JP2008542702A - Water monitoring system - Google Patents
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Abstract
本発明は、給水中に含まれる汚染物質を検出するために、連続的にリアルタイムで給水を監視するための、連続水監視システムとその構成部材及びそのための方法に関する。本システムは、生物発光バクテリアの培地と適切な光検出手段の使用により作動される。
【選択図】なしThe present invention relates to a continuous water monitoring system, its components, and a method therefor for continuously monitoring water supply in real time to detect contaminants contained in the water supply. The system is operated through the use of a bioluminescent bacterial medium and appropriate light detection means.
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Description
本発明は水の汚染物質を監視するための方法、および水の汚染物質を監視するための装置とその構成部品に関する。本発明は、居住用の建造物又は住居における給水を監視する特定の用途を有しているが、工業プラントに入る前又は入った後のいずれの工業用水の監視にも関連する。さらに、本発明は自然の川や小川、池、貯水池、さらに海水といった自然環境の水の監視にも関する。 The present invention relates to a method for monitoring water contaminants, an apparatus for monitoring water contaminants and components thereof. The present invention has particular application for monitoring water supply in residential buildings or residences, but relates to monitoring industrial water either before or after entering an industrial plant. Furthermore, the present invention also relates to the monitoring of natural environmental waters such as natural rivers, streams, ponds, reservoirs, and seawater.
水質の監視に関する関心は先進国全体で高まっており、世界中で重要な安全問題となってきている。このため、水源の毒性試験は大変重要な課題となっており、精度が上がった場合には、リアルタイムの連続した結果が大きな関心となる。マイクロトックス（ＭｉｃｒｏＴＯＸ）と呼ばれる現在の市場の先端技術は、およそ３０分で結果が得られ、フリーズドライ（凍結乾燥）源から活性化させたバクテリアを利用する、研究用のバッチ（回分）式システムである。 Interest in water quality monitoring is growing throughout developed countries and has become an important safety issue worldwide. For this reason, toxicity testing of water sources has become a very important issue, and real-time continuous results are of great interest when accuracy increases. A state-of-the-art technology on the market called MicroTOX is a research batch system that uses bacteria activated from a freeze-dried source that yields results in approximately 30 minutes. It is.
さらに、米国環境保護庁（US Environmental Protection Agency）は最近、飲料水の質を監視し評価するための早期の警告システムとして作動する技術や方法を評価するという報告を作成した。当該報告は上記目的に適したシステムの提供の必要性があると結論し、先進国世界において、ビルや住居だけでなく、給水の連続監視がテロリストの活動の抑止として作用したり、何かの理由で給水が汚染された場合に個人の生命を守ったりするというような、広範な状況において配置することができるリアルタイムの連続的な水監視システムを提供することが必要とされている、という我々の考えを支持している。 In addition, the US Environmental Protection Agency recently created a report evaluating technology and methods that act as an early warning system to monitor and evaluate the quality of drinking water. The report concludes that there is a need to provide a system suitable for the above purpose, and in the developed world, not only buildings and residences, but continuous monitoring of water supply acts as a deterrent to terrorist activities, We need to provide a real-time continuous water monitoring system that can be deployed in a wide range of situations, such as protecting the lives of individuals if the water supply is contaminated for reasons I support the idea.
また、少なくとも、それ以上のさらなるテストに先行して、あるいはその代りに、最初の水質の指標を提供するために、研究所において使用するためのリアルタイムの連続した水監視システムを提供する必要がある。 There is also a need to provide a real-time continuous water monitoring system for use in the laboratory to provide an initial water quality indicator, at least prior to or in lieu of further further testing. .
連続水監視システムは連続して動作する検出器が必要である。さらに、検出器は汚染物質、特に健康そして生物にとって危険な汚染物質の範囲に反応する必要がある。給水の監視に水中脊椎動物を使用することが知られているが、これは、少なくとも、商業的に実現可能なスケールにおいて脊椎動物の数を維持するという観点において問題がある。 Continuous water monitoring systems require a continuously operating detector. Furthermore, the detector needs to react to a range of contaminants, especially those that are dangerous to health and organisms. Although it is known to use underwater vertebrates for water supply monitoring, this is problematic at least in terms of maintaining the number of vertebrates on a commercially viable scale.
我々は、そのため発光バクテリアを使用するシステムを完成させた。多くの生物発光するバクテリアはブルー‐グリーンの光を発し、黄色の光を発するものもある。これらの種は無害である。ビブリオ・フィシェリ（Vibrio Fischeri）は生物発光する海中バクテリアであり、通常魚に寄生している。 We have therefore completed a system that uses luminescent bacteria. Many bioluminescent bacteria emit blue-green light and some emit yellow light. These species are harmless. Vibrio Fischeri is a bioluminescent marine bacterium that usually parasitizes fish.
このバクテリアは、グラム陰性の細胞壁を有し、鞭毛によって運動し、細胞は曲った棒の形をしている。ビブリオ（Vibrio）属のバクテリアはイカ、線虫、微生物との関連で、そして線虫を餌とする昆虫との関連で発見されている。共生関係により魚のポケットの中で集まっているものもいる。その魚は、発光バクテリアにより発光する。 This bacterium has a Gram-negative cell wall, is moved by flagella, and the cells are in the form of bent bars. Vibrio spp. Bacteria have been found in association with squid, nematodes, microorganisms, and in relation to insects that feed on nematodes. Some are gathered in the pockets of fish due to symbiotic relationships. The fish emits light by the luminescent bacteria.
発光が起こるのは、バクテリアの細胞の、アルデヒド、酵素、酸素、そしてリボフラビンの別の形態を含む電子伝達系のためである。分離されたビブリオは通性嫌気性菌であるが、Ｏ２が存在する場合にのみ生物発光する。いくつかの要素がバクテリアの生物発光に必要であり、それは、ルシフェラーゼ酵素、長鎖脂肪族アルデヒド、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、そしてＯ２である。一次電子供与体（primary electron donor）はＮＡＤＨであり、電子はＦＭＮを経由してルシフェラーゼに移動する。その反応は以下のように表わされる。 Luminescence occurs because of the electron transport system in bacterial cells, including aldehydes, enzymes, oxygen, and other forms of riboflavin. The isolated vibrio is a facultative anaerobe, but bioluminescent only when O 2 is present. Some elements are required to bioluminescent bacteria, which, luciferase enzyme, long-chain aliphatic aldehydes, flavin mononucleotide (FMN), and a O 2. The primary electron donor is NADH, and electrons are transferred to luciferase via FMN. The reaction is expressed as follows:
ＦＭＮＨ２＋Ｏ２＋ＲＣＨＯ → ＦＭＮ＋ＲＣＯＯＨ＋Ｈ２Ｏ＋ｌｉｇｈｔ
（Luciferase）
発光系は、キノンやシトクロムのような他の電子伝達体を含まない、ＦＭＮＨ２からＯ２へ電子が短絡するバイパス経路を構成している。
FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + light
(Luciferase)
The light-emitting system constitutes a bypass path in which electrons are short-circuited from FMNH 2 to O 2 and do not include other electron carriers such as quinone and cytochrome.
ルシフェラーゼ酵素は自己誘導機構（autoinduction）と呼ばれる特徴的な合成の制御（regulatory synthesis）を示す。生物発光バクテリアは、培地での成長の間に蓄積するオートインデューサー（autoinducer）という特別な物質を産生し、この物質の量が臨界値に達した時、酵素の導入が起こる。V. Fischeri中のオートインデューサーはＮ-β-ケトカプロイルホモセリンラクトン（N-β-ketocaproylhomoserine lactone）であると特定された。そのため、低い細胞密度での生物発光バクテリアの培地は生物発光しないが、オートインデューサーが蓄積して機能できるような高密度に達すると、生物発光するようになる。自己誘導現象により、海水中の自由生活性の生物発光バクテリアは、オートインデューサーが蓄積できないであろうから、生物発光しないであろうことが明らかであり、生物発光は高密度に発達するのに好ましい状況である場合にのみ発生する。なぜ生物発光が自由生活性のバクテリアの密度依存性であるのかは明らかでないが、共生系統の生物発光バクテリアにおいて、密度依存性の生物発光であることの根拠は明らかである。すなわち、生物発光は、魚の発光器官において光が見える程に十分高密度であるときにのみ生じる。 The luciferase enzyme exhibits a characteristic synthesis control called autoinduction. Bioluminescent bacteria produce a special substance called an autoinducer that accumulates during growth in the medium, and when the amount of this substance reaches a critical value, the introduction of the enzyme occurs. The autoinducer in V. Fischeri has been identified as N-β-ketocaproylhomoserine lactone. For this reason, a bioluminescent bacterial medium at low cell density does not bioluminescence, but bioluminescence occurs when it reaches a high density that allows the autoinducer to accumulate and function. Due to the self-induction phenomenon, it is clear that free-living bioluminescent bacteria in seawater will not bioluminescence because autoinducers will not accumulate and bioluminescence will develop at high density. Occurs only in favorable situations. It is not clear why bioluminescence is density-dependent for free-living bacteria, but the basis for density-dependent bioluminescence is clear in symbiotic bioluminescent bacteria. That is, bioluminescence occurs only when the density is high enough to see light in the fish's luminescent organs.
