JP2008533999A - 深部静脈血栓症に関連する遺伝子欠陥の存在のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号及び同第4,800,159号に記載されているPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)及びそのRT−PCR代替法(逆転写PCR)、特に欧州特許第0.569.272号に開示されている1ステップフォーマットでのPCR;
例えば欧州特許出願公開第0.201.184号に記載されているLCR(リガーゼ連鎖反応);
国際特許出願公開第90/01069号に特許請求されているRCR(修復連鎖反応);
国際特許出願公開第90/06995号に記載されている3SR(自立配列複製);
例えば欧州特許第0.397.269号または米国特許第5,466,586号に開示されている鋳型として二本鎖DNAを用いるNASBA(核酸配列ベース増幅);及び
TMA(転写媒介性増幅)、例えば米国特許第5,399,491号明細書参照;
が当業界で公知である。
制限酵素の使用;
対立遺伝子特異的増幅;
ペプチド核酸(PNA)媒介PCRクランピング;
コンフォメーションの違いの検出、例えば一本鎖高次構造多型(SSCP)及び変性濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE);
標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる膜での検出ステップ(ドットブロット)を有するアッセイ;
微量測定プレートにおける検出ステップを有するアッセイ、例えば逆ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA、MLPA)、第1ヌクレオチド変化(FNC)テクノロジー、架橋テクノロジー;
迅速サイクルPCR及び同時蛍光分析(例えば、5’ヌクレアーゼ/Taqman);
PCR、その後質量分析またはキャピラリー電気泳動を用いるミニ配列決定;
により実施され得る。
1.方法
(1.1)研究集団
ライデン血栓性素因研究の設計はKosterら,Lancet,342:1503−1506(1993)及びVan der Meerら,Thromb.Haemost.,78:631−635(1997)に詳記されている。
FGG遺伝子には5個のハプロタイプ、FGA遺伝子には7個のハプロタイプ、FGB遺伝子には7個のハプロタイプが公知である(図3)。これらのハプロタイプをタギングするために、すべての被験者を15個のハプロタイプタギング(ht)SNP、すなわちFGG中4個、FGA中6個のハプロタイプタギング(ht)SNPについて遺伝子同定した(表2)。FGBの遺伝子同定はポリメラーゼ連鎖反応及び制限断片長多型分析により実施した。
選択した個人において、3つのフィブリノーゲン遺伝子のすべてのプロモーター、5’UTR、エクソン、イントロン/エクソン境界及び3’UTRをABI PRISM(登録商標)310遺伝アナライザー(米国ボストンに所在のPerkin Elmer)を用いて配列決定した。反応はABI PRISM(登録商標)BigDyeターミネーター・サイクル配列決定キット(Perkin Elmer)を用いて実施した。プライマーを以下にリストする。
全フィブリノーゲンをDade(登録商標)トロンビン試薬(米国フロリダ州のマイアミに所在のBaxter)を用いてクラウス法に従って測定した。試験はElectra 1000(米国プレザントビルに所在のMLA)を用いて実施した。全フィブリノーゲンレベルはU/dL(ここで、100U/dLは2.8 g/Lに相当する)で表示した。クラウス法により測定した全フィブリノーゲンは、市販の家兎抗フィブリノーゲン抗体(デンマーク国グロストルップに所在のDAKO A/S)を用いるELISAにより測定した全フィブリノーゲンにうまく一致した(R2=0.902;n=60)。
フィブリノーゲンγ’(すなわち、γA/γ’及びγ’/γ’フィブリノーゲン)抗原レベルを、米国特許出願公開第2003/0003515号に開示されている(オランダ国フェーネンダールに所在のCampro Scientificから入手可能な)γ’鎖のカルボキシ末端配列(VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(配列番号28)から構成されるペプチドに対する抗体2.G2.H9を用いるELISAにより測定した。この抗体はトロンビンに対する高アフィニティー結合部位を含むエピトープを認識し、γ’鎖に対して特異的である。
健康な対照において、各htSNPに対するハーディ・ワインバーグ平衡をX2分析により試験した。フィブリノーゲンのハプロタイプが血栓症に関連していたかどうかを調べるために、Woolf(Ann.Hum.Genet.,19:251−253(1955))に従ってオッズ比(OR)及び95%信頼区間(95%CI)を相対リスクの尺度として計算した。これは、基準カテゴリー(例えば、非ハプロタイプ2キャリア)に対する罹患カテゴリー(例えば、ハプロタイプ2キャリア)における血栓症の発現リスクを示す。
