JP2009089615A - Primer, primer set, method for determining nitrate-reducing bacterium, and biological treatment method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）に用いられるプライマー、ならびに、プライマーセットに関し、さらには、硝酸還元細菌定量方法、および、生物処理方法に関する。 The present invention relates to primers and primer sets used for polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”), and further relates to a nitrate-reducing bacteria quantification method and a biological treatment method.
従来、窒素除去に係わる硝化細菌や脱窒細菌の検出や、その存在量の定量は、培養法により行なわれている。
例えば、硝酸還元細菌などの脱窒細菌の定量は、「下水試験方法 上巻 １９９７年版（発行所 財団法人日本下水道協会）」の６１３頁〜６１５頁に記載される方法によって行なわれている。
この培養法では、通常、結果が得られるまでに多大な時間を要し、例えば、培養法による脱窒細菌数の定量には７日〜１０日もの時間を必要としている。
Conventionally, detection of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria involved in nitrogen removal and quantification of their abundance have been carried out by culture methods.
For example, the quantification of denitrifying bacteria such as nitrate-reducing bacteria is carried out by the method described on pages 613 to 615 of “Sewage Test Method, Vol. 1997 (Published by Japan Sewerage Association)”.
This culturing method usually requires a great amount of time until results are obtained. For example, quantification of the number of denitrifying bacteria by the culturing method requires as much as 7 to 10 days.
近年、分子生物学的手法の発達により、硝化細菌や脱窒細菌を上記培養法などに比べて、比較的簡単にかつ短時間で定量できるようになっている。
例えば、硝化反応に関与する細菌としてアンモニアを亜硝酸に酸化するアンモニア酸化細菌や亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌が知られている。
このアンモニア酸化細菌の存在量の定量は、アンモニア酸化細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットとプローブを用いたリアルタイムＰＣＲで定量可能である（参考文献：Ｃｅｒｄａ Ｈａｒｍｓ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３年、３７巻、３４３頁〜３５１頁）。
また、亜硝酸酸化細菌の一種であるＮｉｔｒｏｓｐｉｒａ属細菌の存在数量は、亜硝酸酸化細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットとプローブを用いたリアルタイムＰＣＲで定量可能である（参考文献：Ｈｅｂｅ Ｍ．Ｄｉｏｎｉｓｉ他、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３年，６９巻，６５９７頁〜６６０４頁）。
In recent years, with the development of molecular biological techniques, nitrifying bacteria and denitrifying bacteria can be quantified relatively easily and in a short time compared to the above-described culture methods.
For example, ammonia-oxidizing bacteria that oxidize ammonia to nitrite and nitrite-oxidizing bacteria that oxidize nitrite to nitric acid are known as bacteria involved in the nitrification reaction.
The amount of the ammonia-oxidizing bacteria can be quantified by real-time PCR using a primer set and probe specific for the 16S rRNA gene of the ammonia-oxidizing bacteria (Reference: Cerda Harms et al., Environ. Sci. Technol.,). 2003, 37, 343-351).
In addition, the amount of Nitrospira genus bacteria, which is a kind of nitrite-oxidizing bacteria, can be quantified by real-time PCR using a primer set and probe specific for the 16S rRNA gene of nitrite-oxidizing bacteria (reference document: Hebe M. et al. Dionisi et al., Appl.Environ.Microbiol., 2003, 69, 6597-6604).
脱窒反応に関与する細菌としては、硝酸を亜硝酸に還元する硝酸還元細菌、亜硝酸を一酸化窒素に還元する亜硝酸還元細菌、一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する一酸化窒素還元細菌、および亜酸化窒素を窒素ガスに還元する亜酸化窒素還元細菌が知られている。
この内、亜硝酸還元細菌の存在数量は、亜硝酸還元酵素遺伝子（例えば、ｎｉｒＫやｎｉｒＳ遺伝子）に特異的なリアルタイムＰＣＲで定量が可能である（参考文献：Ｓｏｎｉａ Ｈｅｎｒｙ他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２００４年，５９巻，３２７頁〜３３５頁、Ｅｌｌｅｎ Ｋａｎｄｅｌｅｒ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６年，７２巻，５９５７頁〜５９６２頁）。
また、近年、ＰＣＲによるｎｏｒＢ遺伝子の検出や定量も検討されている（下記特許文献１参照）。
The bacteria involved in the denitrification reaction are nitrate-reducing bacteria that reduce nitrate to nitrite, nitrite-reducing bacteria that reduce nitrite to nitric oxide, and nitric oxide-reducing bacteria that reduce nitric oxide to nitrous oxide. Nitrous oxide-reducing bacteria that reduce nitrous oxide to nitrogen gas are known.
