JP2009085933A - Temperature-responsive chromatography carrier manufacturing method, chromatography carrier obtained from the method, and utilizing method of the carrier - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、水系移動相を含む特定の条件下で、生物学、医学、薬学等の分野において有用な高分子量の生理活性物質を分離できる、固体表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを被覆した液体クロマトグラフィー用担体の製造方法に関する。 The present invention can separate a high molecular weight physiologically active substance useful in the fields of biology, medicine, pharmacy and the like on a solid surface within a temperature range of 0 to 80 ° C. under specific conditions including an aqueous mobile phase. The present invention relates to a method for producing a carrier for liquid chromatography coated with a charged polymer that varies in sum.
現在普及している高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術は、移動相液体と担体の組合せや、分離に係わる相互作用の様式が多種多様である。このため、試料に応じて種々選択できるので、近年、種々の物質の分離、精製に利用されている。このような技術革新により、制約はあるものの生化学分野の医薬品の分離精製、ペプチドや蛋白質、核酸などの分離が行えるようになってきた。そして、遺伝子工学手法により生産される組換え蛋白質などのバイオ医薬への応用が盛んになるにつれ、これらの分離精製技術のさらなる革新が強まりつつある。 High-performance liquid chromatography (HPLC) techniques that are currently in widespread use various combinations of mobile phase liquids and carriers, and modes of interaction related to separation. For this reason, since it can select variously according to a sample, it is utilized for isolation | separation and refinement | purification of various substances in recent years. Due to such technological innovations, although there are limitations, it has become possible to separate and purify pharmaceuticals in the biochemical field and to separate peptides, proteins, nucleic acids and the like. Further, as the application to biopharmaceuticals such as recombinant proteins produced by genetic engineering techniques becomes more prominent, further innovations in these separation and purification technologies are becoming stronger.
従来使用されているクロマトグラフィーは担体の表面構造は変えずに、主に移動相中に含まれている溶質と担体表面との相互作用を移動相の溶媒を変えることで行われている。例えば、逆相クロマトグラフィーは、疎水性の担体と極性の移動相からなる方法である。溶質はその疎水性度に応じて移動相と担体との間で分配されることで分離される。この場合、移動相の溶媒の疎水性度を変化させ移動相と担体との間の分配を変化させ溶出させている。その際、移動相の溶媒として、メタノ−ル、アセトニトリルなどの有機溶媒を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。 Chromatography conventionally used is performed by changing the solvent of the mobile phase, mainly for the interaction between the solute contained in the mobile phase and the surface of the support without changing the surface structure of the support. For example, reverse phase chromatography is a method comprising a hydrophobic carrier and a polar mobile phase. Solutes are separated by partitioning between the mobile phase and the carrier according to their hydrophobicity. In this case, the hydrophobicity of the solvent of the mobile phase is changed, and the partition between the mobile phase and the carrier is changed and eluted. In that case, since organic solvents, such as a methanol and acetonitrile, are used as a solvent of a mobile phase, there existed a problem which impaired the activity of the biological component used as separation object.
また、イオン交換クロマトグラフィーでは、担体表面に陰イオン交換体あるいは陽イオン交換体を固定し、移動相中に存在する対イオンイオン濃度あるいは種類を変化させて物質分離を行っている。保持担体にはシリカ、セルロースやデキストラン、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体などが良く用いられ、これら担体に通常、スルホン酸基、四級アンモニウム基などのイオン交換基を導入される。溶質は、移動相の水素イオン濃度に応じてカチオン、アニオン、両性イオンに解離し、この溶質をイオン交換カラムに流した時担体表面の逆荷電の交換基に移動相内のイオンと競合して結合し、移動相と担体表面の間に一定の割合で分配する。イオン交換クロマトグラフィーとは、この結合の強さによりカラム内を移動する速度が異なることを利用して分離するものである。この分配の割合は幾つかの方法により変化させることができる。例えば、移動相中の競合するイオン種の濃度を変える方法、或いは移動相の水素イオン濃度を変化させ、担体表面のイオン交換基のイオン化程度の割合を変化させる方法が挙げられる。すなわち、イオン交換クロマトグラフィーにおいては、移動相のイオン強度や水素イオン濃度を調節することで分離する方法が一般的に行われている。その際、移動相として酸や高塩濃度の緩衝液を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。 In ion exchange chromatography, an anion exchanger or a cation exchanger is fixed on the surface of a carrier, and substance separation is performed by changing the concentration or type of counter ion present in the mobile phase. Silica, cellulose, dextran, a copolymer of styrene and divinylbenzene, and the like are often used as the holding carrier, and ion exchange groups such as sulfonic acid groups and quaternary ammonium groups are usually introduced into these carriers. The solute dissociates into cations, anions, and zwitterions according to the hydrogen ion concentration in the mobile phase, and when this solute is passed through the ion exchange column, it competes with the ions in the mobile phase for the reversely charged exchange groups on the surface of the carrier. It binds and distributes between the mobile phase and the support surface at a constant rate. Ion exchange chromatography is performed by utilizing the fact that the speed of movement in the column varies depending on the strength of the bond. This proportion of distribution can be varied in several ways. For example, a method of changing the concentration of competing ionic species in the mobile phase or a method of changing the hydrogen ion concentration of the mobile phase to change the degree of ionization of the ion exchange groups on the surface of the carrier. That is, in ion exchange chromatography, a method of separating by adjusting the ionic strength and hydrogen ion concentration of a mobile phase is generally performed. At that time, since an acid or a buffer solution having a high salt concentration is used as a mobile phase, there is a problem that the activity of a biological component to be separated is impaired.
生化学分野で有用な医薬品、ペプチド、蛋白質、核酸等の分離はイオン交換クロマトグラフィー技術や逆相クロマトグラフィー技術による方法が一般的である。しかしながら、現行の方法では上述のように分離対象の活性を損なうという問題点があり、近年遺伝子工学等の急速な進歩により、生理活性ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどが医薬品を含む様々な分野に広範囲にその利用が期待され、その分離・精製は極めて重要な課題となっている。特に、生理活性物質をその活性を損なうことなく分離・精製する技術の必要性が増大している。また、従来の移動相に用いられている有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤は生理活性物質の活性を損なうと同時に夾雑物となるために、そのシステムの改良が期待されている。従って、このような物質の環境汚染の回避という面からもこれらの物質を用いない分離・精製システムが必要となっている。 Separation of pharmaceuticals, peptides, proteins, nucleic acids and the like useful in the biochemical field is generally performed by ion exchange chromatography techniques or reverse phase chromatography techniques. However, in the current method, there is a problem that the activity of the separation target is impaired as described above, and bioactive peptides, proteins, DNA, etc. are widely used in various fields including pharmaceuticals due to rapid progress in genetic engineering in recent years. Its use is expected and its separation and purification are extremely important issues. In particular, there is an increasing need for a technique for separating and purifying a physiologically active substance without impairing its activity. Further, since organic solvents, acids, alkalis, and surfactants used in conventional mobile phases impair the activity of physiologically active substances and become contaminants, improvement of the system is expected. Therefore, a separation / purification system that does not use these substances is also required from the viewpoint of avoiding environmental pollution of such substances.
このような背景のもと、特開平０５−１３３９４７号公報ではクロマトグラフィー担体として通常使われるシリカゲルやポリマーゲルへポリマーを固定化する検討がなされた。しかしながら、実施例を見る限り、実際にその担体を使ったときの溶質の分離した結果（分離チャート）は示されておらず、この担体を用いてどのような物質を分離できるのか、また具体的な課題についても何ら示されておらず、詳細は不明であった。 Against this background, Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-133947 has studied to immobilize a polymer on silica gel or polymer gel that is usually used as a chromatography carrier. However, as far as the examples are concerned, the result of separation of the solute when actually using the carrier (separation chart) is not shown, and what kind of substance can be separated using this carrier, and more specifically There was no indication of any particular issues, and the details were unknown.
一方、特開平０７−３１８５５１号公報では、シリカゲル表面に温度応答性ポリマーを固定化し、その担体を用いての実際に各種ステロイド類、さらにはリンパ球の分離例が示されている。実際にシリカゲル担体表面に固定化された温度応答性ポリマーの特性で各種ステロイド類、さらにはリンパ球を分離させられていることが明確に示されている。しかしながら、ここで例示されている温度応答性ポリマーの固定化法ではポリマーの嵩高さのため基材表面に０．７ｍｇ／ｍ２程度までしか固定化できず、クロマトグラフィー担体の機能が限られていた。基材表面に対する温度応答性ポリマーの固定化を詳細に設計し、従来技術を改善する革新的な技術が望まれていた。On the other hand, Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-318551 discloses an example of actually separating various steroids and further lymphocytes by immobilizing a temperature-responsive polymer on a silica gel surface and using the carrier. It is clearly shown that various steroids and lymphocytes can be separated due to the characteristics of the temperature-responsive polymer actually immobilized on the silica gel carrier surface. However, the temperature-responsive polymer immobilization method exemplified here can immobilize only up to about 0.7 mg / m 2 on the substrate surface due to the bulk of the polymer, and the function of the chromatography carrier is limited. It was. Innovative techniques that improve the prior art by designing in detail the immobilization of temperature-responsive polymers to the substrate surface have been desired.
