit of 1 pmol / L. It is used to refer to a proteolytic product as detected in the plasma sample of a patient who is not detected but is depressed or depressed. In addition, the “degradation product” is used in the present specification to include a peptidome degradation system (Peptidome Degradome).
うつ病患者特異的に現れるタンパク質分解産物は、例えばアルブミン、αフィブリノーゲン、βフィブリノーゲン、アポリポプロテインA−I、アポリポプロテインA−IV、アポリポプロテインC−III、アポリポプロテインE、α−2−HS−グリコプロテイン、ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物、インターα(グロブリン)インヒビターH2、脳特異的血管新生抑制因子3、有機アニオントランスポーター3、ジンクフィンガー様プロテインH101および補体C3からなる群から選ばれる少なくとも一種のタンパク質の分解産物である。 Proteolytic products that appear specifically in patients with depression include, for example, albumin, α-fibrinogen, β-fibrinogen, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-IV, apolipoprotein C-III, apolipoprotein E, α-2-HS-glyco Protein, rat kidney-specific (KS) gene-like gene expression product, inter-α (globulin) inhibitor H2, brain-specific angiogenesis inhibitor 3, organic anion transporter 3, zinc finger-like protein H101 and complement C3 It is a degradation product of at least one protein selected from the group.
前記ヒトから採取した体液から分子量3000Da以下の低分子量タンパク質を分離してから、該低分子量タンパク質中の前記タンパク質分解産物を測定することが好ましい。 It is preferable to measure a protein degradation product in the low molecular weight protein after separating a low molecular weight protein having a molecular weight of 3000 Da or less from the body fluid collected from the human.
前記ヒトの体液は、例えば血漿である。 The human body fluid is, for example, plasma.
前記タンパク質分解産物の検出は、例えば質量分析法に基づく。質量分析法において、血漿中のタンパク質分解産物の濃度が１pmol/L以上であると、うつ病またはうつ状態と判断される。 The detection of the proteolytic product is based on, for example, mass spectrometry. In mass spectrometry, when the concentration of a proteolytic product in plasma is 1 pmol / L or more, it is judged as depression or a depressed state.
本発明は、また、うつ病またはうつ状態の患者特有のタンパク質分解産物に特異的に結合するリガンド、および該タンパク質分解産物と該リガンドとの結合を認識する手段を備えたうつ病またはうつ状態の診断用キットを提供する。 The invention also provides a ligand that specifically binds to a proteolytic product specific to a patient who is depressed or depressed, and a means of recognizing the binding of the proteolytic product to the ligand. Provide a diagnostic kit.
前記タンパク質分解産物は、アルブミン、αフィブリノーゲン、βフィブリノーゲン、アポリポプロテインA−I、アポリポプロテインA−IV、アポリポプロテインC−III、アポリポプロテインE、α−2−HS−グリコプロテイン、ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物、インターα(グロブリン)インヒビターH2、脳特異的血管新生抑制因子3、有機アニオントランスポーター3、ジンクフィンガー様プロテインH101および補体C3からなる群から選ばれる少なくとも一種のタンパク質の分解産物である。 The proteolytic products are albumin, α-fibrinogen, β-fibrinogen, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-IV, apolipoprotein C-III, apolipoprotein E, α-2-HS-glycoprotein, rat kidney specific ( (KS) gene-like gene expression product, inter-α (globulin) inhibitor H2, brain-specific angiogenesis inhibitor 3, organic anion transporter 3, zinc finger-like protein H101, and complement C3 It is a degradation product of protein.
前記リガンドは、抗体であることが好ましい。 The ligand is preferably an antibody.
本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は、うつ病またはうつ状態の患者の体液に実質的に特異的に含まれるタンパク質分解産物を測定することによって、今まで問診に頼っていたうつ病またはうつ状態の診断を物質的かつ高精度に測定することを可能にする。具体的には、本発明の方法は、うつ病またはうつ状態を７０％以上の精度で同定する。特定のペプチドを選択すれば、その精度は１００％に達する。 The method for identifying depression or depression according to the present invention comprises a method for measuring depression or a depression that has been relied on by an inquiry by measuring a proteolytic product substantially specifically contained in the body fluid of a patient with depression or depression. It makes it possible to measure the diagnosis of depression with material and high accuracy. Specifically, the method of the present invention identifies depression or depression with an accuracy of 70% or more. If a specific peptide is selected, its accuracy reaches 100%.
本発明の同定方法が対象とするうつ病およびうつ状態は、抑うつ神経症、不安神経症、パニック障害、自律神経失調症、強迫性障害、人格障害、統合失調症、摂食障害などの精神疾患からくる心因性のもの、および癌、心筋梗塞、糖尿病、エイズなどの身体疾患からくる身体性のものが広く対象になる。さらに、同方法は、患者の性別や年齢によらない。 Depression and depressive state targeted by the identification method of the present invention include depressive neurosis, anxiety, panic disorder, autonomic dysfunction, obsessive compulsive disorder, personality disorder, schizophrenia, and eating disorders. Psychogenic things that come from, and those that come from bodily diseases such as cancer, myocardial infarction, diabetes, AIDS are widely covered. Furthermore, the method does not depend on the gender or age of the patient.
本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は、うつ病患者の治療中または治療後の監視にも有用である。例えば、アルブミンは、ヒトの体内で１日に100〜200mg/kgが合成されるが、その同じ量が分解され、その半減期は14〜20日である。したがって、患者に抗うつ剤などを処方してから14〜20日以降に、特定のアルブミン分解産物の動向を見ることによって、抗うつ剤の効果やうつ病の改善傾向を把握することができる。また、特異的タンパク質分解産物の挙動をモニタリングすることによって、抗うつ剤の適正使用量を把握し、使用過多や副作用を回避するのにも極めて有効である。さらに、本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は、健康診断時の採血時にも使用することにより、予防医学にも役立つ。 The method for identifying depression or depression of the present invention is also useful for monitoring during or after treatment of depressed patients. For example, albumin is synthesized in the human body at 100-200 mg / kg per day, but the same amount is degraded and its half-life is 14-20 days. Therefore, the effect of an antidepressant and the improvement tendency of depression can be grasped by observing the trend of a specific albumin degradation product after 14-20 days after prescribing an antidepressant or the like to a patient. In addition, by monitoring the behavior of specific proteolytic products, it is extremely effective in grasping the proper amount of antidepressant and avoiding overuse and side effects. Furthermore, the method for identifying depression or depression according to the present invention is also useful for preventive medicine by being used at the time of blood collection at the time of a medical examination.
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は、ヒトから採取した体液に対して、うつ病またはうつ状態の患者に実質的に特異的に現れるタンパク質分解産物を検出することを特徴とする。うつ病またはうつ状態にかかった患者の体内にあるタンパク質は、その立体構造が変化し得る。それに伴い、タンパク質分解酵素による切断部位が変化し、うつ病またはうつ状態にかかった患者特有のタンパク質分解産物が現れる（以下、「特異的タンパク質分解産物」ということがある）。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. The method for identifying depression or depression according to the present invention is characterized by detecting proteolytic products that appear substantially specifically in patients with depression or depression in body fluids collected from humans. Proteins in the body of patients who are depressed or depressed can change their conformation. Along with this, the cleavage site by the proteolytic enzyme changes, and a proteolytic product peculiar to a patient suffering from depression or depression appears (hereinafter also referred to as “specific proteolytic product”).
本発明の同定方法において候補となる特異的タンパク質分解産物は、うつ病またはうつ状態の患者と健常者の体液に含まれるペプチドを、例えばゲル電気泳動などで詳細に対比することにより取得することができる。 Specific proteolytic products that are candidates in the identification method of the present invention can be obtained by comparing peptides contained in body fluids of patients with depression or depression and healthy subjects in detail, for example, by gel electrophoresis. it can.
前記特異的タンパク質分解産物がアルブミン（Albumin）、αフィブリノーゲン（Alpha−fibrinogen）、βフィブリノーゲン（Beta−fibrinogen）、アポリポプロテインA−I（Apolipoprotein A−I）、アポリポプロテインA−IV（Apolipoprotein A−IV）、アポリポプロテインC−III（Apolipoprotein C−III）、アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）、α−2−HS−グリコプロテイン（Alpha−2−HS−glycoprotein）、ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物（Gene with similarity to rat kidney−specific (KS) gene）、インターα(グロブリン)インヒビターH2（Inter−alpha (globulin) inhibitor H2）、脳特異的血管新生抑制因子3（Brain−specific angiogenesis inhibitor 3, isoform CRA_a）、有機アニオントランスポーター3（Organic anion transporter 3）、ジンクフィンガー様プロテインH101（Probable zinc finger protein H101）および補体C3（Complement C3）からなる群から選ばれる少なくとも一種のタンパク質の分解産物であることは、これらのペプチドがうつ病またはうつ状態の患者に特異的なペプチドが高い頻度で現れる点で検出対象として好ましい。 The specific proteolytic products are albumin (Albumin), α-fibrinogen, β-fibrinogen, apolipoprotein A-I, apolipoprotein A-IV (Apolipoprotein A-IV). ), Apolipoprotein C-III (Apolipoprotein C-III), apolipoprotein E (Apolipoprotein E), α-2-HS-glycoprotein (Alpha-2-HS-glycoprotein), rat kidney-specific (KS) gene-like gene Expression product (Gene with similarity to rat kidney-specific (KS) gene), inter-alpha (globulin) inhibitor H2, brain-specific angiogenesis inhibitor 3 3, isoform CRA_a), organic anion transporter 3, organic zinc anion transporter 3 and probable zinc finger protein H101 It is a degradation product of at least one protein selected from the group consisting of C3 (Complement C3) as a detection target in that these peptides appear frequently in patients with depression or depression. preferable.
以下に、上記特異的タンパク質分解産物の具体例をアミノ酸配列で示す。なお、ペプチドのアミノ酸配列記号の意味は、以下のとおりである。
A アラニン、G グリシン、M メチオニン、S セリン、C システイン、H ヒスチジン、N アスパラギン、T スレオニン、D アスパラギン酸、I イソロイシン、P プロリン、V バリン、E グルタミン酸、K リシン、Q グルタミン、W トリプトファン、F フェニルアラニン、L ロイシン、R アルギニン、Y チロシン
Hereinafter, specific examples of the specific proteolytic products are shown by amino acid sequences. In addition, the meaning of the amino acid sequence symbol of a peptide is as follows.
A alanine, G glycine, M methionine, S serine, C cysteine, H histidine, N asparagine, T threonine, D aspartic acid, I isoleucine, P proline, V valine, E glutamic acid, K lysine, Q glutamine, W tryptophan, F Phenylalanine, L leucine, R arginine, Y tyrosine
また、ペプチドのアミノ酸配列の後に付加される記号「＋Oxidation(M)」、「＋2 Oxidation(M)」および「＋3 Oxidation(M)」は、それぞれ、配列に含まれるメチオニンの一酸化物、二酸化物および三酸化物を意味する。 In addition, the symbols “+ Oxidation (M)”, “+2 Oxidation (M)” and “+3 Oxidation (M)” added after the amino acid sequence of the peptide are methionine monoxide and dioxide contained in the sequence, respectively. And trioxide.
前記アルブミン分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号1のFKDLGEENFK、配列番号2のKDLGEENFK、配列番号3のDLGEENFK、配列番号4のALVLIAF、配列番号5のALVLIAFAおよび配列番号6のVLIAFAからなる群の少なくとも一種のペプチドが好ましい。 As the albumin degradation product, the amino acid sequence is FKDLGEENFK of SEQ ID NO: 1, KDLGEENFK of SEQ ID NO: 2, DLGEENFK of SEQ ID NO: 3, ALVLIAF of SEQ ID NO: 4, ALVLIAFA of SEQ ID NO: 5, and VLIAFA of SEQ ID NO: 6 One kind of peptide is preferred.
