JP2008522954A - ｃ−Ｊｕｎ二量化のペプチド阻害剤及びその使用 - Google Patents

ｃ−Ｊｕｎ二量化のペプチド阻害剤及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸断片発現ライブラリーをスクリーニングし、標的のタンパク質又は核酸の活性を調節する能力と、標的のタンパク質又は核酸の一部分と、しかし反復部ではないその一部分と適合する、保存された立体配座を取る能力に基づいて、コードされたペプチドを選択する方法を提供する。本発明は、虚血を診断し、治療する方法も提供する。本発明は、虚血の治療に有用なc-Jun二量化阻害ペプチド及びその類縁体も提供する。

Description

本発明は、概して、核酸断片発現ライブラリーをスクリーニングした後、標的のタンパク質又は核酸の活性を調節し、かつ標的の該タンパク質又は核酸の非反復部と適合する立体配座をとる能力に基づいて、コードされたペプチドを選択する方法に関する。また、本明細書に記載のスクリーニング方法を用いて同定したペプチド阻害剤を使用する、発作を診断及び治療する方法も提供する。
1.概説
本明細書は、ここに提示した3.3版PatentInを用いて作成したヌクレオチド及びアミノ酸の配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、配列表中の表示数字<210>、及びその後の配列識別子(例えば、<210>1、<210>2、<210>3など)により識別される。各ヌクレオチド配列に対する配列の長さ及び種類(DNA、タンパク質(PRT)など)、ならびに起源生物は、各表示数字領域<211>、<212>及び<213>に与えられる情報によって示されている。明細書中で言及するヌクレオチド配列は、「配列番号」という用語と、その後の配列識別子により規定される(例えば、配列番号1は、<400>1と示される配列表中の配列を指す)。
本明細書で言及するヌクレオチド残基の記号表示は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会により勧告されたもので、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、Gはグァニンを表し、Tはチミンを表し、Yはピリミジン残基を表し、Rはプリン残基を表し、Mはアデニン又はシトシンを表し、Kはグァニン又はチミンを表し、Sはグァニン又はシトシンを表し、Wはアデニン又はチミンを表し、Hはグァニン以外のヌクレオチドを表し、Bはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Vはチミン以外のヌクレオチドを表し、Dはシトシン以外のヌクレオチドを表し、Nは任意のヌクレオチド残基を表す。
本明細書で使用する場合、「に由来の」という用語は、指定した完全体が、必ずしも直接ではないが、特定の起源から得られることを示すと解釈するものとする。
文脈から別の意味を指示しない限り、本明細書を通して「含む(comprise)」という単語、又は「含む(comprises)」、「含んだ(comprising)」などの変形は、明記したステップもしくは要素もしくは完全体、又は一群のステップもしくは要素もしくは完全体を包含することを意味するが、他の任意のステップもしくは要素もしくは完全体、又は一群の要素もしくは完全体を排除することは意味しないことが理解されよう。
別途明記しない限り、又は文脈から別の意味を指示しない限り、本明細書を通して単一ステップ、組成物、一群のステップ、又は一群の組成物に言及する場合、そのようなステップや組成物の1つ及び複数(即ち1つ以上)、そのような群のステップや組成物を包含すると解釈することとする。
本明細書に記載の各実施形態は、別途明記しない限り、必要な変更を加えて他のありとあらゆる実施形態に適用できる。
本明細書に記載の本発明は、当業者であれば、具体的に記載した変更及び改変以外の変更及び改変を受け容れることを認識されよう。本発明はこのような変更及び改変を全て包含することを理解すべきである。本発明は、本明細書に言及又は指示するステップ、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に、又は一括して包含し、更に前記ステップ又は特徴のありとあらゆる組合せ、即ち任意の2つ以上の組合せも包含する。
本発明の範囲は、例示する目的だけを意図して本明細書に記載する、特定の実施形態に限定すべきではない。等価機能の生成物、組成物及び方法が、本明細書に記載する本発明の範囲に入ることは明らかである。
本発明は、過度に実験するまでもなく、別途指示しない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA技術、溶液中ペプチド合成、固相ペプチド合成及び免疫学に関する従来技術を用いて実施される。このような操作は、例えば以下のテキストに記載されている。
1. Sambrook, Fritsch & Maniatis,, whole of Vols I, II, and III。
2. DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxfordの全テキスト。
3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxfordの全テキスト、及び特に Gait, pp 1-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; and Wu et al., pp 135-151によるその中の論文。
4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxfordの全テキスト。
5. Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R.W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970の全テキスト。
6. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxfordの全テキスト。
7. Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)。
8. Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)の全シリーズ。
9. J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge
database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)。
10. Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem.
Biophys. Res. Commun. 73 336-342。
11. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154。
12. Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and
Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York。
13. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der
Organischen Chemie (Miller, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts I and 2, Thieme,
Stuttgart。
14. Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg。
15. Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg。
16. Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474。
17. Handbook of Experimental Immunology, Vols. 1-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)。
18. McPherson et al., In: PCR A Practical Approach., IRL Press, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 1991。
19. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (D. Burke et al., eds) Cold Spring Harbor Press, New York, 2000 (全テキストを参照されたい)。
20. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. In: Methods in Enzymology Series, Vol. 194 (C. Guthrie and G.R. Fink eds) Academic Press, London, 1991 2000 (全テキストを参照されたい)。
2. 関連技術の説明
ペプチド治療薬
新規な先導的化合物及び新規な標的同定・検証試薬に対する需要の増加に対応して、製薬産業は、例えば新生物疾患、感染、調節免疫、自己免疫、肥満などの治療等の治療用途において、独特の活性又は特異性を有する新規な先導的化合物を求めて様々な供給源のスクリーニングを強化してきた。
タンパク質が他のタンパク質、抗原、抗体、核酸及び炭水化物に結合することは、知られている。このような結合により、タンパク質は、あらゆる生物の非常に多様な生物学的過程に変化を起こすことが可能である。その結果、タンパク質は、表現型に対する天然のモジュレーターの重要源である。したがって、あるタンパク質の結合活性を調節するペプチドは、一次又は二次の薬物スクリーニングにおいて魅力ある先導的化合物(薬物候補)である。例えば、標的との有害作用(例えば、病原体又は癌細胞の複製)を示す生物学的相互作用の形成を検定することにより、該生物学的相互作用に拮抗する先導的化合物を同定することができる。
核酸系生成物及びペプチド系生成物を含め、特定標的の活性又は機能を調節する新規な化合物を決定する方法の開発が必要であることは、広く認識されている。このような手法では、標的のタンパク質又は核酸の活性をペプチドである潜在的な先導的化合物の不在下及び存在下でスクリーニングし、該標的の調節活性を決定する。
同様に、生体外検定又はトランスジェニックマウスにおけるペプチドの過剰発現から生じる表現型の観察などの検定を用いて、見込まれる薬物標的の優性ネガティブ阻害因子又は検証物質として、該ペプチドを使用することができる。
スクリーニング方法
新規な主導的化合物を同定する既知の一手法では、ランダムペプチド(合成、模倣又はミモトープの)ライブラリーが、合成コンビナトリアルケミストリーにより生成する短鎖ランダムオリゴヌクレオチドを用いて作製される。該DNA配列は、発現用の適当な媒体中にクローニングし、次いで多様な手法の1つを用いて、コードされたペプチドをスクリーニングする。しかし、ランダム断片ライブラリーから活性ペプチドを単離できる程度は、ペプチド結合性パートナーとの間で起こる低親和性の相互作用と共に大きく変動し得る。その上、発現ペプチドは、効果的な結合活性に必要な二次もしくは三次構造を殆どもしくは全く示さず、及び/又は不安定である場合も多い。このことは、生物学的分子が、一次構造ではなく形状及び電荷を認識するらしく(Yang and Honig, J. Mol. Biol. 301(3), 691-711 2000)、また、そのようなランダムペプチドアプタマーは概して小さ過ぎるために、タンパク質ドメインを含むことができないか、又はタンパク質ドメインの二次構造を形成することができないことを考慮すると、驚くには当たらない。このようなペプチドアプタマーの相対的に非構造的な「線状」性のために、対象に投与後の生体内での分解及び消失が速まる結果ともなり、そのため治療剤としてのその魅力が低下する。
ランダムペプチドライブラリーから有用な生物活性のペプチド又はタンパク質を得る確率を上げるために、ペプチドを足場タンパク質内、例えばチオレドキシン(Trx)ループ(Blum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2241-2246, 2000)又は触媒不活性なブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman et al., Science, 285, 591-595, 1999)の内部に束縛することにより、その安定性をこれまで高めてきた。このような構造内にペプチドを束縛すると、恐らく該ペプチドの立体配座自由度が制限され、そのため結合エントロピーの損失が最小となることにより、該発現ペプチドとその標的との相互作用が増加することが、幾つかの例で示されてきた。
特定の過程、例えば抗原-抗体結合活性に関与する特異的ペプチドを同定するために、ペプチド発現ライブラリーを作製することも知られている。例えば、米国特許第6,319,690号(Dade Behring Marburg GmBH)は、1集団の抗体をコードするcDNA配列を増幅するPCRベースの方法を教示しており、その場合、非活性化Bリンパ球の混合物に由来の抗体コードcDNAの保存領域に相同なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、抗体可変領域をコードする核酸を増幅する。該増幅配列は細菌ディスプレイ系を用いて発現させ、選択した抗原を用いてスクリーニングすることにより、該抗原に結合する抗体断片を決定する。しかし、米国特許第6,319,690号に記載の発現ライブラリーでは多様性に限界があり、その理由は、増幅断片が全て、単一種の複雑な真核生物に由来の抗体コード断片であったからである。その上、米国特許第6,319,690号に記載の抗体コードライブラリーに対して、新規な活性(即ち、発現ペプチドはミモトープではなかった)ではなく抗原結合活性がスクリーニングされた。
天然のタンパク質に基づいてライブラリー(例えば、ゲノム発現ライブラリー)を開発する幾つかの試みが、これまでなされてきた。数千種に及ぶポリペプチド又はペプチドのライブラリーが、遺伝子発現系によって作製され、化学的支持体上、又は生物活性の試験に適切な生物系中にディスプレイされてきた。例えば、大腸菌(Escherichia coli)MG1655から単離したゲノム断片は、ファージディスプレイ技術を用いて発現され、その発現ペプチドのスクリーニングによって、抗RecAタンパク質ポリクローナル抗血清に結合するペプチドの同定がなされてきた(Palzkill et al., Gene, 221 79-83, 1998)。このような発現ライブラリーは、単一ゲノムからの核酸を用いて一般に産生され、タンパク質の多重連結タンパク質ドメインを含めて、全遺伝子及び/又は多重遺伝子あるいは全オペロンを含む核酸断片から、一般になっている。その上、多種の細菌がrecAコード遺伝子を含むので、Palzkill等が記載したライブラリーのスクリーニングは、該対象微生物の既知の活性に対してなされたものであり、新規な生物活性に対してなされたものではない(即ち、発現ペプチドは必ずしもミモトープではなかった)。