生物発光についての多くの新しい情報は、この過程の発生についての研究から現れてきている。いくつかのluxオペロンは生物発光のビブリオ種中で確認され、鍵構造遺伝子がクローン化され、配列化された。luxＡとluxＢの遺伝子は、バクテリアルシフェラーゼのａおよびｂのそれぞれのサブユニットの遺伝暗号を指定する。luxＣとluxＤとluxＥの遺伝子は、生物発光反応において、および生物発光系の必要な脂肪酸の生成と活性化において機能する、ポリペプチドの遺伝暗号を指定する。 Much new information about bioluminescence has emerged from studies on the occurrence of this process. Several lux operons have been identified in bioluminescent Vibrio species, and key structural genes have been cloned and sequenced. The luxA and luxB genes specify the genetic code of each subunit of bacterial luciferase a and b. The luxC, luxD, and luxE genes specify the polypeptide genetic code that functions in bioluminescent reactions and in the production and activation of the necessary fatty acids of the bioluminescent system.
そのため、我々は、広範囲の毒性汚染物質に反応する検出システムを提供するために、生物発光バクテリアの特徴を有効に開発して最適化した。これらの汚染物質の検出のための試験基準は、典型的に少なくともある一定時間経過後に計測された発光の減少量である。さらに、ビブリオ・フィシェリなどの研究所での毒性バッチ（回分）分析に通常用いられるバクテリアの種類が好ましい。 Therefore, we have effectively developed and optimized the characteristics of bioluminescent bacteria to provide a detection system that reacts to a wide range of toxic contaminants. A test criterion for the detection of these contaminants is typically a reduction in luminescence measured at least after a certain period of time. Furthermore, the type of bacteria usually used for toxic batch (batch) analysis in laboratories such as Vibrio Fischeri is preferred.
上に示したように、我々の課題は、連続監視システムを提供するために、このバクテリアの数を連続的、回生的に維持することであった。そのため、我々の発明は、ｉ）生存しているバクテリアおよび再生状態のバクテリアの数を維持する発酵槽と、ｉｉ）オンライン監視システムの製造を含む。オンラインという表現は、監視する水の供給を連続的に採取するシステムを意味している。建造物において、水道水供給のサンプルを我々のオンライン監視システムに迂回することも含む。 As indicated above, our challenge was to maintain this bacterial number continuously and regeneratively to provide a continuous monitoring system. Therefore, our invention involves the production of i) fermenters that maintain the number of live and regenerated bacteria, and ii) on-line monitoring systems. The expression online means a system that continuously collects the monitored water supply. Also includes diverting a sample of tap water supply to our online monitoring system in the building.
その技術分野において、供給される水の汚染物質を検出する、連続的なオンライン監視システムを作成するいくつもの研究が行われてきたが、我々が初めてこの目的を達成する。 In that technical field, a number of studies have been conducted to create a continuous online monitoring system that detects contaminants in the supplied water, and we achieve this goal for the first time.
正常に機能するシステムにするために、いくつもの変数の釣り合いをとる必要があったため、我々の研究は困難であった。さらに、バクテリアの数を支え、必要とされる性質の仕様での新鮮なバクテリアの、オンライン監視システムに対する供給を連続的に行う仕様を作成するために、そのシステムの詳細な調整について実験をする必要があった。 Our study was difficult because it was necessary to balance a number of variables in order to make the system work properly. In addition, it is necessary to experiment with the detailed adjustments of the system to create a specification that supports the number of bacteria and continuously supplies fresh bacteria to the online monitoring system with specifications of the required properties. was there.
我々の試みの結果として、供給される水に含まれる汚染物質の存在を、リアルタイムで測定するための、連続的なオンラインの水監視システムを作成することに成功した。 As a result of our efforts, we have succeeded in creating a continuous online water monitoring system to measure the presence of contaminants in the supplied water in real time.
本発明の第１の態様によれば、
ａ）水道又は自然給水源からのサンプルの水（以下、「サンプル水」とする）をテストチャンバー（a test chamber）に供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽（a bioreagent fermenter）と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
前記光検出手段は前記サンプル水と接触する前後の前記生物試薬の発光特性を測定し、前記サンプル水との接触後に前記発光特性に変化があった場合には、（水監視システムは）前記サンプル水が汚染物質を含んでいたと記録することを特徴とする連続水監視システムを提供する。
According to a first aspect of the invention,
a) a supply pipe for supplying sample water from a water supply or natural water source (hereinafter referred to as “sample water”) to a test chamber;
b) a test chamber; and c) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply a luminescent bioreagent cultured in the bioreagent fermentor to the test chamber;
d) at least light detection means associated with the test chamber to measure luminescence from the biological reagent;
e) a continuous water monitoring system for detecting contaminants in the feed water comprising the sample water and a drain for removing the biological reagent from the test chamber;
The light detection means measures the light emission characteristics of the biological reagent before and after contact with the sample water, and if there is a change in the light emission characteristics after contact with the sample water (the water monitoring system) A continuous water monitoring system is provided that records that the water contained contaminants.
本発明の第２の態様によれば、
ａ）水道又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するための、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
ｆ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に、前記サンプル水の調整を行うためのサンプル水調整手段を備えることを特徴とする連続水監視システムが提供される。
According to a second aspect of the invention,
a) a supply pipe for supplying sample water from a water supply or natural water source to the test chamber;
b) a test chamber;
c) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply a luminescent bioreagent cultured in the bioreagent fermentor to the test chamber;
d) at least light detection means associated with the test chamber for measuring luminescence from the biological reagent;
e) a continuous water monitoring system for detecting contaminants in the feed water comprising the sample water and a drain for removing the biological reagent from the test chamber;
f) A continuous water monitoring system is provided, comprising sample water adjustment means for adjusting the sample water before supplying the sample water to the test chamber.
本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態においては、光検出手段が前記テストチャンバーのみと関連付けられ、生物試薬のサンプルは前記テストチャンバーに収容され、発光の測定はサンプル水と混合される前に行われる。さらに又は代わりに、上記光検出手段若しくは別の光検出手段は、前記生物試薬発酵槽、又は生物試薬発酵槽から延びる管に関連しており、サンプル水が加えられた後に行われる前記生物試薬の発光特性の測定に加えて、生物試薬がテストチャンバーに入る前に前記生物試薬の発光特性を測定することができる。したがって、前記光検出手段は、前記テストチャンバーと前記生物試薬を前記生物試薬発酵槽から前記テストチャンバーに送給するための手段のいずれか又は両方に付随する単一の手段か、あるいは、少なくとも一つの光検出手段が前記テストチャンバーに付随し、少なくとも別の光検出手段が生物試薬を前記生物試薬発酵槽から前記テストチャンバーに移送するための手段に付随することで構成される複数の光検出手段で構成される。 In a preferred embodiment of any aspect of the invention, a light detection means is associated only with the test chamber, a sample of biological reagent is contained in the test chamber, and a luminescence measurement is performed before mixing with the sample water. Done. Additionally or alternatively, the light detection means or another light detection means is associated with the biological reagent fermenter or a tube extending from the biological reagent fermenter, wherein the biological reagent is performed after sample water has been added. In addition to measuring the luminescent properties, the luminescent properties of the biological reagent can be measured before the biological reagent enters the test chamber. Accordingly, the light detection means may be a single means associated with either or both of the test chamber and the means for delivering the biological reagent from the biological reagent fermentor to the test chamber, or at least one A plurality of light detection means, wherein one light detection means is associated with the test chamber, and at least another light detection means is associated with the means for transferring a biological reagent from the biological reagent fermenter to the test chamber. Consists of.
本発明の第２の態様では、サンプル水調整手段は、生物試薬が生体適合するようにサンプル水の特性を変化させるものである。最も好ましくは、生物試薬が生体適合するため、そして、一般的に、サンプル水の塩分を変化させるために、サンプル水調整手段はサンプル水のイオン強度を変化させる。さらに、有利には、サンプル水調整手段は少なくとも一つの選択されたイオンのイオン濃度も変化させ、そして、最も好ましくは、供給される水の供給源での塩素処理、クロラミンによる消毒処理、オゾン処理により発生する、抗菌性物質を除去する。 In the second aspect of the present invention, the sample water adjusting means changes the characteristics of the sample water so that the biological reagent is biocompatible. Most preferably, the sample water conditioning means changes the ionic strength of the sample water in order for the biological reagent to be biocompatible and generally to change the salinity of the sample water. Furthermore, advantageously, the sample water conditioning means also changes the ion concentration of at least one selected ion, and most preferably chlorination at the source of the supplied water, disinfection with chloramine, ozone treatment Remove antibacterial substances generated by
本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、生物試薬は発光バクテリアの群であり、特に、生物発光バクテリアである。このバクテリアは、本発明のシステムにおいて作用するために必要な性質と、特に、必要な発光特性と汚染物質に対する感度の両方又はいずれかを有するような、自然に存在している、又は、遺伝子組換えにより又は遺伝子的に作り出され得るものである。さらにより好ましくは、本発明の水監視システムでの使用に適した生物試薬は、発光バクテリア種、ビブリオ（Vibrio）種、ゼノラブダス（Xenorhabdus）種、又は実際には発光するように操作された任意のバクテリアのうち、いずれか一つ又はそれ以上を含むものである。 In a preferred embodiment of any aspect of the invention, the bioreagent is a group of luminescent bacteria, in particular a bioluminescent bacterium. This bacterium is naturally occurring or has a gene set that has the properties necessary to work in the system of the present invention and, in particular, the required luminescent properties and / or sensitivity to contaminants. It can be produced by replacement or genetically. Even more preferably, a biological reagent suitable for use in the water monitoring system of the present invention is a luminescent bacterial species, Vibrio species, Xenorhabdus species, or any actually engineered to emit light. It contains any one or more of bacteria.
