JP2008546399A5

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Publication number: JP2008546399A5
Application number: JP2008517535A
Authority: JP
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2013-04-25
Anticipated expiration: 2026-06-21

Description

さらに、本発明者らは、ＳＭＶのサブゲノムプロモーターの制御下で異種配列を導入するためにこの構築物を用いた。本発明者らは、この配列がこの構築物によって感染した細胞内で発現することと、この配列を含んだウイルスゲノムが通常、ウイルス粒子にパッケージングできることを見出した。

また、宿主細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼ、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターを使うこともできる。それは、ウイルスプロモーター、たとえば、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウイルス）、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＭｏＭＬＶプロモーター（モロニーマウス白血病ウイルス）などのような、哺乳動物の細胞内で異種遺伝子を発現させるために一般的に用いられているものの一つとすることができる。また、真核生物のプロモーター、たとえば、ＡＬＯＮＳＯｅｔａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ，２１，１５９１−１６００，２００３）に記載されているような魚のプロモーターとすることもできる。

本発明にしたがった組換えＤＮＡは、選択されたサケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡを逆転写することで得られたｃＤＮＡから容易に構築することができる。必要なら、本発明にしたがった組換えＤＮＡについて計画されている利用法に応じて、このｃＤＮＡにさまざまな修飾を行うことができる。たとえば、一つまたは複数の制限部位の導入、ウイルスゲノムの一部の削除、とりわけ、該ウイルスの複製に必要ではない部分の削除（たとえば、構造タンパク質をコードする領域の全部または一部）、ウイルス配列の重複、異種配列の導入などである。また、これらのアルファウイルスの特性、たとえば該アルファウイルスの感染力、病原性または抗原性に対する効果をテストするための変異であってもよい。

とりわけ、本発明は、サケ科魚類のアルファウイルスから、他のアルファウイルスからすでに構築されている発現ベクター（たとえばＦＲＯＬＯＶｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１３７１−１１３７７，１９９６参照）に類似した構造の発現ベクターを構築することを可能にする。これらの発現ベクターは二つの主要なタイプとすることができ、該二つの主要なタイプとは、
−複製する能力と、自身に導入される異種配列を発現させる能力、そして、新しいウイルス粒子を産生するためにパッケージングされる能力をもったベクターであり、一般的には、サブゲノムプロモーターのコピーの制御下に置かれた有益な異種配列をアルファウイルスの完全なゲノムに導入することで該アルファウイルスの完全なゲノムから得られるベクターと、
−複製する能力と、自身に導入される異種配列を発現する能力は持っているが、新しいウイルス粒子を産生する能力は持たないベクターであり、一般的には、構造タンパク質をコードするアルファウイルスのゲノム領域を、有益な異種配列で置換することによって得られるものであり、たとえば、これらのタンパク質を発現する補助のベクターを宿主細胞に導入することにより、または、宿主細胞として、これらのタンパク質を発現する発現カセットによって安定的に形質転換された細胞株を利用することにより、構造タンパク質が宿主細胞内にトランスで存在するときにだけ、ウイルスのパッケージングが行われるベクターである。

本発明にしたがった組換えＤＮＡは、サケ科魚類のアルファウイルスのサブゲノムプロモーターの制御下で、有益な異種配列を発現させるために用いることができる。この場合、サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡインサートは、一つまたは複数の発現カセットを含んでおり、該発現カセットのそれぞれは、前記サブゲノムプロモーターのコピーと、前記サブゲノムプロモーターの下流かつ該プロモータの転写制御下に、発現させようとする異種配列またはこの配列の導入を可能にするクローニング部位を含んでいる。

異種配列は、有益なタンパク質をコードする配列、あるいは、たとえばアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡのような、ＲＮＡに転写された有益な配列とすることができる。

異種遺伝子を発現する感染性組換えＳＭＶ構築物
ＧＦＰを発現する感染性の組換えウイルスを産生するため、感染性のｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−Ｔ７ｔを二つの異なる様式で修飾することで、ＧＦＰを発現する追加の発現カセットを導入した。

これらの結果は、ＳＭＶが、野生型ウイルスのゲノムよりも２０％以上長い異種核酸を含みうることを示している。

Claims

サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムに由来し、
−転写プロモーター、
そして該プロモーターの下流に、かつ該プロモーターの転写制御下に、
−少なくとも５個のヌクレオチドからなるスペーサー配列と、
−サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ、
を含んでいる組換えＤＮＡであり、
スペーサー配列が、
５’ Ｘ ₁ ＣＴＧＡＮＧＡＲＸ ₂ Ｂ ₂ Ｘ’ ₂ ＹＧＡＡＡＸ ₃ Ｂ ₃ Ｘ’ ₃ ＴＨ３’ （Ｉ）、
という一般式（Ｉ）によって定義され、
該式において、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣは通常の意味を有し、Ｈは、Ｃ、ＴまたはＡを表し、ＹはＡまたはＧを表し、ＲはＣまたはＴを表し、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、Ｘ ₁ は、前記アルファウイルスのゲノムの５’末端の配列に相補的な配列の、少なくとも３個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ ₂ は、任意の配列の、少なくとも３個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ ₂ は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ’ ₂ はＸ ₂ に相補的なオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ ₃ は、任意の配列の、少なくとも２個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ ₃ は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、そしてＸ’ ₃ は、Ｘ ₃ に相補的なオリゴヌクレオチドを表していることを特徴とする、組換えＤＮＡ。
サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡインサートが一つまたは複数の発現カセットを含んでおり、該発現カセットのそれぞれが、前記サブゲノムプロモーターのコピーと、前記サブゲノムプロモーターの下流かつ該プロモーターの転写制御下に、発現させようとする異種配列またはこの配列の導入を可能にするクローニング部位を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ。
サケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコンの調製方法であり、宿主細胞に、請求項１または請求項２に記載の組換えＤＮＡをインビトロで導入することと、前記宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする方法。
請求項３に記載の方法によって得ることのできる、弱毒化したサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコン。
サケ科魚類の組換えアルファウイルスの調製方法であり、請求項１または請求項２に記載の組換えＤＮＡまたは請求項４に記載のＲＮＡレプリコンを、自身のパッケージングに不可欠な前記アルファウイルスの構造タンパク質の全てが発現する宿主細胞にインビトロで導入することと、前記宿主細胞を培養することを含む方法。
前記構造タンパク質の発現を可能にする全遺伝情報が前記組換えＤＮＡまたは前記ＲＮＡレプリコンに保持されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
前記構造タンパク質の発現を可能にする遺伝情報の全部または一部が宿主細胞によってトランスで提供されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
請求項５〜請求項７のいずれか一つに記載の方法によって得ることのできる、弱毒化したサケ科魚類の組換えアルファウイルス。
請求項１もしくは請求項２に記載の組換えＤＮＡ、請求項４に記載の弱毒化したサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコン、または、請求項８に記載の弱毒化したサケ科魚類の組換えアルファウイルスの、ワクチンを得るための利用方法。
請求項８に記載の弱毒化したサケ科魚類の組換えアルファウイルスを含むワクチン。