JP2009082026A - Method for producing d-amino acid by d-aminoacylase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a D-amino acid using D-aminoacylase.
Ｄ−アミノ酸は、医農薬中間体として注目されており、Ｄ−アミノ酸の製造法、生理活性、代謝作用等について様々な研究がなされている。 D-amino acids are attracting attention as intermediates for medicines and agrochemicals, and various studies have been conducted on production methods, physiological activities, metabolic effects, and the like of D-amino acids.
Ｄ−アミノ酸は、通常、Ｄ，Ｌ−アミノ酸を物理化学法、化学法、酵素法等により光学分割されて製造されている。これらの中でもＤ−アミノ酸を安価で安全に製造する方法としては、酵素法、特にＤ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を選択的に加水分解する方法（非特許文献１及び非特許文献２）が有効である。この方法では、安価で入手容易なＬ−アミノ酸を出発物質として無水酢酸でＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を合成し、Ｄ−アミノアシラーゼによる酵素分割によりＤ−アミノ酸を製造する。 D-amino acids are usually produced by optically resolving D, L-amino acids by physicochemical methods, chemical methods, enzymatic methods and the like. Among these, as a method for producing D-amino acids inexpensively and safely, enzymatic methods, in particular, N-acetyl-D-amino acids are selectively hydrolyzed from N-acetyl-D, L-amino acids using D-aminoacylase. Decomposition methods (Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2) are effective. In this method, an N-acetyl-D, L-amino acid is synthesized with acetic anhydride using an inexpensive and readily available L-amino acid as a starting material, and a D-amino acid is produced by enzymatic cleavage with D-aminoacylase.
しかしながら、Ｄ−アミノアシラーゼは、アミノ酸の種類により活性が大きく異なり、またその活性は、基質濃度や酵素濃度に大きく依存する。また、Ｄ−アミノアシラーゼは、温和な条件下での使用が必須であり、至適温度及び至適ｐＨでの使用が要求されている。 However, the activity of D-aminoacylase varies greatly depending on the type of amino acid, and the activity greatly depends on the substrate concentration and enzyme concentration. In addition, D-aminoacylase must be used under mild conditions, and is required to be used at an optimum temperature and an optimum pH.
そのため、Ｄ−アミノアシラーゼを存在させる反応系内のｐＨを至適ｐＨに保持するため、反応系内に緩衝剤を存在させることが通常行われている。このような緩衝剤としては、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、リン酸塩等が繁用されている。しかしながら、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はリン酸塩を緩衝剤として用いる場合、反応を完結させるためにＤ−アミノアシラーゼを多量に使用する必要がある。 Therefore, in order to maintain the pH in the reaction system in which D-aminoacylase is present at an optimum pH, it is usually performed to have a buffer in the reaction system. As such a buffer, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol hydrochloride (Tris-HCl), phosphate, and the like are frequently used. However, when using Tris-HCl or phosphate as a buffer, it is necessary to use a large amount of D-aminoacylase in order to complete the reaction.
Ｄ−アミノアシラーゼは高価であるため、Ｄ−アミノアシラーゼの少量使用でＤ−アミノ酸を効率良く製造できることが工業的見地から重要であり、Ｄ−アミノアシラーゼの反応性を高めるため、上記緩衝剤と共に、各種金属、キレート材、ＳＨ試薬等の各種添加剤を併用されている。しかしながら、これら添加剤の配合量によっては、逆にＤ−アミノアシラーゼの活性度が低下する場合がある（特許文献１、特許文献２等）。このため、使用する添加剤の種類に応じて、添加剤の配合量の最適化を図る必要があり、工業的見地から問題がある。
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for industrially advantageously producing a D-amino acid from N-acetyl-D, L-amino acid using D-aminoacylase.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねて来た。その結果、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンを存在させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかも、他の添加剤を使用することなく第３級アミンだけでＤ−アミノアシラーゼの活性を向上できることを見い出した。このような知見に基づき、本発明は完成されたものである。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, when producing D-amino acid from N-acetyl-D, L-amino acid using D-aminoacylase, it is easy to maintain the optimum pH by allowing a tertiary amine to be present in the reaction system. In addition, it has been found that the activity of D-aminoacylase can be improved with only a tertiary amine without using other additives. Based on such knowledge, the present invention has been completed.
本発明は、下記項１〜４に係るＤ−アミノ酸の製造方法及びＤ−アミノアシラーゼの酵素活性向上方法を提供する。
項１．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンを存在させる、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
項２．第３級アミンが、一般式（１）
The present invention provides a method for producing a D-amino acid and a method for improving the enzyme activity of D-aminoacylase according to items 1 to 4 below.
