JP2009041931A - タンパク質機能解析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のタンパク質機能解析装置は、測定対象である測定対象タンパク質の高さ、幅、部分構造間の距離を含む構造情報を、溶液内にて解析するタンパク質機能解析装置であり、静電的相互作用にて、表面がインターフェース分子により分子修飾された基板と、前記構造情報を測定する測定装置とを有し、前記インターフェース分子に対し、静電的相互作用により前記測定対象タンパク質を結合させる。
【選択図】図1
Description
すなわち、生体分子が機能する際、他の分子との反応及び外界からの刺激に伴ってその構造を変化させることにより特定の機能を有することになる。
上述した生体分子の構造解析には、X線回折法や電子顕微鏡/電子線回折法が多く用いられている(例えば、非特許文献1参照)。
しかし、上述した構造解析の方法にては、解析対象の試料を結晶化させたり、あるいは凍結させたりすることが必要であり、生体分子が生体内において有する構造及び構造変化を反映しているか否かは明らかとすることができない。
このため、NMR法は非常に限られた一部のタンパク質にのみに適用されているのが現状である。
Eva Pebay-peyroula, Gbriele Rummel, Jurg P.Rosenbusch, Ehud M. Landau, "X-ray Structure of Bacteriohodopsin at 2.5 Angstroms from Microcrystals Grown in Lipidic Cubic Phase", SCIENCE, VOL.277, 12 SEPTEMBER 1997(downloaded from "www.sciencemag.org" on July 4,2007) Daniel J. Muller, Frank A. Schabert, Georg Buldt, and Andreas Engel, "Imaging Purple Membranes in Aqueous Solutions at Sub-Nanometer Resolution by Atomic Force Microscopy", Biophysical Journal, Volume 68, May 1995, pp.1661-1666
一般の膜タンパク質は生体中に浮遊する状態にて存在すると考えられており、上記の二次元結晶構造を有する膜タンパク質に比較して、動的で非常に柔らい構造を有するタンパク質であると予想される。
しかしながら、タンパク質の解析においては、従来の手法を用いた場合、解析対象のタンパク質が安定に基板表面に固定されずに、測定に必要な期間固定されずに高解像の測定が行えなかった。
実際、現在までにAFMを用いて膜タンパク質の構造解析が試みられているが、膜端膜質の部分構造を観察するまでには至っていない。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、動的で柔らかい構造を有するタンパク質を、その機能を維持した構造の形態にて基板に固定し、その構造情報を測定することができるタンパク質機能解析装置を提供することを目的とする。
すなわち、本発明のタンパク質機能解析装置は、測定対象である測定対象タンパク質の高さ、幅、部分構造(タンパク質の構成するサブユニット)間の距離を含む構造情報を、溶液内にて解析するタンパク質機能解析装置であり、静電的相互作用にて、表面がインターフェース分子により分子修飾された基板と、構造情報を測定する測定装置とを有し、インターフェース分子に対し、静電的相互作用により測定対象タンパク質を結合させ、測定対象タンパクを安定した状態にて構造情報を測定する。
以下、本発明の第1の実施形態によるタンパク質機能解析装置を図面を参照して説明する。図1は同実施形態によるタンパク質機能解析装置の構成例を示すブロック図である。
生体分子修飾試料台1は、例えばマイカなどの基板であり、表面が生体分子により修飾されている。
走査プローブ顕微鏡装置2は、STMやAFMであり、本実施形態においてはAFMを用いており、片持ち梁(カンチレバー)の先端に取り付けられた探針と試料との間に働く力により、観察対象の表面構造を検出するものである。
解析用装置3は、AFM像の解析のための画像処理プログラムがインストールされたパーソナルコンピュータなどから構成されており、上記走査プローブ顕微鏡装置2の検出した表面構造のAFMの検出結果である、生体分子修飾試料台1の表面の凹凸に対応した検出値を、生体分子修飾試料台1表面の2次元座標系の座標位置に対応させて一旦データベース4に蓄積する。
すなわち、解析用装置3は、上記画像データを各画素の階調データとして、画素位置を示す座標に対応させて構成している。上記階調データは、解析対象物である試料の凹凸の高さの数値(例えば、nm)を、例えば1nm単位にて量子化したものと生成する。