log(p/(1−p))=b0+b1x1+bkxk
p=症例の場合は1、対照の場合は0;
b0=切片;
b1=当該変数の回帰分析係数;
x1=当該変数のカテゴリー;
bk=潜在交絡子(k=2,3,4…)に対する当てはめロジスティック回帰分析係数;
xk=交絡変数(k=2,3,4…)のカテゴリー。
942人の全被験者の遺伝子同定から、15の選択htSNPはFGGの4つのハプロタイプ、FGAの5つのハプロタイプ、FGBの6タイプに同定された(図3参照)ことが示された。すべてのhtSNPについて、対照被験者におけるゲノタイプの分布はハーディ・ワインバーグ平衡にあった。Haploviewによる遺伝子同定データの精査から、予想通り3つの異なるフィブリノーゲン遺伝子のSNP間の高度の連鎖非平衡が判明した(データ示さず)。Arlequin出力は、ハプロタイプが遺伝子クラスター全体で連続していることを示していた。表3に、対照被験者における>1%の対立遺伝子頻度を有する連続ハプロタイプが示されている。多くの組換えがFGB及びFGA遺伝子間に存在していた。
FGG、FGA及びFGB遺伝子の最も一般的なハプロタイプの静脈血栓症のリスクに対する影響を大集団をベースとする症例−コントロール研究であるライデン血栓性素因研究で調べた。血栓症のリスクを高める3つのハプロタイプ、すなわちEGG−H2、FGA−H2及びFGB−H2が見つかった。3つの遺伝子間の連鎖不平衡を調整した後、FGG−H2ハプロタイプのみが静脈血栓症の高いリスクに関連したままであった。FGG−H2ハプロタイプのホモ接合性キャリア(集団の5.9%)では、最初の静脈血栓イベントを発現するリスクが2.4倍高かった(95%CI:1.5−3.9)。FGG−H2ハプロタイプも低い血漿フィブリノーゲンγ’レベル(γA/γ’プラスγ’/γ’フィブリノーゲン)及び低いフィブリノーゲンγ’/全フィブリノーゲン比(γ’/γ比)に関連していることが判明した。
実施例1において、フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ(FGG−H2)が深部静脈血栓症の高いリスク及び低いフィブリノーゲンγ’レベルに関連していたことを報告した。このハプロタイプ中に存在するハプロタイプタギング一塩基多型(htSNP)についてFGG−H2を調べた後、10034C>T多型のT対立遺伝子[rs2066865](SeattleSNPs(D.Nickerson,SeattleSNPs.NHLBI Program for Genomic Applications,ワシントン州シアトルに所在のUW−FHCRC,http://pga.gs.washington.edu.15−4−2003)に従ってナンバリング;GenBank受託番号AF350254)がフィブリノーゲンγ遺伝子の選択的スプライシングの効率に影響を及ぼすことによるフィブリノーゲンγ’レベルの低下に関与していたと仮定された。
1. FGGハプロタイプミニ遺伝子構築物
本研究で使用したミニ遺伝子は強力CMVプロモーターを含有する発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)に基づいていた。フィブリノーゲンγ遺伝子のエクソン9、イントロン9、エクソン10及び3’UTRを含有する1090bp遺伝子を、FGG−H1及びFGG−H2に対してホモ接合性のゲノムDNAサンプルに高忠実度ポリメラーゼ(Taq/Tgo混合物,Roche)を用いてPCRすることにより増幅させた。前進プライマー(5’−GTC GAT CGG TCT AGA CCA CCA TGG GTG GCA CTT ACT CAA AAG CAT C−3’(配列番号29))が翻訳開始部位(イタリック)及びXbaIに対する導入制限部位(下線)を有するコザック配列を含んでいた。スプライシングされたmRNAのナンセンス仲介崩壊を伴う潜在的問題を防止するめために、エクソン9の天然リーディングフレームとインフレームにある出発コドンを導入した。逆行プライマー(5’−CAA CTA GAA TGC AAA GAG TTA GGC ATA ACA TTT AGC A−3’(配列番号30)をBsmIに対する導入制限部位(下線)を含んでいた。
部位特異的突然変異は、Quikchange(商標)部位特異的突然変異キット(Stratagene)を用いて製造業者のプロトコルに従って実施した。全体として、4つのCstFコンセンサス変異体を作成した(表10)。CstF変異体1では10031GがAに突然変異された。CstF変異体2では10031G及び10042Gの両方がAに突然変異された。CstF変異体3では10033AがGに突然変異され、CstF変異体4では10033A及び10046Aの両方がGに突然変異された。
CstF変異体1:5’−GAC TAG ATA CAT GAT ACC TTT ATT GAC CAT TAA AAA CCA CC−3’(配列番号38)及び逆相補鎖、