さらに、前記アルブミン分解産物として、アミノ酸配列がDLGEENFKおよびALVLIAFのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, it is particularly preferable to include peptides having amino acid sequences DLGEENFK and ALVLIAF as detection targets as the albumin degradation product from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記αフィブリノーゲン分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号7のADSGEGDFLAEGGGVRGP、配列番号8のADSGEGDFLAEGGGVRGPR、配列番号9のDSGEGDFLAEGGGVRGPR、配列番号10のHSLTTNIMEILR、配列番号11のSLTTNIMEILR、配列番号12のLTTNIMEILR、配列番号13のLTTNIMEILR + Oxidation(M)、配列番号14のTTNIMEILR + Oxidation(M)、配列番号15のTNIMEILR + Oxidation(M)、配列番号16のQLLQKNVRAQLVDMKR、配列番号17のSCRGSCSRALAREVDLKDYEDQQKQLEQVIAKD、配列番号18のLGTLSGIGTLDGFR、配列番号19のLIKMKPVPD + Oxidation(M)、配列番号20のMKPVPDLVPGN、配列番号21のMKPVPDLVPGNF + Oxidation(M)、配列番号22のMKPVPDLVPGNF、配列番号23のMKPVPDLVPGNFK、配列番号24のMKPVPDLVPGNFK + Oxidation(M)、配列番号25のPVPDLVPGNFK、配列番号26のPDLVPGNFK、配列番号27のDLVPGNFK、配列番号28のSQLQKVPPEWK、配列番号29のVPPEWK、配列番号30のPEWKALTDMPQMR+ Oxidation(M)、配列番号31のALTDMPQM + 2 Oxidation(M)、配列番号32のALTDMPQM + Oxidation(M)、配列番号33のALTDMPQM、配列番号34のALTDMPQMR、配列番号35のALTDMPQMR + 2 Oxidation(M)、配列番号36のALTDMPQMR + Oxidation(M)、配列番号37のDMPQMRMELERPGGNEITR + Oxidation(M)、配列番号38のMELERPGGNEIT、配列番号39のMELERPGGNEIT + Oxidation(M)、配列番号40のMELERPGGNEITR、配列番号41のMELERPGGNEITR + Oxidation(M)、配列番号42のLERPGGNEITR、配列番号43のERPGGNEITR、配列番号44のGGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPG、配列番号45のGTGSETESPRN、配列番号46のSGPGSTGNRNPGSS、配列番号47のGSSGTGGTATWKPGSSGP、配列番号48のKPGSSGPGSAGSWNSGSSGTGSTGNQN、配列番号49のPGSSGPGSTGSWNSGSSGTGS、配列番号50のGSTGNQNPGSPRPGSTGTWNPGS、配列番号51のSTGTWNPGSSERGSAGHWTSE、配列番号52のSGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEK、配列番号53のDWGTFEEVSGNVSPGTR、配列番号54のEVSGNVSPGTR、配列番号55のREYHTEKLVTS、配列番号56のREYHTEKLVTSKGDKELR、配列番号57のTEKLVTSK、配列番号58のTEKLVTSKGDKEL、配列番号59のTEKLVTSKGDKELR、配列番号60のLVTSKGDKELR、配列番号61のEKVTSGSTTTTR、配列番号62のKEVVTSEDGSDCPE、配列番号63のGTLSGIGTLDGFR、配列番号64のSGIGTLDGFR、配列番号65のHRHPDEAAF、配列番号66のHRHPDEAAFFDTA、配列番号67のHRHPDEAAFFDTASTGK、配列番号68のTFPGFFSPM、配列番号69のHPDEAAFFDTASTGK、配列番号70のTFPGFF、配列番号71のTFPGFFSPM + Oxidation(M)、配列番号72のTFPGFFSPML、配列番号73のTFPGFFSPML + Oxidation(M)、配列番号74のPGFF、配列番号75のPGFFSPM + Oxidation(M)、配列番号76のGFFSPMLGEFVSETESR + Oxidation(M)、配列番号77のFSPMLGEFVSETESR + Oxidation(M)、配列番号78のMLGEFVSETESR + Oxidation(M)、配列番号79のMLGEFVSETESR、配列番号80のLGEFVSETESR、配列番号81のESRGSESGIF、配列番号82のGSESGIFTN、配列番号83のGSESGIFTNTK、配列番号84のGSESGIFTNTKES、配列番号85のTNTKESSSHHPGIAEFPSR、配列番号86のESSSHHPGIAEFPSR、配列番号87のSSHHPGIAEFPSR、配列番号88のSSHHPGIAEFPSRGK、配列番号89のHHPGIAEFPSR、配列番号90のSYSKQFTSSTSY、配列番号91のQFTSSTSYN、配列番号92のQFTSSTSYNR、配列番号93のKQFTSSTSYNR、配列番号94のYNRGDSTFESK、配列番号95のDHEGTHSTKRG、配列番号96のFGSLNDEGEGEF、配列番号97のYHFRVGSEAEGYALQVSおよび配列番号98のGVVWVSFRGADYSLRAVRMKI + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the α fibrinogen degradation product, the amino acid sequence is ADSGEGDFLAEGGGVRGP of SEQ ID NO: 7, ADSGEGDFLAEGGGVRGPR of SEQ ID NO: 8, DSGEGDFLAEGGGVRGPR of SEQ ID NO: 9, HSLTTNIMEILR of SEQ ID NO: 11, SLTTNIMEILR of SEQ ID NO: 12, LTTNIMEILR of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 LTTNIMEILR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 14, TTNIMEILR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 14, TNIMEILR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 15, QLLQKNVRAQLVDMKR of SEQ ID NO: 16, SCRGSCSRALAREVDLKDYEDQQKQLEQVIAKD, LGTLS of SEQ ID NO: 18, LGTLS 19 LIKMKPVPD + Oxidation (M), SEQ ID NO: 20 MKPVPDLVPGN, SEQ ID NO: 21 MKPVPDLVPGNF + Oxidation (M), SEQ ID NO: 22 MKPVPDLVPGNF, SEQ ID NO: 23 MKPVPDLVPGNFK, SEQ ID NO: 24 MKPVPDLVPGNFK + Oxidation (M), Array No. 25 PVPDLVPGNFK, SEQ ID NO: 26 PDLVPGNFK, SEQ ID NO: 27 DLVPGNFK, SEQ ID NO: 28 SQLQKVPPEWK, SEQ ID NO: 29 VPPEWK, SEQ ID NO: 30 PEWKALTDMPQMR + Oxidation (M), SEQ ID NO: 31 ALTDMPQM + 2 Oxi dation (M), ALTDMPQM + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 32, ALTDMPQM of SEQ ID NO: 33, ALTDMPQMR of SEQ ID NO: 34, ALTDMPQMR + 2 Oxidation (M) of SEQ ID NO: 36, ALTDMPQMR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 36 , SEQ ID NO: 37 DMPQMRMELERPGGNEITR + Oxidation (M), SEQ ID NO: 38 MELERPGGNEIT, SEQ ID NO: 39 MELERPGGNEIT + Oxidation (M), SEQ ID NO: 40 MELERPGGNEITR, SEQ ID NO: 41 MELERPGGNEITR + Oxidation (M), SEQ ID NO: 42 LERPGGNEITR, SEQ ID NO: 43 ERPGGNEITR, SEQ ID NO: 44 GGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPG, SEQ ID NO: 45 GTGSETESPRN, SEQ ID NO: 46 SGPGSTGNRNPGSS TG STGTWNPGSSERGSAGHWTSE of SEQ ID NO: 51, SGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEK of SEQ ID NO: 52, DWGTFEEVSGNVSPGTR of SEQ ID NO: 53, EVSGNVSPGTR of SEQ ID NO: 54, REYHTEKLVTS of SEQ ID NO: 55, REYHTEKLVTSKGDKELR of SEQ ID NO: 56 TEKLVTSK of SEQ ID NO: 57, TEKLVTSKGDKEL of SEQ ID NO: 58, TEKLVTSKGDKELR of SEQ ID NO: 59, LVTSKGDKELR of SEQ ID NO: 60, EKVTSGSTTTTR of SEQ ID NO: 61, KEVVTSEDGSDCPE of SEQ ID NO: 63, GTLSGIGTLDGFR of SEQ ID NO: 63, SGIGTLDGFR of SEQ ID NO: 64 65 HRHPDEAAF, SEQ ID NO: 66 HRHPDEAAFFDTA, SEQ ID NO: 67 HRHPDEAAFFDTASTGK, SEQ ID NO: 68 TFPGFFSPM, SEQ ID NO: 69 HPDEAAFFDTASTGK, SEQ ID NO: 70 TFPGFF, SEQ ID NO: 71 TFPGFFSPM + Oxidation (M), SEQ ID NO: 72 TFPGFFSPML , TFPGFFSPML + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 73, PGFF of SEQ ID NO: 74, PGFFSPM + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 75, GFFSPMLGEFVSETESR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 76, FSPMLGEFVSETESR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 77 , MLGEFVSETESR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 78, MLGEFVSETESR of SEQ ID NO: 79, LGEFVSETESR of SEQ ID NO: 80, ESRGSESGIF of SEQ ID NO: 81, GSESGIFTN of SEQ ID NO: 82, GSESGIFTNTK of SEQ ID NO: 83, GSESGIFTNTKES of SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 TNTKESSSHHPGIAEFPS R, ESSSHHPGIAEFPSR of SEQ ID NO: 86, SSHHPGIAEFPSR of SEQ ID NO: 87, SSHHPGIAEFPSRGK of SEQ ID NO: 88, HHPGIAEFPSR of SEQ ID NO: 89, SYSKQFTSSTSY of SEQ ID NO: 91, QFTSSTSYN of SEQ ID NO: 91, QFTSSTSYNR of SEQ ID NO: 93, KQFTSSTSYNR of SEQ ID NO: 93 It is preferable to include at least one peptide of the group consisting of YNRGDSTFESK of SEQ ID NO: 94, DHEGTHSTKRG of SEQ ID NO: 95, FGSLNDEGEGEF of SEQ ID NO: 96, YHFRVGSEAEGYALQVS of SEQ ID NO: 97 and GVVWVSFRGADYSLRAVRMKI + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 98 .
さらに、前記αフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がMKPVPDLVPGN、MKPVPDLVPGNF、MKPVPDLVPGNFK、MKPVPDLVPGNFK + Oxidation(M)、ALTDMPQMR、ALTDMPQMR + 2 Oxidation(M)、ALTDMPQMR + Oxidation(M)、MELERPGGNEITR、MELERPGGNEITR + Oxidation(M)およびTFPGFFSPML + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。
好ましい。
Further, as the α fibrinogen degradation product, the amino acid sequence is MKPVPDLVPGN, MKPVPDLVPGNF, MKPVPDLVPGNFK, MKPVPDLVPGNFK + Oxidation (M), ALTDMPQMR, ALTDMPQMR + 2 Oxidation (M), ALTDMPQMR + Oxidation (M), MELERPGGNEI, MELERPGGNEI And at least one peptide of the group consisting of TFPGFFSPML + Oxidation (M) is particularly preferred from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
preferable.