最も典型的には、バクテリアは発光特性の減少を示す方法により汚染物質に対して反応するように選別される。これは、最も典型的には、バクテリアの集団が減少又は死滅するためである。しかし、本発明の別の実施形態では、特定の汚染物質の存在に対する反応として、強い発光をするバクテリアを使用することもできる。この例においては、バクテリアの集団は、生物栄養（bionutrients）を検出しているのかもしれない。 Most typically, bacteria are screened to react to contaminants by a method that exhibits reduced luminescent properties. This is most typically due to a decrease or death of the bacterial population. However, in another embodiment of the invention, bacteria that emit intense light may be used in response to the presence of certain contaminants. In this example, the bacterial population may be detecting bionutrients.
上記構成が、汚染物質のテストのために、サンプル水と生物試薬のサンプルとを混合可能なテストチャンバーを提供することは、当業者にとって明白であろう。テストが行われた後に、混合された溶液はテストチャンバーから排出管を経由して除去され、システムから完全に排出される。同時に、又はその直後に、又はあらかじめ決められた時間後に、更なる生物試薬と更なるサンプル水がテストチャンバーに供給され、汚染物質の検出が繰り返し行われる。このように、サンプル水を連続して監視することが可能である。 It will be apparent to those skilled in the art that the above configuration provides a test chamber capable of mixing sample water and biological reagent samples for contaminant testing. After the test is performed, the mixed solution is removed from the test chamber via a drain tube and completely drained from the system. At the same time, immediately thereafter, or after a predetermined time, additional biological reagents and additional sample water are supplied to the test chamber and the detection of contaminants is repeated. In this way, it is possible to monitor the sample water continuously.
本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、分割手段は、分割される方式で水源が採取されるように提供され、これにより分割した水は、採取するために分離されることを意味している。最も典型的なものとしては、あらかじめ決められた間隔で気泡を挿入することによりこの分割を行った。 In a preferred embodiment of any aspect of the present invention, the dividing means is provided such that the water source is collected in a divided manner, which means that the divided water is separated for collection. ing. Most typically, this division was performed by inserting bubbles at predetermined intervals.
本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、ポンプ手段は前記サンプル水と生物試薬のサンプルのいずれか又は両方をシステム中に流すために設置される。 In a preferred embodiment of any aspect of the present invention, a pumping means is installed to flow either or both of the sample water and biological reagent sample into the system.
本発明のいずれかの態様のさらに好ましい実施形態においては、前記発酵槽は連続培養システムである。我々の連続培養システムは一定の体積を有する、すなわち新しい培地の連続した流入分と、使用済みの培地とが、理想的には一定の割合で連続して除去される。いったん連続培養システムが定常状態（平衡）に達すると、細胞の数と栄養の状態が一定となる。連続培養システムの他の種類があり、我々のある場合には、（バクテリアの）集まりの密度と培地の成長率の両方をコントロールするケモスタット（a chemostat/恒成分培養槽）として、発酵槽が動作するよう決定したものであった。 In a further preferred embodiment of any aspect of the invention, the fermentor is a continuous culture system. Our continuous culture system has a constant volume, i.e. a continuous inflow of fresh medium and spent medium is ideally removed continuously at a constant rate. Once the continuous culture system reaches steady state (equilibrium), the number of cells and the state of nutrition are constant. There are other types of continuous culture systems, and in our case, the fermenter operates as a chemostat that controls both the density of the (bacteria) population and the growth rate of the medium. It was decided to do.
成長は集団における微生物細胞（生体量）の数の増加量で定義される。微生物細胞は自身を複製することのできる合成装置である。一つの独立した細胞は、新しい二つの細胞（対の分体）に細胞分裂するまで成長し続ける。この周期の間、細胞の全ての構造的な構成要素が二倍になる。バクテリアにおいて完全な成長周期のために必要な時間は、極めて変動しやすく、栄養面および細胞面の両方の多数の要因に依存する。成長率は、単位時間当たりの細胞数又は細胞の重量の変化を測定したパラメータである。どのような生物（有機体）の発生時間も使用される成長培地や実施される培養状況における程度に依存するということに留意する必要がある。 Growth is defined as the increase in the number of microbial cells (biomass) in a population. Microbial cells are synthesizers that can replicate themselves. One independent cell continues to grow until it divides into two new cells (paired halves). During this cycle, all structural components of the cell are doubled. The time required for a complete growth cycle in bacteria is highly variable and depends on many factors, both trophic and cellular. The growth rate is a parameter obtained by measuring a change in the number of cells per unit time or the weight of the cells. It should be noted that the generation time of any organism (organism) depends on the extent of the growth medium used and the culture conditions performed.
最も有利であるのは、発酵槽は、発酵槽の栄養供給源の方向に生物膜（biofilms）が成長することを妨げるための、成長防止装置を有する。典型としては、成長防止装置はバクテリアが発酵槽から栄養供給管内に進行していくことを阻止する障壁を備え、簡単には栄養供給管の終端がバクテリアの培地から隔離している間隙を備える。発酵槽は、バクテリアの集団が接する新鮮な空気の供給を維持するために、空気の流入部と排出部も備えている。培地のオーバーフロー管も、発酵槽の内部の培地を一定の量に保つために設置される。 Most advantageously, the fermentor has a growth prevention device to prevent biofilms from growing in the direction of the fermenter's nutrient source. Typically, the growth prevention device includes a barrier that prevents bacteria from progressing from the fermenter into the nutrient supply tube, and simply includes a gap where the end of the nutrient supply tube is isolated from the bacterial medium. The fermenter also has an air inlet and outlet to maintain a supply of fresh air in contact with the bacterial population. A medium overflow tube is also installed to maintain a constant amount of medium inside the fermenter.
好ましくは、発酵槽に対して又は発酵槽から延びる管は、微生物の成長を妨げ、殺菌効果を有する銀のような材料、又は添加物として含む材料、で形成される。この供給管又はオーバーフロー管の特徴は、管の内部での生物膜の成長を排除する、又は確実な減少をもたらす。 Preferably, the tube extending to or from the fermenter is formed of a material such as silver or an additive that prevents microbial growth and has a bactericidal effect. This feed tube or overflow tube feature eliminates or provides a definite reduction of biofilm growth within the tube.
本発明の好ましい実施形態においては、発酵槽をケモスタットとして作動させている。しかしながら、例えばルミノスタット(luminostat)やタービドスタッ卜（turbidostat）として作動することもできる。 In a preferred embodiment of the present invention, the fermenter is operated as a chemostat. However, it can also operate as, for example, a luminostat or a turbidostat.
ケモスタットのコントロールには二つの重要な要因がある。それは、希釈率と制限栄養素（a limiting nutrient）の濃度である。ケモスタット型の発酵槽の一つの主な利点の一つは、成長率と細胞密度とを互いに独立して制御できることである。成長率は、希釈率を調整することにより制御され、細胞密度は、制限された量の中での栄養の濃度を変化させることにより制御される。 There are two important factors in chemostat control. It is the dilution rate and the concentration of a limiting nutrient. One major advantage of a chemostat-type fermenter is that the growth rate and cell density can be controlled independently of each other. Growth rate is controlled by adjusting the dilution rate, and cell density is controlled by changing the concentration of nutrients in a limited amount.
希釈率は広範囲に成長率を調整する、つまり、ケモスタットにおいて単に希釈率を変化させることにより、どのような所望の成長率であっても得ることができる。しかし、非常に低いそして非常に高い希釈率において、システムの平衡が取れなくなってしまう。高希釈率においては、その希釈を維持するのに十分な速度で成長することができず、培地が発酵槽から洗い出されてしまう。一方、非常に低い希釈率においては、細胞の代謝を維持しうるのに十分な速さで、制限栄養物質が添加されないため、大量の細胞が餓死してしまう。同様に、集団の密度は、蓄えられた培地の単一の栄養素の濃度を変化させることにより、設定することができる。 The dilution rate can be obtained at any desired growth rate by adjusting the growth rate over a wide range, that is, by simply changing the dilution rate in the chemostat. However, at very low and very high dilution rates, the system becomes unbalanced. At a high dilution rate, the medium cannot be grown at a rate sufficient to maintain the dilution and the medium is washed out of the fermentor. On the other hand, at a very low dilution rate, a large number of cells are starved to death because no limiting nutrient is added at a rate fast enough to maintain cell metabolism. Similarly, population density can be set by changing the concentration of a single nutrient in the stored medium.