CstF変異体2:5’−GAC TAG ATA CAT GAT ACC TTT ATT AAC CAT TAA AAA CCA CC−3’(配列番号39)及び逆相補鎖、
CstF変異体3:5’−GAC TAG ATA CAT GGT GCC TTT ATT GAC CAT TAA AAA CCA CC−3’(配列番号40)及び逆相補鎖、
CstF変異体4:5’−GAC TAG ATA CAT GGT GCC TTT ATT GAC CGT TAA AAA CCA CC−3’(配列番号41)及び逆相補鎖。
突然変異を確認するために、すべての突然変異構築物を配列決定により分析した。
構築物をHepG2細胞にトラクスフェクトした。内因性フィブリノーゲンを産生する白人ハプロタイプ肝細胞肝癌細胞株HepG2(ECACC,#85011430)をECACの指示に従って培養した。細胞を12ウェルプレートにおいて培養し、24時間後トランスフェクションをTfx−20試薬(Promega)を用いて製造業者のプロトコルに従って60〜80%集密度で実施した。1μgの各構築物を全容量400μlの増殖培地(10%(v/v) ウシ胎児アルブミン、60U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン及び0.1mM 非必須アミノ酸を補充したMEM)において3μ1のTfx−20試薬を用いて形質移入した。各構築物は両方の転写物(γA及びγ’)を産生するので、トランスフェクション効率の差を補正する必要はなかった。独立のトランスフェクション実験を2つの別々の構築物調製物を用いて実施した。
トリプシン処理により細胞を収集した後、全RNAをRNeasyミニキット(Qiagen)を製造業者のプロトコルに従って用いて単離した。各RNAサンプルを10単位のDNアーゼI(Roche)と37℃で15分間インキュベートした後65℃で15分間不活性化した。全RNAサンプルの各々の量をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。
cDNA合成は、逆転写酵素(RT)用一本鎖cDNA合成キット(SuperScript(商標)II逆転写酵素,Invitrogen)及び1μgのHepG2細胞由来のRNAを用いてプロトコルに従って実施した。ただし、改変したオリゴd(T)プライマー(5’−AGC TGG TCA GTC GTC AGC TGA(T)16−3’(配列番号42))を使用した。このプライマーを用いて、mRNAのみがcDNA合成のための鋳型として使用することができる。
各サンプルについて、選択的スプライシングの効率を蛍光標識したプローブを用いてリアルタイムPCRにより測定した。ヘテロ二本鎖の形成を防止するために、2つの別々のPCR反応においてpA1及びpA2転写物の濃度を分析した。両反応において、内因性フィブリノーゲンmRNAを増幅させることなく構築物転写物に由来するcDNAのみを増幅させるために前進プライマー(5’−TGC AGA TAT CCA TCA CAC TGG−3’(配列番号43))をベクター上に配置した。
E=10[−1/勾配]
(M.W.Pfaffl,Nucleic Acids Res.,29:e45(2001))に従って計算した。pA2−及びpA1−転写物はいずれも未希釈〜10−5希釈cDNA入力(n=6)の範囲で高直線性で2.14のリアルタイムPCR効率を示した(ピアソン相関係数r>0.98)。
構築物間のpA1及びpA2転写物の発現の差を分析するために、ハプロタイプ1を有する構築物のpA1転写物/pA2転写物の相対的発現(pA1/pA2比)を100%(野生型構築物)に設定した。このようにして、pA2の使用が多い構築物についてのpA1/pA2は100%未満である。逆に、pA2の使用が少ない構築物についてのpA1/pA2比は100%より高い。すべての構築物の平均相対的pA1/pA2比を野生型構築物との差について両側ステューデントt−検定を用いて試験した。
1. FGGハプロタイプミニ遺伝子構築物
各種FGGミニ遺伝子構築物の野生型構築物(構築物1,FGG−H1)と比較したpA1及びpA2転写物の平均相対使用(pA1/pA2比)を図10に示す。構築物2(FGG−H2)のpA1/pA2比は野生型構築物について得た値と比較して低下していた(71.5 12%,p<0.001)。これは、FGG−H2がインビボでの低いフィブリノーゲンγ’レベルと関連しているという我々の先の所見に一致した。FGG−H2は選択的スプライシングの領域に2つのSNP(9615C>T及び10034C>T)1を含んでいるので、交換構築物3(9615C,10034T)及び4(9615T,10034C)が作成された。これらのハプロタイプはインビボで存在しないが、これらの構築物は2つのFGG−H2特異的SNPのいずれか1つがフィブリノーゲンγ’発現を低下させるかを調べるために作成した。
