JP2009082017A - 細胞膜蛋白質の局在部位と機能を同時に検出評価するための細胞処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】活性化に伴って細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の局在部位と機能を同時に検出評価できて、かつ当該細胞膜蛋白質の活性を促進または抑制する物質のスクリーニングも可能となる細胞処理方法を提供する。
【解決手段】（１）蛍光性有機化合物または蛍光蛋白質で蛍光標識した細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質Ａ、もしくは蛍光蛋白質で蛍光標識した細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質Ａをコードする遺伝子Ａ’を作製する。（２）上述の細胞膜蛋白質Ａの活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺を検出する蛍光プローブ蛋白質Ｂ、もしくはこれをコードする遺伝子Ｂ’を作製する。（３）Ｂに核移行シグナルペプチドを付加したＣ、またはＢ’に核移行シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したＣ’を作製する。（４）Ａ＋ＣまたはＡ’＋Ｃ’のいずれかの組合せを同一の細胞に導入または発現させる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の局在部位と機能を同時に検出評価できる細胞とするための細胞処理方法に関する。

神経伝達物質、ホルモン、オータコイドなどの細胞間情報伝達物質のうち水溶性のものは、細胞膜に存在する受容体、輸送蛋白質、酵素などの機能蛋白質の活性変化を誘発する。細胞膜に存在する機能蛋白質（以下、「細胞膜蛋白質」と略称する場合がある。）の活性変化は、Ｃａ²⁺、イノシトールリン脂質、環状ヌクレオチド、一酸化窒素、リン酸化蛋白質などのシグナル伝達物質の生成量を変化させ、生体の機能を調節している。細胞膜蛋白質の中でも細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発するものは、筋収縮、分泌、代謝、発生、免疫、脳機能など多彩でかつ重要な生体機能を司るスイッチとして広く利用されている。当該細胞膜蛋白質の活性変化と細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞、組織、器官の機能を解明し、それらの機能と密接に関連した医薬品開発に非常に有用な手段を提供することになる。

細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質には、時々刻々と細胞内での局在部位を変化（トランスロケーション）させて生体の機能を調節しているものがある。細胞膜蛋白質の１種として、例えばある受容体は、過剰量のアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）に曝されると、細胞内に陥入（インターナリゼーション）することによりアゴニストが刺激できる受容体の分子数を減少させて、アゴニストに対する反応性を調節することが報告されている（非特許文献１、２参照）。従って、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の細胞内局在部位を可視化することは、当該細胞膜蛋白質による細胞機能調節を解明する上で有用な情報を提供する。

生きている細胞内で細胞膜蛋白質の細胞内局在部位をリアルタイムに可視化する方法はすでに多数確立されている。中でも、細胞膜蛋白質を蛍光性有機化合物で化学的に標識して細胞に導入、あるいは細胞膜蛋白質と蛍光蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を作製してその融合蛋白質を細胞に発現させた後、細胞から発せられる蛍光を蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検鏡する方法が一般的に用いられている。

一方、当該細胞膜蛋白質の活性変化に伴う細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を解析することも、当該細胞膜蛋白質による細胞機能調節を解明する上で重要な情報を提供する。近年、細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を生きている細胞内でリアルタイムに可視化解析するための蛍光プローブ蛋白質が開発され始めている（特許文献１、２参照）。これらの蛍光プローブ蛋白質は、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇に伴って蛍光強度または蛍光波長のいずれかを変化させるものである。蛍光プローブ蛋白質を用いた細胞内Ｃａ²⁺濃度変化の解析においても、蛍光プローブ蛋白質をコードする遺伝子を作製して細胞にその蛋白質を発現させた後、細胞から発せられる蛍光を蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検鏡する方法が一般的に用いられている。

特開２００２−１５３２７９号公報 特開２００２−２５３２６１号公報 J. Biol. Chem., 272, 14817-14824 (1997) J. Biol. Chem., 273, 322-328 (1998)

