JP2008533976A - ポリペプチド及びそれをコードする核酸 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、並びに飼料転換率(FCR)を改良し、そして/又は腸マイクロフロラを調整するために動物飼料におけるポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。本発明のポリペプチドの例は、本明細書における配列番号2のアミノ酸+1−+85(配列番号2のアミノ酸1−85になる)のアミノ酸配列を有する、バチルス・リケニホルミスATCC14580からのいわゆるL12タンパク質である。本発明はまた、L12に関連するタンパク質を生成するバチルス株の動物飼料への共生使用にも関する。
WO03/093453号は、WO03/093453号の配列番号133のヌクレオチド601−978によりコードされる小さな細胞外タンパク質を生成しない改良されたバチルス・リケニホルミス宿主細胞の企画を、例1において開示しており、ここで前記タンパク質は、WO03/093453号の配列番号134のアミノ酸1−126のアミノ酸配列を有する。WO03/093453号の配列番号133及び134は、それぞれ配列番号3及び4として列挙される配列に包含される。本明細書における配列番号4のアミノ酸1−126の配列は、本明細書における配列番号2のアミノ酸−41−+85と同一である。WO03/093453号は、配列番号2のアミノ酸1−85を有する、単離されたポリペプチドを開示しない。WO03/093453号はまた、配列番号1のヌクレオチド124−378を有する、単離された核酸配列を開示しない。
本発明者は、驚くべきことには、このバチルス・リケニホルミスの推定上の配列の一部、すなわち配列番号2のアミノ酸1−85に関連するポリペプチドが、動物飼料への使用のために高い可能性を有することを見出した。
ポリペプチド、そのポリペプチドをコードする核酸、バチルスの特定株、及び動物飼料への前記ポリペプチド及びバチルス株の使用方法を提供することが本発明の目的である。
本発明は、(a)配列番号2のアミノ酸1−85に対して少なくとも33%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;(b)(i)配列番号1のヌクレオチド124−378、(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列、又は(iii)(i)又は(ii)の相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;(c)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−85のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;(d)(a)又は(b)の対立遺伝子変異体;及び(c)(a)、(b)、(c)又は(d)のフラグメントから成る群から選択された、配列番号4のアミノ酸1−126ではない、単離されたポリペプチドに関する。
さらに、本発明は、本明細書における例6の試験において陽性であるバチルス株の動物飼料への使用に関し、ここで前記株のDNAは、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導く。
ポリペプチド、その特徴及び使用:
第1の観点においては、本発明は、(a)配列番号2のアミノ酸1−85に対して少なくとも33%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;(b)(i)配列番号1のヌクレオチド124−378、(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列、又は(iii)(i)又は(ii)の相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;(c)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−85のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;(d)(a)又は(b)の対立遺伝子変異体;及び(c)(a)、(b)、(c)又は(d)のフラグメントから成る群から選択された、配列番号4のアミノ酸1−126ではない、単離されたポリペプチドに関する。
用語“調整する”とは、腸マイクロフロラに関して本明細書において使用される場合、一般的に、健康で且つ通常機能的動物において機能又はその状態を変えるか、操作するか、変更するか又は調節すること、すなわち非治療的使用を意味する。調整は、本発明のポリペプチド及び/又はバチルス株に応答して存在する。
(i)37℃で5日間の嫌気性培養室においてのインキュベーション後、5%(v/v)の羊血液により補充されたBrucella寒天上での回腸−直腸及び/又は盲腸含有物の培養後に決定される、子豚及び/又はブロイラーにおけるインビボでの合計の通性嫌気性細胞の数の上昇;
(iii)37℃で48時間、嫌気性培養室において、MRS寒天上でのそれぞれ、回腸−直腸及び/又は盲腸含有物の培養後に決定される、子豚及び/又はブロイラーにおけるインビボでの合計の乳酸細菌の実質的な変化又は上昇の不在:
(iv)37℃で48時間、嫌気性培養室において、Rogosa寒天上での回腸−直腸含有物の培養後に決定される、子豚におけるインビボでの合計のラクトバチルスspp.の実質的な変化の不在:
(vi)37℃で48時間、嫌気性的に、エンテロコーカス寒天上で回腸−直腸含有物を培養した後に決定される、子豚におけるインビボでの他のエンテロコーカスssp.の数の低下;及び/又は
(vii)46℃で24時間、嫌気性培養室において、80℃での10分間のサンプルの加熱の後、TSN寒天上での回腸−直腸の培養の後に決定される、子豚においてクロストリジウム・ペルフリゲンス(Clostridium perfringens)が発生する頻度の低下。
(iv)グラム陰性細菌よりもグラム腸性球菌に対してインビトロで、より活性的であり、すなわち子豚及び/又はブロイラー腸含有物から単離されたグラム腸性球菌及びグラム陰性細菌に関して、グラム腸性球菌の強い低下を表し;