米国特許第5,763,239号(Diversa Corporation)には、特性未決定のゲノムの混合物を含んだ特性未決定の環境試料から、平均化ゲノムcDNAライブラリーを産生する手順が記載されている。Diversa Corporationが記載した手順は、環境試料から単離したDNAを融解し、該DNAを厳しい条件下で再アニーリングすることを含む。短時間に相補鎖に再アニーリングする可能性の低い希少配列を一本鎖核酸として単離し、遺伝子発現ライブラリーを生成するために用いる。しかし、このような特性未決定の試料内の各微生物の総合的平均化は、その実現が困難なため、該ライブラリーの生物多様性は減少する。このようなライブラリーは、特定の微生物が自然の環境中で見出される頻度に偏る傾向も示す。したがって、該ライブラリーは、特定の生物試料中で見出される生物多様性の真の集合を表わすものではない。環境試料が支配的微生物を含む場合、ライブラリーの配列多様性に悪影響を及ぼす種の偏向が顕著になる恐れがある。更にまた、このような試料中に見出される微生物の多くは特性未決定であるので、このようなライブラリーを含むゲノムの構成に関して、殆ど情報が知られていない。したがって、このようなライブラリーの真の多様性を推定することは不可能である。その上、Diversa Corp.法は、特性未決定の核酸を増幅するために、ランダムプライマーを用いるPCRに依拠しているので、例えば、環境試料中の微生物のゲノム間にまたがる反復配列の不均衡表示などの偏向因子を解釈することが不可能である。
したがって、その発現ペプチドが、標的のタンパク質又は核酸に結合するのに十分な二次構造又は立体配座を取ることができる、非常に多様で特性の良く決定された発現ライブラリーを、例えばタンパク質ドメインをコードする挿入核酸などによって構築する改良法を作り出す必要性がなお存在している。
本明細書で使用する場合、「タンパク質ドメイン」という用語は、タンパク質の個別部分であって、その部分が、標的タンパク質又は標的核酸に関して特異な機能を発揮すること、特に、標的の該タンパク質又は核酸に結合することを可能とするのに十分な二次構造又は立体配座を取るタンパク質の前記個別部分を意味すると解釈するものとする。好ましいタンパク質ドメインは、標的タンパク質又は標的核酸に結合するため、又は前記結合を強化するために、足場構造内に束縛される必要はない。
「タンパク質ドメイン」もしくは「ドメイン」という用語、又は類似の用語は、文脈から別の意味を指示しない限り、独立に折り畳まれるペプチド構造(即ち、「サブドメイン」)を含むと解釈するものとする。例えば、トロンボモジュリンの第4上皮増殖因子様ドメインのCループから得られる、19残基断片からなるタンパク質サブドメインが、Alder et al., J. Biol. Chem., 270: 23366-23372, 1995によって記載されている。したがって、当業者には、「タンパク質サブドメイン」の意味が認識されている。
また、標的中の構造の必ずしも反復部ではないが、その標的と適合する二次及び/又は三次構造を取るか、又は提示することによって、該標的のタンパク質又は核酸の活性を調節するペプチドを同定するために、前記のようなライブラリーをスクリーニングする必要性もなお存在している。単なる一次構造ではなく、このような立体配座的特徴に基づく選択によって、化学的には無関係ながら同一標的の活性を調節する、広範囲の有用な治療・診断化合物を指示できるという利点が得られる。
虚血/発作
発作は、オーストラリアにおいて第2の主要死因であり、身体障害の主要な一因である。本明細書で使用する場合、「発作」という用語には、任意の虚血性障害、例えば末梢血管疾患、静脈血栓症、肺塞栓、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、肺虚血、不安定狭心症、可逆性虚血性神経障害、副次的血栓溶解活性、過剰血液凝固状態、再潅流傷害、鎌状赤血球貧血、発作障害、又は血管形成術などの医原性虚血期が含まれる。
オーストラリア社会にとって、発作の直接的及び間接的経費は、年間当たり20億ドルを超えると見積もられている。現状では、発作に付随し、発作に付随する長期脳障害の主因と考えられている遅延神経細胞死を阻止する有効な臨床薬は存在しない。急性虚血発作の治療は、これまで形成血塊の破壊に集中してきた。Activase (遺伝子操作組織プラスミノーゲンアクチベーター:Genentec)、Abciximab(血小板阻害剤:Centocor)、Ancrod(フィブリノーゲン溶解性)などの薬物は、発作後直ちに投与した場合、ある程度の成果を示してきた。グルタメート受容体アンタゴニストを標的として神経損傷を予防する代替手法においてさえ、恐らくは発作早期にこのような事象を標的とする必要性のために、患者の治療成績に有意な、又は一貫した改善が認められなかった。
虚血におけるMAPKキナーゼ経路の関与
多種の証拠から、c-Jun N末端キナーゼ(JNK又はSAPK)が、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)経路の活性化を介して、虚血中又はその後の神経細胞死に関与していることが示される。
JNK経路の各成分は、その活性化及び細胞局在を調節する足場タンパク質と結合している。他のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)と同様に、JNK活性は、プロテインキナーゼのカスケード、及び二重特異性MAPKプロテインホスファターゼを含めたプロテインホスファターゼによって制御される。例えば、JNK相互作用性プロテイン-1(JIP-1)足場タンパク質は、JNK、MAPKキナーゼ4(MKK4)及びMAPKキナーゼ7(MKK7)、ならびに混合系統キナーゼ(MLK)ファミリーの構成キナーゼに特異的に結合し、神経細胞におけるJNK活性化を調節する。MKK7及びMLKファミリー員の二重ロイシンジッパーキナーゼ(DLK)のN末端内個別領域は、JIP-1との結合を媒介する。JNKはc-Junに結合するが、これは効率的なc-Junリン酸化に必要と思われる。
JNKの上流で作用する死関連JNK/c-Jun経路の数種の構成成分が、明確になった。この内最も遠位にあるのが、Rho低分子量GTPアーゼファミリー員のRac1及びCdc42である。構成的に活性形のRac1(即ち、Rac1V12)及びCdc42(即ち、Cdc42V12)の過剰発現は、JNK経路の活性化、ならびにJurkat Tリンパ球、PC12細胞及び交感神経細胞の死をもたらす。逆に、交感神経細胞におけるCdc42(即ち、Cdc42N17)及びRac1(即ち、Rac1N17)の優性ネガティブ変異体の過剰発現は、c-Junの増加及び神経成長因子(NGF)の除去で喚起される死を予防する(Bazenet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3984-3989, 1998; Chuang et al., Mol. Biol. Cell 8, 1687-1698, 1997)。優性ネガティブ変異体Rac1N17の過剰発現は、Cdc42V12による死の誘導を逆転させもするが、Cdc42N17はRac1N17誘導死に無効であり、Cdc42はRac1の上流にあることが示唆される(Bazenet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3984-3989, 1998)。同様の手法により、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ4及び7(MKK4及びMKK7)は、Cdc42はRac1の下流にあり、JNKのすぐ上流にあることが示された(Foltz et al., J. Biol. Chem. 273, 9344-9351, 1998; Holland et al., J. Biol. Chem. 272, 24994-24998, 1997; Mazars et al., Oncogene 19, 1277-1287, 2000; Vacratsis et al., J. Biol. Chem. 275, 27893-27900, 2000; Xia et at., Science 270, 1326-1331, 1995; Yamauchi et at., J. Biol. Chem. 274, 1957-1965, 1999)。構成的に活性で、優性ネガティブな構築体を用いた研究により、アポトーシスシグナル調節キナーゼ1(ASK1)も、Cdc42と下流のMKK及びJNKとの間にある、経路中の追加の関与成分として関連付けられた(Kanamoto et al., Mol. Cell. Biol. 20, 196-204, 2000)。
MLKは、MKKキナーゼとして機能し、MKKの活性化を介してJNKの活性化を起こすことが示された(Bock et at., J. Biol. Chem. 275, 14231-1424, 2000; Cuenda et at., Biochem. J. 333, 11-159, 1998; Hirai et at., J. Biol. Chem. 272, 15167-15173, 1997; Merritt et al., J. Biol. Chem. 274, 10195-10202,1999; Rana et al., J. Biol. Chem. 271, 19025-19028, 1996; Tibbles et al., EMBO J. 15, 7026-7035, 1996; Vacratsis et al., J. Biol. Chem. 275, 27893-27900, 2000)。このファミリーに属するものには、MLK1、MLK2(MSTとも呼ばれる)、MLK3(SPRK又はPTK1とも呼ばれる)、二重ロイシンジッパーキナーゼ(DLK:MUK又はZPKとも呼ばれる)、及びロイシンジッパー保持キナーゼ(LZK)が挙げられる。Rac1及びCdc42の構成的に活性な変異体は、MLK2及び3に結合し、それらの活性を調節することが判明しており、MLK3及び活性化Cdc42の共発現により、MLK3の活性化が促進される。
虚血又は発作の動物モデルにおいて、アポトーシス生起ニューロンは、JNKによる転写因子c-Junのリン酸化を促進した。その上、ニューロンのc-Jun量は、栄養因子の消散に応じて増加し、この転写因子の優性ネガティブ型は、JNKの選択的活性化により喚起されるニューロンの細胞死に対して、少なくとも部分的に保護作用を示す(Eilers et al., J. Neurosci. 18, 1713-1724, 1998; Ham et al., Neuron 14, 927-939)。
c-Junの転写活性化作用は、多様な細胞ストレスに反応した際、JNK(SAPK)によるアミノ末端トランス作用ドメイン内の2残基、セリン63及び73におけるリン酸化によって、翻訳後レベルに調節されている。この2残基のリン酸化は、c-Junの転写活性化作用にとって決定的なものであるが、その理由は、該残基の変異によってこの作用が著しく減少するからである。JNK(SAPK)は、Ser63/73において、ERK-1及びERK-2の約10倍の速度でc-Junを容易にリン酸化する。JNK(SAPK)は、再潅流後のc-Junトランス作用ドメイン(Ser63/73)のキナーゼ活性中、その過半を担っており、したがって、c-Junの転写活性化作用を促進することによって、該JNKが、虚血に対する腎臓の超早期遺伝子反応の一部を誘発することが示唆される。c-Junの誘導は自己調節されるので、JNK(SAPK)の活性化が、心筋又は腎臓の虚血後のc-Jun誘導を少なくとも部分的に担っているようである。
虚血中及び/又は虚血後の遺伝子発現の制御におけるJNK(SAPK)の役割は、JNKによるc-Junの調節をはるかに超えた広がりを示す。c-Junは、c-Fos又はATF-2(CREBファミリーの一員)との異種二量体として主に機能することが知られている。c-Fosと複合すると、該二量体は、コラゲナーゼ遺伝子などの、正準AP-1エレメントを含んだプロモーターを標的とする。しかし、ATF-2と複合すると、該二量体は、CRE配列と、AP-1変異体、例えば、c-Junプロモーター中に含まれ、多様な刺激に反応してc-Junの誘導を制御する該変異体とに選択性を示すようである。虚血及び再潅流の後、ATF-2及びc-Junは、異種二量体として、c-Junプロモーター内のATF/CREモチーフ及びJun2 TREの両方を標的とする。このことは、虚血組織の再潅流後、JNK(SAPK)は、c-Junプロモーターを含めた様々なプロモーターを標的としてATF-2/c-Jun異種二量体を差し向け、c-Jun/ATF-2二量体の両成分の転写活性化作用を促進することを示唆している。このことから、該異種二量体の結合を受けるATF/CRE部位、AP-1変異体のいずれかを含んだプロモーターによって調節される、多数の遺伝子を誘導する有力な機構が得られる。
c-Junの二量化は、虚血に反応したニューロンにアポトーシスも起こす(Tong et al., J. Neurochem. 71, 447-459, 1998; Ham et al., Biochem. Pharmacol. 60, 1015-1021, 2000)。
c-Junの同種二量体も、c-Junプロモーター中の転写調節エレメント(TRE)への結合を介して、c-Jun転写因子を活性化することが知られている。
本明細書で使用する場合、別途明記しない限り、又は文脈から別の意味を指示しない限り、「c-Jun二量化」という用語は、c-Jun単量体の同種二量化、及びc-Junと別のペプチド又はポリペプチド、例えばJNK、c-Fos、ATF-2との対合を包含するものと解釈する。
同様に、別途明記しない限り、又は文脈から別の意味を指示しない限り、「c-Jun二量体」という用語は、c-Jun単量体の同種二量体、及びc-Junと別のペプチド又はポリペプチド、例えばJNK、c-Fos、ATF-2との異種二量体を包含するものと解釈する。
本発明は、自然界の良好に折り畳むタンパク質が、非ランダム疎水性分布を有するとの本発明者等の理解に基づいている(Irback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9533-9538, 1996)。任意の天然ペプチドでは、化学的性質(例えば、疎水性、極性など)に従ったアミノ酸残基の分布は非ランダムである(Baud and Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 12494-12499, 1999)。したがって、本発明者等は、ランダムペプチドライブラリーでは、例えばタンパク質ドメインにより形成されるような二次構造及び/又は三次構造であれ、天然産又は天然ペプチドの立体配座構造の頻度が低いことを認識した、