本発明者らは、Ｇｑ蛋白質共役型受容体であるセロトニン_2A（５−ＨＴ_2A）受容体の細胞内局在と５−ＨＴ_2A受容体の活性変化に伴う細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を同時に検出評価できる細胞の作製を試みた。その試みにおいて、シアン色蛍光蛋白質を融合させた５−ＨＴ_2A受容体（５−ＨＴ_2A−ＣＦＰ）とＣａ²⁺を結合すると蛍光強度が増大する蛍光プローブ蛋白質（参考文献１：G-CaMP2:Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103, 4753-4758 (2006)参照）を共発現させた細胞を作製すると、両蛋白質が細胞質で相互作用することにより、５−ＨＴ_2A受容体が細胞膜に局在不可能となり、セロトニン刺激に対する反応性が消失するという問題に直面した。

しかし、従来においては、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の細胞内局在部位と細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を生きている細胞内でリアルタイムに同時に検出評価できる細胞を作製する試みはなされてこなかった。

そこで本発明は、当該細胞膜受容体が関与する細胞内Ｃａ²⁺濃度調節機構の解明や当該細胞膜受容体の機能と密接に関連した医薬品の開発をスピードアップさせるために、当該細胞膜蛋白質の局在部位と細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を生きている細胞内でリアルタイムに同時に検出評価できる細胞処理方法を提供することを目的とする。

この問題を解決するために本発明者らは、
（１）細胞膜に存在する蛋白質は核内に存在する蛋白質と相互作用する機会を持たない、
（２）細胞質と核内は核膜孔（５５ ｋＤａ程度の蛋白質が通過可能な穴）で通じている、
（３）細胞質と核内のＣａ²⁺濃度は同濃度になるように同期して変化する（参考文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 3197-3202 (2001)参照）
ということに注目した。

核移行シグナルペプチドを付加してＧ−ＣａＭＰ２を核内に封じ込めた状態にさせることで、再び５−ＨＴ_2A受容体が細胞膜に局在可能となりセロトニン刺激に対する反応性を回復したことから、５−ＨＴ_2A受容体の細胞内局在と機能を同時に検出評価できる細胞の作製に成功した。この結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
［１］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質をある色に蛍光標識したものと、前記細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺を検出する別の色の蛍光プローブ蛋白質とを細胞に共発現させる場合に、前記蛍光プローブ蛋白質に核移行シグナルペプチドを付加して前記細胞の核内に封じ込めた状態にすることを特徴とする細胞処理方法、
［２］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記［１］で表される細胞処理方法、
［３］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有することを特徴とする上記［１］で表される細胞処理方法、
［４］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、ａ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）ａ）〜ｃ）を組み合わせたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする上記［１］で表される細胞処理方法、
［５］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、天然由来の当該細胞膜蛋白質の部分ペプチド配列を含有することを特徴とする上記［１］で表される細胞処理方法、
［６］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有することを特徴とする上記［５］で表される細胞処理方法、
［７］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、ａ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）ａ）〜ｃ）を組み合わせたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする上記［５］で表される細胞処理方法、
［８］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質は、生理学的に許容される酸または塩基を付加された塩であることを特徴とする上記［１］，［２］、または［５］で表される細胞処理方法、
［９］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質をコードする遺伝子は、当該細胞膜蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであることを特徴とする上記［１］または［５］で表される細胞処理方法、
［１０］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の蛍光標識に用いられる蛍光性有機化合物または蛍光蛋白質は、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有することを特徴とする上記［１］，［２］、または［５］で表される細胞処理方法、
［１１］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の活性測定に用いられる蛍光プローブ蛋白質は、ａ）蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有するものであり、かつｂ）その吸収特性および蛍光特性が蛍光標識された当該細胞膜蛋白質と異なるものであり、かつｃ）当該細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺の量的変化に相関して、その蛍光強度または蛍光波長のいずれかを変化させるもの、であることを特徴とする上記［１］，［２］、または［５］で表される細胞処理方法、および
［１２］細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の活性測定に用いられる蛍光プローブ蛋白質を核移行させる核移行シグナルペプチドは、自体公知のペプチド配列のうちいずれであってもよいことを特徴とする上記［１］，［２］、または［５］で表される細胞処理方法を提供する。