前記βフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列が配列番号99のVNDNEEGFFSAR、配列番号100のDNEEGFFSAR、配列番号101のNEEGFF、配列番号102のGHRPLDK、配列番号103のGHRPLDKK、配列番号104のKREEAPSLR、配列番号105のREEAPSLR、配列番号106のEEAPSLRPA、配列番号107のSLRPAPPPISGGGYR、配列番号108のPAPPPISGGGY、配列番号109のPAPPPISGGGYR、配列番号110のPPPISGGGYR、配列番号111のPPISGGGYR、配列番号112のARPAKAAATQK、配列番号113のMDGASQLMGENRTMTIHNGMFFSTYDRDN + 3 Oxidation(M)および配列番号114のWYSMRKMSMKIRPF + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the β fibrinogen degradation product, the amino acid sequence is VNDNEEGFFSAR of SEQ ID NO: 99, DNEEGFFSAR of SEQ ID NO: 100, NEEGFF of SEQ ID NO: 101, GHRPLDK of SEQ ID NO: 102, GHRPLDKK of SEQ ID NO: 103, KREEAPSLR of SEQ ID NO: 105, REEAPSLR, EEAPSLRPA of SEQ ID NO: 106, SLRPAPPPISGGGYR of SEQ ID NO: 107, PAPPPISGGGY of SEQ ID NO: 108, PAPPPISGGGYR of SEQ ID NO: 109, PPPISGGGYR of SEQ ID NO: 110, PPISGGGYR of SEQ ID NO: 111, ARPAKAAATQK of SEQ ID NO: 113, MDGASQLMGENDRTIMFF of SEQ ID NO: 113 It is preferable that at least one peptide of the group consisting of 3 Oxidation (M) and WYSMRKMSMKIRPF + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 114 is included in the detection target.
前記βフィブリノーゲン分解産物としては、アミノ酸配列がREEAPSLRのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the β fibrinogen degradation product, it is particularly preferable to include a peptide having an amino acid sequence of REEAPSLR in the detection target from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
さらに、前記アポリポプロテインA−I分解産物としてアミノ酸配列が配列番号115のAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDR、配列番号116のVLTLAVLFLTGSQARH、配列番号117のLLDNWDSVTSTFSK、配列番号118のNLEKETEGLRQEMSK + Oxidation(M)、配列番号119のAKVQPYLDDFQK、配列番号120のAKVQPYLDDFQKK、配列番号121のPYLDDFQKKWQEEMELYR + Oxidation(M)、配列番号122のWQEEMELYR、配列番号123のQKVEPLRAELQEGAR、配列番号124のAELQEGAR、配列番号125のAELQEGARQK、配列番号126のLHELQEK、配列番号127のLHELQEKLSPLGEEMRDR + Oxidation(M)、配列番号128のELQEKLSPL、配列番号129のLSPLGEEMR + Oxidation(M)、配列番号130のLSPLGEEMR、配列番号131のSPLGEEMRDRARAH、配列番号132のARAHVDALR、配列番号133のAHVDAL、配列番号134のAHVDALR、配列番号135のVDALR、配列番号136のTHLAP、配列番号137のTHLAPY、配列番号138のTHLAPYSDEL、配列番号139のLAPYSDELR、配列番号140のAPYSDELR、配列番号141のAPYSDELRQR、配列番号142のPYSDELR、配列番号143のPYSDELRQR、配列番号144のARLEALKENGGAR、配列番号145のEYHAKATEHLSTLSEK、配列番号146のATEHLSTL、配列番号147のATEHLSTLSEK、配列番号148のATEHLSTLSEKAKPALEDLR、配列番号149のAKPALEDLR、配列番号150のALEDLR、配列番号151のRQGLLPVLESF、配列番号152のLLPVLESF、配列番号153のLLPVLESFKV、配列番号154のLPVLESFK、配列番号155のPVLESF、配列番号156のVSFLSALEEYTK、配列番号157のVSFLSALEEYTKK、配列番号158のVSFLSALEEYTKKLNTQ、配列番号159のSFLSALEEYTK、配列番号160のFLSALEEYTKK、配列番号161のLSALEEYTKおよび配列番号162のLEEYTKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 Furthermore, as the apolipoprotein A-I degradation product, the amino acid sequence is AVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDR of SEQ ID NO: 115, VLTLAVLFLTGSQARH of SEQ ID NO: 116, LLDNWDSVTSTFSK of SEQ ID NO: 118, NLEKETEGLRQEMSK + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 118, AKVQPYLDQ of SEQ ID NO: 119, 120 AKVQPYLDDFQKK, SEQ ID NO: 121 PYLDDFQKKWQEEMELYR + Oxidation (M), SEQ ID NO: 122 WQEEMELYR, SEQ ID NO: 123 QKVEPLRAELQEGAR, SEQ ID NO: 124 AELQEGAR, SEQ ID NO: 125 AELQEGARQK, SEQ ID NO: 126 LHELQEK, SEQ ID NO: 127 LHELQEKLSPLGEEMRDR + Oxidation (M), ELQEKLSPL of SEQ ID NO: 128, LSPLGEEMR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 129, LSPLGEEMR of SEQ ID NO: 130, SPLGEEMRDRARAH of SEQ ID NO: 131, ARAHVDALR of SEQ ID NO: 132, AHVDAL of SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134 AHVDALR, SEQ ID NO: 135 VDALR, SEQ ID NO: 136 THLAP, SEQ ID NO: 137 THLAPY, SEQ ID NO: 138 THLAPYSDEL, SEQ ID NO: 139 LAPYSDELR, SEQ ID NO: 140 APYSDELR, SEQ ID NO: 141 APYSDELRQR, SEQ ID NO: 142 PYSDELR, SEQ ID NO: 143 PYSDELRQR, SEQ ID NO: 144 ARLEALKENGGAR, SEQ ID NO: 145 EYHAKATEHLSTLSEK, SEQ ID NO: 146 ATEHLSTL, SEQ ID NO: 147 ATEHLSTLSEK, SEQ ID NO: 148 ATEHLSTLSEKAKPALEDLR, SEQ ID NO: 149 AKPALEDLR, ALEDLR of SEQ ID NO: 150, RQGLLPVLESF of SEQ ID NO: 151, LLPVLESF of SEQ ID NO: 152, LLPVLESFKV of SEQ ID NO: 153, LPVLESFK of SEQ ID NO: 154, PVLESF of SEQ ID NO: 155, VSFLSALEEYTK of SEQ ID NO: 156, VSFLSALEEYTKK of SEQ ID NO: 157, It is preferable that at least one peptide of the group consisting of VSFLSALEEYTKKLNTQ of SEQ ID NO: 158, SFLSALEEYTK of SEQ ID NO: 159, FLSALEEYTKK of SEQ ID NO: 160, LSALEEYTK of SEQ ID NO: 161 and LEEYTK of SEQ ID NO: 162 is included in the detection target.
前記アポリポプロテインA−I分解産物としては、アミノ酸配列がAKVQPYLDDFQK、AKVQPYLDDFQKK、AHVDALR、THLAPYおよびLLPVLESFからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the apolipoprotein AI degradation product, it is particularly preferable to include at least one peptide of the group consisting of AKVQPYLDDFQK, AKVQPYLDDFQKK, AHVDALR, THLAPY, and LLPVLESF in the detection target from the viewpoint of improving identification accuracy.
前記アポリポプロテインA−IV分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号163のQKSELTQQLNALFQDKLGE、配列番号164のSELTQQLNALFQDK、配列番号165のKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQ、配列番号166のLLPHANEVSQK、配列番号167のLEPYADQLR、配列番号168のTQVNTQAEQLR、配列番号169のVNTQAEQLR、配列番号170のRQLTPYAQR、配列番号171のVLRENADSLQASLRPHADELK、配列番号172のAKIDQNVEELK、配列番号173のIDQNVEELK、配列番号174のGRLTPYADEFK、配列番号175のLTPYADEFK、配列番号176のPYADEFK、配列番号177のVKIDQTVEELR、配列番号178のVKIDQTVEELRR、配列番号179のIDQTVEELRR、配列番号180のQMKKNAEELKA、配列番号181のARISASAEELR、配列番号182のLAPLAEDV、配列番号183のLAPLAEDVR、配列番号184のLAPLAEDVRGNLR、配列番号185のSLAELGGHLDQQVEEF、配列番号186のELGGHLDQQVEEFR、配列番号187のALVQQMEQL、配列番号188のALVQQMEQLR、配列番号189のALVQQMEQLR + Oxidation(M)、配列番号190のALVQQMEQLRQK + Oxidation(M)、配列番号191のDKVNSFFSTFK、配列番号192のVNSFFSTFK、配列番号193のTLSLPELEQ、配列番号194のTLSLPELEQQおよび配列番号195のMLAPLESからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the apolipoprotein A-IV degradation product, the amino acid sequence is QKSELTQQLNALFQDKLGE of SEQ ID NO: 163, SELTQQLNALFQDK of SEQ ID NO: 164, KELELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQ of SEQ ID NO: 165, LLPHANEVSQK of SEQ ID NO: 166, LEPYADQLR of SEQ ID NO: 168, TQ of SEQ ID NO: 168, QQ SEQ ID NO: 169 VNTQAEQLR, SEQ ID NO: 170 RQLTPYAQR, SEQ ID NO: 171 VRLNADSLQASLRPHADELK, SEQ ID NO: 172 AKIDQNVEELK, SEQ ID NO: 173 IDQNVEELK, SEQ ID NO: 174 GRLTPYADEFK, SEQ ID NO: 175 LTPYADEFK, SEQ ID NO: 176 PYADEFK, SEQ ID NO: 177 VKIDQTVEELR, SEQ ID NO: 178 VKIDQTVEELRR, SEQ ID NO: 179 IDQTVEELRR, SEQ ID NO: 180 QMKKNAEELKA, SEQ ID NO: 181 ARISASAEELR, SEQ ID NO: 182 LAPLAEDV, SEQ ID NO: 183 LAPLAEDVR, SEQ ID NO: 184 LAPLAEDVRGNLR, SEQ ID NO: 185 SLAELGGHLDQQVEEF, ELGGHLDQQVEEFR of SEQ ID NO: 186, ALVQQMEQL of SEQ ID NO: 187, ALVQQMEQLR of SEQ ID NO: 188, ALVQQMEQLR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 189, array Detects at least one peptide of the group consisting of ALVQQMEQLRQK + Oxidation (M) of No. 190, DKVNSFFSTFK of SEQ ID NO: 191, VNSFFSTFK of SEQ ID NO: 192, TLSLPELEQ of SEQ ID NO: 193, TLSLPELEQQ of SEQ ID NO: 194 and MLAPLES of SEQ ID NO: 195 Is preferably included.
さらに、前記アポリポプロテインA−IV分解産物として、アミノ酸配列がAKIDQNVEELKおよび／またはALVQQMEQLR + Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Further, it is particularly preferable that the detection target includes a peptide having an amino acid sequence of AKIDQNVEELK and / or ALVQQMEQLR + Oxidation (M) as the apolipoprotein A-IV degradation product.
前記アポリポプロテインC−III分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号196のLALLASARASEA、配列番号197のSEAEDASLL、配列番号198のSEAEDASLLSFMQGYMK + Oxidation(M)、配列番号199のSEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation(M)、配列番号200のSEAEDASLLSFMQGYMKH + Oxidation(M)、配列番号201のSEAEDASLLSFMQGYMKHATK + Oxidation(M)、配列番号202のASLLSFMQGYMKHATKTA、配列番号203のSLLSFMQGYMK + 2 Oxidation(M)、配列番号204のTAKDALSSVQESQVAQQAR、配列番号205のDALSSVQESQVAQQAR、配列番号206のLSSVQESQVAQQAR、配列番号207のSVQESQVAQQARおよび配列番号208のGWVTDGFSSLKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the apolipoprotein C-III degradation product, the amino acid sequence is LALLASARASEA of SEQ ID NO: 196, SEAEDASLL of SEQ ID NO: 197, SEAEDASLLSFMQGYMK + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 198, SEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation (M) of SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 SEAEDASLLSFMQGYMKH + Oxidation (M), SEQ ID NO: 201 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK + Oxidation (M), SEQ ID NO: 202 ASLLSFMQGYMKHATKTA, SEQ ID NO: 203 SLLSFMQGYMK + 2 OxidQ (Q), SVQQQQQ It is preferable that at least one peptide of the group consisting of LSSVQESQVAQQAR of SEQ ID NO: 206, SVQESQVAQQAR of SEQ ID NO: 207, and GWVTDGFSSLK of SEQ ID NO: 208 is included in the detection target.