本発明に到る研究において、本発明者等は、例えば、その全体がいずれも参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願PCT/AU第00/00414号及び米国特許公報第2003-0215846A1号に記載のようにして作製される、発現ライブラリーを利用しようと試みた。それ以外のライブラリーは、本明細書に記載されている。そのような発現ライブラリーは、多様で特性決定の良くなされた原核ゲノム及び/又は小型の真核ゲノムに由来する核酸断片を含むため、特性決定が良くなされ、非常に多様である。特に、特性決定の良くなされたゲノムの1種又は2種以上からの核酸断片の組合せを使用すると、このような発現ライブラリーで発現されるペプチド/タンパク質の多様性の程度が制御され、それによって、所望のタンパク質又は核酸に対して結合能を有する新規なペプチドを単離できる可能性が高まる。
調節性ペプチドを単離するためには、このようなライブラリーの個々のライブラリークローンにより発現される生物活性のペプチド又はタンパク質を、コードされたペプチドの活性、特に結合活性であって、由来源のタンパク質(即ち、自然の環境にある)に関しては、コードされた前記タンパク質が有すると示されなかった該活性について、スクリーニングすると理解すべきである。例えば、ライブラリーを作製するために用いた起源ゲノムから構成される配列のデータベースに対して、該ペプチド配列を局部的BLAST探索することにより、該ペプチド源の生物、及び存在する場合には、自然における該ペプチドに起因する機能が特定された。自然の環境において有すると思われる、同じ活性を有するペプチドをコードするライブラリークローンは、いずれもスクリーニング工程の間に除外される。
本発明者等は、このようなスクリーニングで同定された各ペプチドに対して、高度に保存され、特異的な二次及び/又は三次構造を同定することが可能であり、その同定は、該ペプチドの一次アミノ酸配列が、相互に対して、又はスクリーニングの対象とした標的のタンパク質もしくは核酸に対して、目立った独自性を示さないにもかかわらず、可能であることを今や見出した。これは、自然の環境において所望の活性を持たないことに基づく単なるペプチドの選択ではなく、特定の立体配座に対するペプチドの選択に基づいた改良スクリーニングアッセイを提供する。ペプチドが、非常に異なるアミノ酸配列及び高度に保存された構造を有することの低い確率、ならびに、ペプチドが、保存された構造的特徴及び標的のタンパク質又は核酸に対して阻害活性を有することの低い確率のために、構造的検討、例えば調節性ペプチドの二次及び/又は三次構造の検討が促されている。
より詳細には、本発明は、ペプチド又はタンパク質のドメイン、特に、標的タンパク質又は標的核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドをコードする、核酸を単離するための発現ライブラリーの使用に関する。この立体配座は、二次及び/又は三次の構造的特徴の産物であり、該ペプチドが標的のタンパク質又は核酸と結合するために、必ずしもその反復部ではないが、標的タンパク質又は標的核酸と適合しなければならない。本発明のこの態様に従えば、該発現ライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、特異的なタンパク質-DNAもしくはタンパク質-タンパク質の相互作用、又は細胞壁もしくは膜輸送成分を調節するために、該ライブラリーの挿入核酸断片によりコードされ、標的タンパク質又は標的核酸と結合するペプチドを同定することである。
例えば、本発明者等は、微生物及び小型真核ゲノムからの組合せ遺伝子断片を含む酵母ライブラリーのスクリーニングで、Jun二量化を阻害する多数のペプチドを同定した。同定したペプチドは、人間及び動物における発作又は発作関連損傷を予防又は治療するために有用であるが、それは、発作(即ち、塞栓症が原因の発作を模倣した焦点虚血モデル、ならびに心拍停止、重度低血圧及び頭部傷害に付随する発作及び脳損傷を模倣した広範囲虚血モデル)の動物モデルにおける送達性、安定性及び有効性によって判定される。一次スクリーニングでは、改変酵母逆ツーハイブリッドスクリーニングプラットホームにおけるJunタンパク質二量化の阻止能及び配列分析に基づいて、ペプチドの選択を行なうことにより、自然において(即ち、自然の環境において)Jun/JNK相互作用に関与することが知られていない配列を有するペプチドを決定する。
Jun二量化を阻止し、自然においてはこの機能がないペプチドは、例えば二次及び/又は三次の構造的特徴を探索することによって、更に構造解析を受けた。例えば、構造的特徴は、National Institutes of Health, 8600 Rockville Pike, Bethesda MD 20894にあるNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のウェブサイト上で入手できる適当なソフトウェアを用い、例えば、X線結晶解析及び/又はNMR分光を用いて決定した三次元生体分子構造を含むNCBI Molecules Modeling Database(MMDB)から決定される。NCBIの保存ドメインデータベース(CDD)は、3D構造ビューア(Cn3D)とリンクされる、周知のSmart、Phamの収蔵資料を含んでいる。NCBI Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)は、ドメイン構造によって、隣接タンパク質への予備計算したドメイン割り付けを使用する。ペプチド阻害剤の隣接関係をこのようにインシリコで決定することにより、本発明者等は、c-Junのロイシンジッパーに結合できるロイシンジッパー様構造を形成し、それによりJun二量化を阻害する、一群のJun二量化阻害ペプチドを同定した。このようなタンパク質は、c-JunのDNA結合性ドメインに結合できる酸性ドメインも含み、それによってc-Junのドッキング又はJun二量化を防止し得る。
インシリコ解析により、c-Junと相互作用すると思われる新規な構造及び折り畳みを形成する、第2群のJun二量化阻害ペプチドも同定した。このようなタンパク質の厳密な構造決定は、X線結晶解析、NMR又は円二色性からなる方法によって行なわれる。
本明細書で使用する場合、「ロイシンジッパー様」という用語は、ロイシンジッパーモチーフ(例えばc-Jun)に結合できる古典的なロイシンジッパー又はその一部に類似した、αヘリックス構造のサブドメインを意味すると解釈するものとする。ロイシンジッパー様サブドメインは、ロイシン残基、又は類似の疎水性及び/又は極性を有するロイシン様残基、例えばイソロイシン、バリンもしくはメチオニンの任意の組合せを含み得るもので、ロイシン残基又はロイシン様残基は、相互に最大約6〜12残基離れ、好ましくは約2〜6残基離れ、又は3〜6残基もしくは2〜4残基離れており、疎水性コアにより囲まれていると理解すべきである。αヘリックスの1回転は約3.6個のアミノ酸残基からなるので、ロイシンジッパー様サブドメインでは、該コアを維持するために、その疎水性残基は、各ロイシン様残基から約3又は4残基離れていると思われる。最適な場合、各ロイシン様残基は6又は7残基離れ、各ロイシン様残基から3又は4残基隔たった疎水性残基がそこに点在することであろう。
好ましくは、酸性ドメインは、アスパラギン酸又はグルタミン酸のクラスター、例えばAsp-Asp-Asp-Aspを含み、それは、ロイシンジッパー様サブドメインと相互作用する。例示する実施形態では、酸性ドメインは、配列Asp-Asp-Asp-Aspを含み、それは、c-JunロイシンジッパーのArg-276、Lys-273及びArg-270と相互作用する。
したがって、本発明は、標的核酸又は標的タンパク質に結合するペプチドを決定する方法であって、
(a)ライブラリーによって発現され、該標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを同定するために、該発現ライブラリーをスクリーニングし、
(b)自然の環境においては前記標的のタンパク質又は核酸に結合しない、(a)からの1種又は複数の任意のペプチドを選択し、更に
(c)保存された二次構造及び/又は三次構造を有する、(a)又は(b)からの1種又は複数の任意のペプチドを選択する
ことを含む方法を提供する。
本発明の実施に適するスクリーニング手法には、例えば、酵母2-ハイブリッド、n-ハイブリッド、逆2-ハイブリッド、逆n-ハイブリッド、分割ツーハイブリッド、細菌ディスプレイ、ミニ細胞ディスプレイ、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、共有結合ディスプレイ及びインビトロディスプレイからなる群から選択される方法が挙げられる。好ましい実施形態では、発現ライブラリーはファージディスプレイ法を用いてスクリーニングされる。
好ましくは、本発明のスクリーニング法は、本明細書に記載の方法により発現ライブラリーを構築することを更に含む。例示した発現ライブラリーのいずれをも含め、このような方法により作製した任意のライブラリーはこの目的に適当である。その代わり又はそれ以外に、任意の適切な発現ライブラリーが、本発明の方法に従って、スクリーニングのために得られる。
場合により、例えば表面プラズモン共鳴(SPR/Biacore)又は等温熱量測定(ITC)を用いることにより、選択ペプチドの固定化標的への結合力を測定し、所望の特定の親和性(例えば、高親和性)で結合する該ペプチドを選択する、二次スクリーニングを行う。
その代わり又はそれ以外に、本法は、ペプチドを選択した系とは異種の系で、該ペプチドが標的のタンパク質又は核酸と相互作用する能力を決定することを含む。「異種の系」とは、異なる細胞、及び/又は異なるレポーター遺伝子の使用、及び/又は一次スクリーニングの相互作用に対する、標的の該タンパク質又は核酸の異なる結合性パートナーとの相互作用の測定を意味している。例えば、一次酵母逆ハイブリッドスクリーニングにおいてc-Jun二量化を阻止するペプチドは、異なるレポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ)の発現が、AP-1エンハンサーエレメントの作動可能な制御下に配され、c-Jun二量化に依存している哺乳類細胞中で発現できる。
本発明は、本明細書に記載のスクリーニング法を、このようなスクリーニングで同定される化合物の試作規模製造又は工業規模製造に移行するための、任意のインシリコ分析法及び/又は工業的方法の使用を包含することは明らかである。本発明は、任意のこのような製造に対する情報の提供も行なう。
したがって、本発明は、上記の化合物又はモジュレーターを同定又は決定する方法であって、
(i)標的のタンパク質及び/又は核酸との結合に十分な立体配座を形成できるペプチドを同定又は決定するために、本明細書に記載の方法を実施し、
(ii)該化合物、又は該ペプチドの名称もしくは構造を、例えば文書形式、機械可読形式又はコンピュータ可読形式で提供する
ことを含む方法も提供する。
場合により、本方法は、(i)の後に該ペプチドの量を決定することを更に含む。場合により、本方法は、(i)の後に該ペプチドの構造を決定することを更に含む。
本明細書で使用する場合、「該ペプチドを提供する」という用語は、前記化合物を製造する(誘導体にして、又はせずに)任意の化学法又は組換え法合成手段を含むか、あるいは、任意の個人又は手段により既に合成された化合物の提供を含むと解釈するものとする。
好ましい実施形態では、該化合物、又は該化合物の名称もしくは構造には、例えば本明細書に記載のスクリーニングで決定した場合、その使用に関する指示が添えられる。
本発明は、上記のペプチドを同定又は決定する方法の実施を含む、上記化合物を製造する方法であって、
(i)標的のタンパク質及び/又は核酸との結合に十分な立体配座を形成できるペプチドを同定又は決定するために、本明細書に記載の方法を実施し、
(ii)場合により、該ペプチドの量を決定し、
(iii)該ペプチドの名称又は構造を、例えば文書形式、機械可読形式又はコンピュータ可読形式で提供し、
(v)該ペプチドを提供する
ことを含む方法も提供する。
場合により、本方法は、(i)の後に該ペプチドの構造を決定することを更に含む。
好ましくは、本方法は、アミノもしくはカルボキシ末端の保護、ペプチドの環化、又はレトロ逆方向ペプチドとしての該ペプチドの構築によって、該ペプチドの化学誘導体を提供することを更に含む。
好ましい実施形態では、該合成ペプチド、又は該ペプチドの名称もしくは構造には、例えば本明細書に記載のスクリーニングで決定した場合、その使用に関する指示が添えられる。
本発明は、本発明の方法により同定したペプチドを医療に使用するために製造する方法であって、
(i)標的のタンパク質及び/又は核酸との結合に十分な立体配座を形成できるペプチドを同定又は決定するために、本明細書に記載の方法を実施し、
(ii)医療に使用するための治療薬又は予防薬の製造に該ペプチドを使用する
ことを含む方法も提供する。
一実施形態では、該方法は該ペプチドを単離する追加のステップを含む。あるいは、医療に使用するための化合物の製造に使用するために、化合物を同定し、生成する。
また本発明は、2個のc-Junタンパク質間の相互作用、即ち自己二量化、又はc-Junと別のタンパク質、例えばATF-2、c-FosもしくはJNKとの、好ましくはc-JunとATF-2との、もしくはc-Junとc-Fosとの相互作用(即ち、c-Jun異種二量体)を阻止する単離したペプチド又はタンパク質ドメイン、あるいは単離した前記ペプチド又はタンパク質ドメインの類縁体も提供する。好ましくは、単離した該ペプチドは、ロイシンジッパー様のドメイン又はサブドメインを含み、場合により、前記したような酸性のドメイン又はサブドメインを更に含む。一層より好ましくは、単離した該ペプチド又はタンパク質ドメインは、細胞内でc-Jun二量化を阻止する。
特に好ましい一実施形態では、単離した該ペプチドは、以下のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178及び配列番号180。
本明細書での開示内容から、以下に示した配列、配列番号66、配列番号70、配列番号74、配列番号78、配列番号82、配列番号86、配列番号90、配列番号94、配列番号98、配列番号102、配列番号106、配列番号110、配列番号114、配列番号118、配列番号122、配列番号126、配列番号130、配列番号134、配列番号138、配列番号142、配列番号146、配列番号150、配列番号154、配列番号158、配列番号162、配列番号166、配列番号170、配列番号174及び配列番号178は、発現ライブラリーを作製するために使用したファージベクターがコードするペプチドと、該ベクター中に挿入した小型真核性又は原核性のゲノムDNAがコードするペプチドとの融合体を含むことが理解されよう。したがって、コードされたこのようなペプチド部分の新規な融合ペプチドへの合体は、c-Jun二量化の阻害を可能とする一手段である。本発明がこのような融合ペプチドの製造及び使用を包含することは、明らかである。
あるいは、以下に示したアミノ酸配列、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号80、配列番号84、配列番号88、配列番号92、配列番号96、配列番号100、配列番号104、配列番号108、配列番号112、配列番号116、配列番号120、配列番号124、配列番号128、配列番号132、配列番号136、配列番号140、配列番号144、配列番号148、配列番号152、配列番号156、配列番号160、配列番号164、配列番号168、配列番号172、配列番号176及び配列番号180は、該ベクター中に挿入した小型真核性又は原核性のゲノムDNAによりコードされる。このようなペプチドもc-Jun二量化の阻害に有用であり、本発明がこのようなペプチド(即ち、隣接するファージベクター配列のない)を全て包含することは明らかである。