本発明によれば、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質をある色に蛍光標識したものと、細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺を検出する別の色の蛍光プローブ蛋白質とを細胞に共発現させる場合に、蛍光プローブ蛋白質に核移行シグナルペプチドを付加して細胞の核内に封じ込めた状態にすることにより、蛍光標識した細胞膜蛋白質と蛍光プローブ蛋白質が細胞質で相互作用することを防ぐことができる。

本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質は、天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。

本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球など）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質など）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（大腸、小腸など）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。

天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは当該細胞膜蛋白質の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列が天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列に対して約８５％未満の相同性であると、両蛋白質の立体構造間に重大な相違がある可能性があり、構造生物学的に相同性が高いとは許容され難いという理由で好ましくない。

天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。

実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性や細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性や細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。

また、本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質としては、
（ａ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｂ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｃ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
（ｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列、
を含有する蛋白質なども用いられる。

本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の部分ペプチド（以下、単に部分ペプチドと略称する場合がある）としては、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドが好ましい。

また、本発明に用いられる部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。

本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容され酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

本発明に用いられる細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質をコードする遺伝子としては、当該細胞膜受容体をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。当該遺伝子としては、本発明に用いられる当該細胞膜蛋白質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。

本発明に用いられる部分ペプチドをコードする遺伝子としては、本発明に用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。

細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の蛍光標識に用いられる蛍光性有機化合物または蛍光蛋白質としては、ａ）その標識により当該細胞膜蛋白質の実質的な活性が損なわれないもの、かつｂ）蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有するもの、であればいずれであってもよい。当該細胞膜蛋白質は、自体公知の化学的架橋（ケミカルクロスリンク）法により当該蛍光性有機化合物または当該蛍光蛋白質で標識できる。また蛍光標識された当該細胞膜蛋白質は、自体公知の蛋白質導入試薬を用いたトランスフェクション法または微小ガラス針を用いたマイクロインジェクション法に準じて細胞へ導入することができる。

また、細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の蛍光標識が蛍光蛋白質との融合による場合、当該細胞膜蛋白質と蛍光蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を作製した後、自体公知の遺伝子導入試薬を用いたトランスフェクション法または微小ガラス針を用いたマイクロインジェクション法に準じて当該遺伝子を細胞に導入することにより、融合蛋白質を細胞に発現させることができる。

本発明に用いられる蛍光プローブ蛋白質は、ａ）当該細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺の量的変化に相関して、その蛍光強度または蛍光波長のいずれかを変化させるものであり、かつｂ）蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有するものであり、かつｃ）その吸収特性および蛍光特性が蛍光標識された当該細胞膜蛋白質と異なるもの、であればいずれであってもよい。蛍光プローブ蛋白質は、自体公知の蛋白質導入試薬を用いたトランスフェクション法または微小ガラス針を用いたマイクロインジェクション法に準じて細胞へ導入することができる。
また、蛍光プローブ蛋白質は、これをコードする遺伝子を作製した後、自体公知の遺伝子導入試薬を用いたトランスフェクション法に準じて当該遺伝子を細胞に導入することにより、細胞に発現させることができる。

蛍光プローブ蛋白質を蛍光標識された当該細胞膜蛋白質と共発現させる場合に、両者が細胞質で相互作用してしまう場合、これを防ぐ目的で、下記の核移行シグナルペプチドを付加して当該蛍光プローブ蛋白質を核内に封じ込めた状態にすることができる。
本発明に用いられる核移行シグナルペプチドは、自体公知のペプチド配列のうちいずれであってもよい。核移行シグナルペプチドを付加する蛍光プローブ蛋白質中の部位は、その付加により蛍光プローブ蛋白質の実質的な活性が損なわれなければいずれであってもよい。