そのような中、特願２００５−２９１７１９号公報では、原子移動ラジカル重合法を用いることでシリカゲル表面に温度応答性ポリマーを高密度に固定化され、そして、実際にその担体を用いたときの分離例も例示されている。しかしながら、何れの実施例においても分離ピーク幅は大きく、有用な生理活性物質の分離方法として利用するにはさらなる技術改善が求められていた。本公報にはその理由については全く記載されていないが、これは温度応答性ポリマーを高密度に固定化されているものの、反応溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いているために原子移動ラジカル重合法の反応速度が速すぎ、温度応答性ポリマーが担体表面に十分に均一に固定化されているためと考えられる。 Under such circumstances, in Japanese Patent Application No. 2005-291719, the temperature-responsive polymer is immobilized at a high density on the surface of the silica gel by using the atom transfer radical polymerization method, and the separation when actually using the carrier is performed. Examples are also illustrated. However, in any of the examples, the separation peak width is large, and further technical improvement has been demanded for use as a method for separating a useful physiologically active substance. Although the reason for this is not described at all in this publication, this is because the temperature-responsive polymer is immobilized at a high density, but N, N-dimethylformamide (DMF) is used as a reaction solvent. This is presumably because the reaction rate of the atom transfer radical polymerization method is too fast and the temperature-responsive polymer is sufficiently uniformly immobilized on the support surface.
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３８，５９３７−５９４３（２００５）にはＮ−イソプロピルアクリルアミドの原子移動ラジカル重合を、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）をはじめとして様々な溶媒下で行う技術が記載されており、反応溶媒の違いによる反応速度の比較も記載されている。しかしながら、ここでの技術は溶液中での重合反応に関するものであり、固体のクロマトグラフィー用担体に温度応答性ポリマーを固定化する記載はなく、また、そのことを示唆するような記載もなかった。さらに、温度応答性ポリマーの原料となるモノマーと荷電を呈する官能基を持つモノマーとの共重合における原子移動ラジカル重合反応に用いた記載もなく、また、そのことを示唆するような記載もなかった。 Macromolecules 38, 5937-5943 (2005) describes a technique in which atom transfer radical polymerization of N-isopropylacrylamide is performed in various solvents including isopropyl alcohol (IPA). A comparison is also described. However, this technique relates to a polymerization reaction in a solution, and there is no description of immobilizing a temperature-responsive polymer on a solid chromatographic support, and there is no description that suggests that. . Furthermore, there was no description used for the atom transfer radical polymerization reaction in the copolymerization of the monomer as the raw material of the temperature-responsive polymer and the monomer having a charged functional group, and there was no description suggesting that. .
一方、特願平１０−１４０７２２号公報では、荷電を有する温度応答性ポリマーを固定化した担体を用いたクロマトグラフィーによって分離する技術を提案している。この方法によれば、担体表面に被覆された０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマー鎖が温度変化により収縮、膨潤するが、ポリマー鎖が収縮した際にポリマー鎖内のイオン交換基が隠れ、ポリマー鎖が膨潤した際にポリマー鎖内のイオン交換基が露出することとなり、担体の温度を制御することにより、担体表面の荷電量を制御できるようになる。しかしながら、ここで例示されている荷電を有するポリマーの固定化法ではポリマーの嵩高さのため基材表面に０．７ｍｇ／ｍ２程度までしか固定化できず、クロマトグラフィー担体の機能が限られていた。担体表面に対する荷電を有するポリマーの固定化を詳細に設計し、従来技術を改善する革新的な技術が望まれていた。On the other hand, Japanese Patent Application No. 10-140722 proposes a technique for separation by chromatography using a carrier on which a temperature-responsive polymer having a charge is immobilized. According to this method, the polymer chain whose hydration power changes within the temperature range of 0 to 80 ° C. coated on the surface of the carrier contracts and swells due to the temperature change, but when the polymer chain contracts, When the ion exchange group is hidden and the polymer chain swells, the ion exchange group in the polymer chain is exposed. By controlling the temperature of the carrier, the charge amount on the carrier surface can be controlled. However, the method of immobilizing a charged polymer exemplified here can immobilize only up to about 0.7 mg / m 2 on the substrate surface due to the bulk of the polymer, and the function of the chromatography carrier is limited. It was. There has been a demand for innovative technology that improves the prior art by designing in detail the immobilization of charged polymers on the surface of the carrier.
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は従来技術と全く異なった発想から、生化学分野において有用な生理活性物質を効率良く分離できる、温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法、それより得られるクロマトグラフィー担体及びその利用方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made with the intention of solving the problems of the prior art as described above. That is, the present invention is a method for producing a temperature-responsive chromatography carrier capable of efficiently separating a physiologically active substance useful in the field of biochemistry from an idea completely different from the prior art, a chromatography carrier obtained therefrom, and a method for using the same. The purpose is to provide.
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、担体表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、イソプロピルアルコールを溶媒として、その開始剤から重合触媒下で原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることで、荷電を有するポリマーが担体表面に均一に固定化され、当該担体のタンパク質との有効結合容量が、そのポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり６０００〜８００００μｇ／ｇとなるクロマトグラフィー用担体が得られることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規なクロマトグイラフィーシステムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。 In order to solve the above problems, the present inventors have studied and developed from various angles. As a result, an atom transfer radical polymerization initiator was immobilized on the surface of the carrier, and charged with an isopropyl alcohol as a solvent by an atom transfer radical method under a polymerization catalyst from within the temperature range of 0 to 80 ° C. By carrying out the growth reaction of the polymer with varying hydration power, the charged polymer is uniformly immobilized on the surface of the carrier, and the effective binding capacity of the carrier with the protein is under the condition that the polymer chain swells. It was found that a chromatographic carrier having a molecular weight of 6000 to 80,000 μg / g per carrier weight was obtained. The technology shown in the present invention was completely unpredictable from the prior art, and is expected to develop into a new chromatographic system that was not present in the prior art. The present invention has been completed based on such findings.
すなわち、本発明は、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下、イソプロピルアルコール中で行う原子移動ラジカル法により０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを成長反応させることを特徴とした温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。また、本発明は、荷電を有するポリマーが担体表面に均一に固定化され、当該担体のタンパク質との有効結合容量が、そのポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり６０００〜８００００μｇ／ｇの温度応答性クロマトグラフィー担体を提供する。さらに、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体を用い、アルブミンやグロブリン等の生理活性物質の分離、精製、分取方法を提供する。 That is, the present invention immobilizes an atom transfer radical polymerization initiator on the surface of a substrate, and has a hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C. by an atom transfer radical method performed in the isopropyl alcohol under the catalyst from the initiator. Provided is a method for producing a temperature-responsive chromatographic support characterized in that a polymer having a varying charge is grown and reacted. The present invention also provides that the charged polymer is uniformly immobilized on the surface of the carrier, and the effective binding capacity of the carrier with the protein is 6000 to 80000 μg / g per carrier weight under the condition that the polymer chain swells. A temperature-responsive chromatography carrier is provided. Furthermore, the present invention provides a method for separating, purifying and fractionating physiologically active substances such as albumin and globulin using the temperature-responsive chromatography carrier.
本発明に記載される温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法により、新規な分離システムが提案される。このシステムを利用すれば、アルブミンやグロブリン等の有用な生理活性化合物を分離させられるようになる。 A novel separation system is proposed by the method for producing a temperature-responsive chromatography carrier described in the present invention. If this system is used, useful physiologically active compounds such as albumin and globulin can be separated.
本発明者らは、上記の要望を満足すべく種々検討した結果、担体の表面構造を、例えば温度などの外的条件を変化させることによって、移動相を変化させることなく移動層に溶解、もしくは分散した特定物と担体表面との相互作用を変化させることにより分離・精製、濃縮する技術を開発し、本発明を完成したもので、本発明の目的は、特定の条件下で原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させる温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法、それより得られるクロマトグラフィー担体及びその利用方法を提供するものである。 As a result of various studies to satisfy the above-mentioned demands, the present inventors have dissolved the surface structure of the support in the mobile layer without changing the mobile phase by changing external conditions such as temperature, or The present invention has been completed by developing a technique for separating, purifying, and concentrating by changing the interaction between the dispersed specific substance and the support surface. The purpose of the present invention is to perform the atom transfer radical method under specific conditions. Provides a method for producing a temperature-responsive chromatographic carrier, which causes a growth reaction of a polymer having a charge and a change in hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C., a chromatographic carrier obtained therefrom, and a method for using the same Is.