本発明が、例示したc-Jun二量化阻害ペプチドのペプチド類縁体まで及ぶことは明らかである。このようなペプチドの特に好ましい類縁体は、レトロ逆方向ペプチドである。例えば、レトロ逆方向ペプチドは、配列番号181又は配列番号182に示したアミノ酸配列を含み得る。
本発明が、細胞内でc-Jun二量化を一部又は完全に阻害又は拮抗又は阻止するペプチド又はタンパク質ドメインを、コードする任意の単離核酸まで及ぶことは明らかである。本明細書に示す例示的核酸は、以下のもの、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177及び配列番号179からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明のペプチド阻害剤については、本発明が、本明細書の表5に示す群別に従って、ファージベクター由来の隣接配列を含むか、又はこのような隣接配列を省いた、例示ペプチドの亜群まで及ぶことは、明らかである。
本発明は、単離した核酸断片のヌクレオチド配列を含むデータベースも提供する。好ましくは、該データベースは、予測構造、又はX線結晶解析もしくは他の実験手段により決定した構造を含め、ペプチドの二次構造に関する情報を取り込む。
本発明は、c-Jun二量化を阻害するペプチドの類縁体であって、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドの逆方向アミノ酸配列を含み、その中の全アミノ酸残基が反転している類縁体も提供する(即ち、対応するDアミノ酸残基で置換されている)。
本発明は、c-Jun二量化を阻害するペプチドの類縁体であって、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドの逆方向アミノ酸配列を含み、その配列中のグリシン以外のアミノ酸残基が反転している類縁体も提供する(即ち、対応するDアミノ酸残基で置換されている)。好ましくは、グリシン以外の全アミノ酸残基が反転している。
特に好ましい一実施形態では、本発明は、c-Jun二量化を阻害できるペプチドの類縁体であって、前記類縁体が配列番号132又は136に示したアミノ酸配列の全体的又は部分的逆方向配列を含み、該逆方向アミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸残基がDアミノ酸残基である、類縁体を提供する。より好ましくは、本発明は、c-Jun二量化を阻害できるペプチドの類縁体であって、(i)配列番号132又は136に示したアミノ酸配列の全体的又は部分的逆方向配列からなり、該逆方向アミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸残基がDアミノ酸残基である、配列を含む第1のペプチジル部分、及び(ii)アミノ酸スペーサーにより(i)から隔てられてもよいタンパク質形質導入ドメインを含む、類縁体を提供する。
本発明は、標的を決定又は検証する方法であって、
(a)ライブラリーによって発現され、標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを同定するために、発現ライブラリーをスクリーニングし、
(b)自然の環境では標的の前記タンパク質又は核酸に結合しない、1種又は複数のペプチドを(a)から選択し、
(c)保存された二次及び/又は三次構造を有する1種又は複数のペプチドを、(a)又は(b)から選択し、
(d)選択したペプチドをある生物中で発現し、該標的タンパク質又は標的核酸により調節される、該生物の表現型を決定する
ことを含む方法も提供する。
本発明は、治療又は予防化合物を同定する方法であって、
(a)ライブラリーによって発現され、標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを同定するために、発現ライブラリーをスクリーニングし、
(b)自然の環境では標的の前記タンパク質又は核酸に結合しない、1種又は複数のペプチドを(a)から選択し、
(c)保存された二次及び/又は三次構造を有する1種又は複数のペプチドを、(a)又は(b)から選択し、
(d)選択したペプチドをある生物中で発現し、該標的タンパク質又は標的核酸により調節される、該生物の表現型を決定し、
(e)場合により、該生物の表現型を調節したペプチドの模倣化合物を同定する
ことを含む方法も提供する。
本発明は、対象における発作などの虚血障害を治療又は予防における化合物の効果を決定する方法であって、a)虚血障害の動物モデルに虚血障害を誘発させ、b)前記動物における発作の治療成績を測定し、c)対象における虚血障害を治療又は予防できる化合物を同定するように、(b)における発作の治療成績を、該化合物が存在しない場合の動物モデルの発作治療成績と比較することを含む方法も提供する。
本発明は、疾患又は障害を治療する方法であって、疾患及び/又は障害に罹患しているか、あるいは疾患及び/又は障害を発症し、及び/又はそれに罹患する危険に瀕している対象に、本発明のスクリーニング法により同定したペプチド、又は前記ペプチドの類縁体の有効量を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を予防又は治療する方法であって、本明細書に記載の任意の実施形態による、c-Jun二量化のペプチド阻害剤、又は前記ペプチドの類縁体を、治療が必要な対象に投与することを含む方法も提供する。
好ましい一実施形態では、本発明は、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を予防又は治療する方法であって、治療が必要な対象に、以下のもの、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178及び配列番号180からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記ペプチドの類縁体を投与することを含む方法を提供する。
関連する一実施形態では、本発明は、c-Junの二量化を阻害する、本明細書に記載の任意の実施形態によるペプチド、又は前記ペプチドの類縁体の医療における使用を提供する。医療における好ましい使用は、例えば、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を治療するための医薬の製造においてなされる。
本発明は、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を予防又は治療する方法であって、本明細書に記載の任意の実施形態による、c-Jun二量化阻害ペプチドをコードする単離核酸、又は前記ペプチドの類縁体を、治療が必要な対象に投与することを含む方法も提供する。
c-Jun二量化阻害ペプチドをコードする好ましい核酸は、以下のもの、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177及び配列番号179からなる群から選択される配列を含むであろう。
関連する一実施形態では、本発明は、c-Junの二量化を阻害する、本明細書に記載の任意の実施形態によるペプチド、又は前記ペプチドの類縁体をコードする単離核酸の医療における使用を提供する。医療における好ましい使用は、例えば、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を治療するための医薬の製造中になされる。
本発明が、多数又は複数の単離したc-Jun二量化阻害ペプチドもしくはその類縁体、又は前記のものをコードする核酸の医療における使用、例えば、対象における虚血又は虚血事象(例えば、発作)を治療するための医薬の製造における使用を包含することは、明らかである。
適切な発現ライブラリー
標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有する、及び/又はそれに結合するポリペプチドを発現するための発現ライブラリーは、以下に記載のように構築される。
本明細書で使用する場合、「発現ライブラリー」という用語は、クローン化DNA断片がペプチド又はタンパク質を産生するために発現されるように、組換え発現ベクター中にクローニングされた複数の核酸を意味すると解釈するものとする。本明細書で使用する場合、「発現」、「発現される」又は「発現する」という用語は、RNA分子を産生するためのヌクレオチド配列の少なくとも転写を意味すると解釈するものとする。「発現」、「発現される」又は「発現する」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を産生するための前記RNA分子の翻訳を更に意味する。
本明細書で使用する場合、「標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有する」という用語は、発現ペプチドが、抑制ペプチド、例えばTrxループの好ましくは不在下で、特定の標的のタンパク質又はペプチド又はポリペプチド、あるいは標的核酸と結合するのに十分な、二次構造及び/又は三次構造を実現できることを意味すると解釈するものとする。このような親和性は、例えば、ペプチド-ペプチド複合体、ペプチド-タンパク質複合体、抗原-抗体複合体、及びペプチド-核酸複合体を含むように、できる限り広い文脈で解釈すべきである。
したがって、「標的のタンパク質又は核酸に結合する」ペプチドは、このような結合が生じるのに必要な二次及び/又は三次構造も実現する。
適切な発現ライブラリーを作製するための好ましい手段は、1種又は2種以上の原核生物及び/又は小型真核生物であって、前記原核生物(及び/又は微生物)及び/又は小型真核生物がそれぞれ実質的に配列決定されたゲノムを有するそのゲノムから、核酸断片を作製することを含む。
本明細書で使用する際の「断片」という用語は、遺伝子を形成する核酸の一部分と同じであるが、その全体ではない核酸を意味すると解釈するものとする。「断片」という用語は、遺伝子間領域の一部分も包含するが、その全体は包含しない。
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ペプチド又はポリペプチドをコードすることのできる、核酸、具体的にはDNAのセグメントを意味するが、本明細書の文脈では、「核酸断片」は、天然遺伝子のコード領域の前後にある領域、例えば5'非翻訳配列又は3'非翻訳配列、ならびに個々のコード配列間の介在配列も含む。
本明細書における開示から、本発明による発現ライブラリーを作製するために用いた核酸断片は、自然において生成するものと同じタンパク質又はペプチドを必ずしもコードしていない(即ち、それらの由来源の遺伝子)ことは、明らかであろう。実際幾つかの状況では、該核酸断片は、特に天然遺伝子の非コード領域に由来する場合、これまで未知のペプチドをコードするであろう。必要とされるのは、ペプチド又はタンパク質のドメインをコードするのに十分な長さのオープンリーディングフレームだけである。
核酸断片は、当業者に公知の多様な方法の1つ又は複数により生成する。このような方法には、例えば、機械的せん断(例えば、超音波、又は細口径針中の核酸の通過)、ヌクレアーゼ(例えば、Dnase1)による消化、1種又は複数の制限酵素、好ましくは4塩基制限酵素部位を認識する高頻度切断酵素による消化、及び放射線によるDNA試料の処理(例えば、γ線又は紫外線)からなる群から選択される、核酸断片の作製法が挙げられる。適切な方法は、例えばAusubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN047 150338, 1987の中)又はSambrook等(...の中)に記載されている。
別の実施形態では、1種又は2種以上の生物に由来する核酸断片は、例えばランダム又は縮重オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成される。好ましくは、このようなランダム又は縮重オリゴヌクレオチドは、増幅した核酸の適当な核酸ベクター中へのクローニングを可能とするために、制限酵素認識部位を含む。オリゴヌクレオチドを生成する方法は、当分野で公知であり、例えばOligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxfordのテキスト全体、特にその中のGait, pp1-22; Atkinson et al., pp.35-81; Sprout et al., pp.83-115; 及びWu et al., pp.135-151による論文に記載されている。PCRを実施する方法も、PCR A Practical Approach, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 1991中のMcPherson等により詳述されている。
好ましい実施形態では、核酸断片は、タンパク質ドメイン、好ましくは1個又は2個のタンパク質ドメインをコードするのに十分な長さを有するヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含むか、それからなる。タンパク質ドメインの例には、とりわけ、ヘリックスループヘリックス(HLH)、ロイシンジッパー、ジンクフィンガー、SH2ドメイン、SH3ドメイン、WWドメイン、C2ドメイン、及び多プロリン領域(PRR)を含む群から選択されるタンパク質ドメインが、例えば挙げられる。しかし、本発明をこのようなタンパク質ドメインに限定すべきではない。むしろ本発明は、二次及び/又は三次構造を形成できるアミノ酸の配列を含む、任意のドメインを想定している。好ましくは前記構造は安定であり、より好ましくは、前記構造は構造足場の不在下で安定である。
幾つかの研究によれば、自律的に折り畳むことのできる最小の天然ドメインは、長さが約19アミノ酸から約87アミノ酸からなることが示された(Gegg et al., Protein Science, 6: 1885-1892, 1997, Yang, Biochemistry 38, 465, 1999, Alder et al., J. Biol. Chem., 270: 23366-23372, 1995, Horng. Biochemistry, 41:13360, 2002, Neidigh, Nature Structural Biology, 9:425, 2002)。これに関しては、「自律的」という用語は、制御因子に依らないこと、即ち自律的に折り畳むことのできるタンパク質は、例えばジスルフィド結合、リガンドの結合、又は例えばTrxループなどの抑制物の使用などの因子の不在下で、自律的に折り畳む。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、発現ライブラリーの核酸断片は、長さが少なくとも約30〜50アミノ酸のペプチドをコードするのに十分なオープンリーディングフレームからなろう。