以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。

参考例１

５−ＨＴ_2A−ＣＦＰの発現プラスミドの構築
５−ＨＴ_2A−ＣＦＰの発現プラスミドであるｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−５ＨＴ_2A−ＣＦＰは、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）の代わりにＣＦＰを用いた点を除き、参考文献３（Eur. J. Pharmacol., 518, 18-21 (2005)）に記載の方法に従って構築した。すなわち第一に、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＣＦＰ ｃＤＮＡ部分において翻訳後Ａｌａ−２０６→Ｌｙｓにアミノ酸置換されるようＡｌａ−２０６／Ｌｅｕ−２０７／Ｓｅｒ−２０８／Ｌｙｓ−２０９をコードしている５’−ＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡ−３’を５’−ＡＡＡＣＴＴＴＣＧＡＡＡ−３’に遺伝子変異させ、ｐＮ１−ｍＥＣＦＰを得た。第二に、ｐＮ１−ｍＥＣＦＰをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ処理して得られた０．７２ｋｂ断片とｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ処理して得られた６．３６ｋｂ断片とを連結させてｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−ｍＥＣＦＰを得た。第三に、ＨＴＲ２Ａ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ０００６２１, 東洋紡）を鋳型として５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＧ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）および５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣ−３’（リバース）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、５−ＨＴ_2A受容体ｃＤＮＡを増幅させた。このＰＣＲ反応産物をＮｃｏＩ処理して得られた１．４２ｋｂ断片を先に作製したｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−ｍＥＣＦＰのＮｃｏＩ部位に順方向に挿入させ、ｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−５ＨＴ_2A−ＣＦＰを得た。

参考例２

ＣＦＰで蛍光標識したα_1Bアドレナリン受容体（α_1BＡＲ−ＣＦＰ）の発現プラスミドの構築
α_1BＡＲ−ＣＦＰの発現プラスミドであるｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−α_1BＡＲ−ＣＦＰは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の代わりに各々ＣＦＰを用いた点とα_1BＡＲの２番目のアミノ酸であるアスパラギンをグリシンに置換した点を除き、参考文献４（Mol. Endocrinol., 12, 1099-1111 (1998)）に記載の方法に従って構築した。すなわち、α_1Bアドレナリン受容体 ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＢＣ０７０９２０, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣ−３’（フォワード）および５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＴＣＧＡＧＡＣＧＧ−３’（リバース）をプライマーとしてＰＣＲを行い、α_1Bアドレナリン受容体ｃＤＮＡを増幅させた。このＰＣＲ反応産物をＮｃｏＩ処理して得られた１．４ｋｂ断片を上記のｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−ｍＥＣＦＰのＮｃｏＩ部位に順方向に挿入させ、ｐＴｒｉＥｘ４ｎｅｏ−α_1BＡＲ−ＣＦＰを得た。

参考例３

核移行シグナルを挿入したＧ−ＣａＭＰ２（Ｇ−ＣａＭＰ２ｎｕ）および核移行シグナルを挿入したＧ−ＣａＭＰ１．６（Ｇ−ＣａＭＰ１．６ｎｕ）の発現プラスミドの構築
Ｇ−ＣａＭＰ２ｎｕおよびＧ−ＣａＭＰ１．６ｎｕの発現プラスミドは、ＰＣＲを用いて作製した核移行シグナル（参考文献５（J. Biol. Chem., 282, 5101-5105 (2007)）参照）を含むペプチド（アミノ酸配列：ＶＤＰＫＫＫＲＫＶＥＧＳ：ＫＫＲＫが核移行シグナル）をコードするＤＮＡ断片を各々Ｇ−ＣａＭＰ２（参考文献１）およびＧ−ＣａＭＰ１．６（参考文献６（Anal. Chem., 77, 5861-5869 (2005)）参照）の発現プラスミドに挿入する方法で構築した。核移行シグナル挿入部位はＧ−ＣａＭＰ２およびＧ−ＣａＭＰ１．６の１番目のアミノ酸であるメチオニンの直後となるようにした。核移行シグナルを含むペプチドをコードするＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより合成した。ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を、鋳型としてＧ−ＣａＭＰ２およびＧ−ＣａＭＰ１．６の発現プラスミドであるｐＮ１−ＧＣａＭＰ２（参考文献１）およびｐＮ１−ＧＣａＭＰ１．６（参考文献６）を、フォワードプライマーとして５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＡＴＡＡＧ−３’、リバースプライマーとして５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣ−３’（プライマーはシグマジェノシスが化学合成）を使用した。いずれの場合も１．２８ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、これらを１％アガロースゲル電気泳動により分離してＱＩＡＥｘII（Ｑｉａｇｅｎ）にてゲルより回収し、制限酵素ＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＳａｌＩとＮｏｔＩで消化したｐＮ１−ＧＣａＭＰ２およびｐＮ１−ＧＣａＭＰ１．６を１％アガロースゲル電気泳動により分離してＱＩＡＥｘIIにてゲルより回収した各々３．９１ｋｂのＤＮＡ断片と、クイックライゲーションキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いてライゲーションさせた。大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこのライゲーション後のプラスミドＤＮＡで形質転換させ、この形質転換後の大腸菌よりプラスミドを回収した。回収したプラスミドのうち、いずれの場合も制限酵素ＳａｌＩとＮｏｔＩで消化して１．２８ｋｂと３．９１ｋｂのＤＮＡ断片が生じたものを選択しＧ−ＣａＭＰ２ｎｕおよびＧ−ＣａＭＰ１．６ｎｕの発現プラスミドを得た。