(x)例えば、子豚及び/又はブロイラー腸含有物から単離されるような有益な微生物、例えば細菌のインビトロでの増殖を実質的に影響せず;そして/又は
(xi)例えば、子豚及び/又はブロイラー腸含有物から単離されるような有害な微生物、例えば細菌のインビトロでの増殖を実質的に低める。
態様(x)においては、有益な微生物は好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)spp.,例えばL.サリバリウス(L. salivarius)DSM18070から選択され、これについてのMIC90は、少なくとも1000μg/ml、好ましくは少なくとも2000, 3000, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 又は少なくとも70001000μg/ml、特に少なくとも4170μg/mlである。
(xii)グラム陽性球菌、例えばエンテロコーカス又はスタフィロコーカスの株、例えばエンテロコーカス・ファエカリス、好ましくはエンテロコーカス・ファエカリスDAM18047についてのMIC90よりも少なくとも50%高い、グラム陽性細菌、例えばE. コリ、クレブシエラ・プネウモニアエ、サルモネラ・エンテリチジス、サルモネラ・チプムリウム又はプロテウス・ミラビリスについてのMIC90を有し、その好ましい副態様においては、グラム陰性細菌のMIC90は好ましくは、グラム陽性細菌のMIC90よりも、少なくとも100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 又は少なくとも500%高い。
2種のアミノ酸配列間の関連性が、パラメーター“同一性”により記載される。
本発明のためには、2種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
推定的な一列整列の例:
配列番号1:ACMSHTWGER-NL
配列番号2: HGWGEDANLAMNPS
本発明はまた、1又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−85のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体に関する。
第2の観点においては、本発明は、バチルス株(そのDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導く)の動物飼料への使用に関する。この試験は、L12−様遺伝子を有する株を同定するよう作用する(例6を参照のこと)。それらのバチルス株は、動物飼料への使用のための組成物の調製にも使用される。それらの使用は、例えば飼料転換率(FCR)を改良し、そして/又は腸マイクロフロラを調整するためである。
本発明はまた、(a)本発明のポリペプチドをコードし;(b)(i)配列番号1のヌクレオチド124−378、(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列、及び/又は(iii)(i)又は(ii)の相補的鎖と、非常に低い緊縮条件下でハイブリダイズし;そして/又は(c)配列番号1のヌクレオチド124−378に対して少なくとも48%の程度の同一性を有する、ポリペプチド−コード核酸配列を含んで成る単離された核酸配列に関し、但し前記核酸配列は、(iv)配列番号3及び(v)配列番号3のヌクレオチド601−978、及び配列番号1のヌクレオチド1−381ではない。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。
第1の特定の態様においては、核酸配列は、飼料転換率(FCR)を改良し、そして/又は腸マイクロフロラを調整することにより、動物飼料利用性を改良するポリペプチドをコードする。
本発明の特定の核酸配列は、配列番号1のヌクレオチド124−378であり、後者は成熟ポリペプチドコード領域に対応する。本発明の他の特定の核酸配列は、配列番号2,8,9及び10のいずれか1つのアミノ酸1−85のポリペプチドをコードするそれらである。
本発明はまた、適切な発現宿主におけるコード配列の発現を指図する1又は複数の制御配列に操作可能的に連結される本発明の核酸配列を含んで成る核酸構造体にも関する。適切な発現宿主はバチルス宿主細胞であり、このDNAは、例6に記載されるように、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応においてDNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導く。
発現は、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌(但し、それらだけには限定されない)を包含することが理解されるであろう。
上記バチルス・リケニホルミス宿主細胞のための好ましいターミネーターは、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子(amyL)、及びそれらの宿主細胞のいずれかからの内因性L12ターミネーターである。
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により操作可能的に連結される。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと)。
本発明はさらに、本発明の核酸構造体及び/又は本発明の発現ベクターを含んで成る組換えバチルス宿主細胞に関する。宿主細胞のDNAは、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応においてDNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導く。
特定の態様においては、PCRフラグメントは、精製され、そして配列決定される場合、配列番号2のアミノ酸1−85に対して少なくとも33%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成方法にも関し、ここで前記方法は、(a)前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために本発明の組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの生成方法にも関し、ここで前記方法は、(a)バチルスの株を培養し、このDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導き;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