Item 1. A method for producing a D-amino acid, wherein a tertiary amine is present in a reaction system in producing a D-amino acid by allowing a D-aminoacylase to act on an N-acetyl-D, L-amino acid.
Item 2. Tertiary amine is represented by the general formula (1)
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基を有することのあるＣ1-6アルキル基を示す。
Ｒ3は、水酸基を有することのあるＣ1-6アルキル基、基
[Wherein, R 1 and R 2 are the same or different and each represents a C 1-6 alkyl group which may have a hydroxyl group.
R 3 is a C 1-6 alkyl group which may have a hydroxyl group, a group
又は基 Or group
を示す。
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、酸素原子もしくは窒素原子を介し又は介することなく互いに結合して５〜６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して５〜６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、項１に記載の製造方法。
項３．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン又はＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリンである、項１又は２に記載の製造方法。
項４．Ｄ−アミノアシラーゼに第３級アミンを接触させてＤ−アミノアシラーゼの酵素活性を向上させる方法。
Indicates.
Here, R 4 represents a C 1-6 alkyl group, and n and m each represents an integer of 1 to 6. R 1 and R 2 are the same as above.
Alternatively, R 1 and R 3 may be bonded to each other through or without an oxygen atom or a nitrogen atom to form a 5- to 6-membered saturated ring. When R 1 and R 3 are bonded to each other via a nitrogen atom to form a 5- to 6-membered saturated ring, a C 1-6 alkyl group is substituted on the nitrogen atom. ]
Item 2. The production method according to Item 1, which is a tertiary amine represented by the formula:
Item 3. N-acetyl-D, L-amino acid is N-acetyl-D, L-phenylalanine, N-acetyl-D, L-tryptophan, N-acetyl-D, L-valine, N-acetyl-D, L- Item 3. The production method according to Item 1 or 2, which is leucine, N-acetyl-D, L-methionine, N-acetyl-D, L-tyrosine or N-acetyl-D, L-serine.
Item 4. A method of improving the enzyme activity of D-aminoacylase by bringing a tertiary amine into contact with D-aminoacylase.
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法においては、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンを存在させる。 In the method for producing D-amino acid of the present invention, a tertiary amine is present in the reaction system when D-aminoacylase is allowed to act on N-acetyl-D, L-amino acid to produce D-amino acid.
本発明で製造原料として用いられるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸は、公知であり、市販品又は公知の方法で製造されたものを広く使用することができる。公知の方法で製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ法（実験化学講座．，１６，１７６）、Ｂｕｃｈｅｒｅｒ−Ｂｕｒｇｓ法（実験化学講座．，１６，１７８〜１７９）等の一般的なアミノ酸の合成法に従って合成されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸を無水酢酸中又はアルカリ性、酸性ないし中性の水溶液中で１５０〜２５０℃に加熱し、ラセミ化することにより製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸等を挙げることができる。 The N-acetyl-D, L-amino acids used as production raw materials in the present invention are known, and commercially available products or those produced by known methods can be widely used. Examples of the N-acetyl-D, L-amino acid produced by a known method include the Strecker method (experimental chemistry course, 16, 176) and the Bucherer-Burgs method (experimental chemistry course, 16, 178-179). N-acetyl-D, L-amino acid, L-amino acid synthesized according to a general method for synthesizing amino acids, etc. is heated to 150-250 ° C. in acetic anhydride or in an alkaline, acidic to neutral aqueous solution, N-acetyl-D, L-amino acid and the like produced by the conversion.
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリン等が挙げられる。 Examples of N-acetyl-D, L-amino acid include N-acetyl-D, L-phenylalanine, N-acetyl-D, L-tryptophan, N-acetyl-D, L-valine, and N-acetyl-D. , L-leucine, N-acetyl-D, L-methionine, N-acetyl-D, L-tyrosine, N-acetyl-D, L-serine and the like.
本発明の方法では、先ず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に加えて、溶解し、必要に応じて酸又はアルカリを加えて、溶液のｐＨを７〜９に調整する（Ａ工程）。無機アルカリ水溶液におけるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の濃度は、通常１〜５０重量％程度、好ましくは５〜２０重量％程度である。 In the method of the present invention, first, N-acetyl-D, L-amino acid and tertiary amine are added to an inorganic alkaline aqueous solution and dissolved, and an acid or alkali is added as necessary to adjust the pH of the solution to 7 to 7. To 9 (step A). The concentration of N-acetyl-D, L-amino acid in the inorganic alkaline aqueous solution is usually about 1 to 50% by weight, preferably about 5 to 20% by weight.