Among these, the quantity of nitrite-reducing bacteria can be quantified by real-time PCR specific to a nitrite reductase gene (for example, mirK or mirS gene) (reference: Sony Henry et al., J. Microbiol. Methods). , 2004, 59, 327-335, Ellen Kandeler et al., Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72, 5957-5962.
In recent years, detection and quantification of the norB gene by PCR have also been studied (see
また、亜酸化窒素還元細菌の存在数量は、亜酸化窒素還元酵素遺伝子（例えば、ｎｏｓＺ遺伝子）に特異的なリアルタイムＰＣＲ法で定量可能である（参考文献：Ｓ．Ｈｅｎｒｙ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６年，７２巻，５１８１頁〜５１８９頁）。 In addition, the quantity of nitrous oxide-reducing bacteria can be quantified by a real-time PCR method specific to a nitrous oxide reductase gene (for example, the nosZ gene) (reference document: S. Henry et al., Appl. Environ. Microbiol). 2006, 72, 5181-5189).
さらに、硝酸還元細菌数の定量に関しても硝酸還元酵素遺伝子（ｎａｒＧ遺伝子）に特異的なＰＣＲプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲが検討されている（参考文献：Ｊｕａｎ Ｃ．Ｌｏｐｅｚ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２００４年，５７巻，３９９頁〜４０７頁）。
しかし、上記において検討されている方法は、ある特定の遺伝子グループに属するｎａｒＧ遺伝子だけを標的にしたＰＣＲプライマーを用いた定量方法であり、汎用的な定量方法ではない。
Furthermore, for the quantification of the number of nitrate-reducing bacteria, real-time PCR using PCR primers specific for the nitrate reductase gene (narG gene) has been examined (reference: Juan C. Lopez-Gutierrez et al., J. Microbiol. Methods., 2004, 57, 399-407).
However, the method studied above is a quantification method using PCR primers targeting only the narG gene belonging to a specific gene group, and is not a general-purpose quantification method.
ところで、上記のような細菌を用いて、処理対象となる排水（以下「被処理水」ともいう）からアンモニアや有機性窒素成分などの処理対象物質を除去する生物処理方法が広く行われている。
この生物処理方法においては、細菌と被処理水とが収容される槽（以下「生物処理槽」ともいう）が用いられており、生物処理方法は、前記生物処理槽内に細菌と被処理水とを含む混合相が形成されて実施されている。
近年、この生物処理槽から排出される処理水の水質を一定以上に維持させるべく、生物処理槽の槽内水の一部を試料として採取してこの試料中の細菌数や溶存酸素濃度などを計測し、該計測結果をもとにシミュレーションを実施してシミュレーション結果を生物処理槽の運転方法にフィードバックさせることが行われている。
By the way, biological treatment methods for removing substances to be treated such as ammonia and organic nitrogen components from wastewater to be treated (hereinafter also referred to as “treated water”) using bacteria as described above are widely used. .
In this biological treatment method, a tank (hereinafter also referred to as “biological treatment tank”) in which bacteria and treated water are stored is used, and the biological treatment method includes bacteria and treated water in the biological treatment tank. A mixed phase containing and is formed.
In recent years, in order to maintain the quality of treated water discharged from this biological treatment tank above a certain level, a part of the water in the biological treatment tank is collected as a sample, and the number of bacteria, dissolved oxygen concentration, etc. in this sample are collected. Measurement is performed, a simulation is performed based on the measurement result, and the simulation result is fed back to the operation method of the biological treatment tank.