宿主細胞の例は、上記セクション“宿主細胞”に言及されている。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチド及び/又はバチルス株を含んで成る組成物に関する。
ポリペプチド組成物は、当業者において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、粒子又は微粒子の形で存在することができる。組成物に含まれるポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
(a)i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド、及び/又はii)本発明のポリペプチド;及び(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、(d)少なくとも1つの微量鉱物、及び/又は(e)少なくとも1つの多量鉱物を含んで成る動物飼料添加剤;
50〜800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そしてi)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド、及び/又はii)本発明のポリペプチドを含んで成る動物飼料組成物;
50〜800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そして“細菌株;共生バチルス株”のセクションに定義されるようなバチルス株を含んで成る動物飼料組成物。
本発明の好ましい使用の例は、上記に与えられ(“ポリペプチド、その特徴及び使用”、及び“細菌株;共生バチルス株”のセクションにおける)、そして下記にさらに詳細に示される。
用語、動物とは、すべての動物を包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物である。反芻動物は例えば、動物、例えば羊、ヤギ、及び蓄牛、例えば、牛、例えば肉ウシ及び乳牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えばブタ又はイノシシ(子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない);家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏(ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない);及び魚(サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない);及び甲殻類(小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない)を包含する。
本発明従っての使用においては、ポリペプチドは、食事の前、後又は同時に動物に供給され得る。後者が好ましい。
しかしながら、動物飼料への使用に関しては、純粋であるポリペプチドは必要ではなく;それは他のポリペプチド、例えば動物飼料酵素を含むことができ、この場合、それはポリペプチド調製物と呼ばれる。
本明書においては、用語、飼料転換率又はFCRとは、用語、飼料転換と類似して使用される。FCRは、g/動物での体重増加に対するg/動物での飼料摂取として計算される。例5における表2を参照のこと。
本発明のポリペプチド及び/又はバチルス株とは別に、本発明の動物飼料添加物は、少なくとも1つの脂溶性ビタミン、及び/又は少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は少なくとも1つの微量鉱物、及び/又は少なくとも1つのマクロ鉱物を含むことができる。
多不飽和脂肪酸の例は、C18, C20及びC22多不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸及びγ−リノール酸である。
通常、脂−及び水−溶性ビタミン、及び微量鉱物は、飼料への添加のために意図された、いわゆるプレミックスの一部を形成し、そしてマクロ鉱物は通常、別々に飼料に添加される。それらの組成物型のいずれかが、本発明のポリペプチド又はバチルス株により富化される場合、本発明の動物飼料添加物である。
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE及びビタミンK、例えばビタミンK3である。
水溶性ビタミンの例は、ビタミンB12、ビオチン及びコリン、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ナイアシン、葉酸及びパントテネート、例えばCa−D−パントテネートである。
マクロ鉱物の例は、カルシウム、リン及びナトリウムである。
それらの成分(家禽、及び子豚/豚により例示される)の栄養必要条件は、WO01/58275号の表Aに列挙される。栄養必要条件とは、それらの成分が示される濃度で規定食に供給されるべきであることを意味する。
WO01/58275号は、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許09/77334号に対応する。
本発明の動物飼料組成物は、50−800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そしてさらに、本明細書に記載され、そして/又は請求されるように、少なくとも1つのポリペプチド及び/又は少なくとも1つのバチルス株を含んで成る。
粗タンパク質は、係数6.25により掛け算される窒素(N)、すなわち粗タンパク質(g/kg)=N(g/kg)×6.25として計算される。窒素含有率は、Kjeldahl方法 (A. O. A. C. , 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)により決定され得る。
特定の態様においては、植物タンパク質源は、1又は複数のマメ科植物、例えば大豆、ルピナス、エンドウ又はインゲン豆からの材料である。