まず、溶液にインターフェース分子として用いる生体分子のポリマーを溶解させるが、このとき、球状に変形した生体分子が解析対象のタンパク質と混同する場合がある。
このため、インターフェース分子を溶解した溶液を微少孔を有するフィルタを通す(濾過する)ことにより、球状となった生体分子を除去する。
しかし、インターフェース分子として用いられる、タンパク質とは完全に区別できる形状の生体分子のみが混入された溶液を作成する。本実施形態においては、上記インターフェース分子として、生体分子由来のポリ−D−リジンを用いる。溶液は、純水中にポリ−D−リジンを溶解(1mg/ml)して、上述したようにフィルタリングを行ったものである。
そして、図2(b)に示すように、溶液を除去して、ポリ−D−リジンを静電的相互作用により生体分子修飾試料台1の表面に吸着させ、ポリ−D−リジンにより生体分子修飾試料台1の表面を分子修飾させる。
図3はAFMにより生体分子修飾試料台1の表面を観察した結果の画像(以下、AFM像)を示すものであるが、図3(a)に示すように、被修飾の生体分子修飾試料台1の表面は平坦であるが、図3(b)に示すように、分子修飾された生体分子修飾試料台1の表面はポリ−D−リジンが複数存在していることが判る。
また、ポリ−D−リジンは、正に荷電している状態にあり、生体分子修飾試料台1の表面に対し、静電的相互作用にて吸着している。
したがって、上記溶液のpHは、ポリ−D−リジンの等電点より低い値に調整されていることが必要である。
図4(a)から判るように、分子修飾を行っていない生体分子修飾試料台1においては、解析対象のタンパク質と生体分子修飾試料台1の表面との界面における相互作用が不十分であり、解析対象のタンパク質の生体分子修飾試料台1表面への密着性が悪い。このため、AFM観察を行う期間、解析対象のタンパク質を生体分子修飾試料台1の表面に固定させることができず、常にバッファー溶液に浮遊する状態であることが判る。
上述した構成により、生体分子修飾試料台1の表面をインターフェース分子により修飾してない従来例のように、膜タンパク質のように柔らかく、生体分子修飾試料台1の表面に対する密着性が低い試料を測定する際、AFMの探針が接触することにより、試料を生体分子修飾試料台1の表面から離脱させたり、固定が不十分のため、試料の固定位置の揺らぎを起こすと言うことが無くなるため、本実施形態のタンパク質機能解析装置は、従来例に比較してより高解像度のAFM像を得ることができる。
このとき、ポリ−D−リジンが正に荷電しており、解析対象のタンパク質が負に荷電した状態にあり、解析対象のタンパク質はポリ−D−リジンに対し、静電的相互作用にて吸着された状態にて固定されている。
ここで、バッファー溶液のpHは、解析対象のタンパク質とポリ−D−リジンとの間に十分な静電的相互作用を持たせるため、ポリ−D−リジン、すなわちインターフェース分子の等電点より低く、かつ測定対象タンパク質の等電点より高く設定(調整)しておく必要がある。
すなわち、解析対象のタンパク質をインターフェース分子を介して、生体分子修飾試料台1の表面に固定させることで、従来の方法では測定が困難な動的で柔らかいタンパク質を、その構造と機能とを維持した形態にて観察することができる。
上述した第1の実施形態と同様に、インターフェース分子を介して、生体分子修飾試料台1表面に解析対象のタンパク質を固定し、この解析対象のタンパク質の薬剤依存的な構造変化のAFM観察を行い、図5に示すAFM像を得た。
タンパク質、特に細胞膜に存在するチャネル(イオンチャネル)タンパクと呼ばれる一群のタンパク質には、特定の薬剤に対して反応し、チャネル中心にポア(イオンの通路となる孔)を形成し、これにより細胞外のイオンを細胞内に流入(取り込み)あるいはその逆の流出(吐き出し)の反応を引き起こす。
しかしながら、本実施形態においては、図5(a)に示す膜タンパク質の構造が薬剤依存的な構造変化により、図5(b)に示す状態に変化すること、すなわちポア形成及びサブユニット構造のAFM観察に成功した。
ここで、図5(a)及び図5(b)各々のAFM観察の位置は異なるが、薬剤刺激により膜タンパク質の構造が変化、すなわち膜タンパク質が図5(a)の塊状から、図5(b)の複数のサブユニットに分離した形状に変化している様子が観察できた。
したがって、本実施形態のように高解像度の画像を得るためには、数千枚から数万枚の画像データを平均化する処理が必要となる。
一方、本実施形態にて示した画像は、一回のスキャンにより、高解像度のものが得られていることが、図5から確認できる。
このように、本実施形態は、タンパク質などの生体分子のAFM観察に対し、非常に有効であることが判る。
上記第2の実施形態で記載したように、本発明においては従来に比較して非常に高解像度の膜タンパク質のAFM像を得ることができるが、よりS/N比を向上させて高解像度のAFM像を得るためには複数の画像データの平均化処理を行うことが必要である。
図6がAFM像の平均化処理を行った画像データを示しており、図6(a)が図5(a)の膜タンパク質のAFM像の平均化処理をしたものであり、図6(b)が図5(b)の膜タンパク質のAFM像の平均化処理をしたものである。