本発明で使用される第３級アミンとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、一般式（１） As the tertiary amine used in the present invention, known ones can be widely used, for example, the general formula (1)
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記に同じ。］
で表される第３級アミンを挙げることができる。
[Wherein, R 1 , R 2 and R 3 are the same as above. ]
The tertiary amine represented by these can be mentioned.
本明細書において、Ｃ1-6アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基等を挙げることができる。 In this specification, examples of the C 1-6 alkyl group include a methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n- Examples thereof include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as a pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and 3-methylpentyl group.
水酸基を有することのあるＣ1-6アルキル基としては、前記Ｃ1-6アルキル基に加えて、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−メチル−３−ヒドロキシプロピル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基等の水酸基を１〜３個有することのある炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基を挙げることができる。 The C 1-6 alkyl group that may have a hydroxyl group includes, in addition to the C 1-6 alkyl group, a hydroxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, a 1-hydroxyethyl group, a 3-hydroxypropyl group, 2- Hydroxypropyl group, 2,3-dihydroxypropyl group, 4-hydroxybutyl group, 3,4-dihydroxybutyl group, 1,1-dimethyl-2-hydroxyethyl group, 5-hydroxypentyl group, 6-hydroxyhexyl group, Listed are straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms which may have 1 to 3 hydroxyl groups such as 2-methyl-3-hydroxypropyl group and 2,3,4-trihydroxybutyl group. Can do.
酸素原子もしくは窒素原子を介し又は介することなく互いに結合して形成される５〜６員の飽和環としては、例えば、ピロリジン環、モルホリン環、ピペリジン環、ピペラジン環等が挙げられる。 Examples of the 5- to 6-membered saturated ring formed by bonding to each other with or without an oxygen atom or nitrogen atom include a pyrrolidine ring, a morpholine ring, a piperidine ring, and a piperazine ring.
一般式（１）で表される第３級アミンの具体例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリｎ−プロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリｉｓｏ−プロピルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、トリｎ−ペンチルアミン、トリｎ−ヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルブタンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジプロピレントリアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−ｎ−ブチルジエタノールアミン、Ｎ−ｔ−ブチルジエタノールアミン、Ｎ−イソブチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、１−メチルピロリジン、１−エチルピロリジン、１−ブチルピロリジン、１−メチル−２−ピロリジンメタノール、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、１−メチルピペリジン、１−エチルピペリジン、１，４−ジメチルピペリジン、１，３−ジメチルピペリジン、１，２−ジメチルピペリジン、１−ピペリジンエタノール、１−メチル−２−ピペリジンメタノール、１−メチル−３−ピペリジンメタノール、１−メチル−４ピペリジンメタノール、１−メチル−２−ピペリジノール、１−メチル−３−ピペリジノール、１−メチル−４−ピペリジノール、１，４−ジメチルピペラジン、１，４−ジエチルピペラジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．０］オクタン等が包含される。 Specific examples of the tertiary amine represented by the general formula (1) include, for example, trimethylamine, triethylamine, tri-n-propylamine, N, N-diisopropylethylamine, triiso-propylamine, tributylamine, N, N- Dimethylbutylamine, tri-n-pentylamine, tri-n-hexylamine, N, N-dimethylcyclohexylamine, N, N, N ′, N′-tetramethyldiaminomethane, N, N, N ′, N′-tetramethyl Ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetramethylpropanediamine, N, N, N ′, N′-tetraethylethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetraethylpropanediamine, N, N, N ′ , N′-tetramethylbutanediamine, N, N, N ′, N′-tetramethylhexanediamine, N, , N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetriamine, N, N, N ′, N ′, N ″ -pentamethyldipropylenetriamine, N, N-dimethylethanolamine, N, N-diethylethanol Amine, N, N-di-n-butylethanolamine, N-methyldiethanolamine, N-ethyldiethanolamine, Nn-butyldiethanolamine, Nt-butyldiethanolamine, N-isobutyldiethanolamine, triethanolamine, triisopropanolamine 1-methylpyrrolidine, 1-ethylpyrrolidine, 1-butylpyrrolidine, 1-methyl-2-pyrrolidinemethanol, N-methylmorpholine, N-ethylmorpholine, 1-methylpiperidine, 1-ethylpiperidine, 1,4-dimethyl Piperidine, 1 3-dimethylpiperidine, 1,2-dimethylpiperidine, 1-piperidineethanol, 1-methyl-2-piperidinemethanol, 1-methyl-3-piperidinemethanol, 1-methyl-4piperidinemethanol, 1-methyl-2-piperidinol 1-methyl-3-piperidinol, 1-methyl-4-piperidinol, 1,4-dimethylpiperazine, 1,4-diethylpiperazine, 1,4-diazabicyclo [2.2.0] octane, and the like.