発酵槽内の細胞密度（cell/ml）は、制限栄養物質のレベルにより制御することができる。もし、希釈率が一定で、流入する培地におけるこの栄養物質の濃度が上昇すれば、細胞密度は上昇するであろう。 The cell density (cell / ml) in the fermenter can be controlled by the level of restricted nutrients. If the dilution rate is constant and the concentration of this nutrient in the incoming medium increases, the cell density will increase.
発酵槽で生産されるバクテリアの量はその種の成長率と培地の容量に依存する。 The amount of bacteria produced in the fermentor depends on the growth rate of the species and the volume of the medium.
他の研究者は、Ｖ．フィシェリ（V. Fisheri）は３％の塩分濃度における２３℃において最も成長することを報告している。 Other researchers are V. Fisheri reports that it grows most at 23 ° C at 3% salinity.
上述のように、本発明のいずれの態様においても、水監視システムは、生物試薬がサンプル水と混合された後の生物試薬の発光を監視する、オンライン監視用の構成部材を含むものである。理想的には、そのオンライン監視システムは、各光子計測装置またはそのグループが、サンプル水と生物試薬とが混合される時点より後のあらかじめ決められた時間に発光の測定を行うように、時間が遅延する方法で制御される複数の光子計測装置を使用して、発光を検出するように適合される。加えて、別の光子計測装置が、バクテリアとサンプル水とを混合する前にバクテリアの発光特性を測定するために使用されることが好ましい。最初の混合前の測定値といずれか別の測定値とを比較することで、生物発光の減少または増加の提示が、もしあったならば、得ることができる。典型的には、汚染物質が存在する場合に減少が観測され、減少は殺菌率と呼ばれる。 As described above, in any aspect of the invention, the water monitoring system includes an on-line monitoring component that monitors the luminescence of the biological reagent after the biological reagent is mixed with the sample water. Ideally, the on-line monitoring system will allow time for each photon measurement device or group to take a luminescence measurement at a predetermined time after the point at which the sample water and biological reagent are mixed. A plurality of photon measuring devices controlled in a delayed manner are used to detect luminescence. In addition, another photon counting device is preferably used to measure the luminescent properties of the bacteria before mixing the bacteria with the sample water. By comparing the measurement before the first mixing with any other measurement, an indication of a decrease or increase in bioluminescence can be obtained, if any. Typically, a decrease is observed when contaminants are present, and the decrease is called the sterilization rate.
本発明のさらにより好ましい実施形態において、前述のポンプ手段は、システム中におけるサンプルの比較的円滑な流れを提供するために、比較的高いパルスレートで作動するぜん動運動式の多チャンネルポンプで構成される。 In an even more preferred embodiment of the present invention, said pump means comprises a peristaltic multichannel pump operating at a relatively high pulse rate to provide a relatively smooth flow of sample in the system. The
本発明の第１の態様のさらにより好ましい実施形態において、水監視システムはサンプル水の調整手段を有する。調整手段は、水監視システムにおいて使用される生物試薬との生体適合性を確保するために、テストするサンプル水を変化させる。すなわち、サンプル水の調整手段は、サンプル水のイオンの濃度を変化させ、典型的にはサンプル水の塩分を増加させるとともに、好ましくはサンプル水に対する生物試薬の感度を妨げる又は変化させてしまうような粒子を除去する。例えば、サンプル水の調整手段は、ほとんどのバクテリアの発光特性に悪影響を与える、塩化物イオン又は塩素処理あるいはクロラミン処理による物質を除去することができる。 In an even more preferred embodiment of the first aspect of the present invention, the water monitoring system comprises sample water conditioning means. The adjustment means changes the sample water to be tested in order to ensure biocompatibility with the biological reagents used in the water monitoring system. That is, the sample water conditioning means changes the concentration of ions in the sample water, typically increases the salinity of the sample water, and preferably interferes with or changes the sensitivity of the biological reagent to the sample water. Remove particles. For example, sample water conditioning means can remove chloride ions or substances resulting from chlorination or chloramine treatment that adversely affect the luminescent properties of most bacteria.
本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、水監視システムは、光検出機能を妨げるであろう空気の塊（pockets of air）を除去するための、理想的には位置を選択可能な、少なくとも一つのバブルトラップを備えている。 In an even more preferred embodiment of any aspect of the present invention, the water monitoring system ideally selects a location to remove pockets of air that would interfere with the light detection function. It has at least one possible bubble trap.
本発明のいずれかの態様のさらに好ましい実施形態においては、前記発酵槽と前記テストチャンバーの両方又はいずれかは、生物試薬を養う培地において空気又は酸素を均一に攪拌するアジテーター又は攪拌機を備えている。 In a further preferred embodiment of any aspect of the present invention, the fermentor and / or the test chamber comprises an agitator or stirrer that uniformly stirs air or oxygen in a culture medium for feeding biological reagents. .
さらに、より好ましくは、本発明のいずれかの態様の水監視システムは、発酵槽内の細胞密度を測定するために、バクテリアの培地の濁度を観測する濁度計を備える。濁度計は、発酵槽又は発酵槽の下流側に付随して設置することができる。 Even more preferably, the water monitoring system of any aspect of the present invention comprises a turbidimeter that observes the turbidity of the bacterial medium to measure the cell density in the fermentor. The turbidimeter can be installed along with the fermenter or the downstream side of the fermenter.
本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、テストに用いるサンプル水をろ過するための、前置ろ過装置が設置される。 In an even more preferred embodiment of any aspect of the present invention, a pre-filtration device is installed to filter the sample water used for testing.
本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、テストするサンプル水を濃縮するための、前置（事前）サンプル水濃縮手段と後置（事後）サンプル水濃縮手段の両方又はいずれかを備える。すなわち、前置サンプル水濃縮手段はテストをする前にサンプル水を濃縮し、水に含まれ得るいずれの汚染物質をも濃縮する。後置サンプル水濃縮手段は、さらにテスト又は分析を行うことができるように、テストを行った後のサンプル水を濃縮するもので、実際には、さらに測定を行う目的で本発明のテストチャンバーに戻すことが可能である。当業者は理解するであろうが、この後置サンプル水濃縮手段は、最も典型的には、適合するバルブ手段を使用する後置サンプル水濃縮手段を通過するサンプル水の選択的流れにより、選択的に稼働することが可能である。 In an even more preferred embodiment of any aspect of the present invention, a pre- (pre) sample water concentrating means and / or a post (post-) sample water concentrating means for concentrating the sample water to be tested. Is provided. That is, the pre-sample water concentration means concentrates the sample water before testing and concentrates any contaminants that may be contained in the water. The post-sample water concentration means concentrates the sample water after the test so that it can be further tested or analyzed. In fact, it is added to the test chamber of the present invention for the purpose of further measurement. It is possible to return. As will be appreciated by those skilled in the art, this post-sample water concentration means is most typically selected by the selective flow of sample water through the post-sample water concentration means using a suitable valve means. It is possible to operate automatically.
本発明の第３の態様によれば、
給水中の汚染物質を検出するための給水を連続的に監視する方法であって、
ａ）水道または自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーへ供給するステップと、
ｂ）発光生物試薬を前記テストチャンバーへ供給するステップと、
ｃ）前記サンプル水に接触させる前と後において前記生物試薬の発光を検出するステップと、
ｄ）前記生物試薬が前記サンプル水に接触した結果、発光に変化があった場合に、前記サンプル水に汚染物質が存在していることを決定するステップと、
ｅ）上記ステップを繰り返すために、前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから除去するステップとを有することを特徴とする給水を連続的に監視する方法を提供する。
According to a third aspect of the invention,
A method for continuously monitoring the water supply to detect contaminants in the water supply,
a) supplying sample water from a water supply or natural water source to a test chamber;
b) supplying a luminescent bioreagent to the test chamber;
c) detecting the luminescence of the biological reagent before and after contacting with the sample water;
d) determining that contaminants are present in the sample water when there is a change in luminescence as a result of the biological reagent contacting the sample water;
e) A method for continuously monitoring water supply comprising the steps of removing the sample water and the biological reagent from the test chamber to repeat the above steps.