さらに、前記アポリポプロテインC−III分解産物として、アミノ酸配列がSEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, it is particularly preferable to include a peptide having an amino acid sequence of SEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation (M) as a detection target as the apolipoprotein C-III degradation product from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記アポリポプロテインE分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号209のALMDETMKELK + 2 Oxidation(M)、配列番号210のSELEEQLTPVAEETR、配列番号211のGEVQAMLGQSTEELR + Oxidation(M)、配列番号212のGLSAIRER、配列番号213のTVGSLAGQPLQERA、配列番号214のAKLEEQAQQIR、配列番号215のSWFEPL、配列番号216のSWFEPLV、配列番号217のSWFEPLVEDMQR + Oxidation(M)および配列番号218のVQAAVGTSAAPVPSDNHからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the apolipoprotein E degradation product, the amino acid sequence of ALMDETMKELK + 2 Oxidation (M) of SEQ ID NO: 209, SELEEQLTPVAEETR of SEQ ID NO: 210, GEVQAMLGQSTEELR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 211, GLSAIRER of SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 TVGSLAGQPLQERA, SEQ ID NO: 214 AKLEEQAQQIR, SEQ ID NO: 215 SWFEPL, SEQ ID NO: 216 SWFEPLV, SEQ ID NO: 217 SWFEPLVEDMQR + Oxidation (M) and SEQ ID NO: 218 VQAAVGTSAAPVPSDNH It is preferable.
さらに、前記アポリポプロテインE分解産物として、アミノ酸配列がSELEEQLTPVAEETRのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, it is particularly preferable to include a peptide having an amino acid sequence of SELEEQLTPVAEETR as a detection target as the apolipoprotein E degradation product from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記α−2−HS−グリコプロテイン分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号219のVLLLCLAQLWGCHSAPHG、配列番号220のLAQLWGCHSAPHGPG、配列番号221のHYDLRHTFMGV、配列番号222のHYDLRHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR、配列番号223のRHTFMGVVSLGSPSGE + Oxidation(M)、配列番号224のHTFMGVVSLGSPSG + Oxidation(M)、配列番号225のHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR、配列番号226のHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation(M)、配列番号227のFMGVV、配列番号228のFMGVV + Oxidation(M)、配列番号229のFMGVVSL、配列番号230のFMGVVSL + Oxidation(M)、配列番号231のFMGVVSLGSPSG、配列番号232のFMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation(M)、配列番号233のSLGSPSGEVSHPRおよび配列番号234のGSPSGEVSHPRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 Examples of the α-2-HS-glycoprotein degradation products include VLLLCLAQLWGCHSAPHG of SEQ ID NO: 219, LAQLWGCHSAPHGPG of SEQ ID NO: 220, HYDLRHTFMGV of SEQ ID NO: 221, HYDLRHTFMGV of SEQ ID NO: 222, RHTFMGVVSLGSPSGE + Oxidation of SEQ ID NO: 223 (M ), HTFMGVVSLGSPSG + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 224, HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR of SEQ ID NO: 225, HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 226, FMGVV of SEQ ID NO: 227, FMGVV + Oxidation (M) of SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 At least one peptide of the group consisting of: Is preferably included in the detection target.
さらに、前記α−2−HS−グリコプロテイン分解産物として、アミノ酸配列がFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVV + Oxidation(M)との組み合わせ、および／またはFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVVSLGSPSGとの組み合わせのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, as the α-2-HS-glycoprotein degradation product, the amino acid sequence is a combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVV + Oxidation (M), and / or a combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVVSLGSPSG. The inclusion of the peptide in the detection target is particularly preferable in terms of improving the accuracy of identification.
前記ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物の分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号235のPGFMGKATPPY + Oxidation(M)および／または配列番号236のENCIIVSMNTADPGのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 The degradation product of the expression product of the rat kidney-specific (KS) gene-like gene may include PGFMGKATPPY + Oxidation (M) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 235 and / or ENCIIVSMNTADPG peptide of SEQ ID NO: 236 as a detection target. preferable.
前記インターα(グロブリン)インヒビターH2分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号237のSLPGESEEMMEEVDQVTLYSYKVQSTITSRMAT、配列番号238のVFDVQIPKGAFISNFS、配列番号239のSSIKEKTVGR、配列番号240のGQQKAHVSFKPTV、配列番号241のQQKAHVSFKPTVAQQRICPSCRET、配列番号242のTILDDLR、配列番号243のNDLISATK、配列番号244のNDLISATKTQVADAK、配列番号245のIQPSGGTNINEALLR、配列番号246のRLSNENHGIAQR、配列番号247のLSNENHGIAQR、配列番号248のNENHGIAQR、配列番号249のIYGNQDTSSQLK、配列番号250のIYGNQDTSSQLKK、配列番号251のKFYNQVSTPLL、配列番号252のFYNQVSTPLLR、配列番号253のQLLAERSLAPTAA、配列番号254のSLAPTAAAKR、配列番号255のLQMSLDHHIVTPLTSLVIENEAG + Oxidation(M)、配列番号256のYYGSKVVPDSTP、配列番号257のSTPSWANPSPTPVISMLAQGSQ、配列番号258のSTPSWANPSATPVISMLAQGSQVLESTPPPHVMRVE、配列番号259のCFNIDSEPGKIL、配列番号260のSVKKEKVVTITLDKEMS + Oxidation(M)および配列番号261のVTITLDKEMSFSVLLHRVWKKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 The inter-α (globulin) inhibitor H2 degradation products include SLPGESEEMMEEVDQVTLYSYKVQSTITSRMAT having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 237, VFDVQIPKGAFISNFS of SEQ ID NO: 238, SSIKEKTVGR of SEQ ID NO: 239, GQQKAHVSFKPTV of SEQ ID NO: 240, QQKAHVSFKRETVAQQRICPSC SEQ ID NO: 241 TILDDLR, NDLISATK with SEQ ID NO: 243, NDLISATKTQVADAK with SEQ ID NO: 244, IQPSGGTNINEALLR with SEQ ID NO: 245, RLSNENHGIAQR with SEQ ID NO: 246, LSNENHGIAQR with SEQ ID NO: 247, NENHGIAQR with SEQ ID NO: 248, IYGNQDTSSQLK with SEQ ID NO: 249, IYGNQD with SQL with SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 251 KFYNQVSTPLL, SEQ ID NO: 252 FYNQVSTPLLR, SEQ ID NO: 253 QLLAERSLAPTAA, SEQ ID NO: 254 SLAPTAAAKR, SEQ ID NO: 255 LQMSLDHHIVTPLTSLVIENEAG + Oxidation (M), SEQ ID NO: 256 YYGSKVVPDSTP, SEQ ID NO: 257 STPSWANQTP STPSWANPSATPVISMLAQGSQVLESTPPPHVMRVE, CFNIDSEPGKIL of SEQ ID NO: 259, SVKKEKVVTITLDKEMS + Oxidation (M of SEQ ID NO: 260 And at least one peptide of the group consisting of VTITLDKEMSFSVLLHRVWKK of SEQ ID NO: 261 is preferably included in the detection target.
さらに、前記インターα(グロブリン)インヒビターH2分解産物として、アミノ酸配列がIYGNQDTSSQLK、IYGNQDTSSQLKKおよびFYNQVSTPLLRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, it is particularly preferable that the detection target includes at least one peptide of the group consisting of IYGNQDTSSQLK, IYGNQDTSSQLKK, and FYNQVSTPLLR as the inter α (globulin) inhibitor H2 degradation product.
前記脳特異的血管新生抑制因子3の分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号262のADMDIVHPQERM + Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the degradation product of the brain-specific angiogenesis inhibitory factor 3, it is preferable to include the peptide ADDMIVHPQERM + Oxidation (M) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 262 in the detection target.
前記有機アニオントランスポーター3の分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号263のPNASLPNDTQRAMEPのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As a degradation product of the organic anion transporter 3, it is preferable to include a peptide of PNASLPNDTQRAMEP having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 263 as a detection target.
前記ジンクフィンガー様プロテインH101の分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号264のLATDHPLLNTのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the degradation product of the zinc finger-like protein H101, it is preferable to include the LATDHPLLNT peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 264 in the detection target.
前記補体C3の分解産物としては、アミノ酸配列が配列番号265のHLPLALGSPMYSIIT + Oxidation(M)、配列番号266のSVQLTEKR、配列番号267のHLGLA、配列番号268のHLGLARおよび配列番号269のTLDPERLGRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 The degradation product of complement C3 is a group consisting of HLPLALGSPMYSIIT + Oxidation (M) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 265, SVQLTEKR of SEQ ID NO: 266, HLGLA of SEQ ID NO: 267, HLGLAR of SEQ ID NO: 268, and TLDPERLGR of SEQ ID NO: 269. It is preferable to include at least one kind of peptide in the detection target.
さらに、前記補体C3の分解産物として、アミノ酸配列がHLGLAのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 Furthermore, it is particularly preferable that a peptide having an amino acid sequence of HLGLA is included in the detection target as the degradation product of complement C3 from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
本発明の同定方法において、ヒトから採取される体液は、前記特異的タンパク質分解産物が検出されるものなら特に制限されない。具体例として、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、組織間液、体腔液、乳汁、尿、唾液、涙、汗、精液、羊水などが挙げられる。アルブミンのようなタンパク質の濃度は、血漿中および組織間液中が最も高い。さらに、血漿・血清中のタンパク質濃度は、日内変動が少ない。したがって、採取するヒトの体液は、血液（全血、血漿、血清）または組織間液が好ましく、特に好ましくは血漿・血清である。 In the identification method of the present invention, a body fluid collected from a human is not particularly limited as long as the specific proteolytic product is detected. Specific examples include blood (whole blood, plasma, serum), lymph, interstitial fluid, body cavity fluid, milk, urine, saliva, tears, sweat, semen, amniotic fluid, and the like. The concentration of proteins such as albumin is highest in plasma and interstitial fluid. In addition, the protein concentration in plasma and serum is less diurnal. Therefore, the human body fluid to be collected is preferably blood (whole blood, plasma, serum) or interstitial fluid, particularly preferably plasma / serum.
血漿、組織間液などのヒト体液には、アルブミン、リポプロテイン、免疫グロブリン、トランスフェリンなどのタンパク質がmg/mLのオーダーで存在する。このようなヒト体液から、極微量の特異的タンパク質分解産物を容易に検出するためには、まず、通常、5000Da以下、好ましくは3000Da以下の低分子量タンパク質を回収および精製することが好ましい。回収方法は、具体的には、遠心ろ過、限外ろ過、濃縮脱塩処理（ZipTip処理）、中空糸モジュール、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル電気泳動などが挙げられる。なお、ヒト血液から血漿を分離する方法は常法による。 In human body fluids such as plasma and interstitial fluid, proteins such as albumin, lipoprotein, immunoglobulin and transferrin are present on the order of mg / mL. In order to easily detect a trace amount of a specific proteolytic product from such a human body fluid, it is usually preferable to first collect and purify a low molecular weight protein of usually 5000 Da or less, preferably 3000 Da or less. Specifically, the recovery methods are centrifugal filtration, ultrafiltration, concentration desalting (ZipTip), hollow fiber module, column chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography, gel filtration, gel Examples include electrophoresis. The method for separating plasma from human blood is a conventional method.
上記回収物からのアルブミン分解産物の検出は、微量タンパク質の同定方法として公知の方法を特に制限なく使用することができる。具体的には、質量分析法（MS）、酵素免疫定量法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ法(RIA)、表面プラズモン共鳴法（SPR）などが挙げられる。質量分析法は、アミノ酸配列の一次構造を簡易かつ迅速に決めることが可能な点で好ましい。ELISA法は、後述のうつ病またはうつ状態の診断用キットを構築するのに有利である。 For the detection of albumin degradation products from the recovered material, a known method can be used without particular limitation as a method for identifying a trace amount of protein. Specific examples include mass spectrometry (MS), enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), surface plasmon resonance (SPR) and the like. Mass spectrometry is preferable in that the primary structure of the amino acid sequence can be determined easily and rapidly. The ELISA method is advantageous for constructing a diagnostic kit for depression or depression described later.