本発明は、荷電を有し、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーをクロマトグラフィー用担体に固定化する方法である。クロマトグラフィー担体に温度応答性ポリマーを固定化する場合において、その固定化量を制御することは、その担体性能を左右することに繋がるため、極めて重要な技術である。その固定化量が少ないと温度応答性がなくなるほか、標的化合物の保持が充分でなくなり、好ましくない。また、その固定化は均一な分子量のポリマーが、担体表面へ均等に行われていることが望ましい。本発明で使用する担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば粒子状、平板状、管状のものがある。特に本発明の担体をクロマトグラフィー用の担体として用いる場合、担体としてはシリカゲル、ガラスが良い。その際、細孔径は特に制約されるものではないが、５０〜５０００Åが良く、好ましく１００〜１０００Å、さらに好ましくは１２０〜５００Åである。５０Å以下であると分離できる溶質の分子量のかなり低いものだけが対象となり、また５０００Å以上であると担体表面積が少なくなり分離が著しく悪くなる。 The present invention is a method for immobilizing a polymer having electric charge and changing hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C. on a chromatography carrier. In the case of immobilizing a temperature-responsive polymer on a chromatographic carrier, controlling the amount of immobilization is an extremely important technique because it affects the performance of the carrier. If the amount of immobilization is small, the temperature responsiveness is lost and the target compound is not sufficiently retained, which is not preferable. Further, it is desirable that the polymer having a uniform molecular weight is uniformly applied to the support surface. The shape of the carrier used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include particles, flat plates, and tubes. In particular, when the carrier of the present invention is used as a carrier for chromatography, the carrier is preferably silica gel or glass. At that time, the pore diameter is not particularly limited, but is preferably 50 to 5000 mm, preferably 100 to 1000 mm, and more preferably 120 to 500 mm. If the molecular weight is less than 50 kg, only the solute having a considerably low molecular weight is targeted, and if it is more than 5000 mm, the surface area of the carrier is reduced and the separation is extremely deteriorated.
本発明では、上記担体に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する温度応答性ポリマーが固定化される。その固定化方法としては、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒の存在下で原子移動ラジカル法により温度応答性ポリマーを成長反応させる方法が挙げられる。その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、本発明のように基材がシリカやガラスの場合、例えば、１−トリクロロシリル−２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニル）エタン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、（３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル）ジメチルエトキシシランなどがあげられる。本発明では、この開始剤よりポリマー鎖を成長させる。その際の触媒としては特に限定されるものでないが、水和力が変わるポリマーとしてＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体を選んだ場合、ハロゲン化銅（ＣｕＩＸ）としてＣｕＩＣｌ、ＣｕＩＢｒ等があげられる。また、そのハロゲン化銅に対するリガンド錯体も特に限定されるものではないが、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、１，４，８，１１−テトラメチル １，４，８，１１−アザシクロテトラデカン（Ｍｅ４Ｃｙｃｌａｍ）、ビピリジン等があげられる。In the present invention, a temperature-responsive polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C. is immobilized on the carrier. Examples of the immobilization method include a method in which an atom transfer radical polymerization initiator is immobilized on the surface of a substrate, and a temperature-responsive polymer is grown from the initiator by the atom transfer radical method in the presence of a catalyst. The initiator used in that case is not particularly limited, but when the substrate is silica or glass as in the present invention, for example, 1-trichlorosilyl-2- (m, p-chloromethylphenyl) ethane 2- (4-chlorosulfonylphenyl) ethyltrimethoxysilane, (3- (2-bromoisobutyryl) propyl) dimethylethoxysilane, and the like. In the present invention, polymer chains are grown from this initiator. The catalyst at that time is not particularly limited, but when an N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative is selected as a polymer whose hydration power changes, Cu I Cl, Cu I as copper halide (Cu I X). Br and the like. The ligand complex for the copper halide is not particularly limited, but tris (2- (dimethylamino) ethyl) amine (Me 6 TREN), N, N, N ″, N ″ -pentamethyl. Diethylenetriamine (PMDETA), 1,1,4,7,10,10-hexamethyltriethylenetetraamine (HMTETA), 1,4,8,11-
本発明で重合時に使用する溶媒としては、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）が好適である。発明者らは種々の検討を行ったところ、まず、温度応答性ポリマーの原料としてＮ−イソプロピルアクリルアミドを選択し、原子移動ラジカル重合反応を室温で溶液中で行った場合では、反応溶媒としてジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）、水、ＩＰＡのいずれを選択しても同程度に反応速度が大きいことが分かった。しかしながら、本発明のような固体のクロマトグラフィー用担体表面に対しＮ−イソプロピルアクリルアミドを固定化重合しようとする固相反応の場合では、反応溶媒をＩＰＡとすると、他の２者を選んだときに比べ顕著に反応速度が遅くなることを見出した。また、上述のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３８，５９３７−５９４３（２００５）に示されるｔ−ブチルアルコールでは、室温で固化する場合があり、従って反応温度を室温以上にしなければならず、その結果、反応速度が上昇してしまうことが分かり、本発明には不適当であることが分かった。ここでの知見は、従来技術では全く知られていなかったことであり、本発明によれば、担体への固定化重合は、反応溶媒としてＩＰＡを選択するとポリマー鎖の分子量は徐々に増加し、担体表面へのポリマー鎖の固定化量も徐々に増加することとなる。従って、本発明の方法に従えば、担体表面へのポリマー鎖を均一に固定化させることができるようになる。さらに、所定の時間で反応を中止することで、反応を中止した時点の固定化状態を有する担体を再現性良く製造できるようになる。 As the solvent used in the polymerization in the present invention, isopropyl alcohol (IPA) is suitable. The inventors conducted various studies. First, N-isopropylacrylamide was selected as a raw material for the temperature-responsive polymer, and when the atom transfer radical polymerization reaction was performed in a solution at room temperature, dimethylformaldehyde was used as a reaction solvent. It was found that the reaction rate was comparable even when any of (DMF), water, and IPA was selected. However, in the case of a solid-phase reaction in which N-isopropylacrylamide is immobilized on the surface of a solid chromatographic support as in the present invention, assuming that the reaction solvent is IPA, the other two are selected. It was found that the reaction rate was remarkably slower than that. In addition, t-butyl alcohol shown in the above Macromolecules 38, 5937-5943 (2005) may solidify at room temperature, and therefore the reaction temperature must be increased to room temperature or higher, resulting in an increase in the reaction rate. It was found that this was inappropriate for the present invention. The knowledge here is not known at all in the prior art, and according to the present invention, the molecular weight of the polymer chain gradually increases when IPA is selected as the reaction solvent for the immobilization polymerization on the carrier, The amount of polymer chains immobilized on the carrier surface will also gradually increase. Therefore, according to the method of the present invention, the polymer chain can be uniformly immobilized on the surface of the carrier. Furthermore, by stopping the reaction at a predetermined time, a carrier having an immobilized state at the time when the reaction is stopped can be produced with good reproducibility.
本発明は、担体表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、イソプロピルアルコールを溶媒として、その開始剤から重合触媒下で原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させる方法であるが、その他の重合時の開始剤濃度、ハロゲン化銅濃度、リガンド錯体濃度、反応温度、反応時間等は特に限定されるものではなく、目的に応じて変更して良い。さらに反応液の状態は静置させても攪拌しても良いが、担体表面に均一に固定化することを考えると後者の方が好ましい。 The present invention immobilizes an atom transfer radical polymerization initiator on the surface of a carrier, has isopropyl alcohol as a solvent, has an electric charge by the atom transfer radical method from the initiator under a polymerization catalyst, and is within a temperature range of 0 to 80 ° C. It is a method of growing and reacting a polymer whose hydration power changes, but the initiator concentration, copper halide concentration, ligand complex concentration, reaction temperature, reaction time, etc. during other polymerization are not particularly limited, It may be changed according to the purpose. Furthermore, the state of the reaction solution may be allowed to stand or be stirred, but the latter is preferred in view of the uniform fixation on the surface of the carrier.
本発明において、クロマトグラフィー担体に固定化される、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーは、特に限定されないが、該温度内で水和力が変化する温度応答性ポリマーに荷電官能基を導入することで得られる。このような０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。 In the present invention, the polymer having a charge that changes its hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C., which is immobilized on a chromatography carrier, is not particularly limited, but the temperature at which the hydration power changes within the temperature range. It is obtained by introducing a charged functional group into the responsive polymer. Examples of such a polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C. include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers. Examples of the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used. Furthermore, copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used. Moreover, it is also possible to crosslink within a range that does not impair the original properties of the polymer.