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ種子、ヒマワリ種子、綿種子及びキャベツである。
植物タンパク質源の他の例は、穀物、例えば大麦、小麦ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、ライコムギ及びモロコシである。
ポリペプチド及び/又はバチルス株はもちろん、有効量で、すなわち飼料の溶解性及び/又は栄養価値を改良するための適切な量で適用され得る。
kg飼料当たりのmgポリペプチドタンパク質を決定するためには、ポリペプチドは、飼料組成物から精製され、そしてkg飼料当たりのmgポリペプチドタンパク質での用量が、例10に記載のようにして、計算される。同じ原理が、飼料添加剤におけるmgポリペプチドタンパク質を決定するために適用される。
例8に記載されるように、ブロイラーの腸含有物から単離された、次の生物学的材料を、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany)に、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された:
寄託物 受託番号 寄託日
エンテロコーカス・ファエカルス DSM 18047 2006年3月10日
ラクトバチルス・サリバリス DSM 18070 2006年3月16日
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
バチルス・リケニホルミスATCC14580を、TY寒天培地(2%寒天により固化されたTYブイヨン)上で37℃で一晩、増殖し、そして次の組成を有するTYブイヨン100mlを含む振盪フラスコ中に接種した:トリプトン:20g/l、酵母抽出物:5g/l、FeCl2・4H2O:7mg/l、MnCl2・4H2O:1mg/l、MgSO4・7H2O:15mg/l、pH7.3。振盪フラスコを、225rpmで振盪しながら、37℃で20時間インキュベートした。細胞を遠心分離により除去した。
例1からの発酵ブイヨンを遠心分離し(20000×g、20分)、そして上清液を、沈殿物から注意してデカントした。組合された上清液を、バチルス細胞を除去するために、Seitz EKSプレートを通して濾過した。EKS濾液を限外濾過し、そしてFiltron 3kカットオフカセット上でジアフィルトレートし、タンパク質を濃縮し、そしてSeitz EKS濾液における導電性を低める。Filtron濃縮物を、もう1つのSeitz EKSプレートを通して濾過した。
グリセロール配合されたL12タンパク質を、冷蔵庫に貯蔵した。その調製物は、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲル上で決定される場合、実質的に純粋であった(1つのバンド)。
SDS−PAGEにより決定される場合の相対的分子量は、Mr=12kDaであった。N−末端配列は次の通りであった:WVNPGYHYQYPSEGG(配列番号5)。
バチルス・リケニホルミスATCC14580の供給−バッチ発酵方法を、下記のようにして実施した。すべての培地は、当業界において知られている方法により殺菌した。特にことわらない限り、水道水を使用した。下記レセピーに言及される成分濃度は、接種の前である。
LB寒天:カゼインからの10g/lのペプトン(例えば、Flukaカタログ番号95039、カゼインからのトリプシン消化物);5g/lの酵母抽出物(サッカロミセス・セレビシアエの自己分解により製造された、例えばOrganotechnie SA, 27, avenue Jean Mermoz, F-93120 La Courneuve, Franceからのカタログ番号9512);10g/lの塩化ナトリウム;12g/lのBacto-寒天(LB−寒天(Miller)、Merckカタログ番号110283)(pH7.0±0.2に調節された)。
M-9緩衝液:リン酸水素二ナトリウム・2H2O、8.8g/l;リン酸二水素カリウム、3g/l;塩化ナトリウム、4g/l;硫酸マグネシウム・7H2O、0.2g/l(脱イオン水がこの緩衝液において使用された)。
供給−培地;グルコース・1H2O、820g/l。
バチスル・リケニホルミスATCC14580を、LB寒天スラント上で37℃で1日間、増殖した。次に、寒天を、M-9緩衝液により洗浄し、そして得られる細胞懸濁液の650nmでの光学密度(OD)を測定した。接種物振盪フラスコ(100mlの培地PRK−50を含む)を、OD(650nm)×ml細胞懸濁液=0.1の接種物により接種した(mlでの接種物の必要とされる量は接種物細胞懸濁液のOD(650nm)により0.1を割り算することにより見出されたことを意味する。振盪フラスコを、37℃、300rpmで20時間インキュベートした。
主要発酵器(発酵タンク)での発酵を、接種物振盪フラスコからの増殖培養物により主要発酵器を接種することにより開始した。接種される体積は、構成培地の10%であった(720mlの構成培地について80ml、接種の後、800mlの初期ブイヨンをもたらす)。
3日(70時間)後、発酵ブイヨンを収穫し、そして下記例4に記載のようにして精製した。
例3からの発酵ブイヨンを遠心分離し(2000×g、20分)、そして上清液を沈殿物から注意してデカントした。組合された上清液をSeitz K-250プレート及び次に、Seitz EKSプレートを通して濾過し、バチルス宿主細胞の残りを除去した。EKS濾液の電導性は、10mS/cmであった。100mlのEKS濾液を、20mMのCH3COOH、50mMのH3BO3、1mMのCaCl2により10倍に希釈し、NaOHによりpH4.5に調節し、そして希釈されたEKS濾液のpHを、20%CH3COOHによりpH4.5に調節した。希釈されたEKS濾液を、NaOHによりpH4.5に調節された、20mMのCH3COOH、50mMのH3BO3、1mMのCaCl2の溶液により平衡化された19mlのSP-セファロースFFカラムに適用した。
動物飼料におけるL12 タンパク質の性能を、次のパラメーターを用いて、ブロイラー鶏成長試験において評価した:
成長試験:8日目〜29日目(0日=孵化の日)
処理:A:対照;B:kg飼料当たり5mgの精製されたL12 のタンパク質
規定食:トウモロコシ/SBM48規定食(飼料組成物、表1を参照のこと)
