JP2009077635A - 軸索内移動粒子の自動追跡システム - Google Patents
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Abstract
【課題】 輸送粒子間の干渉や、軸索周囲の粒子やランダム雑音による影響を受けない、新規な神経細胞の軸索内輸送の粒子経路を解析方法を提供し、さらに、該解析方法を実現する装置、及び、そのためのコンピュータープログラムを提供すること。
【解決手段】 神経細胞の軸索を通過する小胞粒子を可視化する工程、該神経細胞を経時的に撮影した画像を入手する工程、該入手した画像フレームをコンピューターに入力する工程、該画像フレーム中の軸索領域を抽出する工程、該軸索領域中の小胞粒子を検出する工程、該検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程、及び、該演算処理により算出された小胞粒子の軌道を出力する工程、を含む神経細胞の軸索輸送の解析方法を提供する。
【選択図】 図5
Description
1. 神経細胞の培養
胚齢7日目のニワトリ胚由来の後根神経節(DRG:Dorsal Root Ganglion)ニューロンを、100μg /mlのポリ‐L‐リジンでコーティングしたガラス底培養ディッシュで、F12基礎培地に、10%のウシ胎児血清(FBS: Fetal Bovine Serum)及び10 ng/mlの神経増殖因子(NGF: Neural Growth Factor)を添加した培養液で、37℃にて培養した。
上記培養開始から8‐14時間経過後、培養液に、1mg/mlのCellTracker CM-DiI(Molecular Probe)を添加し、さらに1時間培養を継続し、DRGニューロンにDiI色素を取り込ませた。その後、DRGニューロンをPBSで3回洗浄した。洗浄したDRGニューロンを、L15基礎培地に、10%FBS及び10 ng/mlのNGFを添加した培養液で、37℃にて6時間以上培養した。培養開始から6時間経過後、共焦点レーザー顕微鏡にてDRGニューロンを観察し、蛍光染色された小胞がDRGニューロンの軸索を通過していることを確認した(図6)。
さらに、前記DiI染色された小胞が、軸索輸送により移動している粒子であるかどうかを確認するため、ノコダゾール、及びアジ化ナトリウムを用いて、微小管に沿った輸送を阻害し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。具体的には、共焦点レーザー顕微鏡により、DiI染色された神経細胞の2フレーム/秒のフレームレートで12分間撮影し、撮影開始より4分間経過時に、軸索輸送阻害剤として、微小管重合阻害薬であるノコダゾールを30μM、又は、ATPase阻害薬であるアジ化ナトリウムを0.1%で添加し、その後の軸索輸送の経過を観察した。軸索輸送の阻害は、細胞体から約20μm離れた軸索部分に、軸索をほぼ直角に横断する仮想線を設定し、2分間の間に該仮想線を通過する粒子数をカウントし、該粒子数を軸索輸送の活性指数とした。それぞれノコダゾール及びアジ化ナトリウムで軸索輸送を阻害した結果を図7に示すが、両阻害剤とも、阻害前の活性との比較で、0%近くまで軸索活性を低下させていることが判明した(図7)。従って、DiI染色で可視化された粒子の輸送は、微小管重合阻害薬、及び、ATPase阻害薬により低下するので、DiI染色は、微小管依存性の軸索輸送により輸送される小胞粒子を染色することが確認された。
本発明に係る、軸索内移動粒子の自動追跡システムにより、小胞粒子の軸索輸送経路の追跡を行なった。
上記実施例1でDiI染色したニワトリ胚由来DRGニューロンを、共焦点顕レーザー微鏡を用いて撮影し、その画像をビットマップ形式の画像に変換して画像処理を行った。本実施例では、1つの撮影データに対し、2フレーム/秒のフレームレートで、240フレームから成る時系列画像を取得し自動解析を行った。本実施例では、3系統の撮影データを用い、(1)分離度フィルタを用いた場合の検出粒子数、(2)目視による検出粒子数、及び、(3)二値化処理による粒子検出数を比較して、分離度フィルタを用いた粒子検出方法の検証を行った。その結果を下記表1に示す。
次に、本発明に係る遺伝的アルゴリズムを用いた追跡手法の追跡精度について検証する。検証方法として、総ルート数87本のルートに対し、局所的追跡法を適用した段階での追跡精度と遺伝的アルゴリズムを導入後の追跡精度を比較することにより検証を行った。上記式(2)で表される評価関数を用いて適合度の評価を行い、それに基づいて、次世代の残すルートを選択するが、本実施例では一点交叉を用い、一定の世代に達した段階で演算処理を終了した。その結果を表2に、また、導入前と導入後の様子を図8に示す。
最後に、粒子の追跡が目視と同様に行われているかを検証した。従来の軸索輸送の解析方法では、軸索の始まる地点から10μmの位置にある軸索上に仮想線を引き、その線を通過する粒子を測定しているため本実施例でも同様の手法により軸索輸送の経路を追跡した。また、自動解析については、追跡結果は図7のようにグラフ形式で表示されるため、軸索上の細胞体から10μmの位置に相当するX座標を求め、グラフ上で該X座標と交差するルートの数を求め、該ルート数を仮想線を通過した粒子とした。表3にその結果を示す。本実験により、遺伝的アルゴリズム処理による解析は、目視と同程度の追跡が可能であることが確認された。
Claims (27)