この中で、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界温度を有するので、このポリマーで化学修飾した担体表面はこの臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させるため、これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって変得られるようになる。その結果、溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によって制御することができるようになる。下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどの親水性のコモノマーをＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの疎水性のコモノマーとの共重合によって調整することができる。 Among these, since poly (N-isopropylacrylamide) has a lower critical temperature at 32 ° C., the surface of the carrier chemically modified with this polymer greatly changes the hydrophilic / hydrophobic surface properties at this critical temperature. Is used by grafting or coating on the surface of the chromatographic packing material, the retention force on the sample can be changed by temperature. As a result, the retention behavior can be controlled by temperature without changing the composition of the eluate. In order to set the lower critical temperature to 32 ° C. or higher, hydrophilic comonomers such as acrylamide, methacrylic acid, acrylic acid, dimethylacrylamide, and vinylpyrrolidone that are more hydrophilic than isopropylacrylamide are copolymerized with N-isopropylacrylamide. It is possible to make adjustments. Further, when the lower critical temperature is desired to be 32 ° C. or lower, it can be adjusted by copolymerization with a hydrophobic comonomer such as styrene, alkyl methacrylate, alkyl acrylate or the like which is a hydrophobic monomer.
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境として親水性／疎水性に表面物性が変化し、前述のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いはポリマーの被覆によって作製される。 Further, the lower critical temperature of polydiethylacrylamide is about 30 ° C. to 32 ° C., and the surface physical property changes to hydrophilic / hydrophobic with this temperature as a boundary, as in the case of poly (N-isopropylacrylamide) described above. In addition, the holding force for the sample can be adjusted by the temperature. The novel chromatographic support utilized in the present invention is made by chemical modification or polymer coating.
本発明において、担体表面に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等の作業性が悪くなり好ましくない。また、０℃より低いと移動相が凍結する場合があり、やはり好ましくない。 In the present invention, the polymer coated on the surface of the carrier causes hydration and dehydration by changing the temperature. The temperature range is 0 ° C. to 80 ° C., preferably 10 ° C. to 50 ° C., more preferably. 20 to 45 ° C. If the temperature exceeds 80 ° C., the mobile phase is water, which is not preferable because workability such as evaporation is deteriorated. On the other hand, if it is lower than 0 ° C., the mobile phase may freeze, which is not preferable.
また、本発明において、担体表面に被覆されるポリマーは荷電されたものである。その荷電を与える方法は特に限定されないが、通常、担体表面に被覆される温度応答性ポリマー鎖を合成する際、電荷を生じる官能基を持ったイオン性モノマーも含めて共重合する方法があげられる。そのイオン性モノマーとして、例えばアミノ基を有するポリマーの構成単位としてジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノスチレン、アミノアルキルスチレン、アミノアルキル（メタ）アクリルアミド、アルキルオキシアルキルトリメチルアンモニウム塩、（メタ）アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩等が挙げられ、また、カルボキシル基を有するポリマーの構成単位としてアクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸を有するポリマーの構成単位として（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されるものではない。 In the present invention, the polymer coated on the surface of the carrier is charged. The method for imparting the charge is not particularly limited. Usually, when synthesizing the temperature-responsive polymer chain coated on the surface of the carrier, a method of copolymerization including an ionic monomer having a functional group that generates a charge can be given. . Examples of the ionic monomer include dialkylaminoalkyl (meth) acrylamide, dialkylaminoalkyl (meth) acrylate, aminoalkyl (meth) acrylate, aminostyrene, aminoalkylstyrene, aminoalkyl (meth ) Acrylamide, alkyloxyalkyltrimethylammonium salt, (meth) acrylamide alkyltrimethylammonium salt and the like, and as a structural unit of a polymer having a carboxyl group, a structural unit of a polymer having acrylic acid, methacrylic acid, or sulfonic acid ( Examples thereof include, but are not limited to, meth) acrylamide alkyl sulfonic acid.
本発明では、上記ポリマーが高密度かつ均一に固定化されている。その固定化程度は、単位面積あたりの分子鎖数にして、０．０８分子鎖／ｎｍ２以上が良く、好ましくは０．１分子鎖／ｎｍ２以上が良く、さらに好ましくは０．１２分子鎖／ｎｍ２以上が良い。基材表面へのポリマーの固定化程度が０．０８分子鎖／ｎｍ２以下であると、従来法による基材表面へのポリマー固定化と同様に個々のポリマー鎖の特性が発現するだけで本発明の担体として好ましくない。固定化程度を示す数値の算出方法は特に限定されるものではないが、例えば同様な反応条件で基材表面に固定化されていないポリマーを作製し、そのポリマー鎖を分析することで求めた分子量とポリマーが固定化された担体の元素分析などから求めたポリマー固定化量から算出できる。In the present invention, the polymer is fixed with high density and uniformity. The degree of immobilization is preferably 0.08 molecular chain / nm 2 or more, preferably 0.1 molecular chain / nm 2 or more, more preferably 0.12 molecular chain in terms of the number of molecular chains per unit area. / Nm 2 or more is preferable. If the degree of polymer immobilization on the surface of the substrate is 0.08 molecular chain / nm 2 or less, the characteristics of individual polymer chains can be expressed just like the polymer immobilization on the substrate surface by the conventional method. It is not preferred as the carrier of the invention. The calculation method of the numerical value indicating the degree of immobilization is not particularly limited, but for example, a molecular weight obtained by preparing a polymer that is not immobilized on the substrate surface under similar reaction conditions and analyzing the polymer chain And the amount of immobilized polymer obtained from elemental analysis of the carrier on which the polymer is immobilized.
被覆されるポリマーの分子量は０〜８０℃の温度範囲内で水和力の変化が発現するに十分に大きな分子量であれば特に制約されるものではないが、ポリマー分子量は１０００以上が良く、好ましくは２０００以上、さらに好ましくは５０００以上のものが良い。分子量が１０００以下であると、分子量が低すぎるため、水和力の変化を発現できず好ましくない。また、分子量が５０００以上であると、今度はポリマーの分子量が高すぎるため、分子そのものが嵩高くなり温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。 The molecular weight of the polymer to be coated is not particularly limited as long as the molecular weight is sufficiently large to cause a change in hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C., but the polymer molecular weight is preferably 1000 or more, preferably Is 2,000 or more, more preferably 5,000 or more. A molecular weight of 1000 or less is not preferable because the molecular weight is too low and a change in hydration power cannot be expressed. Further, if the molecular weight is 5000 or more, the molecular weight of the polymer is too high, so that the molecule itself becomes bulky and the temperature responsiveness decreases, which is not preferable.
また、本発明で示すところの基材上へのポリマーの固定化量は０．８〜１０．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良く、好ましくは０．９〜８．０ｍｇ／ｍ２の範囲、さらに好ましくは１．０〜６．０ｍｇ／ｍ２の範囲が良い。０．８ｍｇ／ｍ２以下であると温度応答性が認められなくなり、また１０．０ｍｇ／ｍ２より高い値であってもポリマーの嵩高さのため温度応答性が減少してしまうこととなり好ましくない。固定化量の測定は常法に従えば良く、例えば元素分析、ＥＳＣＡを量などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。本発明で固定化されるポリマーの状態は特に限定されるものではなく、直鎖状のものでも良く、架橋状態のものでも良いが、温度に対する応答性を高めること、基材表面に高密度に固定化することを達成するには全社の直鎖状のものが好ましい。Furthermore, immobilization of the polymer onto the substrate at which in this invention may have a range of 0.8~10.0mg / m 2, preferably from 0.9~8.0mg / m 2, further The range of 1.0 to 6.0 mg / m 2 is preferable. If it is 0.8 mg / m 2 or less, the temperature responsiveness is not recognized, and even if the value is higher than 10.0 mg / m 2, the temperature responsiveness decreases due to the bulk of the polymer, which is not preferable. . The measurement of the amount of immobilization may be in accordance with a conventional method, for example, elemental analysis, the amount of ESCA may be mentioned, and any method may be used. The state of the polymer to be immobilized in the present invention is not particularly limited, and may be linear or cross-linked. In order to achieve immobilization, a straight-chain product of the whole company is preferable.