SNP 10034のT対立遺伝子の機能性を予測するために使用されるCstFコンセンサスを裏付けるために、CstFコンセンサスを他の位置で突然変異させた構築物を作成した(表10参照)。CstF変異体1では10031GをAに突然変異させた。仮定上、この突然変異がCstFコンセンサスを弱らせるので、このヌクレオチド変化によりpA2の使用を減らすことによりpA1の使用が有利となるのであろう。このことは、10031G及び10042Gの両方がAに突然変異されているCstF変異体2にも当てはまる。CstF変異体3及び4では、CstFコンセンサスが1つまたは2つのヌクレオチドにより強化されたので、フィブリノーゲンγ’発現におけるpA2の使用の増加及び結果としてのpA1の使用の低下が予想される。CstF変異体3では10033AがGに突然変異され、CstF変異体4では10033A及び10046Aの両方がGに突然変異された。
個人中のFGG−H2ハプロタイプの存在を調べるために使用され得る1つの方法は前記個人を5’ヌクレアーゼ/TagManアッセイを用いてFGG−H2タギング多型10034C/Tを遺伝子同定することである。
Claims (31)
- 静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示し、図5Aに示すフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ2(FGG−H2)(配列番号21)の少なくとも一部である遺伝マーカーが個人のゲノム中に存在するかを調べることを含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを有しているかについて個人をスクリーニングする方法。
- FGG−H2の存在はフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中の1、2、3または4つの突然変異の一組の存在に関連しており、前記突然変異は129A/T(rs2066854)、7874G/A(rs2066861)、9615C/T(rs2066864)及び10034C/T(rs2066865)からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 突然変異の一組が請求項3の表中にリストした組5、6、7、8、11、12、14及び15から選択される請求項3に記載の方法。
- FGG−H2の存在はフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中の突然変異10034C/T(rs2066865)の存在に関連する請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- マーカーを、前記突然変異の一組を含む核酸材料のストレッチの標的核酸増幅反応を実施し、および増幅させた標的核酸を突然変異の組の存在について分析することにより検出する請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 増幅反応をNASBA、PCR、LCR、RCR、3SR及びTMAから選択する請求項5に記載の方法。
- 増幅核酸の各々が相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成する請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 相補的オリゴヌクレオチドを固相、好ましくは磁性粒子に固定させ、検出可能な複合体の各々を標識反応物質と反応させる請求項8に記載の方法。
- 相補的オリゴヌクレオチドを固相に固定し、検出可能な複合体の各々を別々に標識させた反応物質と反応させる請求項8に記載の方法。
- 別個の増幅核酸が別個の相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成する請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記別個の相補的オリゴヌクレオチドの各々を固相上の異なるスポットで固定させる請求項11に記載の方法。
- フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ2(FGG−H2)の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも1つ含む標的核酸の少なくとも1つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする少なくとも1対の増幅プライマー及び前記突然変異の存在について増幅標的核酸を検出する手段を含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを有しているかについて個人をスクリーニングするための請求項1から12のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