しかし、上記のように硝酸還元細菌については、ＰＣＲ用のプライマーとして、特定の遺伝子グループに属するｎａｒＧ遺伝子だけを標的にしたものしか見出されておらず、硝酸還元細菌の検出やその定量が可能な汎用的なＰＣＲの方法が確立されてはいない。
また、培養法では、上記のように多大な時間がかかることから硝酸還元細菌の定量の結果を生物処理槽の運転方法に反映させることは実質不可能である。
However, as described above, only nitrate-reducing bacteria that target only the narG gene belonging to a specific gene group have been found for nitrate-reducing bacteria, enabling detection and quantification of nitrate-reducing bacteria. No general-purpose PCR method has been established.
In addition, since the culture method takes a long time as described above, it is virtually impossible to reflect the result of quantification of nitrate-reducing bacteria in the operation method of the biological treatment tank.
すなわち、従来、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに用いられるプライマーあるいはプライマーセットにおいては、硝酸還元細菌の検出や定量に適したものが提供されていないという問題を有している。
したがって、ＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量方法も汎用性を有していないという問題を有している。
さらには、硝酸還元細菌による硝酸態窒素の還元が実施される生物処理方法においては、処理水の水質を予測することが困難で一定以上の水質を維持させることが困難であるという問題を有している。
That is, conventionally, a primer or primer set used for PCR for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria has not been provided with a primer or primer set suitable for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria.
Therefore, the method for quantifying nitrate-reducing bacteria by PCR also has a problem that it does not have versatility.
Furthermore, in the biological treatment method in which nitrate nitrogen is reduced by nitrate-reducing bacteria, it is difficult to predict the quality of treated water and to maintain a certain level of water quality. ing.
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーの提供を課題としている。
また、本発明は、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーセットの提供を課題としている。
また、本発明は、硝酸還元細菌の汎用的な定量方法の提供を課題としている。
さらには、本発明は、硝酸還元細菌による硝酸態窒素の還元が実施される生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る生物処理方法の提供を課題としている。
The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide primers suitable for PCR for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria.
Another object of the present invention is to provide a primer set suitable for PCR for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria.
Another object of the present invention is to provide a versatile method for quantifying nitrate-reducing bacteria.
Furthermore, the present invention provides a biological treatment method in which nitrate nitrogen is reduced by nitrate-reducing bacteria, and the biological treatment method can easily carry out biological treatment in which the quality of treated water is maintained at a certain level or higher. It is an issue.
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲのプライマーとして好適なプライマーを見出し本発明の完成に到ったのである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a primer suitable as a PCR primer for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria, and have completed the present invention.
すなわち、本発明にかかるプライマーは、硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：１に記載の塩基性配列を有していることを特徴としている。 That is, the primer according to the present invention is used for PCR for detecting or quantifying nitrate-reducing bacteria, and has a basic sequence described in SEQ ID NO: 1.
また、本発明にかかるプライマーセットは、硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、配列番号：２に記載の塩基性配列を有しているプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、配列番号：１に記載の塩基性配列を有しているプライマーが用いられていることを特徴としている。 The primer set according to the present invention is used in PCR for detection or quantification of nitrate-reducing bacteria, and includes a forward primer and a reverse primer, and the basic primer described in SEQ ID NO: 2 is used as the forward primer. A primer having a sequence is used, and a primer having a basic sequence described in SEQ ID NO: 1 is used as the reverse primer.
また、本発明にかかる硝酸還元細菌定量方法は、配列番号：１に記載の塩基性配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基性配列を有しているプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによって硝酸還元細菌の定量を実施することを特徴としている。 Moreover, the nitrate-reducing bacteria quantification method according to the present invention used a primer having the basic sequence described in SEQ ID NO: 1 and a primer having the basic sequence described in SEQ ID NO: 2. The quantification of nitrate-reducing bacteria is performed by real-time PCR.
さらに、本発明にかかる生物処理方法は、硝酸態窒素を含有する被処理水と硝酸還元細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記硝酸還元細菌により前記硝酸態窒素を還元する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、配列番号：１に記載の塩基性配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基性配列を有しているプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによって前記硝酸還元細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴としている。 Furthermore, the biological treatment method according to the present invention is a biological treatment in which a mixed phase containing treated water containing nitrate nitrogen and nitrate-reducing bacteria is formed in a tank, and the nitrate nitrogen is reduced by the nitrate-reducing bacteria. A biological treatment method in which the primer having the basic sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the primer having the basic sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are used. The biological treatment is carried out while quantifying the nitrate-reducing bacteria by real-time PCR.