細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の局在部位および機能の培養細胞を用いた同時検出評価
培養細胞としてＨＥＫ２９３細胞、ＰＣ１２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用し、これらの細胞はいずれも参考文献５に記載の方法に従って培養した。細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の例として５−ＨＴ_2A受容体、α_1Bアドレナリン受容体を用い、これらの受容体の細胞内局在部位を可視化するために、ＣＦＰで蛍光標識したこれらの受容体である５−ＨＴ_2A−ＣＦＰ、α_1BＡＲ−ＣＦＰの発現プラスミドを構築した。５−ＨＴ_2A受容体およびα_1Bアドレナリン受容体はいずれもアゴニスト刺激されると細胞内シグナル伝達物質であるＣａ²⁺の生成量を一過性に増大させる。この細胞内Ｃａ²⁺生成活性を検出するために、細胞内Ｃａ²⁺濃度増大に伴って蛍光強度が増大する蛍光Ｃａ²⁺プローブ蛋白質であるＧ−ＣａＭＰ２、Ｇ−ＣａＭＰ２ｎｕ、Ｇ−ＣａＭＰ１．６、Ｇ−ＣａＭＰ１．６ｎｕの発現プラスミドを構築した。５−ＨＴ_2A−ＣＦＰ、α_1BＡＲ−ＣＦＰ、Ｇ−ＣａＭＰ２、Ｇ−ＣａＭＰ２ｎｕ、Ｇ−ＣａＭＰ１．６、Ｇ−ＣａＭＰ１．６ｎｕの発現プラスミドは参考文献３に記載の方法に従って培養細胞に導入した。細胞膜で機能するＧｑ共役型受容体の細胞内局在部位の検出は参考文献３に記載の方法と同様に、また蛍光Ｃａ²⁺プローブ蛋白質の蛍光強度変化の評価は特許文献１に記載の方法と同様に行った。すなわち、ＨＥＫ２９３細胞は、１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３０Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク）、３０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を培地として用いて培養した。トランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、試薬添付の方法に準じて操作を行った。トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞は、実験時までＣＯ₂培養器にて３７℃で１−４日間培養した。実験時には細胞外液をＨＢＳバッファー（１０７ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１１．５ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）（ｐＨ７．４））に置換した。このように細胞外液を置換した細胞を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ（Ｚｅｉｓｓ）の検鏡台にセットした。５−ＨＴ_2A−ＣＦＰおよびα_1BＡＲ−ＣＦＰの細胞内局在部位の検出は、細胞を４５８ｎｍの光で励起して得られる５００＋２５ｎｍの蛍光を指標として行った。Ｇ−ＣａＭＰ２、Ｇ−ＣａＭＰ２ｎｕ、Ｇ−ＣａＭＰ１．６、Ｇ−ＣａＭＰ１．６ｎｕの蛍光強度変化の評価は、細胞を５１４ｎｍの光で励起して得られる５３０ｎｍより長波長の蛍光を指標として行った。