かくして、本発明に示される製造方法に従えば、従来技術では得られなかった高機能な液体クロマトグラフィー用担体を得られるようになる。その機能の一つとして、常法として用いられる前端クロマトグラフィー法による解析において、担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり６０００〜８００００μｇ／ｇのものが得られる。本発明では、ここで得られた担体はすべて液体クロマトグラフィーに利用できるが、担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり特に７０００〜５００００μｇ／ｇのものが良く、さらに好ましくは８０００〜２００００μｇ／ｇのものが良い。有効結合容量が６０００μｇ／ｇ以下であると、生理活性化合物を分析および分取するために必要な担体の量が大量に必要となり本発明の担体としては好ましくない。また、有効結合容量が８００００μｇ／ｇ以上であると担体表面あたりの荷電密度が高くなり、分離される生理活性物質の変性が懸念され、そのための対応策が必要となり必ずしも好適な担体とならない。本発明に示される方法であれば、液体クロマトグラフィー用担体として好適なものを提供できるようになる。 Thus, according to the production method shown in the present invention, it is possible to obtain a high-performance liquid chromatography carrier that could not be obtained by the prior art. As one of its functions, in the analysis by the front end chromatography method used as a conventional method, the effective binding capacity of the protein per unit weight of the carrier is determined based on the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the carrier swells. 6,000 to 80,000 μg / g are obtained per unit. In the present invention, all the carriers obtained here can be used for liquid chromatography. However, the effective binding capacity of the protein per unit weight of the carrier is determined based on the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the carrier swells. In particular, a value of 7000 to 50000 μg / g is preferable, and a value of 8000 to 20000 μg / g is more preferable. When the effective binding capacity is 6000 μg / g or less, a large amount of carrier is required for analyzing and separating the physiologically active compound, which is not preferable as the carrier of the present invention. Further, if the effective binding capacity is 80000 μg / g or more, the charge density per carrier surface becomes high, and there is a concern about the denaturation of the physiologically active substance to be separated, and a countermeasure for that is required, which is not necessarily a suitable carrier. If it is the method shown by this invention, a thing suitable as a support | carrier for liquid chromatography can be provided now.
さらに、本発明によって得られる担体表面は温度応答性ポリマーが固定化されており、外部環境温度を変えることで温度応答性ポリマー鎖が収縮したり、膨潤したりする。その結果、上述の６０００〜８００００μｇ／ｇで示される担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が温度応答性ポリマー鎖の状態により変化する。その際、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たりのタンパク質の有効結合容量が所定量のものを選択すれば、タンパク質との有効結合容量が、温度を変えることで担体重量当たり５００〜８００００μｇ／ｇの範囲で変化するものが得られる。本発明では、ここで得られた担体はすべて液体クロマトグラフィーに利用できるが、担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が収縮した条件のもとで担体重量当たり特に５００〜５０００μｇ／ｇのものが良く、さらに好ましくは１０００〜３０００μｇ／ｇのものが良い。有効結合容量が５０００μｇ／ｇ以上であると、生理活性化合物を分析および分取するための分離が悪くなり本発明の単体としては好ましくない。 Furthermore, the temperature-responsive polymer is immobilized on the surface of the carrier obtained by the present invention, and the temperature-responsive polymer chain contracts or swells by changing the external environment temperature. As a result, the effective binding capacity of the protein per carrier unit weight represented by the above-mentioned 6000-80000 μg / g varies depending on the state of the temperature-responsive polymer chain. At that time, if the effective binding capacity of the protein per weight of the carrier is selected under the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the support swells, the effective binding capacity with the protein changes the temperature. In the range of 500 to 80,000 μg / g per carrier weight. In the present invention, all of the carriers obtained here can be used for liquid chromatography, but the effective binding capacity of the protein per unit weight of the carrier is determined under the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the carrier is contracted. In particular, it is preferably 500 to 5000 μg / g, more preferably 1000 to 3000 μg / g. When the effective binding capacity is 5000 μg / g or more, the separation for analyzing and separating the physiologically active compound is deteriorated, which is not preferable as a simple substance of the present invention.
本発明によって得られた温度応答性クロマトグラフィー担体は、カラムに充填し、通常の液体クロマトグラフィー装置に取り付けて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、分離性能はカラム内に充填された担体の温度に影響される。その際、担体への温度の負荷方法は特に制約されないが、例えば担体を充填したカラムの全部、もしくは一部を所定の温度にしたアルミブロック、水浴、空気層、ジャケットなどに装着すること等が挙げられる。 The temperature-responsive chromatography carrier obtained by the present invention is packed in a column and attached to a normal liquid chromatography apparatus, and used as a liquid chromatography system. At that time, the separation performance is affected by the temperature of the carrier packed in the column. At that time, the method of applying the temperature to the carrier is not particularly limited. For example, it is possible to attach the whole or part of the column packed with the carrier to an aluminum block, water bath, air layer, jacket or the like having a predetermined temperature. Can be mentioned.
その分離方法は特に限定されるものではないが、あらかじめ担体表面の特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行う方法が挙げられる。この場合、温度変化だけで担体表面の特性が大きく変わるので、溶質によってはシグナルの出てくる時間（保持時間）に大きな差が生じることが期待される。本発明の場合、この担体表面の特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。 The separation method is not particularly limited, and there is a method in which the temperature at which the characteristics of the support surface change is confirmed in advance, and the solute is separated while changing the temperature so as to sandwich the temperature. In this case, since the characteristics of the support surface are greatly changed only by the temperature change, it is expected that a large difference occurs in the time (holding time) in which the signal appears depending on the solute. In the case of the present invention, it is the most effective utilization method that the separation is performed so as to sandwich a temperature at which the characteristics of the carrier surface greatly change.
或いは、別の分離方法の一例としては、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に溶質を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させるような、キャッチアンドリリース法に基づいて利用する方法が挙げられる。その際に吸着させる溶質量は担体に吸着しうる量を超えていても良く、超えていなくても良い。いずれにせよ一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させること吸着した溶質を遊離させる利用法である。 Alternatively, as an example of another separation method, the adsorbed solute is released by once adsorbing the solute on the obtained temperature-responsive liquid chromatography carrier and then changing the temperature and changing the characteristics of the surface of the carrier. The method of using based on the catch and release method is mentioned. In this case, the mass to be adsorbed may or may not exceed the amount that can be adsorbed on the carrier. In any case, the adsorption is performed once, and then the temperature is changed to change the characteristics of the surface of the carrier to release the adsorbed solute.
本発明で示されるクロマトグラフィーは移動相として緩衝液を利用すれば良く、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリスバッファ−、塩化アンモニウム緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に制約されるものではない。その無機塩類の濃度は５〜５０ｍＭが良く、好ましくは１０〜４０ｍＭが良く、さらに好ましくは１５〜３５ｍＭが良い。移動相の無機塩類の濃度が５ｍＭより低いと、溶質である生理活性物質の活性を損ねる問題があり、またクラマトグラフィー担体表面のイオン交換基の解離度が高くなり、担体表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で担体表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、無機塩類の濃度が５０ｍＭより高くなるとクラマトグラフィー担体表面のイオン交換基の解離度が低くなり、担体表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。 The chromatography shown in the present invention may use a buffer as a mobile phase and does not require an organic solvent. Here, the buffer solution is an aqueous solution containing inorganic salts, and specifically includes a phosphate buffer solution, a tris buffer, an ammonium chloride buffer solution, etc. It is not restricted. The concentration of the inorganic salt is 5 to 50 mM, preferably 10 to 40 mM, and more preferably 15 to 35 mM. If the concentration of the inorganic salt in the mobile phase is lower than 5 mM, there is a problem of impairing the activity of the physiologically active substance that is a solute, and the degree of dissociation of ion exchange groups on the surface of the chromatographic support becomes high, so It is not preferable because it is adsorbed and it becomes difficult to remove the solute from the surface of the carrier in the subsequent operation. Conversely, when the concentration of the inorganic salt is higher than 50 mM, the degree of dissociation of ion exchange groups on the surface of the chromatographic support is lowered, it becomes difficult to hold the solute on the surface of the support, and it is difficult to finally separate the solute, which is preferable. Absent.