ジスルフィド結合などの因子は、ペプチドの折り畳みを制御することも知られている。米国特許第6,361,969号及び米国特許第6,083,715号は、タンパク質におけるジスルフィド結合の形成を誘発するための、タンパク質ジスルフィド異性化酵素の発現を記載している。Vrankenによる研究(Proteins, 47: 14-24, 2002の中)では、ジスルフィド結合で安定化された天然タンパク質ドメインは、長さが15〜25アミノ酸まで小さくなり得ることが示唆された。したがって、本発明の代替の一実施形態では、長さが少なくとも約15アミノ酸から約25アミノ酸のペプチドをコードするのに十分なオープンリーディングフレームからなる核酸断片が使用される。
ペプチドサイズの上限に関しては、自然において生じるタンパク質全体を含まないか、それから成り立っていないことが好ましい。好ましくは、該ペプチドは、1個もしくは2個もしくは3個もしくは4個のタンパク質ドメイン又は折り畳み又はサブドメインを含む。より好ましくは、該ペプチドは、1個もしくは2個のタンパク質ドメイン又は折り畳み又はサブドメインを含む。したがって、該ペプチドは、約200個未満のアミノ酸、より好ましくは約150個未満のアミノ酸、更により好ましくは約120個未満のアミノ酸を含むのが好ましい。例えば、本発明者等は、c-Junに結合し、c-Jun二量化を阻害できる約99アミノ酸を含むペプチドを同定した。更に、本発明者等は、長さが約75、70、65、60、50、40、30、20又は15アミノ酸を含むペプチドを同定した。
本発明が、好ましくは、約45から長さ約600ヌクレオチド又は長さ約300ヌクレオチドの長さを有する核酸断片を利用することは、前記の記載から明らかであろう。しかし、平均して、生成する核酸断片が、大体長さが少なくとも約15〜約100アミノ酸、より好ましくは長さが少なくとも約20〜約100アミノ酸、更により好ましくは長さが少なくとも約30〜約100アミノ酸を含むタンパク質ドメイン又はペプチドをコードする限り、前記の範囲からある程度外れても許容されると理解すべきである。
核酸断片を作製し、それらの分子量に従って前記断片を分離する方法は、当分野で公知であり、例えば、上記の断片形成法、ならびにアガロースゲル電気泳導、パルスフィールドゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳導、密度勾配遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー及びそれらの混合方式からなる群から選択される分離法を包含する。その大きさによりDNA断片を分離する他の方法は、幾通りも知られており、例えばSambrook等(In:)に記載されている。
ゲノム核酸は多様な起源から単離される。好ましい一実施形態では、ゲノムDNAは原核生物から単離される。核酸断片の例示的原核源には、アエロピラムペルニクス、アグロバクテリウムトゥムフィシアンス(Agrobacterium tumeficians)、アクイフェックスエオリクス、アーケオグロブスフレギディス、バチルスハロデュランス(Baccilus halodurans)、枯草菌、 ライム病ボレリア、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、ブタ流産菌(Brucella suis)、ブルヒネラ種(Bruchnera sp.)、カウロバクタークレセントゥス(Caulobacter crescentus)、カンピロバクタージェジュニ(Campylobacter jejuni)、クラミジアニューモニエ、クラミジアニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、クラミジアムリダルム(Chlamydia muridarum)、クロロビウムテピドゥム(Chlorobium tepidum)、クロストリジウムアセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、デイノコックスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、大腸菌、インフルエンザ菌Rd、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、ラクトコッカスラクティス(Lactococcus lactis)、リステリアイノキュア(Listeria innocua)、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、メタノコッカスヤッナシ、メソリゾビウムローティ(Mesorhizobium loti)、ハンセン菌(Mycobacterium leprae)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、性器マイコプラズマ(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマペネトランス(Mycoplasma penetrans)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマプルモニス(Mycoplasma pulmonis)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、オーシャノバチルスイヘイエンシス(Oceanobacillus iheyensis)、パスツレラマルトシダ(Pasteurella multocida)、緑膿菌、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)、パイロコッカスホリコシ、リケッチァコノリ(Rickettsia conorii)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、シェワネラオネイデンシス(Shewanella oneidensis) MR-1、フレックスナー赤痢菌(Shigella flexneri) 2a、シノリゾビウムメリローティ(Sinorhizobium meliloti)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスミュータンス(Streptococcus mutans)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトミセスアベルミリティス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトミセスコーリカラー(Streptomyces coelicolor)、スルフォロブスソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)、スルフォロブストーコーダイ(Sulfolobus tokodaii)、シネコシスティス種(Synechocystis sp.)、サーモアンエアロバクターテンコンゲンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、サーモプラズマアシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマボルカニウム、サーモトーガマリティマ、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ウレアプラズマウレアリティクム(Ureaplasma urealyticum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、キサントモナスアクソノポディスpv.シトリ(Xanthomonas axonopodis pv., Citri)、キサントモナスカンペストリスpv. カンペストリス(Xanthomonas campestris pv., Campestris)、キシレラファスティディオーサ(Xylella fastidiosa)及びペスト菌(Yersinia pestis)が挙げられる。
原核生物からゲノムDNAを単離する方法は、当分野で公知であり、例えばAusubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又は(Sambrook等 In:)に記載されている。
代替の一実施形態では、ゲノム核酸は小型真核生物に由来する。本明細書で使用する場合、「小型真核生物」という用語は、約1700メガ未満の塩基対(Mbp)、好ましくは100Mbp未満の1倍体ゲノムサイズを有する、真核生物上界の任意の生物を意味すると解釈するものとする。本目的に適した例示的小型真核生物には、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、シーエレガンス(Caenorhabditis elegans)、ダニオレリオ(Danio rerio)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、アイメリアテネラ(Eimeria tenella)、アイメリアアセルブリナ(Eimeria acervulina)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、オリジアスラティペス(Oryzias latipes)、オリーザサティバ(Oryza sativa), 熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、プラスモジウムヨエリ(Plasmodium yoelii)、サルコシスティスクルージ(Sarcocystis cruzi)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevesiae)、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、シストゾーママンソニ(Schistosoma mansoni)、タキフグルブリペス(Takifugu rubripes)、テイレリアパルバ(Theileria parva)、テトラオドンフルビアティリス(Tetraodon fluviatilis)、トキソプラズマゴンディ(Toxoplasma gondii)、トリポノソーマブルセイ(Tryponosoma brucei)及びトリパノソーマクルージ(Trypanosoma cruzi)が挙げられる。
更に、小型ゲノムを有する前記真核生物は、例えばヒトよりゲノム中の反復ヌクレオチド配列が少ないことが好ましい。このような情報は、例えばNCBI又はTIGRからの情報により決定できる。
本明細書で使用する場合、「NCBI」という用語は、アメリカ合衆国政府、国立衛生研究所、国立医学図書館にある国立生物工学情報センター(Bethesda, MD, 20894)のデータベースを意味すると解釈するものとする。
本明細書で使用する場合、「TIGR」という用語は、Institute of Genomic Research, Rockville, MD, 20850のデータベースを意味すると解釈するものとする。
例えば、小型ゲノムを有する生物はJapanese puffer fishのTakifugu rubripesである。T. rubripesは、約400Mbpの1倍体サイズを有し、遺伝子密度が約16%である。これは、ヌクレオチド配列のわずか約3%がタンパク質をコードする、3000Mbpを超えるサイズのヒトゲノムに匹敵する。T. rubripesゲノム中の天然遺伝子の絶対数は、ヒトゲノムのその数に匹敵し、T. rubripes中に現れる反復配列の方が少ないことを示唆している。この特徴により、T. rubripesは発現ライブラリーの核酸断片源として特に有用となる。これは、小型真核生物のゲノムに由来する核酸断片では、非小型真核生物に由来する配列と比較して、自然状態での天然タンパク質内に含まれるタンパク質ドメインをコードする確率が高まるからである。
タンパク質のこのような自然のドメインは、本明細書に開示するライブラリーによって発現されるが、本発明は既知のタンパク質ドメインの発現に制限されないことを理解すべきである。その上、該ライブラリーは、自然の機能を有する既知のタンパク質ドメインをコードするクローンの選択を除外する方法を用いて、スクリーニングされることを理解すべきである。したがって、本発明は、新規な、又は増強された機能を有する、ペプチドを単離するための生成物及び方法を対象としている。
真核生物からゲノムDNAを単離する方法は、当分野で公知であり、例えばAusubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又は(Sambrook等(In:)に記載されている。
本発明の更なる実施形態では、核酸断片は相補DNA(cDNA)に由来する。当業者であれば、cDNAが、例えばAvian逆転写酵素(AMV)又はMoloneyマウス白血病ウイルス(MMLV) 逆転写酵素を用いたRNAの逆転写によって生成することは、認識されていよう。このような逆転写酵素及びその使用法は、当分野で公知であり、市販のキット、例えばPowerscriptキット(Clontech)、Superscript IIキット(Invitrogen)、Thermoscriptキット(Invitrogen)、Titaniumキット(Clontech)、又はOmniscriptキット(Qiagen)において入手できる。次いで、このようなcDNAを用いて、例えば本明細書に記載の方法を使用して核酸断片を作製してもよい。
多様な生物からmRNAを単離する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又はSambrook等(In:)に記載されている。
単離RNAからcDNAを生成する方法も、当分野で一般に知られており、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又は(Sambrook等(In:)に記載されている。
好ましい一実施形態では、RNA又はcDNAから生成した核酸断片は、より高度に発現する遺伝子に偏るのを抑えるために、標準化される。核酸を標準化する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又はSambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)、及びSoares et al Curr. Opinion Biotechnology 8, 542-546, 1997、ならびにそれらの中で引用されている参考文献に記載されている。このような一方法(Soaresが記載)は、高度に発現する配列にライブラリーが偏るのを抑えるために、再結合に基づく速度を使用する。
あるいは、Kopczynski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17), 9973-9978, 1998に記載のように、磁気ビーズに結合したゲノムDNAとのハイブリッド形成により、cDNAを標準化する。これにより、磁気ビーズからの溶出液中にcDNA配列がほぼ均等に発現する。1種又は2種以上の原核生物又は小型真核生物から、cDNAを用いて作製した標準化発現ライブラリーは、本発明によって明らかに想定されている。