MSは、磁場型、四重極（QMS）型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換型、イオンサイクロトロン共鳴(ICR)型、フーリエ変換で検出するFT−ICR型のいずれでもよい。 MS may be any of magnetic field type, quadrupole (QMS) type, ion trap type, time of flight (TOF) type, Fourier transform type, ion cyclotron resonance (ICR) type, and FT-ICR type detected by Fourier transform. .
MSにかける前の試料のタンパク質の分離手段もまた、公知のものが特に制限なく使用可能である。具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー（LC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、二次元ゲル電気泳動などが挙げられる。 Any known means for separating the protein of the sample before being subjected to MS can be used without particular limitation. Specifically, liquid chromatography (LC), gas chromatography (GC), two-dimensional gel electrophoresis, etc. are mentioned, for example.
本発明の特異的タンパク質分解産物を検出する好ましい方法として、LCとMSとの組み合わせであり、より好ましくはLCとMS・MS、Q−TOFMS、MALDI−TOFMS、FT−MSとの組み合わせである。 A preferred method for detecting the specific proteolytic product of the present invention is a combination of LC and MS, and more preferably a combination of LC and MS / MS, Q-TOFMS, MALDI-TOFMS, and FT-MS.
LCで分離された対象物質にMCに導入するために電荷を持たせるイオン化法には、電界噴霧−エレクトロスプレーイオン化（ESI）法、大気圧化学イオン化（APCI）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、気相(EI,CI)法、電界脱離（FD）法、粒子衝撃(FAB)法などが採用される。 The ionization methods that charge the target substance separated by LC for introduction into the MC include electric field spray-electrospray ionization (ESI) method, atmospheric pressure chemical ionization (APCI) method, matrix-assisted laser desorption ionization ( MALDI) method, gas phase (EI, CI) method, field desorption (FD) method, particle impact (FAB) method and the like are employed.
本発明は、また、うつ病またはうつ状態の患者特有のタンパク質分解産物に特異的に結合するリガンド、および該タンパク質分解産物と該リガンドとの結合を認識する手段を備えたうつ病またはうつ状態の診断用キットを提供する。このキットは、診断装置（例えば自動分析装置）での使用に合わせて構築されるものでもよいし、単独に使用されるものでもよい。 The invention also provides a ligand that specifically binds to a proteolytic product specific to a patient who is depressed or depressed, and a means of recognizing the binding of the proteolytic product to the ligand. Provide a diagnostic kit. This kit may be constructed for use in a diagnostic apparatus (for example, an automatic analyzer) or may be used alone.
上記特異的タンパク質分解産物は、例えばアルブミン、αフィブリノーゲン、βフィブリノーゲン、アポリポプロテインA−I、アポリポプロテインA−IV、アポリポプロテインC−III、アポリポプロテインE、α−2−HS−グリコプロテイン、ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物、インターα(グロブリン)インヒビターH2、脳特異的血管新生抑制因子3、有機アニオントランスポーター3、ジンクフィンガー様プロテインH101および補体C3からなる群から選ばれる少なくとも一種のタンパク質の分解産物である。 Examples of the specific proteolytic products include albumin, α-fibrinogen, β-fibrinogen, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-IV, apolipoprotein C-III, apolipoprotein E, α-2-HS-glycoprotein, rat kidney Selected from the group consisting of a specific (KS) gene-like gene expression product, inter-α (globulin) inhibitor H2, brain-specific angiogenesis inhibitor 3, organic anion transporter 3, zinc finger-like protein H101, and complement C3 It is a degradation product of at least one protein.
前記アルブミン分解産物として、アミノ酸配列がFKDLGEENFK、KDLGEENFK、DLGEENFK、ALVLIAF、ALVLIAFAおよびVLIAFAからなる群の少なくとも一種のペプチドが好ましい。 The albumin degradation product is preferably at least one peptide of the group consisting of FKDLGEENFK, KDLGEENFK, DLGEENFK, ALVLIAF, ALVLIAFA and VLIAFA.
前記アルブミン分解産物として、アミノ酸配列がDLGEENFKおよびALVLIAFのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the albumin degradation product, inclusion of peptides having amino acid sequences of DLGEENFK and ALVLIAF in the detection target is particularly preferable from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記αフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がADSGEGDFLAEGGGVRGP、ADSGEGDFLAEGGGVRGPR、DSGEGDFLAEGGGVRGPR、HSLTTNIMEILR、SLTTNIMEILR、LTTNIMEILR、LTTNIMEILR + Oxidation(M)、TTNIMEILR + Oxidation(M)、TNIMEILR + Oxidation(M)、QLLQKNVRAQLVDMKR、SCRGSCSRALAREVDLKDYEDQQKQLEQVIAKD、LGTLSGIGTLDGFR、LIKMKPVPD + Oxidation(M)、MKPVPDLVPGN、MKPVPDLVPGNF + Oxidation(M)、MKPVPDLVPGNF、MKPVPDLVPGNFK、MKPVPDLVPGNFK + Oxidation(M)、PVPDLVPGNFK、PDLVPGNFK、DLVPGNFK、SQLQKVPPEWK、VPPEWK、PEWKALTDMPQMR+ Oxidation(M)、ALTDMPQM + 2 Oxidation(M)、ALTDMPQM + Oxidation(M)、ALTDMPQM、ALTDMPQMR、ALTDMPQMR + 2 Oxidation(M)、ALTDMPQMR + Oxidation(M)、DMPQMRMELERPGGNEITR + Oxidation(M)、MELERPGGNEIT、MELERPGGNEIT + Oxidation(M)、MELERPGGNEITR、MELERPGGNEITR + Oxidation(M)、LERPGGNEITR、ERPGGNEITR、GGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPG、GTGSETESPRN、SGPGSTGNRNPGSS、GSSGTGGTATWKPGSSGP、KPGSSGPGSAGSWNSGSSGTGSTGNQN、PGSSGPGSTGSWNSGSSGTGS、GSTGNQNPGSPRPGSTGTWNPGS、STGTWNPGSSERGSAGHWTSE、SGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEK、DWGTFEEVSGNVSPGTR、EVSGNVSPGTR、REYHTEKLVTS、REYHTEKLVTSKGDKELR、TEKLVTSK、TEKLVTSKGDKEL、TEKLVTSKGDKELR、LVTSKGDKELR、EKVTSGSTTTTR、KEVVTSEDGSDCPE、GTLSGIGTLDGFR、SGIGTLDGFR、HRHPDEAAF、HRHPDEAAFFDTA、HRHPDEAAFFDTASTGK、TFPGFFSPM、HPDEAAFFDTASTGK、TFPGFF、TFPGFFSPM + Oxidation(M)、TFPGFFSPML、TFPGFFSPML + Oxidation(M)、PGFF、PGFFSPM + Oxidation(M)、GFFSPMLGEFVSETESR + Oxidation(M)、FSPMLGEFVSETESR + Oxidation(M)、MLGEFVSETESR + Oxidation(M)、MLGEFVSETESR、LGEFVSETESR、ESRGSESGIF、GSESGIFTN、GSESGIFTNTK、GSESGIFTNTKES、TNTKESSSHHPGIAEFPSR、ESSSHHPGIAEFPSR、SSHHPGIAEFPSR、SSHHPGIAEFPSRGK、HHPGIAEFPSR、SYSKQFTSSTSY、QFTSSTSYN、QFTSSTSYNR、KQFTSSTSYNR、YNRGDSTFESK、DHEGTHSTKRG、FGSLNDEGEGEF、YHFRVGSEAEGYALQVSおよびGVVWVSFRGADYSLRAVRMKI + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the α fibrinogen degradation products, amino acid sequence ADSGEGDFLAEGGGVRGP, ADSGEGDFLAEGGGVRGPR, DSGEGDFLAEGGGVRGPR, HSLTTNIMEILR, SLTTNIMEILR, LTTNIMEILR, LTTNIMEILR + Oxidation (M), TTNIMEILR + Oxidation (M), TNIMEILR + Oxidation (M), QLLQKNVRAQLVDMKR, SCRGSCSRALAREVDLKDYEDQQKQLEQVIAKD, LGTLSGIGTLDGFR, LIKMKPVPD + Oxidation (M), MKPVPDLVPGN, MKPVPDLVPGNF + Oxidation (M), MKPVPDLVPGNF, MKPVPDLVPGNFK, MKPVPDLVPGNFK + Oxidation (M), PVPDLVPGNFK, PDLVPGNFK, DLVPGNFK, MPQKMPPEMPKWMPD ALTDMPQM + Oxidation (M), ALTDMPQM, ALTDMPQMR, ALTDMPQMR + 2 Oxidation (M), ALTDMPQMR + Oxidation (M), DMPQMRMELERPGGNEITR + Oxidation (M), MELERPGGNEIT, MELERPGGNEIT + Oxidation (GN), LER, PG , LERPGGNEITR, ERPGGNEITR, GGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPG, GTGSETESPRN, SGPGSTGNRNPGSS, GSSGTGGTATWKPGSSGP, KPGSSGPGSAGSWNSGSSGTGSTGNQN, PGSSGPGSTGSWNSGSSGTGS, GSTG NQNPGSPRPGSTGTWNPGS, STGTWNPGSSERGSAGHWTSE, SGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEK, DWGTFEEVSGNVSPGTR, EVSGNVSPGTR, REYHTEKLVTS, REYHTEKLVTSKGDKELR, TEKLVTSK, TEKLVTSKGDKEL, TEKLVTSKGDKELR, LVTSKGDKELR, EKVTSGSTTTTR, KEVVTSEDGSDCPE, GTLSGIGTLDGFR, SGIGTLDGFR, HRHPDEAAF, HRHPDEAAFFDTA, HRHPDEAAFFDTASTGK, TFPGFFSPM, HPDEAAFFDTASTGK, TFPGFF, TFPGFFSPM + Oxidation (M), TFPGFFSPML , TFPGFFSPML + Oxidation (M), PGFF, PGFFSPM + Oxidation (M), GFFSPMLGEFVSETESR + Oxidation (M), FSPMLGEFVSETESR + Oxidation (M), MLGEFVSETESR + Oxidation (M), MLGEFVSETESGS, ES, LGEFRGTN TNTKESSSHHPGIAEFPSR, ESSSHHPGIAEFPSR, SSHHPGIAEFPSR, SSHHPGIAEFPSRGK, HHPGIAEFPSR, SYSKQFTSSTSY, QFTSSTSYN, QFTSSTSYNR, KQFTSSTSYNR, YNRGDSTFESK, DHEGTHSTKRG, FGSLNDEGEGEF, HFR
前記αフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がMKPVPDLVPGN、MKPVPDLVPGNF、MKPVPDLVPGNFK、MKPVPDLVPGNFK + Oxidation(M)、ALTDMPQMR、ALTDMPQMR + 2 Oxidation(M)、ALTDMPQMR + Oxidation(M)、MELERPGGNEITR、MELERPGGNEITR + Oxidation(M)およびTFPGFFSPML + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。
好ましい。
As the α fibrinogen degradation products, the amino acid sequence is MKPVPDLVPGN, MKPVPDLVPGNF, MKPVPDLVPGNFK, MKPVPDLVPGNFK + Oxidation (M), ALTDMPQMR, ALTDMPQMR + 2 Oxidation (M), ALTDMPQMR + Oxidation (M), MELERPGGNidTR, ML The inclusion of at least one peptide of the group consisting of + Oxidation (M) in the detection target is particularly preferable in terms of improving the accuracy of identification.
preferable.