反復試験:処理当たり、6羽の雄鶏ROSS PM3の8つのグループ
飼料:任意のペレット。
2:DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Belgium及びLasalocid Sodiumから市販されている。
3:EC−等式(EEC (1986) Directive de Ia Commission du 9 avril 1986 fixant Ia methode de calcul de Ia valeur energetique des aliments composes destines a Ia volaille; Journal Officiel des Communautes Europeennes, L 130, 53-54)により計算された。
4:飼料材料のための原料;Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Franceから入手できる。
5:Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Franceから入手できる、大豆ミール、油製造の残留物、飼料材料のための原料。
L12タンパク質(配列番号1)をコードする遺伝子に類似する遺伝子を、PCRにより、多くの他のバチルス・リケニホルミス株において同定した。PCR反応のための鋳型として使用するためのDNAを、TY寒天プレート(レセピーについては、例1を参照のこと)上で37℃で一晩、増殖された11の異なったバチルス・リケニホルミス株から単離した。個々の株からの細胞を有する1つの接種管を、0.1mlの水に懸濁し、そして10分間、煮沸し、遠心分離し、そして個々からの5μlの上清液を、下記のように、PCR反応におけるDNA鋳型として使用した。
PCRプログラム:1) 95℃ 3分; 2) 95℃ 10秒; 3) 65℃ 30秒-1℃ プレサイクル; 4) 72℃ 1 分; 5) 2)への進行 9 回; 6) 95℃ 10秒; 7) 55℃ 30秒; 8) 72℃ 1分; 9) 6)への進行 19 回; 10) 72℃ 5分; 11) 4℃ 永久、これは、段階10)に続いて、温度を4℃に下げることを意味する。
Pep481:AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3'(配列番号6)
Pep482:TTAAGAATTCGAATGAAAGAGGAGGAATG-3'(配列番号7)
5種の陽性株(陽性性とは、正しいサイズのDNAバンドを付与することを意味する)からの得られる0.4kbのPCRフラグメントを精製し、そして配列プライマーとして再び、Pep481(配列番号6)及びPep482(配列番号7)プライマーを用いて、DNA配列決定実験に使用した。
BioPlusTM2B (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege AIIe, DK-2970 Hoersholm, Denmarkにより提供される)と呼ばれる飼料内共生生成物から単離されたバチルス・リケニホルミス株が、11の試験された株間に包含されたが、しかし陰性であった。
示差走査熱量法(DSC)を用いて、pH2.5、4.0及び7.0でのL12タンパク質の熱安定性を決定した。約2mg/mlの濃度での精製されたL12を、適切な緩衝液に対して4℃で一晩、透析し、そして20〜90℃で1.5℃/分の一定の走査速度でのVP−DSC装置(Microcal)上で試験した。データ取り扱いを、MicroCal Originソフトウェア(バージョン4.10)を用いて行い、そして変性温度は、エンタルピーピークの頂点での温度として定義された。10mMのクエン酸、50mMの塩化ナトリウム(pH2.5)において、L12は、55℃の変性温度を有することが見出された。10mMの酢酸ナトリウム、50mMのNaCl(pH4.0)においては、L12は69℃で変性し、そして10mMのリン酸ナトリウム、50mMのNaCl(pH7.0)においては、変性温度は60℃であった。
腸マイクロフロラに対するL12タンパク質の影響を、a)インビボ、子豚及ブロイラー;及びb)インビトロ、腸マイクロフロラから単離された微生物に対して評価した。
子豚研究:
生存動物を伴っての実験に基づいてFrench法律規則に従って行われたこの研究を実施し、子豚の腸マイクロフロラに対する5ppmのL12(kg飼料当たり5mgの精製されたL12)の効果を評価した。
規定食A:18%の大豆ミール、53%のトウモロコシ、13%の大麦、6%のオートミル、5.4%の小麦ふすま、1%の大豆油、3.6%の鉱物、ビタミン及び合成アミノ酸(w/v)を含む、Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Switzerlandから入手できるKLIBA。
規定食E:5mg/kgのタンパク質L12の添加を伴っての規定食A。
規定食B, C及びDは、本発明のために適切でない他の試験化合物を含んだ。
実験用規定食は、8:00及び15:30で2かいの等しいミールにおける、2kg/日のレベルでの動物への分布を可能にされた。
動物は、実験の間、中毒又は疾病のいずれの徴候も示さなかった。観察の間、それらの毎日の体重の増加は、1.14±0.1kgであり、これは非常に良好な畜産性能である。
実験蝕の最後で、動物を、精神安定化の後、致死注射により安楽死せしめた。
放出の直後、10gの回腸−直腸内容物を、100mlの塩化ナトリウムペプトンブイヨン(Merck, Darmstadt, Germany、カタログ番号10582)を含むフラスコ中に移し、そして均質化した。放出を嫌気性チャンバー(AES Cheminex, Combourg, France)に急速に移された理想的内容物の除去との間の経過は5分以下であった。続いてサンプルを、10-1〜10-8(重量/体積)、塩化ナトリウムペプトンブイヨンを用いて、10倍段階で連続的に希釈した。すべての細菌計数は、二重反復試験プレートにより達成された。
個々の試験グループに関しては、データの統計学的分析は、平均及び平均の標準偏差の計算、及び変動の分析、続くグループ内差異の有意性を評価するためのスチューデントt試験を包含する。