今般５−ＨＴ_2A−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２をＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、両蛋白質が細胞質で相互作用することにより、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰが細胞膜に局在不可能となりセロトニン刺激に対する反応性が消失するという問題が生じた。図１はその様子を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は５−ＨＴ_2A−ＣＦＰを、（ｂ）はＧ−ＣａＭＰ２を示す。
ここで、核移行シグナルペプチドを付加してあるＧ−ＣａＭＰ２ｎｕをＧ−ＣａＭＰ２の代わりに使用して５−ＨＴ_2A−ＣＦＰと共発現させたところ、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰは細胞膜に局在可能となりセロトニン刺激に対する反応性が回復し、問題点を克服できた。図２はその様子を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は５−ＨＴ_2A−ＣＦＰを、（ｂ）はＧ−ＣａＭＰ２ｎｕを示す。また図３は１００ｎＭセロトニン添加後の５−ＨＴ２Ａ−ＣＦＰインターナリゼーションによる細胞膜の変化を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は０分後、（ｂ）は１０分後、（ｃ）は２０分後、（ｄ）は３０分後の状態を示す。図４は１００ｎＭセロトニン添加後のＧ−ＣａＭＰ２ｎｕの蛍光変化量を示すグラフである。
この事例はＨＥＫ２９３細胞の代わりにＰＣ１２細胞またはＣ２Ｃ１２細胞を使用した場合でも確認できた。

同様の事例として、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ１．６をＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、両蛋白質が細胞質で相互作用することにより、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰが細胞膜に局在不可能となりセロトニン刺激に対する反応性が消失した。
しかしながら、Ｇ−ＣａＭＰ１．６ｎｕをＧ−ＣａＭＰ１．６の代わりに使用して５−ＨＴ_2A−ＣＦＰと共発現させたところ、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰは細胞膜に局在可能となりセロトニン刺激に対する反応性を示した。

次に、蛍光標識した細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質が蛍光Ｃａ²⁺プローブ蛋白質と細胞質で相互作用するといった事例が他の場合でもみられるか、検討した。α_1BＡＲ−ＣＦＰをＧ−ＣａＭＰ２とＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、両蛋白質が細胞質で相互作用することはなく、α_1BＡＲ−ＣＦＰは野生型の受容体（参考文献４）の場合と同様に細胞膜に局在し、ノルアドレナリン刺激に対する反応性が消失することはなかった。図５はその様子を示す顕微鏡写真であり、（ａ）はα_1BＡＲ−ＣＦＰを、（ｂ）はＧ−ＣａＭＰ２を示す。
またＧ−ＣａＭＰ２ｎｕをＧ−ＣａＭＰ２の代わりに使用してα_1BＡＲ−ＣＦＰと共発現させた場合でも、α_1BＡＲ−ＣＦＰは野生型の受容体の場合と同様に細胞膜に局在し、ノルアドレナリン刺激に対する反応性を示した。図６はその様子を示す顕微鏡写真であり、ａ）はα_1BＡＲ−ＣＦＰを、（ｂ）はＧ−ＣａＭＰ２ｎｕを示す。
このことから、蛍光標識した５−ＨＴ_2A受容体の場合とは異なり、蛍光標識したα_1B受容体は蛍光Ｃａ²⁺プローブ蛋白質と細胞質で相互作用しないことを見出した。

細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質の活性を促進または抑制する物質のスクリーニング
５−ＨＴ_2A−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２ｎｕをＨＥＫ２９３細胞に実施例１に記載の方法に従って共発現させ、この安定発現細胞をクローニングにより創出した。この安定発現細胞において、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰはその活性を促進するセロトニンの刺激に応じて細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を惹起させてＧ−ＣａＭＰ２ｎｕの蛍光強度を増大させるとともに、自分自身はインターナリゼーションする。一方、この安定発現細胞を５−ＨＴ_2A−ＣＦＰの活性を抑制する物質で前処理しておくと、セロトニン誘発性のＧ−ＣａＭＰ２ｎｕの蛍光強度増大が抑制されることになる。実際、この安定発現細胞を５−ＨＴ_2A受容体のアンタゴニストであるサルポグレラートの前処理することによってセロトニン誘発性のＧ−ＣａＭＰ２ｎｕの蛍光強度増大が抑制されることが確認できたため、ここに記載したスクリーニングが実現可能であることが示された。