さらに、本発明で用いられる中性の緩衝液とは、ｐＨが６．５〜７．５が良く、好ましくは６．８〜７．２が良く、さらに好ましくは７．０が良い。担体表面に導入されるイオン交換基がカチオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが６．５より低くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、担体表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で担体表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが７．５より高くなるとクラマトグラフィー担体表面のイオン交換基の解離度が低くなり、担体表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。同様に、担体表面に導入されるイオン交換基がアニオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが７．５より高くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、担体表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で担体表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが６．５より低くなるとクラマトグラフィー担体表面のイオン交換基の解離度が低くなり、担体表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。ここでの対象となる物質は、生理活性を有する高分子物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、ペプチド、蛋白質、核酸等が挙げられ、好ましくは分子量３００００以上の生理活性高分子が挙げられる。その中で、特に蛋白質は３次元構造を有した高分子物質であるため本発明の対象物質として好適なものとなる。本発明において、その蛋白質は特に限定されないが、本発明が荷電を有する担体表面を利用した分離方法であるため、酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質が好ましい。ここで示す酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質とはそれぞれ一般的なもので良く、具体的には、酸性蛋白質として、アルブミン、ビメンチン、アンキリン３、アクチン、ミオシン等が挙げられ、塩基性蛋白質として、リゾチーム、ヘモグロビンβ鎖、カタラーゼ、アネキシン、エズリン等が挙げられるが特に限定されるものではない。 Furthermore, the neutral buffer used in the present invention has a pH of 6.5 to 7.5, preferably 6.8 to 7.2, and more preferably 7.0. When the ion exchange group introduced into the support surface is cationic, if the pH of the buffer solution is lower than 6.5, the degree of dissociation of the ion exchange group increases and the solute is strongly adsorbed on the support surface. Then, it is difficult to remove the solute from the surface of the carrier in the subsequent operation, which is not preferable. On the other hand, if the pH is higher than 7.5, the degree of dissociation of ion exchange groups on the surface of the chromatographic support becomes low, making it difficult to maintain the solute on the surface of the support, and it becomes difficult to finally separate the solute, which is not preferable. . Similarly, when the ion exchange group introduced onto the support surface is anionic, the degree of dissociation of the ion exchange group increases when the pH of the buffer is higher than 7.5, and the solute is strongly adsorbed on the support surface. Therefore, it is difficult to remove the solute from the surface of the carrier in the subsequent operation, which is not preferable. On the other hand, if the pH is lower than 6.5, the degree of dissociation of ion exchange groups on the surface of the chromatographic support becomes low, making it difficult to maintain the solute on the surface of the support, and it becomes difficult to finally separate the solute, which is not preferable. . The target substance here is not particularly limited as long as it is a polymer substance having physiological activity, and examples thereof include peptides, proteins, nucleic acids and the like, and preferably a physiologically active polymer having a molecular weight of 30000 or more. Is mentioned. Among them, in particular, a protein is a polymer substance having a three-dimensional structure, and therefore is suitable as a target substance of the present invention. In the present invention, the protein is not particularly limited. However, since the present invention is a separation method using a charged carrier surface, an acidic protein or a basic protein is preferable. The acidic protein or basic protein shown here may be a general one. Specifically, the acidic protein includes albumin, vimentin, ankyrin 3, actin, myosin and the like, and the basic protein includes lysozyme. , Hemoglobin β chain, catalase, annexin, ezrin and the like, but are not particularly limited.
さらに、本発明によれば、ｐＨ６．５以下の上述したリン酸緩衝液を移動相とし、担体として、その表面が負荷電の温度応答性クロマトグラフィー担体を用いた場合、複数の生理活性高分子物質が溶解した水溶液の中からグロブリンを選択的に担体表面のポリマー鎖を収縮させることで保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることでグロブリンを脱着させられることが判明した。その際、負荷電の温度応答性クロマトグラフィー担体は上述した方法で得られるものであれば特に限定されるものではなく、また、分離されるグロブリンも、γ−グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリンの何れでも良く、特に限定されるものではない。本発明によって得られる担体を利用すれば、γ−グロブリンという極めて有用なタンパク質を有機溶媒による変性なく、低損傷の状態で回収できるようになる。 Furthermore, according to the present invention, when the above-described phosphate buffer having a pH of 6.5 or less is used as a mobile phase and a surface is a negatively charged temperature-responsive chromatography carrier, a plurality of physiologically active polymers are used. It has been found that globulins can be desorbed by selectively holding the globulins from the aqueous solution in which the substance is dissolved by contracting the polymer chains on the surface of the carrier and swelling the polymer chains. In this case, the negatively charged temperature-responsive chromatographic carrier is not particularly limited as long as it can be obtained by the above-mentioned method, and the globulin to be separated is also γ-globulin, α-globulin, β-globulin. Any of these may be used and is not particularly limited. If the carrier obtained by the present invention is used, a very useful protein called γ-globulin can be recovered in a low damage state without denaturation with an organic solvent.
以上に示してきた本発明における温度応答性クロマトグラフィー担体を用いれば、医薬品等に利用できる極めて有用な生理活性物質を分離することができる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成でき、分離に有機溶媒を必要としないため分離された生理活性物質も変性なく得られる。 By using the temperature-responsive chromatography carrier in the present invention described above, it is possible to separate a very useful physiologically active substance that can be used for pharmaceuticals and the like. In that case, separation can be achieved only by changing the temperature in the column by a simple operation, and since an organic solvent is not required for separation, the separated physiologically active substance can be obtained without modification.
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but these do not limit the present invention in any way.
温度応答性正荷電担体表面を下記の２段階を経て作製した。
１−ａ）シリカゲルへ開始剤固定化表面を導入するために下記の化合物を使用した。
ｍ，ｐ−クロロメチルトリクロロシラン３．７２ｍｌ（Ｍ．Ｗ．：２８８．１）、トルエン３１８ｍｌに混合させ、水蒸気を含ませたシリカゲル１６．０ｇを分散させた。室温で１８時間反応させた。反応後、ろ過してからトルエン、アセトンで洗浄し、１１０度で乾燥させた。これにより、シリカゲル表面に原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤を導入した。
１−ｂ）温度応答性正荷電固定化表面の形成のために下記の化合物を使用した。
１−ａ）で作製した開始剤固定化シリカゲル１．０ｇ
ＩＰＡＡｍ ３．８９ｇ
ＤＭＡＰＡＡｍ（ジメチルアミノプロピルアクリルアミド） ０．９７１ｇ
ｔＢＡＡｍ（ｔｅｒｔブチルアクリルアミド） ０．５４７ｇ
ＣｕＣｌ ０．８４７ｇ
ＣｕＣｌ２ ０．０１１５ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ（トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン） ２０．２２１ｇ
イソプロパノール ４３ｍｌ
ＩＰＡＡｍ、ＤＭＡＰＡＡｍ、ｔＢＡＡｍを２−プロパノールに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ２／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器中の開始剤導入シリカビーズに反応させ、室温で１６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、アセトン、ＥＤＴＡ溶液でモノマー、ポリマー、銅触媒を洗浄し、５０℃で３時間減圧乾燥をおこなった。得られた担体を、常法の前端クロマトグラフィー法で解析したところ、担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり１５０００μｇ／ｇのものが得られていることが分かった。次に、ポリマー修飾担体をステンレスカラムに充填し、以下の分析を行った。A temperature-responsive positively charged carrier surface was prepared through the following two steps.
1-a) The following compounds were used to introduce an initiator-immobilized surface to silica gel.
m, p-Chloromethyltrichlorosilane 3.72 ml (MW: 288.1) and toluene 318 ml were mixed, and 16.0 g of silica gel containing water vapor was dispersed. The reaction was allowed to proceed for 18 hours at room temperature. After the reaction, it was filtered, washed with toluene and acetone, and dried at 110 degrees. This introduced an atom transfer radical polymerization (ATRP) initiator on the silica gel surface.
1-b) The following compounds were used for the formation of temperature responsive positively charged immobilized surfaces.
Initiator-immobilized silica gel 1.0 g prepared in 1-a)
IPAAm 3.89g
DMAPAAm (dimethylaminopropylacrylamide) 0.971 g
tBAAm (tert-butylacrylamide) 0.547g
CuCl 0.847g
CuCl 2 0.0115 g
Me 6 TREN (Tris (2-dimethylaminoethyl) amine) 20.221 g
43 ml of isopropanol
IPAAm, DMAPAAm, and tBAAm were dissolved in 2-propanol and bubbled with nitrogen for 30 minutes. Thereafter, CuCl, CuCl 2 and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere and stirred for 30 minutes to form a catalyst of CuCl / CuCl 2 / Me 6 TREN. This reaction solution was reacted with initiator-introduced silica beads in a glass container, and ATRP was performed at room temperature for 16 hours. After the reaction, the monomer, polymer and copper catalyst were washed with acetone and EDTA solution, and dried under reduced pressure at 50 ° C. for 3 hours. When the obtained carrier was analyzed by a conventional front end chromatography method, the effective binding capacity of the protein per unit weight of the carrier was 15000 μg per weight of the carrier under the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the carrier swells. / G was found to be obtained. Next, the polymer-modified carrier was packed in a stainless steel column, and the following analysis was performed.
正荷電コポリマー（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＰＡＡｍ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ））ブラシ修飾表面を用いたグロブリン、アルブミンの分離を以下のように行った。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＰＡＡｍ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ）ブラシ修飾シリカビーズを用いて、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝１６．７ｍＭを用いた。
（結果）１０℃ではグロブリン、アルブミンともに吸着せずに溶出してくる。４０℃では、グロブリンが溶出し、コポリマー表面にアルブミンのみが吸着し、溶出しなかった。得られた結果を図１に示す。また、図２に示す通り、得られたクロマトグラムのピークエリアからも、温度を上昇するに従いグロブリンは溶出し続けるが、アルブミンは吸着を起すことが示された。このことから、カラム温度４０℃でグロブリンのみを溶出させ、その後１０℃に温度を下げることにより、アルブミンを溶出させられる。このように温度を変化させてシリカビーズ表面のコポリマーの状態を変化させることでグロブリン、アルブミンの二種類の血中タンパク質の分離することが可能であることが分かる。Separation of globulin and albumin using a positively charged copolymer (poly (IPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm)) brush-modified surface was performed as follows.