本発明によれば、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーならびにプライマーセットを提供し得る。
また、本発明によれば、ＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量方法の汎用性をも向上させ得る。
さらには、硝酸還元細菌により硝酸態窒素を還元する生物処理が実施される生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る。
According to the present invention, it is possible to provide a primer and a primer set suitable for PCR for detection and quantification of nitrate-reducing bacteria.
Moreover, according to the present invention, the versatility of the method for quantifying nitrate-reducing bacteria by PCR can be improved.
Furthermore, in a biological treatment method in which nitrate treatment is performed by nitrate-reducing bacteria to reduce nitrate nitrogen, biological treatment in which the quality of treated water is maintained at a certain level or more can be easily performed.
本発明の実施の形態について、硝化槽から排出された硝酸態窒素などの窒素成分を含有する被処理水をパラッコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌などの硝酸還元細菌が収容されている生物処理槽（以下「脱窒槽」ともいう）に導入するとともに、該脱窒槽において前記硝酸還元細菌で硝酸態窒素が還元されて窒素成分が除去（脱窒）された処理水を排出させる生物処理方法を例に説明する。 Embodiments of the present invention, water to be treated containing nitrogen component, such as nitrate nitrogen discharged from the nitrification tank Para' Lactococcus (Paracoccus) bacteria, nitrate-reducing bacteria, such as Pseudomonas (Pseudomonas) bacteria housed In the biological treatment tank (hereinafter also referred to as “denitrification tank”), and in the denitrification tank, nitrate water is reduced by the nitrate-reducing bacteria to remove the nitrogen component (denitrification) and discharge the treated water. A biological treatment method will be described as an example.
本実施形態の生物処理方法においては、被処理水と硝酸還元細菌とを含んだ活性汚泥状態で前記脱窒槽内に混合相を形成させて生物処理を実施する。
しかも、定期的に前記混合相が形成されている脱窒槽の槽内水（以下「活性汚泥」ともいう）をサンプリングして、該サンプリングされた槽内水中の窒素成分含有量、溶存酸素量を測定するとともに硝酸還元細菌の定量を実施して得られた測定結果をパラメータとするシミュレーションを実施して脱窒槽から排出される処理水の水質を予測する。
そしてこの予測結果を硝化槽や脱窒槽の運転条件などにフィードバックさせて、例えば、硝化槽における散気量や、硝化槽、脱窒槽の槽内温度、汚泥の引抜き条件、汚泥返送条件などを調整する。
本実施形態の生物処理方法は、後述するリアルタイムＰＣＲにより硝酸還元細菌の定量を簡便且つ短時間に測定し得ることから、上記のようなシミュレーションとその結果のフィードバックとを容易に実施させることができ、脱窒槽から排出される処理水の水質を一定以上に維持させることを容易に実施させ得る。
In the biological treatment method of this embodiment, biological treatment is performed by forming a mixed phase in the denitrification tank in an activated sludge state containing treated water and nitrate-reducing bacteria.
Moreover, the water in the denitrification tank (hereinafter also referred to as “activated sludge”) in which the mixed phase is regularly formed is sampled, and the nitrogen component content and dissolved oxygen content in the sampled water in the tank are determined. The quality of the treated water discharged from the denitrification tank is predicted by performing a simulation using the measurement result obtained by quantifying nitrate-reducing bacteria as a parameter.
This prediction result is fed back to the operating conditions of the nitrification tank and denitrification tank, for example, adjusting the amount of air diffused in the nitrification tank, the temperature in the nitrification tank and the denitrification tank, the sludge extraction condition, the sludge return condition, etc. To do.
Since the biological treatment method of the present embodiment can measure nitrate-reducing bacteria in a simple manner in a short time by real-time PCR, which will be described later, it is possible to easily carry out the above simulation and the feedback of the result. The quality of the treated water discharged from the denitrification tank can be easily maintained at a certain level or higher.