特に好ましい一実施形態では、核酸断片は、実質的に配列決定されたゲノムを有する原核生物及び/又は小型真核生物に由来する。このような断片を使用する利点は、特性未決定のライブラリーを用いて可能となる程度より、ライブラリー構成に関するもっと完全な情報を得るために、バイオインフォマティクスデータを結集し、使用できることである。これにより、例えば、ライブラリーの核酸断片の多数又は全てに由来する配列を含有する、DNAアレイの生成が促進される。DNAアレイの生成及びスクリーニングに使用される方法は、当分野で公知であり、例えば、Schena (Microarray Analysis, John Wiley and Sons, ISBN: 0471414433, 2002の中)に記載されている。生物多様な核酸断片のスクリーニングによる陽性クローンの配列決定を目指す、ハイスループット分析にDNAアレイを使用することは、想定されている。
本明細書で使用する場合、「実質的に配列決定されたゲノム」とは、そのゲノムの少なくとも約60%が配列決定されたことを意味するものとする。より好ましくは、そのゲノムの少なくとも約70%が配列決定されており、より好ましくは、そのゲノムの少なくとも約75%が配列決定されたことである。更により好ましくは、そのゲノムの少なくとも約80%が配列決定されたことである。
配列決定されたゲノムの量を決定する方法は、当分野で公知である。更に、配列決定された配列に関する情報は、例えば、NCBIやTIGRのデータベースなどの公共源から用意に入手され、それによりゲノムの多様性の判定が促進されている。
実質的に配列決定されたゲノムを有する生物には、例えば、以下のものからなる群から選択される生物が含まれる: アクチノバチルスブリューロニューモニエ血清型変種(Actinobacillus pleuropneumoniae serovar)、アエロピルムペルニクス、アグロバクテリウムトゥムフィシアンス(Agrobacterium tumeficians)、ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、アクイフェクスエオリクス、シロイヌナズナ、アーケオグロブスフルギディス、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(bacillus cereus)、バチルスハロデュランス(Baccilus halodurans)、枯草菌、バクテロイデステタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)、ブデロビブリオバクテリオボラス(Bdellovibrio bacteriovorus)、ブドバクテリウムロングム(Bdobacterium longum)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、ブラディリゾビウムヤポニクム(Bradyrhizobium japonicum)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、ブタ流産菌、ブルヒネラアフィディコーラ(Bruchnera aphidicola)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、シーエレガンス(Caenorhabditis elegans)、カンピロバクタージェジュニ、カンディダトゥスブロヒマニアフロリダヌス(Candidatus blochmannia floridanus)、カウロバクタークレセントゥス(Caulobacter crescentus)、クラミジアムリダルム(Chlamydia muridarum)、トラコーマクラミジア、クラミドフィリアキャビエ(Chlamydophilia caviae)、クラミジアニューモニエ、クロビウムテピドゥム、クロモバクテリウムビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、クロストリジウムアセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウムエフィシェンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コクシエラバーネッティ(Coxiella burnetii)、ダニオレリオ(Danio rerio)、デクロロモナスアロマチカ (Dechloromonas aromatica)、デイノコックスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、アイメリアテネラ(Eimeria tenella)、アイメリアアセルブリナ(Eimeria acervulina)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、エンテロコッカスフェーカリス(Enterococcus faecalis)、大腸菌、フゾバクテリウムヌクレアトゥム(Fusobacterium nucleatum)、ゲオバクターサルファレドゥスンス(Geobacter sulfurreducens)、ゲオバクタービオラセウス(Gloeobacter violaceus)、軟性下疳菌(Haemophilis ducreyi)、インフルエンザ菌、ハロバクテリウム(Halobacterium)、ヘリコバクターヘパティクス(Helicobacter hepaticus)、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)、ラクトバチルスジョンソニ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルスプランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトコッカスラクティス(Lactococcus lactis)、レプトスピラ・インテロガンス血清型変種ライ(Leptospira interrogans serovar lai)、リステリアイノキュア(Listeria innocua)、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、メソリゾビウムローティ(Mesorhizobium loti)、メタノバクテリウムサーモオートトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、メタノカルドコッススヤッナシ(Methanocaldocossus jannaschii)、メタノコッコイデスブルトーニ(Methanococcoides burtonii)、メタノピルスカンドレリ(Methanopyrus kandleri)、メタノサルシナアセティボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナミードゴア(Methanosarcina mead Goa)、メタノサーモバクターサーモオートトロフィクス(Methanothermobacter thermautotrophicus)、トリ型結核菌(Mycobacterium avium)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、ハンセン菌、ヒト型結核菌、マイコプラズマガリセプティクムR菌株(Mycoplasma gallisepticum strain R)、性器マイコプラズマ、マイコプラズマペネトランス、肺炎マイコプラズマ、マイコプラズマプルモニス、ナノアーケウムエキタンス(Nanoarchaeum equitans)、髄膜炎菌、ニトロソモナスユーロペー(Nitrosomonas europaea)、ネンジュモ(Nostoc)、オーシャノバチルスイヘイエンシス(Oceanobacillus iheyensis)、オニオンイエローズファイトプラズマ(Onion yellows phytoplasma)、オリジアスラティペス(Oryzias latipes)、オリーザサティバ(Oryza sativa)、パスツレラマルトシダ(Pasteurella multocida)、フォトラブドゥスルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、ピレルラ(Pirellula)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、プラスモジウムヨエリ(Plasmodium yoelii)、ポルフィロモナスジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プロクロロコッカスマリヌス(Prochlorococcus marinus)、プロクロロコッカスマリヌス(Prochlorococcus marinus)、プロクロロコッカス(Prochlorococcus)、緑膿菌、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナスシリンガエ(Pseudomonas syringae)、パイロバキュラムアエロフィラム(Pyrobaculum aerophilum)、パイロコッカスアビッシ(Pyrococcus abyssi)、パイロコッカスフリオスス(Pyrococcus furiosus)、パイロコッカスホリコシ、ラルストニアソラナセアラム(Ralstonia solanacearum)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、リケッチァコノリ(Rickettsia conorii)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、斑点熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、腸炎菌(Salmonella enterica)、ネズミチフス菌、サルコシスティスクルージ(Sarcocystis cruzi)、シストソーママンソニ(Schistosoma mansoni)、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、シェワネラオネイデンシス(Shewanella oneidensis)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、シノリゾビウムメリロティ(Sinorhizobium meliloti)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカスミュータンス(Streptococcus mutans)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトミセスアベルミチリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトミセスコーリカラー(Streptomyces coelicolor)、スルフォロブスソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)、スルフォロブストーコーダイ(Sulfolobus tokodaii)、シネコシスティス種(Synechocystis sp.)、タキフグルブリペス(Takifugu rubripes)、テトラオドンフルビアティリス(Tetraodon fluviatilis)、テイレリアパルバ(Theileria parva)、サーモアンエアロバクターテンコンゲンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、サーモプラズマアシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモシネココッカスエロンガテス(Thermosynechococcus elongates)、サーモトガマリティマ(Thermotoga maritima)、トキソプラズマゴンディ(Toxoplasma gondii)、トレポネーマデンティコーラ(Treponema denticola)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、トロフェリマホイップレイ(Tropheryma whipplei)、トリポノソーマブルセイ(Tryponosoma brucei)、トリパノソーマクルージ(Trypanosoma cruzi)、ウレアプラズマウレアリティクム(Ureaplasma urealyticum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、腸炎ビブリオ(Vibro parahaemolyticus)、ビブリオブルニフィカス(Vibro vulnificus)、ウィッグルズワーシアブレビパルピス(Wigglesworthia brevipalpis)、キイロショウジョウバエ(Drosophilia melanogaster)のウォルバヒア内部共生(Wolbachia endosymbiont)、ウォリネラサクシノゲネス(WOlinella succinogenes)、キサントモナスアクソノポディスpv.シトリ(Xanthomonas axonopodis pv. Citri)、キサントモナスカンペストリスpv. カンペストリス(Xanthomonas campestris pv. Campestris)、キシレラファスティディオーサ(Xylella fastidiosa)及びペスト菌(Yersinia pestis)。