(Separation conditions) Poly (IPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm) brush-modified silica beads as a column, Na 2 PO 3 / NaHPO 3 buffer pH = 7.0, ionic strength = 16.7 mM as a mobile phase Was used.
(Result) At 10 ° C., both globulin and albumin are eluted without being adsorbed. At 40 ° C., the globulin was eluted, and only albumin was adsorbed on the copolymer surface and did not elute. The obtained results are shown in FIG. In addition, as shown in FIG. 2, it was shown from the peak area of the obtained chromatogram that although globulin continues to elute as the temperature increases, albumin causes adsorption. From this, albumin can be eluted by eluting only globulin at a column temperature of 40 ° C. and then lowering the temperature to 10 ° C. Thus, it can be seen that two kinds of blood proteins, globulin and albumin, can be separated by changing the temperature and changing the state of the copolymer on the silica bead surface.
正荷電コポリマー（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＰＡＡｍ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ））ブラシ修飾表面を用いたグロブリン、アルブミンの分離を以下のように行った。
（分離条件）カラムとして（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＰＡＡｍ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ））ブラシ修飾シリカビーズを用いて、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝１６．７ｍＭを用いた。
（結果）１０℃ではグロブリン、アルブミンともに吸着せずに溶出してくる。４０℃では、グロブリンが溶出し、コポリマー表面にアルブミンのみが吸着する。この性質を利用して、カラム温度４０℃でグロブリンのみを溶出させ、その後カラム温度を１０℃に温度を下げることにより、アルブミンを溶出させることができた。結果を図３、４に示す。このように温度を変化させてシリカビーズ表面のコポリマーの状態を変化させることでグロブリン、アルブミンの二種類の血中タンパク質の分離が可能であり、血中からのγグロブリンの分離や、製薬中のγグロブリン中に存在する微量なアルブミンの除去が可能であることが分かる。Separation of globulin and albumin using a positively charged copolymer (poly (IPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm)) brush-modified surface was performed as follows.
(Separation conditions) (Poly (IPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm)) brush-modified silica beads as a column, Na 2 PO 3 / NaHPO 3 buffer solution pH = 7.0, ionic strength = 16 as a mobile phase .7 mM was used.
(Result) At 10 ° C., both globulin and albumin are eluted without being adsorbed. At 40 ° C., globulin elutes and only albumin is adsorbed on the copolymer surface. Using this property, albumin could be eluted by eluting only globulin at a column temperature of 40 ° C. and then lowering the column temperature to 10 ° C. The results are shown in FIGS. By changing the state of the copolymer on the silica bead surface by changing the temperature in this way, it is possible to separate two types of blood proteins, globulin and albumin. It can be seen that a small amount of albumin present in γ globulin can be removed.
温度応答性負荷電担体表面を下記の２段階を経て作製した。
４−ａ）シリカゲル表面への開始剤の導入は、１−ａ）と同様の方法で行った。
４−ｂ）温度応答性負荷電コポリマーの高密度グラフト表面の形成のために下記の化合物を使用した。
４−ａ）で作製した開始剤固定化シリカゲル１．０ｇ
ＩＰＡＡｍ ３．８９ｇ
ｔＢＡ（ｔｅｒｔブチルアクリレート） ０．５５１ｇ
ｔＢＡＡｍ（ｔｅｒｔブチルアクリルアミド） ０．５４７ｇ
ＣｕＣｌ ０．８４７ｇ
ＣｕＣｌ２ ０．１１５ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ（トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン） ２０．２２１ｇ
イソプロパノール ４３ｍｌ
ＩＰＡＡｍ、ｔＢＡ、ｔＢＡＡｍを２−プロパノールに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ２／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器中の開始剤導入シリカビーズに反応させ、室温で１６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、アセトン、ＥＤＴＡ溶液でモノマー、遊離ポリマー、銅触媒を洗浄し、５０℃で３時間減圧乾燥をおこなった。回収したポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｔＢＡ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ）ブラシ修飾表面をクロロホルム中に分散させ、メタンスルホン酸で加水分解することでｔＢＡのｔｅｒｔブチル基を加水分解し、ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ（アクリル酸）−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ）とすることで、アニオン性イオン交換基を大量に有する温度応答型負荷電コポリマー高密度グラフトシリカゲルを調製できた。得られた担体を、常法の前端クロマトグラフィー法で解析したところ、担体単位重量あたりのタンパク質の有効結合容量が、担体表面の温度応答性ポリマー鎖が膨潤する条件のもとで担体重量当たり１３０００μｇ／ｇのものが得られていることが分かった。次に、ポリマー修飾担体をステンレスカラムに充填し、以下の分析を行った。The surface of the temperature-responsive negatively charged carrier was produced through the following two steps.
4-a) The initiator was introduced into the silica gel surface in the same manner as in 1-a).
4-b) The following compounds were used for the formation of high density graft surfaces of temperature responsive negatively charged copolymers.
Initiator-immobilized silica gel 1.0 g prepared in 4-a)
IPAAm 3.89g
tBA (tert-butyl acrylate) 0.551 g
tBAAm (tert-butylacrylamide) 0.547g
CuCl 0.847g
CuCl 2 0.115 g
Me 6 TREN (Tris (2-dimethylaminoethyl) amine) 20.221 g
43 ml of isopropanol
IPAAm, tBA, and tBAAm were dissolved in 2-propanol, and nitrogen bubbling was performed for 30 minutes. Thereafter, CuCl, CuCl 2 and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere and stirred for 30 minutes to form a CuCl / CuCl 2 / Me 6 TREN catalyst. This reaction solution was reacted with initiator-introduced silica beads in a glass container, and ATRP was performed at room temperature for 16 hours. After the reaction, the monomer, free polymer, and copper catalyst were washed with acetone and EDTA solution, and dried under reduced pressure at 50 ° C. for 3 hours. The recovered poly (IPAAm-co-tBA-co-tBAAm) brush-modified surface is dispersed in chloroform and hydrolyzed with methanesulfonic acid to hydrolyze the tert-butyl group of tBA. By using (acrylic acid) -co-tBAAm), a temperature-responsive negatively charged copolymer high-density graft silica gel having a large amount of anionic ion-exchange groups could be prepared. The obtained carrier was analyzed by a conventional front end chromatography method. As a result, the effective binding capacity of the protein per unit weight of the carrier was 13000 μg per weight of the carrier under the condition that the temperature-responsive polymer chain on the surface of the carrier swells. / G was found to be obtained. Next, the polymer-modified carrier was packed in a stainless steel column, and the following analysis was performed.
負荷電コポリマー（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ））ブラシ修飾シリカとグロブリン、アルブミンとの相互作用を以下のように測定した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ）ブラシ修飾シリカビーズを用いて、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝５．８、イオン強度＝１６．７ｍＭを用いた。
（結果）温度を１０℃から５０℃に変化させてクロマトグラムを測定したところ、低温ではγグロブリンのピークが小さいが、温度を上昇させるに従い徐々にピークが大きくなり、溶出した。一方、アルブミンは温度変化にかかわらず溶出し続ける挙動が示された。得られた結果を図５に示す。また、図６に示すように、得られたクロマトグラムのピークエリアから、低温ではグロブリンを吸着し、温度を上昇するに従いグロブリンは溶出するという傾向が示された。一方、アルブミンは温度変化をおこしても溶出し続けた。このことから負荷電コポリマー（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ｔＢＡＡｍ））ブラシ修飾表面とのグロブリン、アルブミンとの相互作用には大きな差異があり、温度を変化させてシリカビーズ表面のコポリマーの状態を変化させることでγグロブリンのみを選択的に吸着させることが可能であり、血中からのγグロブリンの選択的な吸着による分離、γグロブリンの濃縮が可能であるであることが分かった。The interaction between negatively charged copolymer (poly (IPAAm-co-AAc-co-tBAAm)) brush-modified silica, globulin and albumin was measured as follows.
(Separation conditions) Poly (IPAAm-co-AAc-co-tBAAm) brush-modified silica beads as a column, Na 2 PO 3 / NaHPO 3 buffer pH = 5.8, ionic strength = 16.7 mM as a mobile phase Was used.
(Results) When the chromatogram was measured by changing the temperature from 10 ° C. to 50 ° C., the peak of γ globulin was small at a low temperature, but the peak gradually increased and eluted as the temperature was increased. On the other hand, albumin showed a behavior of continuing to elute regardless of the temperature change. The obtained results are shown in FIG. Moreover, as shown in FIG. 6, from the peak area of the obtained chromatogram, it was shown that the globulin tends to be adsorbed at a low temperature and eluted as the temperature is increased. On the other hand, albumin continued to elute even when the temperature was changed. Therefore, negatively charged copolymer (poly (IPAAm-co-AAc-co-tBAAm)) has a large difference in interaction with globulin and albumin on the brush-modified surface. It was found that by changing the state, only γ globulin can be selectively adsorbed, and separation by selective adsorption of γ globulin from blood and concentration of γ globulin are possible.