前記シミュレーションは、例えば、ＩＷＡ（世界水協会）により作成された、ＡＳＭ１、ＡＳＭ２、ＡＳＭ２ｄ、ＡＳＭ３などのシミュレーションモデルを利用して実施させることができる。
また、シミュレーションに用いるパラメータの内、硝酸還元細菌の量（個体数）などはＰＣＲによって求めることができる
The simulation can be performed using a simulation model such as ASM1, ASM2, ASM2d, and ASM3 created by IWA (World Water Association), for example.
Of the parameters used in the simulation, the amount (number of individuals) of nitrate-reducing bacteria can be determined by PCR.
このＰＣＲとしては、簡便でありながら比較的高い精度で細菌の定量が可能なリアルタイムＰＣＲを実施することが好ましい。
このリアルタイムＰＣＲとしては、蛍光を発する色素をインターカレートさせる方法や、蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法などを採用し得る。
また、例えば、このリアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施することができる。
As this PCR, it is preferable to carry out real-time PCR that is simple but capable of quantifying bacteria with relatively high accuracy.
As this real-time PCR, a method of intercalating a fluorescent dye or a method using a probe to which a fluorescent dye is bound may be employed.
Further, for example, this real-time PCR can be performed using a real-time PCR apparatus such as Applied Biosystems 7300 (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
このリアルタイムＰＣＲには、フォアワードプライマーとしてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）（参考文献：Ｒａｌｆ Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）と、リバースプライマーとして本発明者が設計したｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）とを含むプライマーセットを用いることが好ましい。
上記プライマーならびにプライマーセットを用いることにより、ｎａｒＨ遺伝子（参考文献：Ｒａｌｆ Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）との相同性の高いＤＮＡの増幅を他の遺伝子の非特異的な増幅を抑制しつつＰＣＲを実施させることができ好適である。
For this real-time PCR, narH50F (SEQ ID NO: 5′-AARTGYATCGGYTGCCA-3 ′) (reference: Ralph Petri and Johannes F. Imhoff, 2000, Systemic and Applied Microbiology, pages 47 to 47) 57) and a primer set comprising narHr3B (SEQ ID NO: 5′-TCCCCARKCCCTTGGRTAG-3 ′) designed by the present inventor as a reverse primer.
Amplification of DNA having high homology with the narH gene (reference: Ralph Petri and Johns F. Imhoff, 2000, Systematic and Applied Microbiology, 23, 47-57) by using the above primers and primer sets It is preferable that PCR can be performed while suppressing non-specific amplification of other genes.
このようなプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量は汎用性にも優れており、迅速且つ精度良く硝酸還元細菌の定量が実施でき、生物処理方法における処理水質の向上にも有用である。 The quantification of nitrate-reducing bacteria by real-time PCR using such a primer set is excellent in versatility, and can quantitate nitrate-reducing bacteria quickly and accurately, and is useful for improving the quality of treated water in biological treatment methods. is there.
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited to these.
（硝酸還元細菌用PCRプライマーの設計）
１）硝酸還元細菌のｎａｒＨ遺伝子のクローニングとシーケンス
生物学的に窒素除去を行っている排水処理設備の脱窒槽から活性汚泥を採取し、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（株式会社ニッポンジーン製）を用いＤＮＡを精製した。
なお、このＤＮＡの精製は、製造業者の推奨する方法に従って実施した。
(Design of PCR primers for nitrate-reducing bacteria)
1) Cloning and sequencing of the narH gene of nitrate-reducing bacteria Collected activated sludge from a denitrification tank of a wastewater treatment facility that is biologically removing nitrogen, and purified DNA using ISOIL for Beads Beating (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) did.
The DNA was purified according to the method recommended by the manufacturer.
この精製したＤＮＡを鋳型としてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）とｎａｒＨ４３０Ｂ（配列番号３：５’−ＴＣＮＴＣＣＣＡＧＴＴＮＧＧＮＣＣ−３’）のプライマーセット（参考文献：Ｒａｌｆ Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）を用いて硝酸還元細菌のｎａｒＨ遺伝子を増幅した。 Using this purified DNA as a template, primer sets of narH50F (SEQ ID NO: 2'-AARTGYATCGGGTGCCCA-3 ') and narH430B (SEQ ID NO: 5'-TCNTCCCACGTTNGGNCC-3') (reference document: Ralph Petri and Johannes F. Imhoff , 2000, Systematic and Applied Microbiology, Vol. 23, pp. 47-57), the narH gene of nitrate-reducing bacteria was amplified.