本発明のさらなる態様によれば、
給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
ａ）水道水又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に前記サンプル水のイオン強度を変化させるサンプル水調整手段と、
ｄ）発酵槽で培養された発光生物試薬であるビブリオ・フィシェリ（Vibrio Fischeri）を前記テストチャンバーに供給するために前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｅ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｆ）前記テストチャンバーから前記サンプル水と前記生物試薬を除去するための排出管とを備えることを特徴とする連続水監視システムを提供する。
According to a further aspect of the invention,
A continuous water monitoring system for detecting contaminants in the water supply,
a) a supply pipe for supplying sample water from a tap water or a natural water supply source to the test chamber;
b) a test chamber;
c) Sample water adjusting means for changing the ionic strength of the sample water before supplying the sample water to the test chamber;
d) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply Vibrio Fischeri, a luminescent bioreagent cultured in the fermentor, to the test chamber;
e) at least light detection means associated with the test chamber to measure luminescence from the biological reagent;
f) A continuous water monitoring system is provided, comprising a drain tube for removing the sample water and the biological reagent from the test chamber.
本発明のさらなる態様によれば、以下の図面を参照しつつ、実質的に本明細書に記載されているような、連続水監視システム又はその構成部材を提供する。 According to a further aspect of the present invention, there is provided a continuous water monitoring system or component thereof substantially as described herein with reference to the following drawings.
本発明のさらなる態様によれば、以下の図面を参照しつつ、実質的に本明細書に記載されているような、給水を連続的に監視する方法を提供する。 According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for continuously monitoring water supply, substantially as described herein, with reference to the following figures.
本発明の実施形態を、単に例示を目的として、以下の図面を参照して説明する。 Embodiments of the present invention will now be described, by way of example only, with reference to the following drawings.
図１は、本発明の水監視システムの第１の構成部材の概略図であり、本質的には、生物試薬発酵槽を示している。 FIG. 1 is a schematic view of a first component of the water monitoring system of the present invention, essentially showing a biological reagent fermenter.
図２は、水監視システムの第２の構成部材の概略図であり、本質的には、オンライン監視サブシステムを示している。 FIG. 2 is a schematic diagram of a second component of the water monitoring system, essentially showing the online monitoring subsystem.
図３は濁度計の組立図である。 FIG. 3 is an assembly drawing of the turbidimeter.
図１における概略図は、生物試薬を培養するために使用されるバクテリア生産システムを示している。三口の２５０ｍｌのガラスの球形のボトルを発酵槽容器として使用した。中央の口は、培地のために栄養液を供給する供給管と連結するために使用した。使用した種は生物膜（biofilms）を形成する可能性があり、栄養源の方向に向かって成長する傾向があるため、発酵槽を培地容器から離隔するために成長防止装置が設置される。成長防止装置は、培地の中央に栄養を滴らせる第１６番の針（a No.16 needle）が使用されることにより構成されており、発酵槽から供給管に通り抜けてくるバクテリアの進行を阻止する空気の障壁を形成する。 The schematic in FIG. 1 shows a bacterial production system used to culture biological reagents. A three-necked 250 ml glass spherical bottle was used as the fermenter vessel. The central mouth was used to connect with a supply tube that supplied nutrient solution for the medium. Since the species used can form biofilms and tend to grow in the direction of the nutrient source, a growth prevention device is installed to separate the fermenter from the media container. The growth prevention device is configured by using a 16th needle (a No.16 needle) that drops nutrients in the center of the medium, and prevents the progress of bacteria passing from the fermenter to the supply pipe. Forms a blocking air barrier.
空気の流入と培地のオーバーフロー管は穴のあいたゴム栓を用いて発酵槽容器の側方の口の一つに連結した。ゴム栓を貫通するために、ステンレス鋼のチューブを使用した。発酵槽に接続される全ての管は生物膜が成長してしまうのを防ぐために、殺菌効果を有する材料で形成される、あるいは、殺菌効果を有する材料を含有する。空気の流入は外径が２ｍｍの管を用いて連結され、オーバーフロー管は外径が５ｍｍの管を用いて連結される。生物発光に対しては酸素濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以上必要とされるため、培地の中央に浸漬される散布管を通って連続的に空気が供給される。培地に酸素を拡散させるために、培地は連続的に攪拌される。バクテリアの発光は、酸素の濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以下においては変化に対して非常に敏感であることに留意する必要がある。最低限必要とする酸素の供給量は良質の生物試薬を保証するために重要な事項である。 The air inflow and the medium overflow tube were connected to one of the side ports of the fermenter vessel using a rubber stopper with a hole. A stainless steel tube was used to penetrate the rubber stopper. All tubes connected to the fermenter are made of a material having a bactericidal effect or contain a material having a bactericidal effect in order to prevent the biofilm from growing. The inflow of air is connected using a tube having an outer diameter of 2 mm, and the overflow tube is connected using a tube having an outer diameter of 5 mm. Since bioluminescence requires an oxygen concentration of 0.5 mg / L or more, air is continuously supplied through a spray tube immersed in the center of the medium. The medium is continuously agitated to diffuse oxygen into the medium. It should be noted that the luminescence of bacteria is very sensitive to changes at oxygen concentrations below 0.5 mg / L. The minimum required oxygen supply is an important matter to ensure a good quality biological reagent.
オーバーフロー管は、発酵槽内部の培地の体積を一定に保つために用いられ、空気の排出も同様である。液位は必要な高さに排出口を配置することにより、制御する。 The overflow pipe is used to keep the volume of the medium inside the fermentor constant, and the discharge of air is the same. The liquid level is controlled by placing the outlet at the required height.
容器内部の液位が上昇するときは、栄養の流入量が増加したため、又は、生物試薬の需要が減少したためであり、培地がオーバーフローに到達すると、超過した体積は空気の流入による加圧により排出される。 When the liquid level inside the container rises, the amount of nutrient inflow increased or the demand for biological reagents decreased, and when the culture medium overflowed, the excess volume was discharged by pressurization due to the inflow of air. Is done.
生物試薬供給管は、他方の側方の口に連結した。この管はオンライン監視システムに新しく培養されたバクテリアを供給する。 The biological reagent supply tube was connected to the other side port. This tube supplies freshly cultured bacteria to an online monitoring system.
図２には、光検出オンライン監視サブシステムの概略図を示す。 FIG. 2 shows a schematic diagram of a light detection online monitoring subsystem.
このオンライン監視システム（ＯＬＭＳ）は、生物試薬がサンプル水と混合される前と後で、生物試薬の発光を監視するために反応するシステムである。混合後の発光は、必須ではないが、理想的には、サンプルと生物試薬とが混合された時点より後の、３秒、１５秒、３０秒の位置において配置され、又は作動する、３つの光子計測装置により測定される。いくつかの実施形態においては、単一の光子計測装置が利用される。さらに、発光はいずれか一つ又はそれ以上の選択された、理想的には３０秒以内の時間間隔で、測定される。発光の変化は、生物試薬をサンプルと混合する前の生物試薬の最初の発光を考慮にいれた、算出変数（a calculated variable）を用いる方法により監視される。この変数は抑制率と呼ばれる。本発明の別の実施形態においては、光子計算機のＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３そしてＰＭＴ４は光ファイバーセンサーに置き換えることが可能である。これらのセンサーは信号を一つの主光子計算機に送信する。信号は一定の順序に配列され、次に続く信号の分析と解釈を可能とするためにタグ付け（tagged）される。この後者の構成は、典型的には、気泡の計画した定量的な導入により、連続的に供給されるサンプルから分割されたものとして、効果的にサンプルを離隔する分割システムと呼ばれるものと共に使用されるのが最も好ましい。本システムにおけるこの分割によって、いずれかの別々の光子計算機、又は一つの計算機を供給する光ファイバーセンサーを用いてパルスの読み込みと信号の解釈が可能となる。さらに、この分離した方法において本システムを使用することで、監視中における洗浄部分としての使用や、試験部分との比較のための対照部分としての使用が可能となる。分離は、さらに、抗菌性物質の利用を排出するだけでなく、システムを破壊しバクテリア群を殺す重金属をキレートするために、重金属キレート化剤のような抗毒素汚染物質の使用により、汚染物質の性質の正確な測定を可能にする点で有利である。 This online monitoring system (OLMS) is a system that reacts to monitor the luminescence of the biological reagent before and after it is mixed with the sample water. Luminescence after mixing is not essential, but ideally it is placed or activated at 3 seconds, 15 seconds, 30 seconds position after the time point when the sample and biological reagent are mixed. It is measured by a photon measuring device. In some embodiments, a single photon measurement device is utilized. Furthermore, the luminescence is measured at any one or more selected, ideally at time intervals within 30 seconds. The change in luminescence is monitored by a method using a calculated variable that takes into account the initial luminescence of the biological reagent prior to mixing the biological reagent with the sample. This variable is called the inhibition rate. In another embodiment of the present invention, the photon calculators PMT1, PMT2, PMT3 and PMT4 can be replaced by fiber optic sensors. These sensors send signals to one main photon calculator. The signals are arranged in a certain order and tagged to allow analysis and interpretation of subsequent signals. This latter configuration is typically used in conjunction with what is called a split system that effectively separates the sample as split from a continuously fed sample by the planned quantitative introduction of bubbles. Most preferably. This splitting in the system allows for pulse reading and signal interpretation using any separate photon calculator, or a fiber optic sensor that supplies a single calculator. Furthermore, the use of the system in this separate method allows it to be used as a cleaning part during monitoring and as a control part for comparison with a test part. Separation further eliminates the use of antibacterial substances, as well as the nature of the pollutants through the use of antitoxin pollutants such as heavy metal chelators to chelate heavy metals that destroy the system and kill bacteria. This is advantageous in that it enables accurate measurement.