第３級アミンは、無機アルカリ水溶液中に、通常１〜１００ｍＭ程度、好ましくは５〜５０ｍＭ程度になるように配合される。 The tertiary amine is usually blended in the inorganic alkaline aqueous solution so as to be about 1 to 100 mM, preferably about 5 to 50 mM.
無機アルカリとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等の水酸化アルカリ、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム等の炭酸塩、アンモニア水等が挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上混合して使用される。 As the inorganic alkali, known ones can be widely used. For example, lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, calcium hydroxide and other alkali hydroxides, lithium carbonate, sodium carbonate, Examples thereof include potassium carbonate, magnesium carbonate, barium carbonate, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, carbonates such as ammonium hydrogen carbonate, aqueous ammonia, and the like. These are used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
無機アルカリの使用量は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が溶解する最低必要量でよく、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に対し、通常０．１〜２当量程度、好ましくは０．５〜１当量程度である。 The amount of inorganic alkali used may be the minimum necessary amount for dissolving N-acetyl-D, L-amino acid, and is usually about 0.1 to 2 equivalents, preferably about 0.1 equivalent to N-acetyl-D, L-amino acid. About 5 to 1 equivalent.
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に溶解するに当たっては、室温付近で行うことができるが、溶解速度を上げるために５０℃付近まで加温するのが望ましい。 The N-acetyl-D, L-amino acid and the tertiary amine can be dissolved in the aqueous inorganic alkali solution at around room temperature, but it is desirable to heat up to around 50 ° C. in order to increase the dissolution rate.
ｐＨ調整する際に用いられる酸としては、公知の無機酸及び有機酸を広く使用することができる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、硼酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、トルエンスルホン酸等が挙げられる。アルカリとしては、上述した無機アルカリをいずれも使用できる。 As the acid used for adjusting the pH, known inorganic acids and organic acids can be widely used. Examples of the inorganic acid include hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid and the like. Examples of the organic acid include acetic acid, propionic acid, oxalic acid, citric acid, Examples include methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, propanesulfonic acid, toluenesulfonic acid and the like. As the alkali, any of the inorganic alkalis described above can be used.
本発明において、第３級アミンは、緩衝剤として作用するので、一度上記ｐＨ値への調整を行うだけで、そのｐＨ値を容易に維持することができる。 In the present invention, the tertiary amine acts as a buffer, so that the pH value can be easily maintained only by adjusting the pH value once.
本発明では、次にＡ工程で得られる溶液にＤ−アミノアシラーゼを加え、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する（Ｂ工程）。この工程では、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸はＬ−アミノ酸に加水分解されない。 In the present invention, D-aminoacylase is then added to the solution obtained in step A to hydrolyze N-acetyl-D-amino acid to D-amino acid (step B). In this step, N-acetyl-L-amino acid is not hydrolyzed to L-amino acid.
第３級アミンは、Ｄ−アミノアシラーゼに接触すると、Ｄ−アミノアシラーゼを活性化させることができる。それ故、本発明の方法では、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を軽減することができる。 A tertiary amine can activate D-aminoacylase when contacted with D-aminoacylase. Therefore, in the method of the present invention, the amount of D-aminoacylase used can be reduced.
Ｄ−アミノアシラーゼの使用量は、通常１０〜１０００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１０〜３００Ｕ／ｍｌ程度である。 The usage-amount of D-aminoacylase is about 10-1000 U / ml normally, Preferably it is about 10-300 U / ml.
Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する際の温度は、２５〜５０℃程度が適当であり、上記加水分解は一般に１〜３日程度で終了する。この加水分解は、撹拌下で行ってもよいし、無撹拌下で行ってもよい。 The temperature at which N-acetyl-D-amino acid is hydrolyzed to D-amino acid is suitably about 25 to 50 ° C., and the hydrolysis is generally completed in about 1 to 3 days. This hydrolysis may be carried out with stirring or without stirring.
上記加水分解反応終了後、目的とするＤ−アミノ酸は、通常行われている単離及び精製手段により、反応混合物から単離され、精製される。 After completion of the hydrolysis reaction, the target D-amino acid is isolated from the reaction mixture and purified by a usual isolation and purification means.