本発明は、蛍光標識した細胞膜蛋白質と蛍光プローブ蛋白質が細胞質で相互作用することを防いで、細胞膜蛋白質の局在部位と機能を同時に検出評価するための細胞処理方法であり、細胞膜受容体が関与する細胞内Ｃａ²⁺濃度調節機構の解明や当該細胞膜受容体の機能と密接に関連した医薬品の開発をスピードアップさせるために有用な技術である。

５−ＨＴ_2A−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２をＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰが細胞膜に局在不可能となりセロトニン刺激に対する反応性がみられない様子を示す顕微鏡写真である。 ５−ＨＴ_2A−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２ｎｕをＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、５−ＨＴ_2A−ＣＦＰが細胞膜に局在可能となりセロトニン刺激に対する反応性がみられる様子を示す顕微鏡写真である。 １００ｎＭセロトニン添加後の５−ＨＴ２Ａ−ＣＦＰインターナリゼーションによる細胞膜の変化を示す顕微鏡写真である。 １００ｎＭセロトニン添加後のＧ−ＣａＭＰ２ｎｕの蛍光変化量を示すグラフである。 α_1BＡＲ−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２をＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、α_1BＡＲ−ＣＦＰが細胞膜に局在可能となりノルアドレナリン刺激に対する反応性がみられる様子を示す顕微鏡写真である。 α_1BＡＲ−ＣＦＰとＧ−ＣａＭＰ２ｎｕをＨＥＫ２９３細胞に共発現させると、α_1BＡＲ−ＣＦＰが細胞膜に局在可能となりノルアドレナリン刺激に対する反応性がみられる様子を示す顕微鏡写真である。

Claims (12)

1. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する細胞膜蛋白質をある色に蛍光標識したものと、
   前記細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺を検出する別の色の蛍光プローブ蛋白質とを細胞に共発現させる場合に、
   前記蛍光プローブ蛋白質に核移行シグナルペプチドを付加して前記細胞の核内に封じ込めた状態にすることを特徴とする細胞処理方法。
2. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載の細胞処理方法。
3. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有することを特徴とする請求項１記載の細胞処理方法。
4. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、ａ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）ａ）〜ｃ）を組み合わせたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする請求項１記載の細胞処理方法。
5. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、天然由来の当該細胞膜蛋白質の部分ペプチド配列を含有することを特徴とする請求項１記載の細胞処理方法。
6. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、天然由来の当該細胞膜蛋白質と実質的に同質の活性を有することを特徴とする請求項５記載の細胞処理方法。
7. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、ａ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）天然由来の当該細胞膜蛋白質のアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）ａ）〜ｃ）を組み合わせたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする請求項５記載の細胞処理方法。
8. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質が、生理学的に許容される酸または塩基を付加された塩であることを特徴とする請求項１，２、または５記載の細胞処理方法。
9. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質をコードする遺伝子が、当該細胞膜蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであることを特徴とする請求項１，２、または５記載の細胞処理方法。
10. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の蛍光標識に用いられる蛍光性有機化合物または蛍光蛋白質が、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有することを特徴とする請求項１，２、または５記載の細胞処理方法。
11. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の活性測定に用いられる蛍光プローブ蛋白質が、ａ）蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で検出できる吸収特性および蛍光特性を有するものであり、かつｂ）その吸収特性および蛍光特性が蛍光標識された当該細胞膜蛋白質と異なるものであり、かつｃ）当該細胞膜蛋白質の活性化に伴って細胞内で濃度上昇するＣａ²⁺の量的変化に相関して、その蛍光強度または蛍光波長のいずれかを変化させるもの、であることを特徴とする請求項１，２、または５記載の細胞処理方法。
12. 細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を誘発する前記細胞膜蛋白質の活性測定に用いられる蛍光プローブ蛋白質を核移行させる核移行シグナルペプチドが、自体公知のペプチド配列（−Ｋ−（ＫまたはＲ）−Ｘ−（ＫまたはＲ）−：Ｋはリジン残基、Ｒはアルギニン残基、Ｘは任意のアミノ酸残基）のうちいずれかであることを特徴とする請求項１，２、または５記載の細胞処理方法。