代替の一実施形態では、ライブラリーは、実質的に配列決定されたゲノムを有し、以下のものからなる群から選択される、1種又は複数の公的に入手可能な細菌のゲノムDNAから作製される: アシジチオバチルスフェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)、カンフィロバクタージェジュニ亜種ジェジュニ(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、カウロバクタービブリオイデス(Caulobacter vibrioides)、コルウェリアサイクレリトレー(Colwellia psychrerythraea)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、デスルフォビブリオブルガリス亜種ブルガリス(Desulfovibrio vulgaris subsp. Vulgaris)、エンテロコッカスフェーカリス(Enterococcus faecalis)、大腸菌、ゲオバクターサルファレドゥスンス(Geobacter sulfurreducens)、ヘモフィラスアクチノミセテムコミタンス(Haemophilus actinomycetemcomitans)、インフルエンザ菌、ハロバクテリウムサリナルム(Halobacterium salinarum)、ハロフェラックスボルカニ(Haloferax volcanii)、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)、肺炎桿菌亜種ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae)、ラクトバチルスプランタルム(Lactobacillus plantarum)、マンハイミアヘモリティカ(Mannheimia haemolytica)、メタノコッカスヤッナシ(Methanococcus jannaschii), メタノコッカスマリパルディス(Methanococcus maripaludis)、メチロバクテリウムエクストルカンス(Methylobacterium extorquens)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ニトロソモナスユーロペー(Nitrosomonas europaea)、ネンジュモ種(Nostoc sp.)、ノボスフィンゴビウムアロマティックボランス(Novosphingobium aromaticvorans)、オイノコッカスオイニ(Oenococcus oeni)、ペクトバクテリウムアトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)、ポルフィロモナスジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、緑膿菌、パイロコッカスフリオスス(Pyrococcus furiosus)、パイロコッカスホリコシ(Pyrococcus horikoshii)、リゾビウムラジオバクター(Rhizobium radiobacter)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、腸炎菌亜種ディアリゾネ(Salmonella enterica subsp. Diarizonae)、腸炎菌亜種エンテリカ血清変種パラチフス菌A(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A)、腸炎菌亜種エンテリカ血清変種チフス菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi)、腸炎菌亜種エンテリカ血清変種ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium)、シェワネラオネイデンシス(Shewanella oneidensis)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、シリシバクターポメロイ(Silicibacter pomeroyi)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトミセスビオラセオルーバー(Streptomyces violaceoruber)、サーモプラズマボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモトーガ マリティマ(Thermotoga maritima)、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus)、チオバチルスフェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)、ウレアプラズマウレアリティカム(Ureaplasma urealyticum)、ビブリオフィッシェリ(Vibrio fischeri)、ワウターシアメタリデュランス(Wautersia metallidurans)及びキシレラファスティディオーサ(Xylella fastidiosa)、ならびにそれらの組合せ。
代替及び/又は追加の一実施形態では、核酸断片は、実質的に配列決定されたゲノムを有するウイルスに由来する。実質的に配列決定されたゲノムを有するウイルスは、当分野で公知であり、例えば、以下のものからなる群から選択されるウイルスを包含する:T7ファージ、HIV、ウマ動脈炎ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ増強ウイルス、レリスタッド(lelystad)ウイルス、ブタ生殖・呼吸症候群ウイルス、サル出血熱ウイルス、鳥類腎炎ウイルス1、シチメンチョウアストロウイルス1、ヒトアステロウイルス1型、2型又は8型、ミンクアストロウイルス1、ヒツジアストロウイルス1、鳥類伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルス、マウス肝炎ウイルス、ブタ伝染性下痢症ウイルス、SARSコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ハチ急性麻痺症ウイルス、アブラムシ致死性麻痺症ウイルス、黒色女王バチ細胞ウイルス、コオロギ麻痺症ウイルス、ショウジョウバエCウイルス、ヒメトビPウイルス、カシミールビーンウイルス、プラウティアスターリ(plautia stali)腸ウイルス、ロパロシフムパディ(rhopalosiphum padi)ウイルス、タウラ(taura)症候群ウイルス、トリアトーマ(triatoma)ウイルス、アルカーマ(alkhurma)ウイルス、アポイ(apoi)ウイルス、細胞融合剤ウイルス、シカダニウイルス、デング熱1型、2型、3型又は4型ウイルス、日本脳炎ウイルス、カミチ(Kamiti)河ウイルス、クンジン(kunjin)ウイルス、ランガト(langat)ウイルス、跳躍病ウイルス、モドック(modoc)ウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、オムスク(omsk)出血熱ウイルス、ポワッサン(powassan)ウイルス、リオブラボーウイルス、タマナコウモリウイルス、ダニ伝染性ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ヨコセ(yokose)ウイルス、肝炎Cウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス下痢症1型又は2型ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、キリンペスティウイルス、トナカイペスティウイルス、GBウイルスC、肝炎Gウイルス、肝炎GBウイルス、バクテリオファージM11、バクテリオファージQβ、バクテリオファージSP、腸内細菌ファージMX1、腸内細菌NL95、バクテリオファージAP205、腸内細菌ファージfr、腸内細菌ファージGA、腸内細菌ファージKU1、腸内細菌ファージM12、腸内細菌ファージMS2、シュードモナスファージPP7、エンドウ隆起生長モザイクウイルス1、大麦縞萎縮ウイルス、大麦縞萎縮ウイルスGAV、大麦縞萎縮ウイルスMAW、大麦縞萎縮ウイルスPAS、大麦縞萎縮ウイルスPAV、マメ葉巻病ウイルス、大豆萎縮ウイルス、ビート萎黄病ウイルス、ビート淡黄化ウイルス、ビート西洋萎黄病ウイルス、穀物萎黄病ウイルスRPS、穀物萎黄病ウイルスRPV、ウリアブラムシ伝染性萎黄病ウイルス、ポテト葉巻病ウイルス、カブ萎黄病ウイルス、サトウキビ黄葉ウイルス、ウマ鼻炎A型ウイルス、口蹄病ウイルス、脳心筋炎ウイルス、タイロウイルス(theilovirus)、ウシエンテロウイルス、ヒトA、B、C、D又はE型エンテロウイルス、ポリオウイルス、ブタA又はB型エンテロウイルス、分類不明エンテロウイルス、ウマ鼻炎B型ウイルス、A型肝炎ウイルス、アイチ(aichi)ウイルス、ヒト1、2又は3型パレコウイルス(parechovirus)、イジュンガン(Ijungan)ウイルス、ウマ3型リノウイルス、ヒトA及びB型リノウイルス、ブタ1、2-7、8、9、10又は11型テスコウイルス(teschovirus)、鳥類脳心筋炎ウイルス、カクゴ(kakugo)ウイルス、サル1型ピコルナウイルス、アウラウイルス、バーマ(barmah)森林ウイルス、チクングニャ(chikungunya)ウイルス、東洋ウマ脳炎ウイルス、イグボオーラ(igbo ora)ウイルス、マヤロ(mayaro)ウイルス、オッケルボ(ockelbo)ウイルス、オンヨン-ニョン(onyong-nyong)ウイルス、ロス(Ross)河ウイルス、サギヤマ(sagiyama)ウイルス、サケすい酵素病ウイルス、セムリキ(semliki)森林ウイルス、シンドビスウイルス、シンドビス様ウイルス、睡眠病ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西洋ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、ブドウつる斑点ウイルス、トウモロコシラヤドフィノ(rayado fino)ウイルス、燕麦青色萎縮病ウイルス、ハヤトウリモザイクチモウイルス(tymovirus)、ナスモザイクウイルス、エリシマム(erysimum)潜在ウイルス、ケネジャ(kenned
ya)黄斑モザイクウイルス、オノニス(ononis)黄斑モザイクウイルス、ホオズキ斑点ウイルス、カブ黄斑モザイクウイルス及びポインセチアモザイクウイルス。
配列決定されたウイルス配列に関する情報は、例えば、VirGen及び/又はNCBIのデータベースなどの公的な入手源から容易に得られ、それによりゲノムの多様性の判定が促進されている。
本明細書で使用する場合、「VirGen」という用語は、Bioinformatics Centre, University of Prune, Prune 411 007, Indiaのウイルスゲノム資源を意味するものと解釈する。
特に好ましい一実施形態では、十分に相異なる、又は相違したヌクレオチド配列を有する核酸断片が選択され、そのために、由来源のゲノムにおける配列の多様性と比較して、選択された断片間でヌクレオチド配列の多様性を高める。
一実施形態では、核酸断片は、コードするそのポリペプチドが、ライブラリー中の別の断片がコードするポリペプチドのアミノ酸配列に対して、1個又は複数のアミノ酸だけ変化するように選択されるが、これは、実質的に配列決定されたゲノムを用いて促進される処理過程である。
代替の一実施形態では、核酸断片のヌクレオチド配列は、「鋳型」核酸断片と比較して、コードするそのペプチドが、1個又は複数のアミノ酸だけ変化するような過程によって、変異を受ける。該「鋳型」は、自然の状態における元の核酸断片(即ち、由来源の遺伝子)と同じヌクレオチド配列を有してもよい。あるいは、該「鋳型」自体が、変異誘発の結果、元の核酸断片とは異なる中間的変異体であってもよい。変異は、元の断片の配列と比較して、少なくとも1個のヌクレオチドの相違を包含する。核酸のこの変化により、例えば、コードされるペプチド中に異なるアミノ酸が1個生じるか、又は終止コドンが導入もしくは欠失される。したがって、発現ライブラリーの核酸及びコードされるそのポリペプチドの多様性は、このような変異過程によって高められる。
一実施形態では、核酸断片は、変異原性PCR、ランダム変異を誘発する細菌細胞中での核酸断片の発現、部位特異的変異誘発、及び、例えば、とりわけ放射線、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、エチルニトロソウレア(ENU)、メタンスルホン酸エチル(EMS)、ヒドロキシルアミン又はトリメチルリン酸などの変異誘発剤に曝した宿主細胞における核酸断片の発現からなる群から選択される、変異誘発の処理過程によって修飾される。
好ましい一実施形態では、核酸断片は、変異原性PCRを用いた核酸断片の増幅によって修飾される。このような方法は、例えば、(i)マンガン存在下でのPCRの実施、及び(ii)ヌクレオチドの不正取り込みを起こすのに十分な濃度のdNTP存在下でのPCRの実施からなる群から選択される処理過程を包含する。
PCRを用いたランダム変異の誘発法は、当分野で公知であり、例えば、Dieffenbach(編)及びDveksler(編)(PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995)に記載されている。更に、変異誘発性PCRに使用する市販キット、例えば、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech)又はGeneMorph Random Mutagenesis Kit (Stratagene)が入手できる。
一実施形態では、PCR反応は、少なくとも約200μMのマンガンもしくはその塩、より好ましくは少なくとも約300μMのマンガンもしくはその塩、あるいはより一層好ましくは少なくとも約500μM、又は少なくとも約600μMのマンガンもしくはその塩の存在下で実施される。このような濃度のマンガンイオン又はマンガン塩は、増幅される核酸の1000塩基対(bp)当たり約変異2個から1000bp毎に約変異10個を誘発する(Leung et al Technique 1, 11-15, 1989)。
別の実施形態では、PCR反応は、上昇もしくは増加した、又は高い濃度のdGTPの存在下で実施される。dGTPの濃度は、少なくとも約25μM、又はより好ましくは約50μMと約100μMの間であるのが好ましい。より一層好ましくは、dGTPの濃度は、約100μMと約150μMの間、更により好ましくは約150μMと約200μMの間である。このような高濃度のdGTPは、増幅される核酸の1000bp毎に約ヌクレオチド1個から約ヌクレオチド3個の割合で、PCR産物中にヌクレオチドの不正取り込みを生じる(Shafkhani et al BioTechniques 23, 304-306, 1997)。
PCR準拠変異誘発は、PCR回数を追加することによって変異率が増加するので、核酸断片の変異にとって好ましい。
別の好ましい実施形態では、発現ライブラリーの核酸は、核酸を変異できる宿主細胞中に前記核酸を挿入することによって、変異される。このような宿主細胞は、1種又は複数の酵素、例えば1種又は複数の組換え酵素又はDNA修復酵素を欠いており、そのため、非変異体細胞の約5000〜10000倍高い率へ変異率を増強する。適切な細菌株は、例えば、ミスマッチ修復経路の成分を修飾又は不活性化する対立遺伝子を保有している。このような対立遺伝子の例には、mutY、mutM、mutD、mutT、mutA、mutC及びmutSからなる群から選択される対立遺伝子が挙げられる。ミスマッチ修復経路の成分を修飾又は不活性化する対立遺伝子を保有する細菌細胞は、当分野で公知であり、例えば、XL-1Red、XL-mutS及びXL-mutS-Kanrの細菌細胞がある(Stratageneより市販)。
あるいは、核酸断片は、細菌細胞中で修復ポリメラーゼPol Iにより選択的に複製される、核酸ベクター中にクローニングされる。例示すれば、Pol I変異株は、導入した核酸ベクター中で高度の変異を誘発し、そのため発現ライブラリーの生成に用いる核酸の配列多様性を高めるであろう。このような方法は、参照により本明細書に組み込まれるFabret等(Nucl. Acid Res, 28, 1-5 2000)により記載されている。
更に好ましい一実施形態では、変異した核酸断片は、発現ベクター中にサブクローニングするために、由来源の非変異断片と組み合わされる。このようにして、発現ライブラリーのヌクレオチド多様性が、発現されるペプチド及びタンパク質の立体配座の多様性と同様に、強化される。