複数の光検出器を使用することにより、生物発光に影響を与える汚染物質の性質の分析を行うことができることは当業者にとって明らかであり、例えば、シアン化物等の汚染物質は、バクテリア群が殺された場合に抑制率が水平状態になるまで急激な上昇を素早く示すように作用するというような抑制スペクトルの特徴から、毒素の性質および濃度を推定することができる。それに比べて、重金属は、高濃度であっても、非常にゆっくり作用し、そのため抑制率が水平状態に到達するまでに非常に長く浅い曲線を示す。 It will be apparent to those skilled in the art that the use of multiple photodetectors can analyze the nature of contaminants that affect bioluminescence. For example, contaminants such as cyanide are killed by bacteria. The nature and concentration of the toxin can be deduced from the characteristics of the suppression spectrum such that when it is done, it acts to quickly show a rapid rise until the suppression rate is level. In contrast, heavy metals act very slowly, even at high concentrations, so they exhibit a very long and shallow curve before the inhibition rate reaches a horizontal state.
本発明のシステムを使用することで、一旦汚染物質を検出した場合にシステム内の流れを停止させることについても利点を有する。このように、流れを停止した後、いずれも毒素の性質の重要な指標としての、実際の毒素作用の断定や抑制レベルの経時変化の測定を行うために、長時間（数分程度）いずれかの混合後の光検出器を使用して、抑制の経時変化を測定することができる。 The use of the system of the present invention also has the advantage of stopping the flow in the system once a contaminant has been detected. Thus, after stopping the flow, either to determine the actual toxin action or to measure the time course of the inhibition level as an important indicator of the nature of the toxin, either for a long time (about several minutes) Using a photodetector after mixing, the time course of inhibition can be measured.
以上のように、本システムは毒素特異的な抗毒試薬の添加のために使用することもできる。 As described above, the system can also be used for the addition of toxin-specific antitoxin reagents.
サンプル水と生物試薬は、８個の回転ヘッドを有する蠕動型多チャンネルポンプで送りこまれる。多チャンネルポンプの使用は、同じポンプで複数の流れを供給することができるためシステムのコストを低減することができるという利点を有する。しかし、一方で、生物試薬とサンプル水の混合率が多岐管（the manifold tubes）の径を変更することでしか調節できないという制限を課すこととなる。そうすると、混合率は製造業者から供給される多岐管のサイズに制限されてしまう。別の実施形態としては、数種類のポンプを使用することができる。この後者の実施形態によれば、混合率を変更することが可能となる。 Sample water and biological reagent are pumped by a peristaltic multi-channel pump with 8 rotating heads. The use of a multi-channel pump has the advantage that the cost of the system can be reduced because multiple streams can be supplied by the same pump. However, on the other hand, it imposes a restriction that the mixing ratio of biological reagent and sample water can only be adjusted by changing the diameter of the manifold tubes. This limits the mixing ratio to the size of the manifold supplied by the manufacturer. In another embodiment, several types of pumps can be used. According to this latter embodiment, the mixing rate can be changed.
分析器は新しい水を監視するように構成されるが、海洋環境に基づく生物試薬生物の結果として、好ましい感度および作用が発揮されるためには、サンプル水の塩分が培地の塩分と同等である必要がある。もし、バクテリアが繁殖する培地のイオン状態が急激に変化（減少または増加）した場合、大部分のバクテリア群を殺す浸透圧衝撃が起こると思われる。（サンプル水と生物試薬の混合後の）混合物の浸透圧の減少を避けるために、サンプル水は濃縮した塩化ナトリウム溶液と混合することにより前もって調整する必要がある。サンプル水の調整溶液の調製を下記に述べる。 The analyzer is configured to monitor fresh water, but the salinity of the sample water is equivalent to the salinity of the medium in order to achieve the desired sensitivity and action as a result of the biological reagent organism based on the marine environment There is a need. If the ionic state of the medium in which the bacteria grow is rapidly changed (decreased or increased), an osmotic shock that kills the majority of bacteria is likely to occur. In order to avoid a decrease in the osmotic pressure of the mixture (after mixing the sample water and the biological reagent), the sample water needs to be adjusted in advance by mixing with concentrated sodium chloride solution. The preparation of the sample water adjustment solution is described below.
前述のように、急性毒性の基本的な測定は抑制率である。これは、サンプル水との混合後に、生物試薬のどのくらいの発光が変化したかのパーセンテージでの算定である。そのため混合の直前での生物試薬の発光は、対照例として使用する。抑制率の計算に用いる式は、 As mentioned above, the basic measure of acute toxicity is the inhibition rate. This is a percentage calculation of how much luminescence of the biological reagent has changed after mixing with the sample water. Therefore, the luminescence of the biological reagent immediately before mixing is used as a control example. The formula used to calculate the inhibition rate is
である。
It is.
ＰＭＴ１は混合地点の前に設置されている光子計測装置により報告される光子の計測結果であり、ＰＭＴＸは混合地点より３秒、１５秒そして３０秒後に設置されている３つの光子計算機のそれぞれにおける光子数である。 PMT 1 is a photon measurement result reported by a photon measuring device installed in front of the mixing point, and PMT X is a result of three photon calculators installed at 3 seconds, 15 seconds and 30 seconds after the mixing point. The number of photons in each.
ＯＬＭＳのために使用しているぜん動ポンプはＷａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ製の多チャンネルぜん動ポンプ（ポンプモデル：５０５Ｕ，ヘッドモデル：３０８ＭＣ）である。ぜん動ポンプは正確な流量であり、殺菌した溶液を扱う必要がある場合には最適な選択である。全体のシステムは、システムの殺菌の効果を無くすことなく、組み立て、オートクレーブそしてポンプに後付けで設置することができる。他方、ぜん動ポンプは流れのパターンが連続ではなくパルスであるという不利益を有する。このパルスの流れの影響は、ポンプ速度が低い場合においては拡大する。ＯＬＭＳは発光の測定のために光子計測装置を使用しているため、流量が変化した場合には光子の数が変化する。光子の数のパルスの流れに起因する変動を最小にするために、ポンプを最大速度（５５ＲＰＭ）で駆動させるのが好ましい。 The peristaltic pump used for the OLMS is a multi-channel peristaltic pump manufactured by Watson Marlow (pump model: 505U, head model: 308MC). Peristaltic pumps have the correct flow rate and are the best choice if you need to handle sterilized solutions. The entire system can be retrofitted to the assembly, autoclave and pump without losing the sterilizing effect of the system. On the other hand, peristaltic pumps have the disadvantage that the flow pattern is pulses rather than continuous. The effect of this pulse flow is magnified when the pump speed is low. Since OLMS uses a photon measuring device to measure luminescence, the number of photons changes when the flow rate changes. The pump is preferably driven at maximum speed (55 RPM) to minimize fluctuations due to the flow of the number of photons.
ＯＬＭＳは３つの流れを扱う必要があり、３つの流れは、サンプル水、生物試薬、そしてサンプル水調整溶液である。生物試薬とサンプル水との希釈率は、適切な希釈率が明らかとなるまで製造業者が提供できる管のサイズを変更して決定する。生物試薬は内径０．２５ｍｍの多岐管（manifold tubing）（カラーコード：青‐オレンジ）を使用して供給されている。サンプル水は、内径０．８８ｍｍの管（カラーコード：オレンジ‐オレンジ）により供給される。 The OLMS needs to handle three streams, the three streams being sample water, biological reagent, and sample water conditioning solution. The dilution ratio between the biological reagent and the sample water is determined by changing the size of the tube that the manufacturer can provide until an appropriate dilution ratio is revealed. Biological reagents are supplied using manifold tubes with an inner diameter of 0.25 mm (color code: blue-orange). Sample water is supplied by a tube having an inner diameter of 0.88 mm (color code: orange-orange).
これらの管は、生物試薬については名目流量０．２３ｍｌ／ｍｉｎで、サンプル水については流量２．６ｍｌ／ｍｉｎである。サンプル水との混合後の生物試薬の濃度は５０％から５％で、好ましくは７．５２％である。 These tubes have a nominal flow rate of 0.23 ml / min for biological reagents and a flow rate of 2.6 ml / min for sample water. The concentration of the biological reagent after mixing with sample water is 50% to 5%, preferably 7.52%.
多くの気泡がサンプル水の管および生物試薬の管において観察される。気泡は光子が放出されない空の部分であるから、光子の数において負のピークの要因となる。気泡の大きさにより、監視システムにおいて空の空間は誤検出を発生させてしまう。 Many bubbles are observed in the sample water and biological reagent tubes. Since the bubble is an empty part where no photons are emitted, it causes a negative peak in the number of photons. Due to the size of the bubbles, empty spaces in the monitoring system can cause false detections.