画像データにおける平均化の処理において、それぞれの画像データ中におけるタンパク質の画像部分を重ね合わせる必要がある。
一方、本実施形態においては、解析対象のタンパク質が無作為に生体分子修飾試料台1表面に固定されているわけではなく、静電的相互作用によって基板に吸着されて固定されている。
したがって、本実施形態によれば、解析用装置3は、AFM像の画像データにおけるタンパク質の画像の平均化処理を、AFM観察により得られたままの画像データを、データベース4から読み出して、各画像データの対応する画素毎の平均化することにより行う。
すなわち、解析用装置3は、各画像データの画素毎に検出値を加算し、加算した画像データの数により除算する計算を順次行うことにより、タンパク質の画像の平均化処理を行う。
第1から第2の実施形態にて得られた薬剤刺激等による時間変化におけるAFM像や、その画像データにおける解析対象のタンパク質の画像(タンパク質の構造)の変化あるいは変化量が正しいか否かを判断するために、変化あるいは変化量を定量的に判定する必要がある。
図7にを用いて上述した時間経過によるタンパク質の画像の変化及び変化量を定量的に判定する処理の流れを説明する。図7はタンパク質の画像の変化及び変化量の定量的処理を説明する概念図である。以下の処理は、解析用装置3が行う。
このトポログラフィー像は、各検出位置の凹凸の高さを検出強度にて表したものであり、生体分子修飾試料台1表面に、インターフェース分子を介して吸着されている各解析対象のタンパク質毎に生成される。
そして、解析用装置3は、上記トポログラフィー像各々から、それぞれのタンパク質の高さ及び幅を求め、図7(c)に示すように、全トポログラフィー像全体における高さと幅とのそれぞれのパラメータについてのヒストグラムを生成する
これにより、利用者は解析対象のタンパク質における高さ及び幅それぞれのパラメータ及びその変化量についての全体的な傾向を確認することができる。
また、解析用装置3は、横軸(X軸)を幅、縦軸(Y軸)を高さのパラメータとして、検出された各タンパク質を、対応する幅、高さの位置を座標としてプロット(配置)することにより、図7(d)に示す散布図を、薬剤刺激の無い場合と有る場合とでプロットのマークを異ならせ生成する。利用者はこの散布図からタンパク質のパラメータ及びその変化量についての全体的な傾向を確認することができる。
最終的には、図7(e)に示すコンピュータグラフィック(CG)画像にて、解析対称のタンパク質の構造変化をしめすこととなる。
これにより、各タンパク質の刺激の無い場合と有る場合と画像から、トポログラフィー像を生成することにより、タンパク質の種類毎の刺激に対する反応(構造の変化)を一分子レベル毎に定量的に解析・評価することができる。
また、図8(b)に示すように、種類毎に各タンパク質の幅及び高さのパラメータによる散布図を生成することにより、刺激の無い場合と有る場合とのタンパク質の構造の変化及び変化量の傾向を推定することができる。
本実施形態においては、各タンパク質がインターフェース分子により、それぞれ異なった位置に固定され、他の種類のタンパク質の干渉を抑制することができるため、個々のタンパク質の一分子単位の解析を行うことができる。
上述したような細胞を用いてタンパク質を発現する実験系においては、実際に解析したいタンパク質以外の種類のタンパク質も発現されている場合が多い。
このため、すでに述べたように従来の場合タンパク質が固定されずに浮遊する可能性も高く、従来例においては他のタンパク質を介した2次的な作用が解析結果に混入してしまう可能性がある。
しかしながら、本実施形態においては、解析に必要な時間、生体分子修飾試料台1表面に十分吸着されて固定されているため、解析対象のタンパク質を同定して、解析対象のタンパク質のみの解析を行うことが可能である。
上述したような一種類のタンパク質の他の分子との相互作用を検出するスクリーニング系が存在しているものの、本実施形態のように、直接に一分子単位の構造変化の挙動を観察できる訳ではない。
また、上述したスクリーニング系においては、多数のタンパク質の反応から、全体の平均的な反応を観察するため、本実施形態のように、複数の異なる種類のタンパク質を同時に観察することはできない。
上述したように、本実施形態によれば、生体分子修飾試料台1表面にインターフェース分子を介して固定されたタンパク質、すなわち一分子単位の挙動を直接AFM像として捉えることにより、混合状態においてどのサブユニットの組成及び構造が薬剤刺激に反応するかという、従来技術にては判定が困難であった情報を得ることができる。
2…走査プローブ顕微鏡装置
3…解析用装置
4…データベース
Claims (4)
- 測定対象である測定対象タンパク質の高さ、幅、部分構造間の距離を含む構造情報を、溶液内にて解析するタンパク質機能解析装置であり、
静電的相互作用にて、表面がインターフェース分子により分子修飾された基板と、