- 増幅させようとする標的核酸の1つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする1対の増幅プライマー及び前記突然変異の存在について増幅標的核酸を検出するための少なくとも1つのプローブを含み、前記標的核酸はフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ2(FGG−H2)の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも1つ含むフィブリノーゲンγ遺伝子の少なくとも一部に相当する請求項13に記載のキット。
- 増幅させようとする標的核酸の1つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする1対の増幅プライマー及び増幅標的核酸中の当該突然変異の各々を検出するための少なくとも1つのプローブを含み、前記標的核酸は129A/T、7874G/A、9615C/T及び10034C/Tからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含むフィブリノーゲンγ遺伝子の少なくとも一部に相当する請求項13または14に記載のキット。
- 第1オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、第2オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、配列番号10:GTGTCAACCATGTTCATAGGCまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含む請求項17に記載のキット。
- 第1オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、配列番号6:TTCCAAGGAAGCATCCTACGまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含み、第2オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、配列番号16:GCTTTGCAAGTCCATTGTCCまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含む請求項19に記載のキット。
- 第1オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、配列番号7:GTAACTGGCAATGCACTTCGまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含み、第2オリゴヌクレオチドは10〜26ヌクレオチド長であり、配列番号16:GCTTTGCAAGTCCATTGTCCまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含む請求項21に記載のキット。
- 増幅標的核酸中の当該突然変異(129A/T、7874G/A、9615C/Tまたは10034C/T)の各々を検出するための1つのプローブを含み、前記プローブは非突然変異アナライト核酸と識別するために突然変異したアナライト核酸に相当する核酸配列を含む請求項14または15に記載のキット。
- プローブは分子ビーコンである請求項25に記載のキット。
- 10034T対立遺伝子(突然変異10034C/T)に結合させることによりFGG−H2ハプロタイプを検出するためのプローブは配列番号19:ATGGTCAATAAAGATACCAであるか、または10〜50ヌクレオチド長、好ましくは10〜26ヌクレオチド長であり、および配列番号19:ATGGTCAATAAAGATACCAまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含むオリゴヌクレオチドを含む請求項25または26に記載のキット。
- 更に、配列番号20:TTTTAATGGTCAATAAAGGTACCAであるか、または10〜50ヌクレオチド長、好ましくは10〜26ヌクレオチド長であり、および配列番号20:TTTTAATGGTCAATAAAGGTACCAまたは少なくともその10ヌクレオチドの断片を含むオリゴヌクレオチドを含む10034C対立遺伝子に結合させることによりFGG−H2ハプロタイプを検出するためのプローブを含む請求項25から27のいずれかに記載のキット。
- キットは更に適当な増幅試薬を含む請求項13から28のいずれかに記載のキット。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の方法とフィブリノーゲンγ’/全フィブリノーゲン比(γ’/γ比)の測定を組み合わせた静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示す遺伝マーカーが個人のゲノム中に存在するかを調べることにより静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクについて個人をスクリーニングする方法。
- 深部静脈血栓症の高いリスクを有するにはγ’/γ比は0.69未満でなければならない請求項30に記載の方法。
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