前記βフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がVNDNEEGFFSAR、DNEEGFFSAR、NEEGFF、GHRPLDK、GHRPLDKK、KREEAPSLR、REEAPSLR、EEAPSLRPA、SLRPAPPPISGGGYR、PAPPPISGGGY、PAPPPISGGGYR、PPPISGGGYR、PPISGGGYR、ARPAKAAATQK、MDGASQLMGENRTMTIHNGMFFSTYDRDN + 3 Oxidation(M)およびWYSMRKMSMKIRPF + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the β-fibrinogen degradation products, the amino acid sequence is VNDNEEGFFSAR, DNEEGFFSAR, NEEGFF, GHRPLDK, GHRPLDKK, KREEAPSLR, REEAPSLR, EEAPSLRPA, SLRPAPPPISGGGYR, PAPPPISGGGY, PAPPPISGGGYR, TIPPNGSGMQ, TI Preferably, at least one peptide of the group consisting of M) is included in the detection target.
前記βフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がREEAPSLRのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the β-fibrinogen degradation product, it is particularly preferable to include a peptide having an amino acid sequence of REEAPSLR in the detection target from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記アポリポプロテインA−I分解産物としてアミノ酸配列がAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDR、VLTLAVLFLTGSQARH、LLDNWDSVTSTFSK、NLEKETEGLRQEMSK + Oxidation(M)、AKVQPYLDDFQK、AKVQPYLDDFQKK、PYLDDFQKKWQEEMELYR + Oxidation(M)、WQEEMELYR、QKVEPLRAELQEGAR、AELQEGAR、AELQEGARQK、LHELQEK、LHELQEKLSPLGEEMRDR + Oxidation(M)、ELQEKLSPL、LSPLGEEMR + Oxidation(M)、LSPLGEEMR、SPLGEEMRDRARAH、ARAHVDALR、AHVDAL、AHVDALR、VDALR、THLAP、THLAPY、THLAPYSDEL、LAPYSDELR、APYSDELR、APYSDELRQR、PYSDELR、PYSDELRQR、ARLEALKENGGAR、EYHAKATEHLSTLSEK、ATEHLSTL、ATEHLSTLSEK、ATEHLSTLSEKAKPALEDLR、AKPALEDLR、ALEDLR、RQGLLPVLESF、LLPVLESF、LLPVLESFKV、LPVLESFK、PVLESF、VSFLSALEEYTK、VSFLSALEEYTKK、VSFLSALEEYTKKLNTQ、SFLSALEEYTK、FLSALEEYTKK、LSALEEYTKおよびLEEYTKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 The apolipoprotein A-I amino acid sequence as degradation products AVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDR, VLTLAVLFLTGSQARH, LLDNWDSVTSTFSK, NLEKETEGLRQEMSK + Oxidation (M), AKVQPYLDDFQK, AKVQPYLDDFQKK, PYLDDFQKKWQEEMELYR + Oxidation (M), WQEEMELYR, QKVEPLRAELQEGAR, AELQEGAR, AELQEGARQK, LHELQEK, LHELQEKLSPLGEEMRDR + Oxidation ( M), ELQEKLSPL, LSPLGEEMR + Oxidation (M), LSPLGEEMR, SPLGEEMRDRARAH, ARAHVDALR, AHVDAL, AHVDALR, VDALR, THLAP, THLAPY, THLAPYSDEL, LAPYSDELR, APYSDELR, YPSDELR, PYSDELRQR, PYSDELRQR AKPALEDLR, ALEDLR, RQGLLPVLESF, LLPVLESF, LLPVLESFKV, LPVLESFK, PVLESF, VSFLSALEEYTK, VSFLSALEEYTKK, VSFLSALEEYTKKLNTQ, SFLSALEEYTK, FLSALEEYTKK, LSALEEYTK and LEEYTK are included in the target.
前記アポリポプロテインA−I分解産物として、アミノ酸配列がAKVQPYLDDFQK、AKVQPYLDDFQKK、AHVDALR、THLAPYおよびLLPVLESFからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the apolipoprotein A-I degradation product, it is particularly preferable that at least one peptide of the group consisting of AKVQPYLDDFQK, AKVQPYLDDFQKK, AHVDALR, THLAPY and LLPVLESF is included in the detection target in terms of improving the accuracy of identification.
前記アポリポプロテインA−IV分解産物として、アミノ酸配列がQKSELTQQLNALFQDKLGE、SELTQQLNALFQDK、KELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQ、LLPHANEVSQK、LEPYADQLR、TQVNTQAEQLR、VNTQAEQLR、RQLTPYAQR、VLRENADSLQASLRPHADELK、AKIDQNVEELK、IDQNVEELK、GRLTPYADEFK、LTPYADEFK、PYADEFK、VKIDQTVEELR、VKIDQTVEELRR、IDQTVEELRR、QMKKNAEELKA、ARISASAEELR、LAPLAEDV、LAPLAEDVR、LAPLAEDVRGNLR、SLAELGGHLDQQVEEF、ELGGHLDQQVEEFR、ALVQQMEQL、ALVQQMEQLR、ALVQQMEQLR + Oxidation(M)、ALVQQMEQLRQK + Oxidation(M)、DKVNSFFSTFK、VNSFFSTFK、TLSLPELEQ、TLSLPELEQQおよびMLAPLESからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 Examples apolipoprotein A-IV degradation products, amino acid sequence QKSELTQQLNALFQDKLGE, SELTQQLNALFQDK, KELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQ, LLPHANEVSQK, LEPYADQLR, TQVNTQAEQLR, VNTQAEQLR, RQLTPYAQR, VLRENADSLQASLRPHADELK, AKIDQNVEELK, IDQNVEELK, GRLTPYADEFK, LTPYADEFK, PYADEFK, VKIDQTVEELR, VKIDQTVEELRR, IDQTVEELRR, QMKKNAEELKA, ARISASAEELR , LAPLAEDV, LAPLAEDVR, LAPLAEDVRGNLR, SLAELGGHLDQQVEEF, ELGGHLDQQVEEFR, ALVQQMEQL, ALVQQMEQLR, ALVQQMEQLR + Oxidation (M), ALVQQMEQLRQKQOLSF Preferably included.
前記アポリポプロテインA−IV分解産物として、アミノ酸配列がAKIDQNVEELKおよび／またはALVQQMEQLR + Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the apolipoprotein A-IV degradation product, inclusion of a peptide having an amino acid sequence of AKIDQNVEELK and / or ALVQQMEQLR + Oxidation (M) as a detection target is particularly preferable from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記アポリポプロテインC−III分解産物として、アミノ酸配列がLALLASARASEA、SEAEDASLL、SEAEDASLLSFMQGYMK + Oxidation(M)、SEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation(M)、SEAEDASLLSFMQGYMKH + Oxidation(M)、SEAEDASLLSFMQGYMKHATK + Oxidation(M)、ASLLSFMQGYMKHATKTA、SLLSFMQGYMK + 2 Oxidation(M)、TAKDALSSVQESQVAQQAR、DALSSVQESQVAQQAR、LSSVQESQVAQQAR、SVQESQVAQQARおよびGWVTDGFSSLKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the apolipoprotein C-III degradation products, the amino acid sequence is LALLASARASEA, SEAEDASLL, SEAEDASLLSFMQGYMK + Oxidation (M), SEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation (M), SEAEDASLLSFMQGYMKH + Oxidation (M), SEAEDASLKKYY It is preferable to include at least one peptide of the group consisting of Oxidation (M), TAKDALSSVQESQVAQQAR, DALSSVQESQVAQQAR, LSSVQESQVAQQAR, SVQESQVAQQAR and GWVTDGFSSLK as a detection target.
前記アポリポプロテインC−III分解産物として、アミノ酸配列がSEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the apolipoprotein C-III degradation product, it is particularly preferable that a peptide having an amino acid sequence of SEAEDASLLSFMQGYMK + 2Oxidation (M) is included in the detection target from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記アポリポプロテインE分解産物として、アミノ酸配列がALMDETMKELK + 2 Oxidation(M)、SELEEQLTPVAEETR、GEVQAMLGQSTEELR + Oxidation(M)、GLSAIRER、TVGSLAGQPLQERA、AKLEEQAQQIR、SWFEPL、SWFEPLV、SWFEPLVEDMQR + Oxidation(M)およびVQAAVGTSAAPVPSDNHからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As the apolipoprotein E degradation product, the amino acid sequence consists of ALMDETMKELK + 2 Oxidation (M), SELEEQLTPVAEETR, GEVQAMLGQSTEELR + Oxidation (M), GLSAIRER, TVGSLAGQPLQERA, AKLEEQAQQIR, SWFEPLV, SWFEPLV, SWFEPLQDMVAP, GT It is preferable to include at least one peptide in the detection target.
前記アポリポプロテインE分解産物として、アミノ酸配列がSELEEQLTPVAEETRのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the apolipoprotein E degradation product, inclusion of a peptide having an amino acid sequence of SELEEQLTPVAEETR in the detection target is particularly preferable from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記α−2−HS−グリコプロテイン分解産物として、アミノ酸配列がVLLLCLAQLWGCHSAPHG 、LAQLWGCHSAPHGPG、HYDLRHTFMGV、HYDLRHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR、RHTFMGVVSLGSPSGE + Oxidation(M)、HTFMGVVSLGSPSG + Oxidation(M)、HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR、HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation(M)
FMGVV、FMGVV + Oxidation(M)、FMGVVSL、FMGVVSL + Oxidation(M)、FMGVVSLGSPSG、FMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation(M)、SLGSPSGEVSHPRおよびGSPSGEVSHPRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。
As the α-2-HS-glycoprotein degradation products, the amino acid sequence is VLLLCLAQLWGCHSAPHG, LAQLWGCHSAPHGPG, HYDLRHTFMGV, HYDLRHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, RHTFMGVVSLGSPSGE + Oxidation (M), HTFMGVVSLGSPSG + OxidSH (VS), SGF
It is preferable to include at least one peptide of the group consisting of FMGVV, FMGVV + Oxidation (M), FMGVVSL, FMGVVSL + Oxidation (M), FMGVVSLGSPSG, FMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation (M), SLGSPSGEVSHPR and GSPSGEVSHPR.
前記α−2−HS−グリコプロテイン分解産物として、アミノ酸配列がFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVV + Oxidation(M)との組み合わせ、および／またはFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVVSLGSPSGとの組み合わせのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 As the α-2-HS-glycoprotein degradation product, a peptide whose amino acid sequence is a combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVV + Oxidation (M) and / or a combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVVSLGSPSG Inclusion in the detection target is particularly preferable in terms of improving identification accuracy.
前記ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物の分解産物として、アミノ酸配列がPGFMGKATPPY + Oxidation(M)および／またはENCIIVSMNTADPGのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As a degradation product of the expression product of the rat kidney-specific (KS) gene-like gene, a peptide whose amino acid sequence is PGFMGKATPPY + Oxidation (M) and / or ENCIIVSMNTADPG is preferably included in the detection target.