イソプロパノール中での温度応答性ポリマーの重合速度を以下のように測定した。
ＩＰＡＡｍ ３ｇ
ＣｕＣｌ ０．０１３ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ ０．０３１ｇ
イソプロパノール ３．８３ｍｌ
ＩＰＡＡｍをイソプロパノールに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器に入れ開始剤であるｐ−クロロ−キシレンを０．０１７６ｍｌ添加し、室温で０．５〜６時間のＡＴＲＰを行った。反応後、溶液を透析して、モノマー、銅触媒を除去したものを凍結乾燥してポリマーを得た。得られたＰＩＰＡＡｍ分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した。The polymerization rate of the temperature-responsive polymer in isopropanol was measured as follows.
IPAAm 3g
CuCl 0.013g
Me 6 TREN 0.031g
3.83 ml of isopropanol
IPAAm was dissolved in isopropanol and nitrogen bubbled for 30 minutes. Thereafter, CuCl and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere, and stirred for 30 minutes to form a CuCl / Me 6 TREN catalyst. This reaction solution was put in a glass container, 0.0176 ml of p-chloro-xylene as an initiator was added, and ATRP was performed at room temperature for 0.5 to 6 hours. After the reaction, the solution was dialyzed, and the polymer and the copper catalyst removed were lyophilized to obtain a polymer. The obtained PIPAAm molecular weight was measured by gel permeation chromatography.
ＤＭＦ中での温度応答性ポリマーの重合速度を以下のように測定した。
ＩＰＡＡｍ ３ｇ
ＣｕＣｌ ０．０１３ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ ０．０３１ｇ
ＤＭＦ ３．８３ｍｌ
ＩＰＡＡｍをＤＭＦに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器に入れ開始剤であるｐ−クロロ−キシレンを０．０１７６ｍｌ添加し、室温で０．５〜６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、溶液を透析して、モノマー、銅触媒を除去したものを凍結乾燥してポリマーを得た。得られたＰＩＰＡＡｍ分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した。The polymerization rate of the temperature-responsive polymer in DMF was measured as follows.
IPAAm 3g
CuCl 0.013g
Me 6 TREN 0.031g
DMF 3.83ml
IPAAm was dissolved in DMF and bubbled with nitrogen for 30 minutes. Thereafter, CuCl and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere, and stirred for 30 minutes to form a CuCl / Me 6 TREN catalyst. This reaction solution was put into a glass container, 0.0176 ml of p-chloro-xylene as an initiator was added, and ATRP was performed at room temperature for 0.5 to 6 hours. After the reaction, the solution was dialyzed, and the polymer and the copper catalyst removed were lyophilized to obtain a polymer. The obtained PIPAAm molecular weight was measured by gel permeation chromatography.
比較例１、比較例２で得られた結果を図７に示す。その結果、イソプロパノール（実施例６）とＤＭＦ（比較例１）は同程度の重合速度になった。これにより、溶液中でＰＩＰＡＡｍをＡＴＲＰにより調製する場合は、両者の間で差が無いことが分かった。 The results obtained in Comparative Example 1 and Comparative Example 2 are shown in FIG. As a result, polymerization rates of isopropanol (Example 6) and DMF (Comparative Example 1) were comparable. Thereby, when PIPAAm was prepared by ATRP in a solution, it turned out that there is no difference between both.
温度応答性ポリマー固定表面をイソプロパノール中で作製した。
１−ａ）で作製した開始剤固定化シリカゲル１．０ｇ
ＩＰＡＡｍ ４．８６ｇ
ＣｕＣｌ ０．８４７ｇ
ＣｕＣｌ２ ０．０１１５ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ ２０．２２１ｇ
イソプロパノール ４３ｍｌ
ＩＰＡＡｍをイソプロパノールに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ２／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器中の開始剤導入シリカビーズに反応させ、室温で０．５〜１５時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、アセトン、ＥＤＴＡ溶液でモノマー、遊離ポリマー、銅触媒を洗浄し、５０℃で３時間減圧乾燥をおこなった。ポリマーグラフト量はＣＨＮ元素分析により算出した。A temperature responsive polymer immobilization surface was made in isopropanol.
Initiator-immobilized silica gel 1.0 g prepared in 1-a)
IPAAm 4.86g
CuCl 0.847g
CuCl 2 0.0115 g
Me 6 TREN 20.221g
43 ml of isopropanol
IPAAm was dissolved in isopropanol and nitrogen bubbled for 30 minutes. Thereafter, CuCl, CuCl 2 and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere and stirred for 30 minutes to form a CuCl / CuCl 2 / Me 6 TREN catalyst. This reaction solution was reacted with the initiator-introduced silica beads in a glass container, and ATRP was performed at room temperature for 0.5 to 15 hours. After the reaction, the monomer, free polymer, and copper catalyst were washed with acetone and EDTA solution, and dried under reduced pressure at 50 ° C. for 3 hours. The amount of polymer graft was calculated by CHN elemental analysis.
温度応答性ポリマー固定表面をＤＭＦ中で作製した。
１−ａ）で作製した開始剤固定化シリカゲル１．０ｇ
ＩＰＡＡｍ ４．８６ｇ
ＣｕＣｌ ０．８４７ｇ
ＣｕＣｌ２ ０．０１１５ｇ
Ｍｅ６ＴＲＥＮ ２０．２２１ｇ
ＤＭＦ ４３ｍｌ
ＩＰＡＡｍをＤＭＦに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、Ｍｅ６ＴＲＥＮを加えて、３０分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ２／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液をガラス容器中の開始剤導入シリカビーズに反応させ、室温で０．５〜１５時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、アセトン、ＥＤＴＡ溶液でモノマー、遊離ポリマー、銅触媒を洗浄し、５０℃で３時間減圧乾燥をおこなった。ポリマーグラフト量はＣＨＮ元素分析により算出した。A temperature responsive polymer immobilization surface was made in DMF.
Initiator-immobilized silica gel 1.0 g prepared in 1-a)
IPAAm 4.86g
CuCl 0.847g
CuCl 2 0.0115 g
Me 6 TREN 20.221g
43 ml of DMF
IPAAm was dissolved in DMF and bubbled with nitrogen for 30 minutes. Thereafter, CuCl, CuCl 2 and Me 6 TREN were added to the solution under a nitrogen atmosphere and stirred for 30 minutes to form a catalyst of CuCl / CuCl 2 / Me 6 TREN. This reaction solution was reacted with the initiator-introduced silica beads in a glass container, and ATRP was performed at room temperature for 0.5 to 15 hours. After the reaction, the monomer, free polymer and copper catalyst were washed with acetone and EDTA solution, and dried under reduced pressure at 50 ° C. for 3 hours. The amount of polymer graft was calculated by CHN elemental analysis.
実施例６、比較例３で得られた結果を図８に示す。その結果、固定化されたＰＩＰＡＡｍの量から重合速度を推算すると、ＤＭＦ（比較例３）よりもイソプロパノール（実施例６）を用いた方が、顕著に重合速度が遅いことが分かる。これによりＡＴＲＰでＰＩＰＡＡｍを担体に固定化する際には、反応溶媒にイソプロパノールを用いる方が、担体表面へのＰＩＰＡＡｍ固定化状態の制御が可能であり、反応時間によりＰＩＰＡＡｍグラフト量を調節することが可能であることが分かった。 The results obtained in Example 6 and Comparative Example 3 are shown in FIG. As a result, when the polymerization rate was estimated from the amount of immobilized PIPAAm, it was found that the polymerization rate was significantly slower when isopropanol (Example 6) was used than with DMF (Comparative Example 3). As a result, when PIPAAm is immobilized on the support by ATRP, it is possible to control the PIPAAm immobilization state on the support surface by using isopropanol as the reaction solvent, and the amount of PIPAAm grafting can be adjusted by the reaction time. I found it possible.
本発明によれば、担体表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーが高密度に固定化された温度応答性クロマトグラフィー担体が得られる。この担体を利用すると温度変化に対する担体表面への生理活性物質の相互作用が著しく変化する。この分離対象としては、例えばタンパク質やペプチド等の分離、精製、分別への利用が強く期待される。したがって、本発明は医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。 According to the present invention, there can be obtained a temperature-responsive chromatographic support in which a polymer having a charge whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C. is immobilized on the support surface at a high density. When this carrier is used, the interaction of the physiologically active substance on the surface of the carrier with respect to temperature changes is remarkably changed. As this separation object, for example, the use for separation, purification, and separation of proteins and peptides is strongly expected. Therefore, the present invention is extremely useful in the fields of medicine and biology.
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