それぞれの細菌計数(理想的内容物乾燥物質(DM)1g当たりのコロニー形成単離(CFU)の数±標準偏差(SD))が、下記表3に与えられており、これはまた、対照に対して、5ppmのL2の添加により引起されるそれぞれ細菌計数での補正も示す。
L12の陽性効果が合計の通性嫌気性細菌の平均に見られ、ここで計数は、対照に対して48%、高められた。
クロストリジウム・ペルフリンゲンスが20の対照サンプルの13に見出され(規定食A)、ところがそれは、L12−補充された規定食(規定食E)に関しての20のサンプルの6に見出された。従って、この病原性細菌は、L12に関して、強く低められた(99%)。
例5に記載されるブロイラー成長試験においては、ブロイラー腸マイクロフロラに対するL12(kg飼料当たり5mgの精製されたL12 )の効果をまた評価した。
グループ当たり12匹の動物からのマイクロフロラの分析を、ブロイラーの殺害のあと、出発材料として盲腸内容物を用いて、上記のようにして(子豚の研究)行った。
ブロイラー盲腸内容物における細菌集団計数の結果が表4に示されている。
この変動は、L12補充されたグループにおいて観察される合計の乳酸細菌の観察される(数的な)上昇により説明され得る。合計の乳酸細菌は、合計の通性嫌気性フロラの主要集団を表し、そして宿主健康のための通常のマイクロフロラにより付与される有益性において重要な役割を演じるラクトバチルス種から主に構成される。
マイクロフロラに対するL12の効果を、さらにインビトロで評価した。腸マイクロフロラの有益な及び有害な微生物の代表的細菌を、子豚及びブロイラー腸内容物から単離した。それらの識別を、適切なAPIシステム(BioMerieux, Marcy I'Etoile, France)を用いて、グラム染色及び生化学的試験の後、顕微鏡試薬により確認した。
それらの評価の結果は、表6に示される。
それらの結果は、胃−腸マイクロフロラに対するL12の影響を一部、説明する。
エンテロコーカス・ファエカリス及びエンテロコーカス・ファエシウムに対するインビトロでのL12の観察された効果は、子豚においてインビボで観察されるエンテロコーカスspp.の観察される低下を確認した。
ブロイラー腸内容物から単離されたクロストリジウム・ペルフリンゲンスに対するインビトロでのL12の観察される効果は、子豚においてインビボで観察されるこの集団の強い低下を確認した。
動物飼料におけるL12 タンパク質の性能を、次のパラメーターを用いて、ブロイラー鶏成長試験において評価した:
成長試験:8日目〜29日目(0日=孵化の日)
処理:A:対照;B:kg飼料当たり2.5、5.0及び7.5mgの精製されたL12 のタンパク質
規定食:トウモロコシ/SBM48規定食(飼料組成物、表1を参照のこと)
反復試験:処理当たり、6羽の雄鶏ROSS PM3の8つのグループ
飼料:任意のペレット。
2:DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Belgium及びLasalocid Sodiumから市販されている。
3:EC−等式(EEC (1986) Directive de Ia Commission du 9 avril 1986 fixant Ia methode de calcul de Ia valeur energetique des aliments composes destines a Ia volaille; Journal Officiel des Communautes Europeennes, L 130, 53-54)により計算された。
5:Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Franceから入手できる、大豆ミール、油製造の残留物、飼料材料のための原料。
精製されたL12タンパク質調製物を、L12タンパク質の標準として使用した。それを、例4に記載のようにして調製し、そして例2に記載のようにして、グリセロールと共に配合した。純度は、HPLCにより測定される場合、96%以上であった(Waters 2690分離モデュール及びWaters 2487 UV検出器(280nmで検出する)、カラムACE C18 5μm 100Å 150×3.0mm及びWater μ−Bondapak C18 20×3.9mm(ガードカラム)、0.5ml/分の流速、10μlの注入体積、移動相A:H2O 18MΩ+0.1%TFA(三−弗素酢酸)、移動相B:アセト二トリル+0.1%TFA)。
種々の他のL12サンプルの純度及び濃度を、この標準により、下記のようなSDS−PAGEゲルにより決定した。
L12タンパク質サンプルのペプチド結合を、酸加水分解し、続いて、Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmarkから市販されているBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上で、製造業者の説明書に従って、開放されるアミノ酸を分離し、そしてそれを定量化した。酸加水分解のために、タンパク質サンプルを、真空遠心分離機において乾燥し、18.5%(v/v)のHCl+0.1%(v/v)のフェノールに溶解し、そして110℃で16時間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを再び真空遠心分離機において乾燥し、負荷緩衝液(0.2Mのクエン酸ナトリウム、pH2.2)に溶解し、そしてBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上に負荷した。
種々のL12サンプルの濃度を、次の方法により決定した(言及されるすべてのNovex製品は、Invitrogenから市販されている、www.invitrogen.comを参照のこと)。
生来のL12:10mMのトリス/CH3COOH緩衝液(pH4.5)により1mg/mlに希釈された、精製されたL12のタンパク質。
変性されたL12:精製されたL12(10mMのトリス/CH3COOH緩衝液(pH4.5)において1mg/ml)のサンプルを、タンパク質を変性するために5分間、煮沸した。
パンクレアチン:豚パンクレアチン(Sigma P-7545, 8xUSP)。80mg/mlを、0.5Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
pH3緩衝液:10mMの琥珀酸pH3.0.