前記インターα(グロブリン)インヒビターH2分解産物として、アミノ酸配列がSLPGESEEMMEEVDQVTLYSYKVQSTITSRMAT、VFDVQIPKGAFISNFS、SSIKEKTVGR、GQQKAHVSFKPTV、QQKAHVSFKPTVAQQRICPSCRET、TILDDLR、NDLISATK、NDLISATKTQVADAK、IQPSGGTNINEALLR、RLSNENHGIAQR、LSNENHGIAQR、NENHGIAQR、IYGNQDTSSQLK、IYGNQDTSSQLKK、KFYNQVSTPLL、FYNQVSTPLLR、QLLAERSLAPTAA、SLAPTAAAKR、LQMSLDHHIVTPLTSLVIENEAG + Oxidation(M)、YYGSKVVPDSTP、STPSWANPSPTPVISMLAQGSQ、STPSWANPSATPVISMLAQGSQVLESTPPPHVMRVE、CFNIDSEPGKIL、SVKKEKVVTITLDKEMS + Oxidation(M)およびVTITLDKEMSFSVLLHRVWKKからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 The inter alpha (globulin) as inhibitors H2 degradation product, amino acid sequence SLPGESEEMMEEVDQVTLYSYKVQSTITSRMAT, VFDVQIPKGAFISNFS, SSIKEKTVGR, GQQKAHVSFKPTV, QQKAHVSFKPTVAQQRICPSCRET, TILDDLR, NDLISATK, NDLISATKTQVADAK, IQPSGGTNINEALLR, RLSNENHGIAQR, LSNENHGIAQR, NENHGIAQR, IYGNQDTSSQLK, IYGNQDTSSQLKK, KFYNQVSTPLL, FYNQVSTPLLR, QLLAERSLAPTAA, SLAPTAAAKR , LQMSLDHHIVTPLTSLVIENEAG + Oxidation (M), YYGSKVVPDSTP, STPSWANPSPTPVISMLAQGSQ, STPSWANPSATPVISMLAQGSQVLESTPPPHVMRVE, CFNIDSEPGKIL, SVKKEKVVTITLDKEMS + Oxidation (M) and VTITLDKEMS
前記インターα(グロブリン)インヒビターH2分解産物として、アミノ酸配列がIYGNQDTSSQLK、IYGNQDTSSQLKKおよびFYNQVSTPLLRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 It is particularly preferable from the viewpoint of improving the accuracy of identification that the inter-α (globulin) inhibitor H2 degradation product includes at least one peptide of the group consisting of IYGNQDTSSQLK, IYGNQDTSSQLKK and FYNQVSTPLLR as the detection target.
前記脳特異的血管新生抑制因子3の分解産物として、アミノ酸配列がADMDIVHPQERM + Oxidation(M)のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As a degradation product of the brain-specific angiogenesis inhibitory factor 3, a peptide having an amino acid sequence of ADDMIVHPQERM + Oxidation (M) is preferably included in the detection target.
前記有機アニオントランスポーター3の分解産物として、アミノ酸配列がPNASLPNDTQRAMEPのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As a degradation product of the organic anion transporter 3, a peptide having an amino acid sequence of PNASLPNDTQRAMEP is preferably included in the detection target.
前記ジンクフィンガー様プロテインH101の分解産物として、アミノ酸配列がLATDHPLLNTのペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 As a degradation product of the zinc finger-like protein H101, a peptide having an amino acid sequence of LATDHPLLNT is preferably included in the detection target.
前記補体C3の分解産物として、アミノ酸配列がHLPLALGSPMYSIIT + Oxidation(M)、SVQLTEKR、HLGLA、HLGLARおよびTLDPERLGRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることが好ましい。 It is preferable that the detection target includes at least one peptide of the group consisting of HLPLALGSPMYSIIT + Oxidation (M), SVQLTEKR, HLGLA, HLGLAR, and TLDPERLGR as the degradation product of complement C3.
前記補体C3の分解産物として、アミノ酸配列がHLGLAのペプチドを検出対象に含めることが、同定の精度を向上させる点で特に好ましい。 It is particularly preferable that a peptide having an amino acid sequence of HLGLA is included in the detection target as the degradation product of complement C3 from the viewpoint of improving the accuracy of identification.
前記リガンドの例には、抗体やアプタマーが挙げられる。アプタマーは、アルブミン分解産物のペプチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。検出感度と簡便性の点で抗体が好ましい。 Examples of the ligand include antibodies and aptamers. Aptamers are oligonucleotides that specifically bind to peptides of albumin degradation products. An antibody is preferable in terms of detection sensitivity and convenience.
上記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナ抗体のいずれでもよい。抗体は、従来公知の免疫方法を用いることにより容易に作成することができる。 The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. An antibody can be easily prepared by using a conventionally known immunization method.
ポリクローナル抗体は、常法に従って上記ペプチドをウサギ、ヤギなどの動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取および精製すればよい。 Polyclonal antibodies may be obtained by immunizing animals such as rabbits and goats with the above peptides according to conventional methods, and collecting and purifying antibodies produced in vivo.
モノクローナル抗体は、例えばKohler and Milstein, Nature 256, 495−497, 1975に記載の方法に従ってペプチドに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立すればよい。 For the monoclonal antibody, a hybridoma may be established by fusing an antibody-producing cell producing an antibody against the peptide and a myeloma cell according to the method described in Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, for example.
上記リガンドは、アンプル、ボトル、試験管、マイクロプレートのような容器に収容された状態で提供されてもよいし、マイクロアレイ、チューブ、ビーズなどの形状をした固相担体に担持させた状態で提供されてもよい。 The ligand may be provided in a state of being accommodated in a container such as an ampoule, a bottle, a test tube, or a microplate, or provided in a state of being supported on a solid phase carrier having a shape such as a microarray, a tube, or a bead. May be.
前記固相担体の材質には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。 Examples of the material of the solid phase carrier include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, nylon, and polyacrylamide.
前記固相担体の表面を化学修飾することによって、抗体またはアプタマーの接着性を強化してもよい。 The adhesiveness of the antibody or aptamer may be enhanced by chemically modifying the surface of the solid phase carrier.
本発明のうつ病またはうつ状態の診断用キットは、特異的該タンパク質分解産物と該リガンドとの結合を認識する手段もまた含む。これは、アルブミン分解産物などのタンパク質分解産物から作成された一次抗体またはその二次抗体あるいはアプタマーに結合させた標識、および、抗原抗体反応後に標識に作用させる基質の組み合わせからなる。 The diagnostic kit for depression or depression of the present invention also includes a means for recognizing the binding of the specific proteolytic product and the ligand. This consists of a combination of a primary antibody prepared from a proteolytic product such as albumin degradation product or a label bound to the secondary antibody or aptamer, and a substrate that acts on the label after the antigen-antibody reaction.
前記標識には、アルアリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチンなどが使用可能である。 For the label, ariphosphatase, horseradish peroxidase, biotin and the like can be used.
また、前記基質には、発色試薬、発光試薬、ラジオアイソトープなどが使用可能である。標識に基質が結合した際の発色や発光量を適宜の手段でカウントすることにより、特異的タンパク質分解産物を定性、定量することができる。 As the substrate, a coloring reagent, a luminescent reagent, a radioisotope, and the like can be used. A specific proteolytic product can be qualitatively and quantified by counting the color development and the amount of luminescence when the substrate is bound to the label by an appropriate means.
本発明のうつ病またはうつ状態の診断用キットの使用方法は、ELISAで知られる直接吸着法、サンドイッチ法、競合法のいずれでもよい。具体的には、パニングのように抗体の固定された担体を用いて対象ペプチドを集めた後、それはがして、ＭＳで検出するなどの方法が採用される。 The method for using the kit for diagnosing depression or depression of the present invention may be any of the direct adsorption method, sandwich method, and competitive method known by ELISA. Specifically, a method is used in which the target peptide is collected using an antibody-immobilized carrier as in panning, and then peeled off and detected by MS.
以下に、実施例を用いて、本発明の同定方法をより詳細に説明する。しかし、本発明の範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the identification method of the present invention will be described in more detail using examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples.
（うつ病患者の選別）
DSM−IVおよびICD−10の両基準の大うつ病に合致する患者を選別した。表１にDSM−IVによる大うつ病のエピソードを、そして、表２に選別された患者の性別、年齢、問診結果を示す。また、正常対照として、年齢および性別が患者群と有意差の出ない健常者群を18名選別した。各被験者の性別、年齢、問診結果を表２に示す。
(Selection of depression patients)
Patients who matched major depression on both DSM-IV and ICD-10 criteria were screened. Table 1 shows episodes of major depression caused by DSM-IV, and Table 2 shows the sex, age, and interview results of patients selected. As normal controls, 18 healthy subjects were selected that were not significantly different from the patient group in age and sex. Table 2 shows the sex, age, and interview results of each subject.
（出典：DSM−IV−TR 精神疾患の分類と診断の手引、医学書院、2002、高橋三郎、大野裕、染矢俊幸（訳））
(Source: DSM-IV-TR Psychiatric Classification and Diagnosis Guide, Medical School, 2002, Saburo Takahashi, Hiroshi Ohno, Toshiyuki Someya (translation))
（血漿の分離）
提供試料の使用について上記被験者からコンセンサスを得た後、静脈血７mLを、EDTA−２Na入りの真空採血管（容量７ｍｌ）に採取した。採血を、採取後120分以内に、800Ｇにて遠心処理することにより血漿を分離した。得られた血漿は、−80℃で保管した。保管できない場合は、できるだけ迅速に下記の測定に供した。
(Separation of plasma)
After obtaining consensus from the above subjects on the use of the provided sample, 7 mL of venous blood was collected into a vacuum blood collection tube (7 ml capacity) containing EDTA-2Na. Plasma was separated by centrifuging at 800 G within 120 minutes after collection. The obtained plasma was stored at −80 ° C. When it could not be stored, it was subjected to the following measurements as quickly as possible.
（低分子量タンパク質の回収）
分画分子量3000Daの低吸着再生セルロース製メンブレンからなる遠心式フィルターユニット（商品名Microcon（登録商標）、ミリポア製）に、前記血漿40μlを入れ、微小遠心管遠心分離機にて、4℃、12000rpm、30〜60分間、遠心処理した。血漿からの分離液がフィルターユニットの下側に10μl蓄積されたところで、遠心処理を終了した。フィルターユニットの下側に採取された血漿分離液には、3000Da以下の物質のみが濃縮された。なお、上部に残った液は廃棄した。
(Recovery of low molecular weight protein)
Place 40 μl of the plasma in a centrifugal filter unit (trade name Microcon (registered trademark), manufactured by Millipore) consisting of a low-adsorption regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 3000 Da. And centrifuged for 30-60 minutes. When 10 μl of the separation liquid from plasma was accumulated on the lower side of the filter unit, the centrifugation process was terminated. In the plasma separation collected at the lower side of the filter unit, only substances of 3000 Da or less were concentrated. The liquid remaining on the top was discarded.
（特異的タンパク質分解産物の精製）
下記の手順で、濃縮分離液を脱塩処理した。ZipTipピペットチップ（ミリポア社製）をP−20ピペットマンに装着し、50％アセトニトリル−0.1％TFAを吸い上げ，樹脂の上端ぎりぎりまで吐き出した（pre−wetting）。その際、樹脂に空気が入らないように慎重にピペッティングした。この操作を２回行った。次いで、0.1％TFAで同様に吸い吐きして樹脂を洗浄する操作を３回行った。その後、濃縮分離液をZipTipで吸って、別に用意した200μlチューブに移した。全部移し終えたら、再度、元のチューブに戻した。この作業を２往復くり返して、ペプチド断片をできるだけ多く吸着させた。0.1％TFAを吸い吐きして洗浄する操作を３回行った。4μlの20％アセトニトリル−0.1％TFAを200μlチューブに入れ、ZipTipで10回ほど吸い吐きして溶出し、最後に、完全に吐き出した。4μlの35％アセトニトリル−0.1％TFAと、4μlの50％アセトニトリル−0.1％TFAについても、同様に行い、ひとつの濃縮分離液からそれぞれの3種類のサンプル（4μl）を得た。
(Purification of specific proteolytic products)
The concentrated separation liquid was desalted by the following procedure. A ZipTip pipette tip (Millipore) was attached to a P-20 pipette man, 50% acetonitrile-0.1% TFA was sucked up and discharged to the very top of the resin (pre-wetting). At that time, pipetting was carefully performed so that air did not enter the resin. This operation was performed twice. Subsequently, the operation of washing and discharging the resin in the same manner with 0.1% TFA was performed three times. Thereafter, the concentrated separation liquid was sucked with ZipTip and transferred to a separately prepared 200 μl tube. When all was transferred, it was returned to the original tube again. This operation was repeated twice to adsorb as much peptide fragments as possible. The operation of sucking and washing 0.1% TFA was performed three times. 4 μl of 20% acetonitrile-0.1% TFA was put into a 200 μl tube, and it was eluted by exhaling about 10 times with ZipTip. Finally, it was completely exhaled. 4 μl of 35% acetonitrile-0.1% TFA and 4 μl of 50% acetonitrile-0.1% TFA were performed in the same manner, and three types of samples (4 μl) were obtained from one concentrated separation liquid.