- 神経細胞の軸索を通過する小胞粒子を可視化する工程、該神経細胞を経時的に撮影した画像を入手する工程、該入手した画像フレームをコンピューターに入力する工程、該画像フレーム中の軸索領域を抽出する工程、該軸索領域中の小胞粒子を検出する工程、該検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程、及び、該演算処理により算出された小胞粒子の軌道を出力する工程、を含む神経細胞の軸索輸送の解析方法。
- 前記神経細胞の軸索を通過する小胞粒子を可視化する工程で、該可視化される小胞粒子が微小管依存性の軸索輸送により輸送される小胞粒子である請求項1記載の方法。
- 前記神経細胞の軸索を通過する小胞粒子を可視化する工程において、該小胞粒子の脂質二重膜の蛍光ラベル化により粒子を可視化する請求項1又は2記載の方法。
- 前記脂質二重膜の蛍光ラベル化が、カルボシアニン蛍光色素染色により行なわれる請求項3記載の方法。
- 前記軸索領域中の小胞粒子を検出する工程において、該小胞粒子が分離度フィルタを用いて検出される請求項1乃至4いずれか一項記載の方法。
- 前記検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程において、該安定追跡経路の統合が評価関数の最適化アルゴリズムにより演算処理される請求項1乃至6いずれか一項記載の方法。
- 前記最適化アルゴリズムが、遺伝的アルゴリズムである請求項7記載の方法。
- 前記遺伝的アルゴリズムが、前記小胞粒子経路を一点交叉により探索する請求項8又は9記載の方法。
- 前記画像フレーム中の軸索領域を抽出する工程において、該軸索領域が画像フレーム間の時間的移動平均処理、該移動平均画像に対する二値化処理、該二値化処理された各領域のラベリング、及び最大領域の選択により抽出される請求項1乃至10のいずれか一項記載の方法。
- 軸索を通過する小胞粒子が可視化された神経細胞を経時的に撮影した画像を入手する手段、該入手した画像フレームをコンピューターに入力する手段、該画像フレーム中の軸索領域を抽出する手段、該軸索領域中の小胞粒子を検出する手段、該検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する手段、及び、該演算処理により算出された小胞粒子の軌道を出力する手段、を含む神経細胞の軸索輸送の解析装置。
- 前記軸索領域中の小胞粒子を検出する手段において、該小胞粒子が分離度フィルタを用いて検出される請求項12記載の装置。
- 前記分離度フィルタが、任意の領域Rの中心領域R1の面積を複数段階に変化させた場合に、上記評価式(1)のHが最大値をとるR1の面積を小胞粒子の面積と定めて、該小胞粒子を検出する請求項13記載の装置。
- 前記検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程において、該安定追跡経路の統合が評価関数の最適化アルゴリズムにより演算処理される請求項12乃至14いずれか一項記載の装置。
- 前記最適化アルゴリズムが、遺伝的アルゴリズムである請求項15記載の装置。
- 前記遺伝的アルゴリズムが、上記式(2)で表される評価関数を環境適合度とし、安定追跡経路を遺伝子、該安定追跡経路が再結合結合された模擬ルートを個体として、式(2)の適合度が最小値を取るように小胞粒子経路を模索する請求項16記載の装置。
- 前記遺伝的アルゴリズムが、前記小胞粒子経路を一点交叉により探索する請求項16又は17記載の装置。
- 前記画像フレーム中の軸索領域を抽出する手段において、該軸索領域が画像フレーム間の時間的移動平均処理、該移動平均画像に対する二値化処理、該二値化処理された各領域のラベリング、及び最大領域の選択により抽出される請求項12乃至18のいずれか一項記載の装置。
- 軸索を通過する小胞粒子が可視化された神経細胞を経時的に撮影して入手した画像フレームをコンピューターに入力する工程、該画像フレーム中の軸索領域を抽出する工程、該軸索領域中の小胞粒子を検出する工程、該検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程、及び、該演算処理により算出された小胞粒子の軌道を出力する工程、を含む神経細胞の軸索輸送の解析用プログラム。
- 前記軸索領域中の小胞粒子を検出する工程において、該小胞粒子が分離度フィルタを用いて検出される請求項20記載のプログラム。
- 前記分離度フィルタが、任意の領域Rの中心領域R1の面積を複数段階に変化させた場合に、上記評価式(1)のHが最大値をとるR1の面積を小胞粒子の面積と定めて、該小胞粒子を検出する請求項21記載のプログラム。
- 前記検出された小胞粒子の局所的追跡、安定追跡経路の抽出及び安定追跡経路の統合を演算処理する工程において、該安定追跡経路の統合が評価関数の最適化アルゴリズムにより演算処理される請求項20乃至22いずれか一項記載のプログラム。
- 前記最適化アルゴリズムが、遺伝的アルゴリズムである請求項23記載のプログラム。
- 前記遺伝的アルゴリズムが、上記式(2)で表される評価関数を環境適合度とし、安定追跡経路を遺伝子、該安定追跡経路が再結合結合された模擬ルートを個体として、式(2)の適合度が最小値を取るように小胞粒子経路を模索する請求項24記載のプログラム。
- 前記遺伝的アルゴリズムが、前記小胞粒子経路を一点交叉により探索する請求項24又は25記載のプログラム。
- 前記画像フレーム中の軸索領域を抽出する工程において、該軸索領域が画像フレーム間の時間的移動平均処理、該移動平均画像に対する二値化処理、該二値化処理された各領域のラベリング、及び最大領域の選択により抽出される請求項20乃至26のいずれか一項記載のプログラム。
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