気泡の存在は、ポンプから供給された後に試薬とサンプル水の管に気液分離器を導入することにより解決される（図２参照）。気液分離器の気泡の除去における有効性は１００％である。気液分離器の使用の利点は、分離室の内部の空隙が、ポンプの回転によるパルス効果を減少するパルス緩衝部材として機能するというものである。他方、気液分離器の導入は分離器容器の内部に死容積を形成するという欠点を有し、管を通過する過剰な空気を放出することにより液体レベルをコントロールするためのコントロールシステムが必要となる。容器の内部の液体の体積は滞留時間を決める。これは、粒子を分離システムに通過させる時間である。結果として、滞留時間は生物試薬の酸化を減少すること及び検出時間が増加することによってシステムを低下させる。この副作用を減少するために、滞留時間は最小に抑える必要がある。 The presence of bubbles is resolved by introducing a gas-liquid separator into the reagent and sample water tubes after being supplied from the pump (see FIG. 2). The effectiveness of the gas-liquid separator in removing bubbles is 100%. The advantage of using the gas-liquid separator is that the air gap inside the separation chamber functions as a pulse buffer member that reduces the pulse effect due to the rotation of the pump. On the other hand, the introduction of a gas-liquid separator has the disadvantage of creating a dead volume inside the separator vessel and requires a control system to control the liquid level by releasing excess air through the tube. Become. The volume of liquid inside the container determines the residence time. This is the time for the particles to pass through the separation system. As a result, residence time degrades the system by reducing biological reagent oxidation and increasing detection time. In order to reduce this side effect, the residence time needs to be kept to a minimum.
微生物の成長の監視は、どのような連続培養システムにおいても鍵となるパラメータである。細胞の数の推定値を得るために最適な方法は、濁度測定器を使用することである。バクテリアの培地は、培地内の細胞が溶液を透過する光を散乱するため、より濁って見える。細胞の数が増えると、散乱は増加し、そのために溶液はより濁る。細胞の懸濁液に光を透過し、現れた散乱していない光の量を測定することにより、濁度を測定することができる。発酵槽内部の細胞密度を監視するために、濁度計は生物試薬を供給するラインの気泡トラップの後に設置される（図２参照）。光源は高強度（2000mcd）の緑色の発光素子（ＬＥＤ）を用いて形成される。光源の強度は分圧器に接続された１０キロオームのポテンシオメータを用いて、調整することができる。ＬＥＤは電力供給と制御のためにデジタル出力に接続される。散乱していない光を測定するために、増幅器を内蔵したフォトダイオードが使用される（ＯＰＴ３０１）。増幅器の増幅率は、二つの１０メガオームの抵抗を使用することによって２０×１０６に設定した。フォトダイオードは二つの電源（＋／−12Vdc）を必要とし、出力を０〜１０Vdcの範囲に復帰させる。濁度計からの、ＬＥＤに適用した電圧とフォトダイオードが受信した電圧の、二つの信号が監視される。 Monitoring microbial growth is a key parameter in any continuous culture system. The best way to obtain an estimate of the number of cells is to use a turbidimeter. The bacterial medium appears more turbid because the cells in the medium scatter the light that passes through the solution. As the number of cells increases, scatter increases and so the solution becomes more turbid. Turbidity can be measured by transmitting light through the cell suspension and measuring the amount of unscattered light that appears. To monitor the cell density inside the fermenter, a turbidimeter is installed after the bubble trap in the line supplying the biological reagent (see FIG. 2). The light source is formed using a green light emitting element (LED) having a high intensity (2000 mcd). The intensity of the light source can be adjusted using a 10 kilohm potentiometer connected to a voltage divider. The LED is connected to the digital output for power supply and control. In order to measure unscattered light, a photodiode with a built-in amplifier is used (OPT301). The amplification factor of the amplifier was set to 20 × 10 6 by using two 10 megohm resistors. The photodiode requires two power supplies (+/− 12 Vdc) and returns the output to the range of 0 to 10 Vdc. Two signals from the turbidimeter are monitored, the voltage applied to the LED and the voltage received by the photodiode.
生物試薬として用いられるバクテリアは、シリコンチューブの内壁上に成長する傾向があり、生物膜（biofilms）を形成する。連続して４８時間動作した後、生物膜はオンライン監視システム（ＯＬＭＳ）のチューブ内で発見された。これらの生物膜は、光の伝播を妨げることにより、光子計算機によって報知される測定結果の質を低下させる。さらに、チューブの内径を減少させる。チューブの内径の減少はシステムを横断する流量と圧力についての問題を引き起こす。時間が経過することにより、バクテリアは成長を維持して、生物膜は厚くなり、流速が上昇する。流速の上昇は抵抗を上昇させ、生物膜の存在によって内側部分が減少した場合、下流側を塞ぐ生物膜の塊が放出される。オンライン監視システムの整合性（インテグリティ）を損なうように、生物膜が厚く成長することを避けるために、システムは、理想的には、２４時間毎又は４８時間毎に酸性溶液で常に洗い流すようにする必要がある。 Bacteria used as biological reagents tend to grow on the inner wall of the silicon tube and form biofilms. After 48 hours of continuous operation, the biofilm was discovered in an online monitoring system (OLMS) tube. These biofilms reduce the quality of the measurement results reported by the photon calculator by preventing the propagation of light. In addition, the inner diameter of the tube is reduced. The reduction in tube inner diameter causes problems with flow and pressure across the system. Over time, the bacteria maintain growth, the biofilm becomes thicker and the flow rate increases. Increasing the flow rate increases the resistance, and if the inner part is reduced due to the presence of the biofilm, a mass of biofilm closing the downstream side is released. Ideally, the system should always be flushed with an acidic solution every 24 or 48 hours to avoid thick growth of the biofilm so as to compromise the integrity of the online monitoring system. There is a need.
毒物を監視する生物試薬は、海中バクテリアに基づいている。これらの微生物は、生理機能を発揮するために３％の塩分濃度を必要とする。典型的に、毒性の監視は淡水のサンプルを目的とするものであるから、サンプル水の塩分を生体適合のために上昇させる必要がある。そのため、サンプルの浸透圧条件を培地の状態と同等にするために、サンプルの水を塩化ナトリウム水溶液と混合する。サンプル水調整用溶液（ＳＣＳ）の適切な濃度は、生物試薬の塩化ナトリウム濃度（２５ｇ／Ｌ）によって決定される。たとえば、我々のケースでは、サンプル水は名目流量が2.6 ml/minで供給され、生物試薬は0.23 ml/minで供給した。ＳＣＳの濃度を計算するために、以下の式を用いた。 Biological reagents that monitor toxic substances are based on marine bacteria. These microorganisms require a salt concentration of 3% in order to exert physiological functions. Typically, toxicity monitoring is aimed at fresh water samples, so the salinity of the sample water needs to be raised for biocompatibility. Therefore, in order to make the osmotic pressure condition of the sample equal to the state of the medium, the sample water is mixed with the sodium chloride aqueous solution. The appropriate concentration of the sample water preparation solution (SCS) is determined by the sodium chloride concentration (25 g / L) of the biological reagent. For example, in our case, sample water was supplied at a nominal flow rate of 2.6 ml / min and biological reagent was supplied at 0.23 ml / min. The following formula was used to calculate the concentration of SCS.
Ｖ１はＳＣＳの流量であり、Ｃ１はＳＣＳの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｖ２はサンプル水とＳＣＳの流量であり、Ｃ２は生物試薬のＮａＣｌの濃度である。上記名目流量の場合には、ＳＣＳの濃度は、
３０７．６１ｇ／Ｌである。
V 1 is the flow rate of SCS, C 1 is the concentration of SCS (g / L), V 2 is the flow rate of sample water and SCS, and C 2 is the concentration of the biological reagent NaCl. In the above nominal flow rate, the concentration of SCS is
307.61 g / L.
飲料水は抗菌物質の添加による処理が行われる。飲料水のための処理のために、塩素処理、クロラミン処理、オゾン処理の３つの抗菌工程がある。列挙した選択肢のうち、塩素処理が最もよく行われる。塩素は、水源からもたらされるバクテリアを殺菌するために用いられ、移送する過程の間バクテリアから水を保護するために、残存量が０．５〜１．０ｍｇ／Ｌに維持される。 Drinking water is treated by the addition of antibacterial substances. There are three antibacterial processes for treatment for drinking water: chlorination, chloramine treatment, and ozone treatment. Of the listed options, chlorination is the most common. Chlorine is used to disinfect bacteria coming from water sources, and the residual amount is maintained at 0.5-1.0 mg / L to protect water from bacteria during the transfer process.