pH7緩衝液:0.5Mのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0
次のサンプルを調製した:
278μlの生来の又は変性されたL12+100μlのペプシン溶液+122μlのpH3緩衝液を、振盪しながら40℃で2時間インキュベートし、pHは3.5であることを測定した。次に、400μlのpH7緩衝液+100μlのパンクレアチン懸濁液を添加し、そして続いて、振盪しながら40℃で4時間インキュベート、pHは7.0であることを測定した。
278μlの生来の又は変性されたL12+100μlのペプシン溶液+122μlのpH3緩衝液を、振盪しながら40℃で2時間インキュベートした(pHは3.5であることを測定した)。次に、500μlのpH7緩衝液を添加した(pHは7.0であることを測定した)。
3)L12をパンクレアチンと共にインキュベートする:
278μlの生来の又は変性されたL12+222μlのpH3緩衝液を、振盪しながら40℃で2時間インキュベートした。次に、400μlのpH7緩衝液+100μlのパンクレアチン懸濁液を添加し、そして続いて、振盪しながら40℃で4時間インキュベートした。
278μlの生来の又は変性されたL12+100μlのペプシン溶液+122μlのpH3緩衝液+400μlのpH7緩衝液+100μlのパンクレアチン懸濁液を、氷上で混合し、そして冷たいまま維持した。
5)ペプシン対照サンプル:
100μlのペプシン溶液+400μlのpH3緩衝液を、振盪しながら、40℃で2時間インキュベートした(pH3.5を測定した)。次に、500μlのpH7緩衝液を添加した。
500μlのpH3緩衝液+400μlのpH7緩衝液+100μlのパンクレアチン緩衝液を、振盪しながら、40℃で4時間インキュベートした(pH7.0を測定した)。
7)ペプシン+パンクレアチン対照サンプル:
100μlのペプシン溶液+400μlのpH3緩衝液を、振盪しながら、40℃で2時間インキュベートした(pH3.5を測定した)。次に、400μlのpH7緩衝液+100μlのパンクレアチン緩衝液を添加し、そして続いて、振盪しながら、40℃で4時間インキュベートした(pH7.0を測定した)。
この例は、36日の十分な成長サイクルにわたってのブロイラー鶏の成長性能に対するL12タンパク質の効果を評価する。
ブロイラー鶏による成長性能試験を、1〜36日目で実施した。
成長試験:1日目〜36日目(0日=孵化の日)
規定食:小麦/ライ麦/SBM48規定食(飼料組成物、表9を参照のこと)
飼料:任意のペレット
処理:対照、kg飼料当たり7.5mgのL12 のタンパク質
反復試験:処理当たり、20羽の鶏の6つのグループ(20羽の雌の6グループ、20羽の雄の6グループ)。
2:DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Belgium及びLasalocid Sodiumから市販されている。
3:EC−等式(EEC (1986) Directive de Ia Commission du 9 avril 1986 fixant Ia methode de calcul de Ia valeur energetique des aliments composes destines a Ia volaille; Journal Officiel des Communautes Europeennes, L 130, 53-54)により計算された。
4:飼料材料のための原料;Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Franceから入手できる。
5:Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Franceから入手できる、大豆ミール、油製造の残留物、飼料材料のための原料。
L12タンパク質は、鶏の体重増加をわずかに改良したが(表10)、しかしながら、この効果は有意ではなかった。L12を受ける鶏の飼料摂取は、対照鶏のそれとは異ならなかった。飼料転換率(FCR)は、対照に比較して、L12タンパク質により2.7%、有意に改良された。
動物飼料添加剤:
動物飼料添加剤を、次のプレミックスに、20g/kgの量で、精製されたL12タンパク質を含んで成る被覆されたT−粒質物25g(EP569468B1の例3に記載のようにして調製された;しかしながら、約7%の水素化されたヤシ油及び約13%のCaCO3の被膜を伴う)を添加することにより調製する(kgプレミックス当たり):
300000 IE ビタミン D3
4000 IE ビタミン E
250 mg ビタミン B1
800 mg ビタミン B2
200 mg Ca-D-パントテネート
500 mg ビタミン B6
2.5 mg ビタミン B12
5000 mg ナイアシン
10000 mg ビタミン C
300 mg ビタミン K3
15 mg ビオチン
150 mg 葉酸
50004 mg 塩化コリン
6000 mg Fe
3000 mg Cu
5400 mg Zn
8000 mg Mn
124 mg I
60 mg Co
29.7 mg Se
9000 mg Lasalocid Sodium (Avatec)
17.3 % Ca
0.8 % Mg
11.7 % Na
次の組成(%、w/w)を有するブロイラー成長規定食を、成分を混合することにより調製する。小麦、ライ麦及びSBM48は、Moulin Moderne Hirsinque, Hirsingue, Franceから入手できる。混合の後、飼料を、所望する温度、例えば約70℃でペレット化する(3×25mm):
ライ麦 15.00
大豆ミール (SBM 48) 30.73
大豆油 4.90
DL-メチオニン 0.04
DCP (リン酸二カルシウム) 1.65
石灰石 0.43
塩 0.15
TiO2 0.10
動物飼料添加物 (上記) 1.00
追加の動物飼料及び飼料添加剤組成物を、同じ態様で調製するが、但しkgプレミックス当たり25gの被覆されたL12 CT粒質物を、g飼料組織物当たり約108個のコロニー形成単位(CFU)を有する動物飼料をもたらす。バチルス・リケニホルミスATCC14580の内生胞子の形での1013個のCFUにより置換する。
Claims (23)