目的とするＤ−アミノ酸を単離した後の反応混合物には、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸の他、少量のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸が含まれている。この単離後の反応混合物に、後記実施例１２に示すように、Ｌ−アミノ酸を加え、公知の方法によりＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を製造し、更に本発明の方法を適用することにより、再び目的とするＤ−アミノ酸を製造することができる。 The reaction mixture after isolating the target D-amino acid contains a small amount of N-acetyl-D-amino acid and D-amino acid in addition to N-acetyl-L-amino acid. To this reaction mixture after isolation, as shown in Example 12 below, L-amino acid is added to produce N-acetyl-D, L-amino acid by a known method, and the method of the present invention is further applied. Thus, the target D-amino acid can be produced again.
本発明によれば、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造し得る。 According to the present invention, D-amino acid can be industrially advantageously produced from N-acetyl-D, L-amino acid using D-aminoacylase.
Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンを存在させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかもＤ−アミノアシラーゼの活性を向上できる。Ｄ−アミノアシラーゼの活性を向上できることに伴い、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を削減できる。 When producing D-amino acid from N-acetyl-D, L-amino acid using D-aminoacylase, the presence of a tertiary amine in the reaction system makes it easy to maintain the optimum pH. The activity of D-aminoacylase can be improved. Along with the improved activity of D-aminoacylase, the amount of D-aminoacylase used can be reduced.
また、第３級アミンの使用量の多少に拘わらず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を効率的に製造できる。 In addition, D-amino acids can be efficiently produced from N-acetyl-D, L-amino acids regardless of the amount of tertiary amine used.
そのため、本発明の方法を採用すれば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を経由してＤ−アミノ酸を簡易に且つ安価に高収率で製造することができる。 Therefore, if the method of this invention is employ | adopted, D-amino acid can be easily and cheaply manufactured in high yield via N-acetyl-D, L-amino acid.
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。 The present invention will be further clarified by the following examples.
なお、各実施例における反応液の評価は、下記に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し、反応率及び純度を測定した。
カラム：住化分析センター製のＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００、φ４．６×１５０ｍｍ、カラム充填剤の粒子径：５μｍ
溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液：イソプロパノール＝８５：１５
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出器：２５４ｎｍ
Ｄ−フェニルアラニンの製造例
実施例１
１０ｇ（４８．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを１０６ｇ（４８ｍｍｏｌ）の５．６％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに０．１４９ｇ（１ｍｍｏｌ）のトリエタノールアミンを加え（トリエタノールアミンの添加量：１０ｍＭ）、少量の酸を加えてｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを４０００Ｕ加えて、酵素濃度を４０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９３％進行しているのを確認した。
In addition, the reaction liquid in each Example evaluated the reaction rate and purity using the high performance liquid chromatography (HPLC) shown below.
Column: SUMICHIRAL OA-5000 manufactured by Sumika Chemical Analysis Center, φ4.6 × 150 mm, particle diameter of column filler: 5 μm
Eluent: 2 mM copper sulfate aqueous solution: isopropanol = 85: 15
Column temperature: 40 ° C
UV detector: 254 nm
Production Example of D-Phenylalanine Example 1
10 g (48.3 mmol) of N-acetyl-D, L-phenylalanine was dissolved in 106 g (48 mmol) of a 5.6% aqueous sodium hydroxide solution. To this, 0.149 g (1 mmol) of triethanolamine was added (addition amount of triethanolamine: 10 mM), and a small amount of acid was added to adjust pH = 8. To this, 4000 U of D-aminoacylase was added to make the enzyme concentration 40 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 93%.
実施例２
Ｄ−アミノアシラーゼを３０００Ｕ加えて、酵素濃度を３０Ｕ／ｍｌとする以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９１％進行しているのを確認した。
Example 2
The hydrolysis reaction was performed in the same manner as in Example 1 except that 3000 U of D-aminoacylase was added to adjust the enzyme concentration to 30 U / ml. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 91%.
実施例３
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを溶解した実施例１と同じ水酸化ナトリウム水溶液に、０．７４５ｇ（５ｍｍｏｌ）のトリエタノールアミンを加え（トリエタノールアミンの添加量：５０ｍＭ）、少量の酸を加えてｐＨ＝９に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを３０００Ｕ加えて、酵素濃度を３０Ｕ／ｍｌとし、５０℃で１日撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９３％進行しているのを確認した。
Example 3
To the same aqueous sodium hydroxide solution as in Example 1 in which N-acetyl-D, L-phenylalanine was dissolved, 0.745 g (5 mmol) of triethanolamine was added (addition amount of triethanolamine: 50 mM), and a small amount of acid was added. In addition, the pH was adjusted to 9. To this, 3000 U of D-aminoacylase was added to adjust the enzyme concentration to 30 U / ml, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 1 day. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 93%.