前記構造情報を測定する測定装置と
を有し、
前記インターフェース分子に対し、静電的相互作用により前記測定対象タンパク質を結合させることを特徴とするタンパク質機能解析装置。 - 前記測定装置が前記インターフェース分子に結合した測定対象タンパク質毎に前記構造情報を測定することを特徴とする請求項1記載のタンパク質機能解析装置。
- 前記溶液のpHをインターフェース分子の等電点より低く、かつ測定対象タンパク質の等電点より高く設定することを特徴とする請求項1または請求項2に記載のタンパク質機能解析装置。
- 前記インターフェース分子として、ポリ−D−リジンを用いることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれかに記載のタンパク質機能解析装置。
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JP2019095243A (ja) * | 2017-11-20 | 2019-06-20 | 国立大学法人金沢大学 | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0723796A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-27 | Hitachi Ltd | 細胞内試料サンプリング及び分析方法 |
JPH10123031A (ja) * | 1996-10-23 | 1998-05-15 | Canon Inc | 観察試料の基板への固定方法 |
JPH11503022A (ja) * | 1995-04-03 | 1999-03-23 | ニューヨーク ユニバーシティー | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
JP2004198408A (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-15 | Carl Zeiss Jena Gmbh | 顕微鏡用検査標本 |
WO2004092712A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | 分子の検出方法、分子の計数方法、分子局在化の検出方法、及びこれらに用いる分子検出装置 |
JP2005043312A (ja) * | 2003-07-25 | 2005-02-17 | Toyo Kohan Co Ltd | 真空パック固体支持体アレイ及びその製造方法 |
JP2006017578A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Canon Inc | 複数のリガンドを用いた蛋白質分析方法 |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0723796A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-27 | Hitachi Ltd | 細胞内試料サンプリング及び分析方法 |
JPH11503022A (ja) * | 1995-04-03 | 1999-03-23 | ニューヨーク ユニバーシティー | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
JPH10123031A (ja) * | 1996-10-23 | 1998-05-15 | Canon Inc | 観察試料の基板への固定方法 |
JP2004198408A (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-15 | Carl Zeiss Jena Gmbh | 顕微鏡用検査標本 |
WO2004092712A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | 分子の検出方法、分子の計数方法、分子局在化の検出方法、及びこれらに用いる分子検出装置 |
JP2005043312A (ja) * | 2003-07-25 | 2005-02-17 | Toyo Kohan Co Ltd | 真空パック固体支持体アレイ及びその製造方法 |
JP2006017578A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Canon Inc | 複数のリガンドを用いた蛋白質分析方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019095243A (ja) * | 2017-11-20 | 2019-06-20 | 国立大学法人金沢大学 | 高速原子間力顕微鏡による細胞小器官の観察のための試料の調製方法 |
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