- (a)配列番号2のアミノ酸1−85に対して少なくとも33%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)(i)配列番号1のヌクレオチド124−378、
(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列、又は
(iii)(i)又は(ii)の相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;
(c)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−85のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;
(d)(a)又は(b)の対立遺伝子変異体;及び
(c)(a)、(b)、(c)又は(d)のフラグメントから成る群から選択された、配列番号4のアミノ酸1−126ではない、単離されたポリペプチド。 - 飼料転換率(FCR)を改良し、そして/又は腸マイクロフロラを調整することにより動物飼料利用性を改良する請求項1記載のポリペプチド。
- (a)請求項1記載のポリペプチドをコードし;
(b)(i)配列番号1のヌクレオチド124−378、
(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列、又は
(iii)(i)又は(ii)の相補的鎖と、非常に低い緊縮条件下でハイブリダイズし;そして/又は
(c)配列番号1のヌクレオチド124−378に対して少なくとも48%の程度の同一性を有するが、但し、
(iv)配列番号3ではなく、
(v)配列番号3のヌクレオチド601−978ではなく、そして
(vi)配列番号1のヌクレオチド1−381ではない、ポリペプチド−コード核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。 - 請求項2記載のポリペプチドをコードする請求項3記載の核酸配列。
- バチルス(Bacillus)宿主細胞におけるポリペプチドの生成を指図する1又は複数の制御配列に操作可能的に連結される請求項3又は4記載のポリペプチド−コード核酸配列を含んで成る核酸構造体であって、前記宿主細胞のDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導くことを特徴とする核酸構造体。
- 請求項5記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項5記載の核酸構造体又は請求項6記載のベクターを含んで成る組換えバチルス宿主細胞であって、前記宿主細胞のDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導くことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドの生成方法であって、(a)請求項7記載の組換え宿主細胞を培養し、前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドの生成方法であって、(a)バチルスの株を培養し、このDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導き;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
- i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチドの動物飼料への使用。
- 動物飼料への使用のための組成物の調製への、i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチドの使用。
- i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチドが、動物飼料に添加される、動物飼料転換率(FCR)の改良方法。
- i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチドが、動物飼料に添加される、動物の腸マイクロフロラの調整方法。
- (a)i)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチド;及び
(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、
(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、
(d)少なくとも1つの微量鉱物、及び/又は
(e)少なくとも1つの多量鉱物、を含んで成る動物飼料添加剤。 - 50〜800g/kgの含有率の粗タンパク質を有し、そしてi)配列番号4のアミノ酸1−126を有するポリペプチド;及び/又はii)請求項1又は2記載のポリペプチドを含んで成る動物飼料組成物。
- バチルス株(そのDNAが、収穫され、そしてプライマーとしての配列番号6及び7とのPCR反応において、DNA鋳型として使用される場合、約0.4kbのサイズのPCRフラグメントの生成を導く)の動物飼料への使用。
- 動物飼料への使用のための組成物の調製への請求項16記載のバチルス株の使用。
- 請求項16記載のバチルス株が動物飼料に添加される、飼料転換率(FCR)の改良方法。
- 請求項16記載のバチルス株が動物飼料に添加される、腸マイクロフロラの調整方法。
- (a)請求項16記載のバチルス株;及び
(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、
(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、
(d)少なくとも1つの微量鉱物、及び/又は
(e)少なくとも1つの多量鉱物、を含んで成る動物飼料添加剤。 - 50〜800g/kgの含有率の粗タンパク質を有し、そして請求項16記載のバチルス株を含んで成る動物飼料組成物。
- エンテロコーカス・フェエカリス(Enterococcus faecalis) DSM18047。
- ラクトバチルス・サリバリウム(Lactobacillus salivarius)DSM18070。
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