この増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製）を用い、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、大腸菌を形質転換した。
なお、増幅産物の精製ならびにクローニングの方法は、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
This amplified product was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by Qiagen Co., Ltd.) and then cloned into a pCR4-TOPO vector using TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen Corporation) to transform Escherichia coli.
The amplification product was purified and cloned according to the method recommended by each manufacturer.
得られた形質転換体を任意に４８個選択し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社製）を用いて組み換えプラスミドを精製した。
このプラスミドを鋳型にしてＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を決定した。
なお、この組み換えプラスミドの精製ならびにＤＮＡ配列の決定については、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
Forty-eight obtained transformants were arbitrarily selected, and the recombinant plasmid was purified using QIAquick Spin Miniprep Kit (manufactured by Invitrogen Corporation).
Using this plasmid as a template, the DNA sequence of the PCR amplification product was determined using the BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
The purification of the recombinant plasmid and the determination of the DNA sequence were performed according to the method recommended by each manufacturer.
２）ＰＣＲプライマーの設計
上記“手順１”で決定したＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｍｌ．ｇｏｖ／）を行い、ＰＣＲ増幅産物が既知のｎａｒＨ遺伝子と相同性が高いことを確認した。
引き続いて決定したＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷ解析（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）を行い、それぞれのＰＣＲ増幅産物に共通に存在するＤＮＡ配列を検索し、下記のプライマーを設計した。
ｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）
2) PCR primer design A BLAST homology search (http://www.ncbi.nml.gov/) between the DNA sequence of the PCR amplification product determined in the above "
Subsequently, a CLUSTALW analysis (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) of the determined DNA sequence was performed to search for a DNA sequence commonly present in each PCR amplification product, and the following primers were designed. .
narHr3B (SEQ ID NO: 1 5'-TCCCCARKCCCTTGGRTAG-3 ')
３）リアルタイムＰＣＲ条件の検討
上記１）で精製したＤＮＡを鋳型にして、フォアワードプライマーとしてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）（参考文献：Ｒａｌｆ Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）、リバースプライマーとして上記ｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）、および、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を含む反応液を用いて、ＰＣＲの条件検討を行った。
3) Examination of real-time PCR conditions The DNA purified in 1) above was used as a template, and narH50F (SEQ ID NO: 5′-AARTGYATCGGYTGCCA-3 ′) as a forward primer (reference: Ralph Petri and Johannes F. Imhoff, 2000) Year, Systematic and Applied Microbiology, Vol. 23, pp. 47-57), including the above narHr3B (SEQ ID NO: 5′-TCCCARCKCCTGTGRTTAG-3 ′) as a reverse primer, and SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.) PCR conditions were examined using the reaction solution.
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行なった。
各プライマー濃度と反応温度を変え、アガロースゲル電気泳動で目的とする１２８ｂｐの単一の増幅産物が得られること、融解曲線分析でシングルピークとなること、および増幅効率が８０％以上となるような条件を検討した。
その結果、表１に示す最適条件を決定した。
The PCR reaction was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
Each primer concentration and reaction temperature are changed, and a target amplification product of 128 bp can be obtained by agarose gel electrophoresis, a single peak can be obtained by melting curve analysis, and amplification efficiency can be 80% or more. The conditions were examined.
As a result, the optimum conditions shown in Table 1 were determined.
さらに、リアルタイムＰＣＲの増幅産物を上記１）に記載の方法と同様の方法でｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、６１個の形質転換体からプラスミドを精製しＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を決定した。
これらのＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性解析を行った。
Furthermore, the amplified product of real-time PCR was cloned into the pCR4-TOPO vector in the same manner as described in 1) above, and the plasmid was purified from 61 transformants to determine the DNA sequence of the PCR amplified product.
BLAST homology analysis was performed between these DNA sequences and known genes.