（LC/MS測定）
これらのサンプルを、LC/MS装置（製品名LCQ、サーモクエスト社製）にかけた。具体的には、HPLCのC18逆相カラムにて、サンプル中の共存物質を分離した後、対象物質を含む液相をESI法によってイオントラップ型MSに直接導入した。LCおよびMSの測定条件を以下に示す。
(LC / MS measurement)
These samples were applied to an LC / MS apparatus (product name LCQ, manufactured by ThermoQuest). Specifically, coexisting substances in the sample were separated by HPLC C18 reverse phase column, and then the liquid phase containing the target substance was directly introduced into ion trap MS by ESI method. The measurement conditions for LC and MS are shown below.
（LCの条件）
カラム：Capillary Ex−Nano
移動相：A液 ２％アセトニトリル/98％超純水/0.1％ギ酸、B液 ９０％アセトニトリル/10％超純水/0.1％ギ酸
流量：80μl/min
注入量：4μl
(LC conditions)
Column: Capillary Ex-Nano
Mobile phase: Liquid A 2% acetonitrile / 98% ultrapure water / 0.1% formic acid, liquid B 90% acetonitrile / 10% ultrapure water / 0.1% formic acid Flow rate: 80 μl / min
Injection volume: 4μl
（MSの条件）
イオンスプレー電圧：130V
イオン源温度：200℃
(MS conditions)
Ion spray voltage: 130V
Ion source temperature: 200 ° C
上記条件でのMSとMS・MS分析により、サンプル中に含まれる特異的タンパク質分解産物（アルブミン、αフィブリノーゲン、βフィブリノーゲン、アポリポプロテインA−I、アポリポプロテインA−IV、アポリポプロテインC−III、アポリポプロテインE、α−2−HS−グリコプロテイン、ラット腎臓特異的(KS)遺伝子様遺伝子の発現産物、インターα(グロブリン)インヒビターH2、脳特異的血管新生抑制因子3、有機アニオントランスポーター3、ジンクフィンガー様プロテインH101および補体C3の分解産物を検出および同定した。 Specific protein degradation products (albumin, α fibrinogen, β fibrinogen, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-IV, apolipoprotein C-III, apolipo Protein E, α-2-HS-glycoprotein, rat kidney-specific (KS) gene-like gene expression product, inter α (globulin) inhibitor H2, brain-specific angiogenesis inhibitor 3, organic anion transporter 3, zinc The degradation products of finger-like protein H101 and complement C3 were detected and identified.
各被験者から採取された特異的タンパク質分解産物のアミノ酸配列を、表３〜１７に示す。 The amino acid sequences of specific proteolytic products collected from each subject are shown in Tables 3-17.
表３〜１７に示すように、うつ病患者の全員に、うつ病患者特有のペプチドがLC/MSの検出限界（１pmol/L）を超えて検出された。これらのペプチドは、健常者には検出されず、存在しても検出限界の１pmol/L未満と推定された。 As shown in Tables 3 to 17, the depression patient-specific peptide was detected in excess of the detection limit of LC / MS (1 pmol / L) in all of the depression patients. These peptides were not detected by healthy individuals, and even when present, it was estimated that the detection limit was less than 1 pmol / L.
ところで、うつ病およびうつ状態の検出は、一時点の生体試料の測定によってなされることを前提としている。実施例に示すように、現行の診断法によってうつ病であることが確認されている症例で表のペプチドが検出された事実からは、本発明の方法によってうつ病を検出することが可能であることが示された。これは、うつ状態ではないことを保障するものではなく、本発明の方法は、うつ状態も検出できる性質を持っている。 By the way, it is premised that the detection of depression and a depression state is made by measurement of a biological sample at a temporary point. As shown in the examples, it is possible to detect depression by the method of the present invention from the fact that the peptides in the table were detected in cases confirmed to be depressed by current diagnostic methods. It was shown that. This does not guarantee that the patient is not in a depressed state, and the method of the present invention has the property of detecting a depressed state.
うつ病患者18例すべてに出現するペプチドが、診断的価値を持つかどうかについて、χ二乗検定によれば、いずれのペプチドであっても、うつ病患者・うつ状態にこれらのペプチドが出現する事象は、Pearsonのχ二乗値36、尤度比49.907、漸近有意確率p<0.001であるため、きわめて、有意性が高いと判断できる。うつ病患者にのみアルブミン分解産物の少なくとも一種が出現する事象は、Pearsonのχ二乗値36、尤度比49.907、漸近有意確率p<0.001であったため、本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は有意性が極めて高いことが証明された。うつ病患者の性別ついては、χ二乗検定により、Pearsonのχ二乗値0.114、尤度比0.114、漸近有意確率p＝0.735と有意差はなかった。うつ病患者の年齢（平均41.89歳（SD値12.8））については、T検定により有意差はなかった（p=0.191）。よって、本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法は、性別や年齢に関係なく広く利用可能であることが証明された。 According to the chi-square test, whether peptides appearing in all 18 patients with depression have a diagnostic value. Since Pearson's chi-square value 36, likelihood ratio 49.907, and asymptotic significance probability p <0.001, it can be judged that the significance is extremely high. The event in which at least one albumin degradation product appears only in patients with depression was Pearson's chi-square value 36, likelihood ratio 49.907, asymptotic significance probability p <0.001, and therefore the method for identifying depression or depression according to the present invention Proved to be extremely significant. The gender of depression patients was not significantly different by chi-square test with Pearson's chi-square value 0.114, likelihood ratio 0.114, and asymptotic significance probability p = 0.735. The age of depression patients (mean 41.89 years (SD value 12.8)) was not significantly different by T test (p = 0.191). Therefore, it has been proved that the method for identifying depression or depression according to the present invention can be widely used regardless of gender and age.
さらに、表３〜１７中の以下のペプチドを検出対象に用いれば、患者のうつ病またはうつ状態を高い精度（実施例では１００％）で同定可能なことがわかる。
（１）アルブミン分解産物として、アミノ酸配列がDLGEENFKおよびALVLIAFのペプチド
（２）αフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がMKPVPDLVPGN、MKPVPDLVPGNF、MKPVPDLVPGNFK、MKPVPDLVPGNFK + Oxidation(M)、ALTDMPQMR、ALTDMPQMR + 2 Oxidation(M)、ALTDMPQMR + Oxidation(M)、MELERPGGNEITR、MELERPGGNEITR + Oxidation(M)およびTFPGFFSPML + Oxidation(M)からなる群の少なくとも一種のペプチド
（３）βフィブリノーゲン分解産物として、アミノ酸配列がREEAPSLRのペプチド
アポリポプロテインA−I分解産物として、アミノ酸配列がAKVQPYLDDFQK、AKVQPYLDDFQKK、AHVDALR、THLAPYおよびLLPVLESFからなる群の少なくとも一種のペプチド
（４）アポリポプロテインA−IV分解産物として、アミノ酸配列がAKIDQNVEELKおよび／またはALVQQMEQLR + Oxidation(M)のペプチド
（５）アポリポプロテインC−III分解産物として、アミノ酸配列がSEAEDASLLSFMQGYMK + 2 Oxidation(M)のペプチド
（６）アポリポプロテインE分解産物として、アミノ酸配列がSELEEQLTPVAEETRのペプチド
（７）α−2−HS−グリコプロテイン分解産物として、アミノ酸配列がFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVV + Oxidation(M)との組み合わせ、および／またはFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVVSLGSPSGとの組み合わせのペプチド
（８）インターα(グロブリン)インヒビターH2分解産物として、アミノ酸配列がIYGNQDTSSQLK、IYGNQDTSSQLKKおよびFYNQVSTPLLRからなる群の少なくとも一種のペプチド
（９）補体C3の分解産物として、アミノ酸配列がHLGLAのペプチド
Furthermore, if the following peptides in Tables 3 to 17 are used as detection targets, it can be seen that the patient's depression or depression can be identified with high accuracy (100% in the examples).
(1) As an albumin degradation product, a peptide whose amino acid sequence is DLGEENFK and ALVLIAF , ALTDMPQMR + Oxidation (M), MELERPGGNEITR, MELERPGGNEITR + Oxidation (M) and TFPGFFSPML + Oxidation (M) As an I degradation product, the amino acid sequence is AKVQPYLDDFQK, AKVQPYLDDFQKK, AHVDALR, THLAPY, and LLPVLESF. Peptide (5) as an apolipoprotein C-III degradation product, amino acids Peptide with the sequence SEAEDASLLSFMQGYMK + 2 Oxidation (M) (6) As an apolipoprotein E degradation product, Amino acid sequence as a peptide with SELEEQLTPVAEETR (7) α-2-HS-glycoprotein degradation product, Amino acid sequence FMGVVSL + Oxidation (M ) And FMGVV + Oxidation (M), and / or peptide (8) inter-alpha (globulin) inhibitor H2 degradation products in combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVVSLGSPSG. At least one peptide of the group consisting of (9) peptides whose amino acid sequence is HLGLA as a degradation product of complement C3
（１）に関して、アルブミンの特異的ペプチドで、１００％の頻度のものは見受けられないが、DLGEENFKおよびALVLIAFの二種類のペプチドを組み合わせると、患者１８例がすべて＋で埋まる。 Regarding (1), no albumin-specific peptide is found with a frequency of 100%, but when the two peptides of DLGEENFK and ALVLIAF are combined, all 18 patients are filled with +.
（７）に関して、α−2−HS−グリコプロテインの特異的ペプチドで、アミノ酸配列がFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVV + Oxidation(M)との組み合わせ、またはFMGVVSL + Oxidation(M)とFMGVVSLGSPSGとの組み合わせによれば、患者１８例がすべて＋で埋まる。 Regarding (7), it is a specific peptide of α-2-HS-glycoprotein, and the amino acid sequence is a combination of FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVV + Oxidation (M), or FMGVVSL + Oxidation (M) and FMGVVSLGSPSG According to the combination, all 18 patients are filled with +.
アルブミンやα−2−HS−グリコプロテイン以外の特異的ペプチドについても同様に、頻度が１００％未満のものを、すべての患者を網羅するように二種類以上適宜組み合わせることは、本発明のうつ病またはうつ状態の同定方法の好ましい実施態様である。そのような組み合わせは、表３〜１７から容易に抽出することができる。 Similarly, for specific peptides other than albumin and α-2-HS-glycoprotein, it is possible to appropriately combine two or more types having a frequency of less than 100% so as to cover all patients. Or a preferred embodiment of a method for identifying depression. Such combinations can be easily extracted from Tables 3-17.
Claims (33)
FMGVV、FMGVV + Oxidation(M)、FMGVVSL、FMGVVSL + Oxidation(M)、FMGVVSLGSPSG、FMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation(M)、SLGSPSGEVSHPRおよびGSPSGEVSHPRからなる群の少なくとも一種のペプチドを検出対象に含めることを特徴とする、請求項２に記載のうつ病またはうつ状態の同定方法。 As the α-2-HS-glycoprotein degradation product, the amino acid sequence is VLLLCLAQLWGCHSAPHG, LAQLWGCHSAPHGPG, HYDLRHTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, RHTFMGVVSLGSPSGE + Oxidation (M), HTFMGVVSLGSPSG + SGxEVSHVSGV
Claimed to include at least one peptide from the group consisting of FMGVV, FMGVV + Oxidation (M), FMGVVSL, FMGVVSL + Oxidation (M), FMGVVSLGSPSG, FMGVVSLGSPSGEVSHPR + Oxidation (M), SLGSPSGEVSHPR and GSPSGEVSHPR Item 3. The method for identifying depression or depression according to Item 2.
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