実施例４
トリエタノールアミンの代わりに０．１１６ｇ（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を使用（ＴＭＥＤＡの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９０％進行しているのを確認した。
Example 4
In the same manner as in Example 1 except that 0.116 g (1 mmol) of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (TMEDA) was used instead of triethanolamine (addition amount of TMEDA: 10 mM), Hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 90%.
実施例５
トリエタノールアミンの代わりに０．１７３ｇ（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）を使用（ＰＭＤＥＴＡの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
Example 5
Example 1 except that 0.173 g (1 mmol) of N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA) was used instead of triethanolamine (addition amount of PMDETA: 10 mM). In the same manner as described above, a hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and 94% of the hydrolysis reaction was confirmed.
実施例６
トリエタノールアミンの代わりに０．１１５ｇ（１ｍｍｏｌ）の１−メチル−２−ピロリジンメタノールを使用（１−メチル−２−ピロリジンメタノールの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９３％進行しているのを確認した。
Example 6
In the same manner as in Example 1 except that 0.115 g (1 mmol) of 1-methyl-2-pyrrolidinemethanol was used instead of triethanolamine (addition amount of 1-methyl-2-pyrrolidinemethanol: 10 mM). A decomposition reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 93%.
比較例１
トリエタノールアミンの代わりに０．１５７ｇ（１ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が７５％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 1
The hydrolysis reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that 0.157 g (1 mmol) of Tris-HCl was used instead of triethanolamine (addition amount of Tris-HCl: 10 mM). The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 75%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
比較例２
トリエタノールアミンの代わりに０．３５８ｇ（１ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が２１％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 2
Example 3 was used except that 0.358 g (1 mmol) of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate was used instead of triethanolamine (addition amount of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate: 10 mM). The hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 21%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
Ｄ−トリプトファンの製造例
実施例７
５ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンを１０２．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）の２．４％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに０．１１７ｇ（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジエチルエタノールアミンを加え（Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミンの添加量：１０ｍＭ）、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを７５００Ｕ加えて、酵素濃度を７５Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９２％進行しているのを確認した。
Production Example of D-tryptophan Example 7
5 g (20.3 mmol) of N-acetyl-D, L-tryptophan was dissolved in 102.5 g (20 mmol) of a 2.4% aqueous sodium hydroxide solution. To this, 0.117 g (1 mmol) of N, N-diethylethanolamine was added (amount of N, N-diethylethanolamine added: 10 mM), and a small amount of acid was added to adjust to pH = 8. 7500 U of D-aminoacylase was added thereto, the enzyme concentration was adjusted to 75 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and 92% hydrolysis reaction was confirmed.
比較例３
Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミンの代わりに０．１５７ｇ（１ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が７２％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 3
The hydrolysis reaction was performed in the same manner as in Example 7 except that 0.157 g (1 mmol) of Tris-HCl was used instead of N, N-diethylethanolamine (addition amount of Tris-HCl: 10 mM). The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 72%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
比較例４
Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミンの代わりに０．３５８ｇ（１ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が４７％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 4
Example 7 except that 0.358 g (1 mmol) of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate was used instead of N, N-diethylethanolamine (addition amount of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate: 10 mM) In the same manner as described above, a hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 47%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
Ｄ−メチオニンの製造例
実施例８
２０ｇ（１０５ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンを１１３．１ｇ（１０５ｍｍｏｌ）の１１．５％水酸化ナトリウム水溶液に０．２０２ｇ（２ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリンを加え（Ｎ−メチルモルホリンの添加量：２０ｍＭ）、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを４５００Ｕ加えて、酵素濃度を４５Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
Production Example of D-methionine Example 8
Add 20 g (105 mmol) N-acetyl-D, L-methionine to 113.1 g (105 mmol) 11.5% aqueous sodium hydroxide solution and add 0.202 g (2 mmol) N-methylmorpholine (of N-methylmorpholine). Addition amount: 20 mM), and a small amount of acid was added to adjust pH = 8. 4500 U of D-aminoacylase was added thereto, the enzyme concentration was adjusted to 45 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 95%.