そのような抗菌性のため、塩素が微生物を殺すことによってバイオセンサーを妨げる。もし、塩素量が一定であった場合には、塩素の妨げは問題にならないと思われるが、水道水に含まれる塩素量は常時塩化するため、この変化が毒性物質として観測されたり、偽陽性の結果を生じたりするおそれがある。この好ましくない動作を避けるために、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を加えることによりサンプル水から塩素を除去することができる。 Because of such antibacterial properties, chlorine interferes with the biosensor by killing microorganisms. If the amount of chlorine is constant, hindering chlorine may not be a problem, but the amount of chlorine contained in tap water is constantly chlorinated, so this change is observed as a toxic substance, or a false positive May result. To avoid this undesirable behavior, chlorine can be removed from the sample water by adding sodium thiosulfate (Na 2 S 2 O 3 ).
サンプル水から塩素を取り除くために必要なチオ硫酸ナトリウムの量は、遊離塩素の量に依存する。化学量論計算を行うことができるが、計算は非常に複雑であり、信頼性のある結果を得るためには、すべての外的要因を考慮する必要がある。サンプル水の調整のために使用される投与量は、マイクロトックスの使用者マニュアルから得られ、サンプル水処理のための推奨濃度は１００ｍｇ／Ｌである。ＳＣＳに添加する必要のあるチオ硫酸ナトリウムの量の決定のため、式１を使用する必要がある。塩化ナトリウムの例に用いた流量と同じ流量の場合、ＳＣＳに含まれるチオ硫酸ナトリウムの濃度は、１．２３ｇ／Ｌである。
The amount of sodium thiosulfate required to remove chlorine from the sample water depends on the amount of free chlorine. Although stoichiometric calculations can be performed, the calculations are very complex and all external factors must be considered in order to obtain reliable results. The dosage used for preparation of sample water is obtained from the Microtox user manual and the recommended concentration for sample water treatment is 100 mg /
明示していないが、本技術分野における当業者であれば、浮遊している固形物や、最も典型的には、生物発光に影響する物質を取り除く目的で、試験を行うサンプル水をろ過するためのフィルターが、システム内において使用されることは明らかである。さらに、すべての汚染物質を検知する機会（採取前）を増やすために、採取される水を濃縮する場合には、採取前と採取後の両方又はいずれかにおいて濃縮手段を配置することができる。さらに、又はもう一つの方法として、もし測定値が満足できない場合に、すでにある生物試薬を使用してもう一度測定を試みる場合、又は、新たな生物試薬を加えて測定を行う場合のいずれかの前に、サンプルの水を濃縮できるように、サンプル後の濃縮手段を配置することができる。 Although not explicitly indicated, those skilled in the art may filter sample water to be tested in order to remove suspended solids and, most typically, substances that affect bioluminescence. Obviously, these filters are used in the system. Furthermore, in order to increase the chance of detecting all contaminants (before collection), when the collected water is concentrated, a concentration means can be arranged before and / or after collection. In addition, or as an alternative, if the measurement is not satisfactory, try again with an existing biological reagent, or add a new biological reagent and perform the measurement. In addition, a concentration means after the sample can be arranged so that the sample water can be concentrated.
シアン化物、硫酸タリウムそして塩素の３つの基準物質についての、環境保護庁の基準値に相当する市場標準に対して、我々の水監視システムのテストを行い、それぞれの場合において、我々のシステムは環境保護庁の基準値と１００％適合し、あるいはそれ以上であることがわかった。表１を参照のこと。 We tested our water monitoring system against market standards corresponding to the Environmental Protection Agency standards for the three reference substances cyanide, thallium sulfate and chlorine, and in each case our system It was found that it was 100% compliant with the protection agency standard value or better. See Table 1.
さらに、０．２５ｍｇ／Ｌのシアン化物又は２４０ｍｌ／Ｌの硫酸タリウムを通常の塩素処理水（塩素濃度は０．２から１ｍｇ／Ｌで、長時間経過）にあらかじめ導入したテストサンプルのＰｏＣ装置への導入後、３０秒以内での「毒性警報」の表示を行うことによる、「３０秒の検出時間」の実現可能性の実証を行った。結果は表２に示し、適合性は１００％であった。 Furthermore, 0.25 mg / L of cyanide or 240 ml / L of thallium sulfate was introduced into normal chlorinated water (chlorine concentration was 0.2 to 1 mg / L for a long time) to a PoC device for a test sample. We demonstrated the feasibility of “30 seconds detection time” by displaying “toxicity warning” within 30 seconds after the introduction of. The results are shown in Table 2 and the compatibility was 100%.
最初のサブシステム中の流れ内での連続発光培地の自動的な植え付け及び定着、最初のサブシステム中の流れ内での十分な発光のための係属中の目標の検知、連続的な毒性測定ができるように、そのような方法で第２のサブシステム中の流れの中で次に続く連続発光培地の植え付け及び定着を行うことによる、「８週間の消耗周期」の実現可能性の実証を行った。結果は表３に示した。適合性は１００％であった。 Automatic planting and establishment of continuous luminescence media in the flow in the first subsystem, detection of pending targets for sufficient luminescence in the flow in the first subsystem, continuous toxicity measurement To demonstrate the feasibility of an “eight week exhaustion cycle” by planting and establishing the subsequent continuous luminescent medium in the flow in the second subsystem in such a way as possible It was. The results are shown in Table 3. The compatibility was 100%.
そのため、我々の水監視システムは、リアルタイムで水の連続したサンプリングのための新しく発明的なシステムを提供すると考える。
Claims (31)
ｂ）テストチャンバーと
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
前記光検出手段は前記サンプル水と接触する前後の前記生物試薬の発光特性を測定し、前記サンプル水との接触後に前記発光特性に変化があった場合には、前記水監視システムは前記サンプル水が汚染物質を含んでいたことを示すことを特徴とする連続水監視システム。 a) a supply pipe for supplying sample water from a water supply or natural water source to the test chamber;
b) a test chamber; and c) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply a luminescent bioreagent cultured in the bioreagent fermentor to the test chamber;
d) at least light detection means associated with the test chamber to measure luminescence from the biological reagent;
e) a continuous water monitoring system for detecting contaminants in the feed water comprising the sample water and a drain for removing the biological reagent from the test chamber;
The light detection means measures the luminescence characteristics of the biological reagent before and after contact with the sample water, and if there is a change in the luminescence characteristics after contact with the sample water, the water monitoring system detects the sample water. A continuous water monitoring system, characterized in that indicates that it contained contaminants.
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
ｆ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に、前記サンプル水の調整を行うためのサンプル水調整手段を備えることを特徴とする連続水監視システム。 a) a supply pipe for supplying sample water from a water supply or natural water source to the test chamber;
b) a test chamber;
c) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply a luminescent bioreagent cultured in the bioreagent fermentor to the test chamber;
d) at least light detection means associated with the test chamber to measure luminescence from the biological reagent;
e) a continuous water monitoring system for detecting contaminants in the feed water comprising the sample water and a drain for removing the biological reagent from the test chamber;
f) A continuous water monitoring system comprising a sample water adjusting means for adjusting the sample water before supplying the sample water to the test chamber.
ａ）水道または自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーへ供給するステップと、
ｂ）発光生物試薬を前記テストチャンバーへ供給するステップと、
ｃ）前記サンプル水に接触させる前と後において前記生物試薬からの発光を検出するステップと、
ｄ）前記生物試薬が前記サンプル水に接触した結果、発光に変化があった場合に、前記サンプル水に汚染物質が存在していることを決定するステップと、
ｅ）上記ステップを繰り返すために、前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから除去するステップとを有することを特徴とする給水を連続的に監視する方法。 A method for continuously monitoring the water supply to detect contaminants in the water supply,
a) supplying sample water from a water supply or natural water source to a test chamber;
b) supplying a luminescent bioreagent to the test chamber;
c) detecting luminescence from the biological reagent before and after contacting with the sample water;
d) determining that contaminants are present in the sample water when there is a change in luminescence as a result of the biological reagent contacting the sample water;
e) A method for continuously monitoring water supply comprising the step of removing the sample water and the biological reagent from the test chamber to repeat the above steps.
ａ）水道又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に前記サンプル水のイオン強度を変化させるサンプル水調整手段と、
ｄ）発酵槽で培養された発光生物試薬であるビブリオ・フィシェリ（Vibrio Fischeri）を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｅ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーに関連する光検出手段と、
ｆ）前記テストチャンバーから前記サンプル水と前記生物試薬を除去するための排出管とを備えることを特徴とする連続水監視システム。 A continuous water monitoring system for detecting contaminants in the water supply,
a) a supply pipe for supplying sample water from a water supply or natural water source to the test chamber;
b) a test chamber;
c) Sample water adjusting means for changing the ionic strength of the sample water before supplying the sample water to the test chamber;
d) a bioreagent fermenter in fluid communication with the test chamber to supply Vibrio Fischeri, a luminescent bioreagent cultured in the fermentor, to the test chamber;
e) at least light detection means associated with the test chamber to measure luminescence from the biological reagent;
f) A continuous water monitoring system comprising a drain pipe for removing the sample water and the biological reagent from the test chamber.
A method of continuously monitoring water supply substantially as described herein.
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