上記表１に示す最適条件でリアルタイムＰＣＲを行なった時のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真を図１に、融解曲線を図２にそれぞれ示す。
アガロースゲル電気泳動により、目的とする１２８ｂｐの単一のバンドが増幅されていたこと、および融解曲線はシングルピークとなっていたことから、非特異的なＤＮＡの増幅は起こっていないことが確認された。
さらに、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、解析した６１個のクローン全てにおいてｎａｒＨ遺伝子と相同性が高く、他の遺伝子の非特異的な増幅は起きていないことを確認した（下記表２参照）。
An agarose gel electrophoresis photograph of the PCR product when real-time PCR is performed under the optimum conditions shown in Table 1 is shown in FIG. 1, and a melting curve is shown in FIG.
As a result of agarose gel electrophoresis, the target 128 bp single band was amplified and the melting curve was a single peak, confirming that non-specific DNA amplification did not occur. It was.
Furthermore, as a result of the BLAST homology search between the DNA sequence of the PCR product and the known gene, all the analyzed 61 clones are highly homologous to the narH gene, and non-specific amplification of other genes has not occurred. (See Table 2 below).
４）硝酸還元細菌の存在数量の定量
窒素除去を行っている火力発電所の排水処理設備および下水処理場の排水処理設備から活性汚泥を採取し、上記１）と同様の方法で活性汚泥からＤＮＡを精製した。このＤＮＡを鋳型にして表１に示す条件でリアルタイムＰＣＲを行い、硝酸還元細菌の存在数量を求めた。
4) Quantification of the amount of nitrate-reducing bacteria The activated sludge is collected from the wastewater treatment facility of the thermal power plant and the sewage treatment plant where nitrogen is removed, and DNA is extracted from the activated sludge in the same manner as 1) above. Was purified. Using this DNA as a template, real-time PCR was performed under the conditions shown in Table 1 to determine the number of nitrate-reducing bacteria present.
検量線作成用のスタンダードサンプルは、上記１）にてクローニングしたｎａｒＨ遺伝子を用いた。
検量線の作成には３．２×１０4、１．６×１０5、８．０×１０6、４．０×１０6、２．０×１０7および１．０×１０8ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎのスタンダードサンプルを用いた。
表３に火力発電所排水処理設備の脱窒槽の活性汚泥および下水処理場の曝気槽の活性汚泥に存在する硝酸還元細菌数、すなわちｎａｒＨ遺伝子のコピー数をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示す。
As a standard sample for preparing a calibration curve, the narH gene cloned in 1) above was used.
For the creation of calibration curves, 3.2 × 10 4 , 1.6 × 10 5 , 8.0 × 10 6 , 4.0 × 10 6 , 2.0 × 10 7 and 1.0 × 10 8 copies / reactions Standard samples were used.
Table 3 shows the results of quantifying the number of nitrate-reducing bacteria present in the activated sludge of the denitrification tank of the thermal power plant wastewater treatment facility and the activated sludge of the aeration tank of the sewage treatment plant, that is, the number of copies of the narH gene, by real-time PCR.
その結果、火力発電所排水処理設備の脱窒槽の活性汚泥には１ｍｌあたり１．６０×１０8〜３．４３×１０8コピー、また下水処理場の曝気槽の活性汚泥には６．８４×１０7〜９．９７×１０7コピーのｎａｒＨ遺伝子が存在することがわかった。 As a result, 1.60 × 10 8 to 3.43 × 10 8 copies per ml are used for the activated sludge in the denitrification tank of the thermal power plant wastewater treatment facility, and 6.84 × for the activated sludge in the aeration tank of the sewage treatment plant. It was found that 10 7 to 9.97 × 10 7 copies of the narH gene was present.
上記のことからも、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーが硝酸還元細菌の検出や定量に好適であることがわかる。 From the above, it can be seen that the primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is suitable for the detection and quantification of nitrate-reducing bacteria.
Claims (4)
配列番号：１に記載の塩基性配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基性配列を有しているプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによって前記硝酸還元細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴とする生物処理方法。 A biological treatment method for carrying out a biological treatment in which a mixed phase containing water to be treated containing nitrate nitrogen and nitrate-reducing bacteria is formed in the tank and the nitrate nitrogen is reduced by the nitrate-reducing bacteria in the tank. There,
While quantifying the nitrate-reducing bacteria by real-time PCR using a primer having the basic sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a primer having the basic sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The biological treatment method characterized by implementing biological treatment.
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