比較例５
Ｎ−メチルモルホリンの代わりに０．３１６ｇ（２ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：２０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が８５％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 5
The hydrolysis reaction was carried out in the same manner as in Example 8 except that 0.316 g (2 mmol) of Tris-HCl was used instead of N-methylmorpholine (addition amount of Tris-HCl: 20 mM). The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 85%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
比較例６
Ｎ−メチルモルホリンの代わりに０．７１４ｇ（２ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：２０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が８０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 6
Instead of N-methylmorpholine, 0.714 g (2 mmol) of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate was used (addition amount of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate: 20 mM). Then, a hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 80%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
Ｄ−バリンの製造例
実施例９
１０ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンを１０７．８ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）の７．１％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに０．１１４ｇ（１ｍｍｏｌ）の１，４−ジメチルピペラジンを加え（１，４−ジメチルピペラジンの添加量：１０ｍＭ）、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを１００００Ｕ加え、酵素濃度を１００Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９３％進行しているのを確認した。
Production Example of D-Valine Example 9
10 g (62.8 mmol) of N-acetyl-D, L-valine was dissolved in 107.8 g (62.8 mmol) of 7.1% aqueous sodium hydroxide solution. To this, 0.114 g (1 mmol) of 1,4-dimethylpiperazine was added (addition amount of 1,4-dimethylpiperazine: 10 mM), and a small amount of acid was added to adjust to pH = 8. 10000 U of D-aminoacylase was added thereto, the enzyme concentration was adjusted to 100 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 93%.
比較例７
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに０．１５８ｇ（１ｍｍｏｌ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例９と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が８２％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 7
The hydrolysis reaction was performed in the same manner as in Example 9 except that 0.158 g (1 mmol) Tris-HCl was used instead of 1,4-dimethylpiperazine (addition amount of Tris-HCl: 10 mM). Analysis of the reaction solution by HPLC confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 82%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
比較例８
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに０．３５８ｇ（１ｍｍｏｌ）リン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例９と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が７８％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 8
The same as Example 9 except that 0.358 g (1 mmol) disodium hydrogen phosphate 12 hydrate was used instead of 1,4-dimethylpiperazine (addition amount of disodium hydrogen phosphate 12 hydrate: 10 mM). Then, the hydrolysis reaction was performed. Analysis of the reaction solution by HPLC confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 78%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
Ｄ−チロシンの製造例
実施例１０
５ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシンを１０２．８ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）の２．７％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。０．１７３ｇ（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミン（ＰＭＤＥＴＡ）を加え（ＰＭＤＥＴＡの添加量：１０ｍＭ）、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを５０００Ｕ加えて、酵素濃度を５０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
Production Example of D-tyrosine Example 10
5 g (22.4 mmol) of N-acetyl-D, L-tyrosine was dissolved in 102.8 g (22.4 mmol) of a 2.7% aqueous sodium hydroxide solution. 0.173 g (1 mmol) of N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetetraamine (PMDETA) was added (PMDETA added amount: 10 mM), a small amount of acid was added, pH = Adjusted to 8. To this, 5000 U of D-aminoacylase was added, the enzyme concentration was adjusted to 50 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 95%.
実施例１１
５ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシンを１０２．８ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）の２．７％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。０．８６５ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミン（ＰＭＤＥＴＡ）を加え（ＰＭＤＥＴＡの添加量：５０ｍＭ）、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを５０００Ｕ加えて、酵素濃度を５０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
Example 11
5 g (22.4 mmol) of N-acetyl-D, L-tyrosine was dissolved in 102.8 g (22.4 mmol) of a 2.7% aqueous sodium hydroxide solution. 0.865 g (5 mmol) of N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetetraamine (PMDETA) was added (PMDETA added amount: 50 mM), a small amount of acid was added, pH = Adjusted to 8. To this, 5000 U of D-aminoacylase was added, the enzyme concentration was adjusted to 50 U / ml, and the mixture was stirred at 33 ° C. for 3 days. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 95%.
比較例９
Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミンの代わりに０．１５８ｇ（１ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１０と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が１０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 9
Example except that 0.158 g (1 mmol) of Tris-HCl was used instead of N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetetraamine (addition amount of Tris-HCl: 10 mM). In the same manner as in No. 10, the hydrolysis reaction was performed. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 10%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
比較例１０
Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミンの代わりに０．３５８ｇ（１ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１０ｍＭ）する以外は実施例１０と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が６８％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
Comparative Example 10
Instead of N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetetraamine, 0.358 g (1 mmol) of hydrogen phosphate disodium 12 hydrate was used (hydrogen disodium phosphate 12 hydrate) The amount of the product added was 10 mM), and the hydrolysis reaction was performed in the same manner as in Example 10. The reaction solution was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the hydrolysis reaction had progressed 68%. The reaction was stirred for an additional 24 hours, but the reaction did not proceed further.
Ｄ−トリプトファンの製造
実施例１２
実施例７にて得られた反応液から水を９５ｇ回収し、３５％塩酸でｐＨ＝６．５に中和し、２５℃で析出物を濾取、水洗、乾燥し、Ｄ−トリプトファンを１．６６ｇ（収率８０．２％）で得た。得られたＤ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンは、全く含まれず純度１００％であった。
Production Example 12 of D-tryptophan
95 g of water was recovered from the reaction solution obtained in Example 7, neutralized with 35% hydrochloric acid to pH = 6.5, the precipitate was collected by filtration, washed with water and dried at 25 ° C., and D-tryptophan was 1 Obtained in a yield of .66 g (yield 80.2%). When the obtained D-tryptophan was analyzed by HPLC, L-tryptophan and N-acetyl-D, L-tryptophan were not contained at all and the purity was 100%.
一方、濾液には、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンと、少量のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファン及びＤ−トリプトファンが含まれており、これを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｄ−トリプトファンの合成に用いた。 On the other hand, the filtrate contains N-acetyl-L-tryptophan, and a small amount of N-acetyl-D-tryptophan and D-tryptophan. Using this, N-acetyl-D, L-tryptophan, D- Used for the synthesis of tryptophan.
上記の濾液に水４０ｇ、Ｌ−トリプトファン４．０８ｇ（２０ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム５ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え、これを３０℃に加熱し、溶解した。この溶液に３．７ｇ（３６．２ｍｍｏｌ）の無水酢酸を滴下し、３０℃で１時間撹拌した後、８０℃に加熱し、無水酢酸９．２ｇ（９０ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌した。この段階で完全にラセミ化していることをＨＰＬＣで確認し、３０℃に冷却した。５０°硫酸でｐＨ＝２．３に酸析し、析出物を濾過、水洗、乾燥し、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン６．２２ｇ（収率９５．１％）を得た。得られたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンのみであった。 40 g of water, 4.08 g (20 mmol) of L-tryptophan and 5 g (40 mmol) of sodium hydroxide were added to the above filtrate, and this was heated to 30 ° C. and dissolved. To this solution, 3.7 g (36.2 mmol) of acetic anhydride was added dropwise and stirred at 30 ° C. for 1 hour, then heated to 80 ° C., and 9.2 g (90 mmol) of acetic anhydride was added dropwise and stirred for 1 hour. At this stage, complete racemization was confirmed by HPLC, and the mixture was cooled to 30 ° C. The acid was precipitated with 50 ° sulfuric acid to pH = 2.3, and the precipitate was filtered, washed with water and dried to obtain 6.22 g (yield 95.1%) of N-acetyl-D, L-tryptophan. When the obtained N-acetyl-D, L-tryptophan was analyzed by HPLC, only N-acetyl-D, L-tryptophan was found.
更に実施例７と同様にして加水分解反応を行い、反応後ＨＰＬＣにて分析すると９３％反応が進行していることを確認した。この反応液からＤ−トリプトファン１．６４ｇ（収率７９．１％）を得た。 Further, a hydrolysis reaction was carried out in the same manner as in Example 7. When analyzed by HPLC after the reaction, it was confirmed that 93% reaction had progressed. From this reaction solution, 1.64 g (yield: 79.1%) of D-tryptophan was obtained.
Claims (4)
Ｒ3は、水酸基を有することのあるＣ1-6アルキル基、基
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、酸素原子もしくは窒素原子を介し又は介することなく互いに結合して５〜６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して５〜６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、請求項１に記載の製造方法。 Tertiary amine is represented by the general formula (1)
R 3 is a C 1-6 alkyl group which may have a hydroxyl group, a group
Here, R 4 represents a C 1-6 alkyl group, and n and m each represents an integer of 1 to 6. R 1 and R 2 are the same as above.
Alternatively, R 1 and R 3 may be bonded to each other through or without an oxygen atom or a nitrogen atom to form a 5- to 6-membered saturated ring. When R 1 and R 3 are bonded to each other via a nitrogen atom to form a 5- to 6-membered saturated ring, a C 1-6 alkyl group is substituted on the nitrogen atom. ]
The manufacturing method of Claim 1 which is a tertiary amine represented by these.
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