別の実施形態では、核酸断片の配列多様性は、例えば、合成シャッフリング法を用いて増加させるが、その技法の一例は、参照により本明細書に組み込まれるNess et al, Nature Biotechnology, 20, 1251-1255, 2002に記載の方法である。このような技法を本発明に適合させる際、機能的に相同な核酸断片が、本明細書に記載の方法を用いて発現ライブラリーから選択される。この点に関する「機能的に相同な」の意味は、選択された断片が同じ標的タンパク質又は標的核酸に結合することである。標的に結合する各ペプチドのアミノ酸配列は、当分野で公知の方法を用いて決定され、その配列は、当分野で公知のアルゴリズムを用いてアライメントされる。コンセンサス配列は、高度に保存された残基をもたらし、同時に、厳密には保存されているとは言えないが、構造類似の残基も明らかにするそのアライメントから決定される。該ペプチドの構造的特徴も、X線結晶解析及び/又はコンピュータ準拠モデリング操作を用いて誘導される。したがって、個々のスクリーニングから同定したペプチドの相違によって、標的タンパク質又は標的核酸との結合が起こるのに必要な一次、二次両方の構造的特徴の同定が可能となる。得られたバイオインフォマティクスデータに基づいて、標的タンパク質又は標的核酸と結合するありとあらゆるペプチドをコードする、オリゴヌクレオチド(例えば、適宜に縮重オリゴヌクレオチド又は非縮重オリゴヌクレオチド)が設計される。次いで、多数回の増幅を使用するPCRを用いて、これらのオリゴヌクレオチドを組み立てることにより、ペプチドのありとあらゆる組合せをコードする複数の核酸を生成する。したがって、自然界には普通見出されないアミノ酸配列が産生される。
一実施形態では、核酸断片を遺伝子構築体中の少なくとも2個の順方向オープンリーディングフレーム中、好ましくは少なくとも3個の順方向オープンリーディングフレーム中にクローニングし、それにより特定の核酸断片がコードする相異なるペプチド又はタンパク質の数を増加させる。好ましくは、相当な比率の該核酸断片を遺伝子構築体中の少なくとも2個の順方向オープンリーディングフレーム中、好ましくは少なくとも3個の順方向オープンリーディングフレーム中にクローニングし、それにより特定の核酸断片がコードする相異なるペプチド又はタンパク質の数を増加させる。この点に関しては、「相当な比率」という用語は、複数のオープンリーディングフレームが発現のために利用できるように、適切な遺伝子構築体中に首尾よくサブクローニングされる全核酸断片に対して、少なくとも約30%〜50%、好ましくは少なくとも約40%〜60%、より好ましくは少なくとも約50%〜70%、更により好ましくは少なくとも約60%〜80%、更により好ましくは少なくとも約70%又は80%より大なることを意味する。当業者には公知のことと思われるが、単一の核酸を遺伝子構築体中の多数のリーディングフレームにクローニングする手順は公知である。
核酸断片(複数も)を多数のリーディングフレーム中にサブクローニングする好ましい方法は、以下のものからなる群から選択される処理過程を含む：
(a)核酸断片を、リンカー又はアダプター、例えば、追加の1もしくは2もしくは3塩基対、又は1個もしくは2個もしくは3個のヌクレオチドの多数倍を含むように修飾された、1個又は複数のリンカーに連結すること；
(b)核酸断片を、作動可能にコザックコンセンサス配列の制御下に、かつ前記コザックコンセンサス配列から異なる距離(例えば、1個もしくは2個もしくは3個のヌクレオチド、又は1個もしくは2個もしくは3個のヌクレオチドの多数倍)に配置すること；
(c)断片を、転写ずれ及び/又は翻訳ずれを賦与する配列の制御下に配置すること。
核酸断片をリンカー又はアダプターに連結することによって、導入するヌクレオチド数を変えることにより、相当な比率の該核酸断片を発現ベクター又は遺伝子構築体中の少なくとも2個、好ましくは3個のリーディングフレーム中に導入することができる。同じ配列の各核酸断片に、長さの異なるリンカー又はアダプターが平均して付加するように、各リンカー又はアダプターが該核酸断片の5'末端に連結される。これは、各リンカー/アダプターの核酸断片に対する相対比を変えることによって、一般に実現する。当然ながら、長さの異なる各リンカー/アダプターは、ライゲーション反応中に一般に等モルあり、リンカー/アダプター3'末端の全濃度は、連結される核酸断片の5'末端の全濃度に対して等モルに維持されている。アダプターを核酸に連結する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又はSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
適切な遺伝子構築体中にサブクローニングする前に、核酸断片にリンカー/アダプターを別途付加させる代替法として、翻訳開始シグナルの追加のヌクレオチド3'を含み、核酸断片を各リーディングフレーム中にサブクローニングする適切な遺伝子構築体が使用される。当業者には公知のことと思われるが、遺伝子構築体中の各リーディングフレームは。該遺伝子構築体を異なる制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いでその消化した線状化ベクター中に核酸断片をサブクローニングすることによって、一般に利用される。「サブクローニング」とは、ライゲーション反応を伴うか、又は含む処理過程を意味する。
あるいは、遺伝子構築体の翻訳開始部位の後に追加のヌクレオチドを導入するために、部位特異的変異誘発が使用される。部位特異的変異誘発の方法は当分野で公知であり、例えば、Dieffenbach(編)及びDveksler(編)(PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995の中)に記載されている。更に、部位特異的変異誘発に必要な教示及び試薬を含んだキット、例えばQuikchange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)が市販されている。
更に、転写開始コドンの後に追加のヌクレオチド1個又は2個を含めることにより、少なくとも2個、及び好ましくは3個のリーディングフレーム中での核酸のクローニングを可能とするように修飾された発現ベクターも、市販されている。このようなベクターには、例えばpcDNA(A、B又はC)ベクター一式(Invitrogen)が挙げられる。
発現が、作動可能にコザックコンセンサス配列の制御下に、かつそれから異なる距離に配置されるように、各核酸断片を位置決めすることによって、相当な比率の該核酸断片が、ベクター中の少なくとも2個、及び好ましくは3個のリーディングフレームに挿入される。好ましいコザック配列は、コア配列RNNATG(配列番号1)を有し、式中Rはプリン(即ちA又はG)で、Nは任意のヌクレオチドである。真核細胞中にポリペプチドを発現するための特に好ましいコザック配列は、配列CCRCCATG(配列番号2)又はGCCAGCCATGG(配列番号3)を含む。植物中にポリペプチドを発現するための好ましいコザック配列は、CTACCATG(配列番号4)である。
コザックコンセンサス配列は、当分野で公知の方法において合成オリゴヌクレオチドを用いて生成され、例えば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxfordの全テキスト、及び特に Gait, pp 1-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; and Wu et al., pp 135-151によるその中の論文に記載されている。あるいは、コザック配列は、当分野で公知の方法、例えば、その群から制限酵素消化又はPCRを用いて、天然源又は組換え源から単離される。
一実施形態では、コザック配列は、オリゴヌクレオチド又は核酸断片として生成され、次いで該核酸断片(即ち、サブクローニングされる核酸断片)の5'に連結される。このようなオリゴヌクレオチド又は断片を連結する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又はSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。他のライゲーションの場合同様、各連結種(即ち、コザック含有断片及び核酸)の核酸の全濃度は、好ましくは等モルとすべきである。相当な比率の核酸断片が各リーディングフレーム中に連結されることを保証するために、当然ではあるが、長さの異なるコザック含有断片も、ほぼ等モルの濃度で存在すべきである。
適切なベクター中にサブクローニングする前に、核酸断片にコザックコンセンサス配列のオリゴヌクレオチド又は断片を別途付加させる代替法として、翻訳開始部位を含み、核酸断片を各リーディングフレーム中にサブクローニングする適切なベクターが使用される。当業者には公知のことと思われるが、このようなベクター中の各リーディングフレームは。該ベクターを異なる制限酵素で消化し、次いでその消化した線状化ベクター中に断片をサブクローニングすることによって、一般に利用される。
核酸断片を真核細胞中に発現させようとする場合、前記実施形態のコザック配列をリボソーム結合性配列又はシャイン・ダルガーノ配列で置き換えることが特に好ましい。特に好ましいシャイン・ダルガーノ配列は、ヌクレオチド配列GAAGAAGATA(配列番号5)を有する核酸からなる。
転写ずれ及び/又は翻訳ずれを賦与する配列の制御下に、ある断片を配置することは、転写及び/又は翻訳の開始部位の忠実度が減少するために、翻訳が異なる部位で開始されることを意味する。したがって、このような配列は、数種の異なるポリペプチドの発現を起こす。
一実施形態では、翻訳ずれ(又は翻訳のフレームシフト)は、コンセンサス配列N1N1 N1N2 N2 N2N3を含む核酸を用いて誘発され、式中Nは任意のヌクレオチドを表し、N1により表現される全てのヌクレオチドは同一のヌクレオチドであり、N2により表現される全てのヌクレオチドは同一のヌクレオチドである。この実施形態に従えば、N1及び/又は N2及び/又はN3は、同一であるか、又は相異なっている。真核生物に使用するための特に好ましい翻訳ずれ配列は、以下のものからなる群から選択される配列を含むことになろう:AAAAAAC(配列番号6)、AAATTTA(配列番号7)、AAATTTT(配列番号8)、GGGAAAC(配列番号9)、GGGCCCC(配列番号10)、GGGTTTA(配列番号11)、GGGTTTT(配列番号12)、TTTAAAC(配列番号13)、TTTAAAT(配列番号14)、TTTTTA(配列番号15)及びGGATTTA(配列番号16)。代替の一実施形態では、酵母において翻訳ずれを誘発する配列は、CTTAGGC(配列番号17)又はGCGAGTT(配列番号18)である。更に別の実施形態では、哺乳類において翻訳ずれを誘発する配列は、TCCTGAT(配列番号19)である。
別の実施形態では、原核生物に使用する翻訳ずれ配列は、AAAAAAG(配列番号20)、AAAAAAA(配列番号21)、AAAAAAC(配列番号22)、GGGAAAG(配列番号23)、AAAAGGG(配列番号24)、GGGAAAA(配列番号25)、TTTAAAG(配列番号26)及びAAAGGGG(配列番号27)からなる群から選択される配列を含むが、それだけに限らない。この翻訳ずれ配列は、シャイン・ダルガーノ配列よりヌクレオチド約7個から約19個下流に位置づけるのが特に好ましい。代替の一実施形態では、細菌細胞において翻訳ずれを誘発する核酸は、ヌクレオチド配列CTT(配列番号28)を含み、その核酸断片の発現を制御するシャイン・ダルガーノ配列よりヌクレオチド約3個上流に位置づけられる。
翻訳ずれ配列は、合成オリゴヌクレオチドを用いて生成されるか、又は天然源もしくは組換え源、例えば、各種のレトロウイルス、コロナウイルス、レトロトランスポゾン、酵母内ウイルス様配列、細菌遺伝子及びバクテリオファージ遺伝子以外に、prfB遺伝子、dnaX遺伝子、哺乳類オルニチンデカルボキシラーゼ・アンチザイムから単離される。このような配列は、当分野で公知の方法、例えば、制限酵素消化又はPCRを用いて単離される。
翻訳ずれを賦与する配列は、アダプター付加に対するのと同様に、核酸断片の5'末端に連結するのが好ましい。アダプターを連結する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)又はSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
また、転写ずれ又は翻訳ずれを賦与する配列は、核酸断片を挿入した発現ベクター又は遺伝子構築体中に、該断片における翻訳開始部位の上流(即ち5')に位置するように組み込むのが好ましい。
別の実施形態では、転写ずれは、例えばT9、A9などの配列を有する一繋がりのヌクレオチドの導入によって誘発される。転写ずれ配列は、転写開始部位の下流(即ち3')にクローニングするのが好ましい。転写ずれ配列を、核酸断片における翻訳開始部位の上流(即ち5')に位置づけることも好ましい。したがって、転写ずれ配列は、核酸断片を挿入した発現ベクター又は遺伝子構築体中に含まれる。
したがって、転写ずれ配列を形成する核酸は、翻訳開始部位と協調して、核酸断片の5'末端に連結される。
転写ずれ配列が、発現ベクター又は遺伝子構築体中に、翻訳開始部位の上流及び転写開始部位の下流に組み込まれることは、上記内容から明らかであろう。
好ましくは、原核生物又は小型真核生物のゲノムに由来する核酸断片は、前記核酸断片の1個又は2個又は3個又は4個又は5個又は6個のオープンリーディングフレームが利用されるように、順方向及び/又は逆方向にも遺伝子構築体中に挿入される。断片をベクター中に両方向に挿入する方法は、当分野で公知である。
核酸断片を適切な発現ベクター中の多数のリーディングフレーム中にサブクローニングすることによって、自然には存在しないペプチド又はタンパク質のドメインをコードすることが、多様な天然ペプチドドメインを産生することだけでなく可能であることは、当業者であれば明らかであろう。したがって、発現ライブラリーの核酸及びそれらがコードするペプチドの多様性は、このように修飾した核酸断片発現ライブラリーにおいて非常に高められる。
好ましい実施形態では、ゲノムからいずれの縮重核酸も除外するために、発現ライブラリーは標準化される。本明細書で使用する場合、「縮重核酸」という用語は、例えば、大きなコピー数、反復配列などの同一又は実質的に同一なヌクレオチド配列を有する核酸を意味するものと解釈する。同じ種又は異なる種に由来するか否かにかかわらず、多数の相同配列に由来する核酸断片に、発現ライブラリー中の縮重配列の存在を減じるために、標準化することができる。同様に、反復DNAに由来する核酸断片及び偽遺伝子に由来する核酸断片にも、都合よく標準化することができる。縮重核酸を除外するためにライブラリーを標準化する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、又はDiversa Corporation (米国特許第5,763,239号)、又はSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)、又はBonaldo et al., Genome Res. 6(9), 791-806, 1997により記載されている。
一実施形態では、縮重配列又は高度反復配列を除外するために、核酸断片はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかける。このような標準化処理過程の成否は、例えば、非標準化及び標準化標識DNAをゲノムDNAのサザンブロットとハイブリッド形成させ、各ブロットに結合した標識量を比較することによって、判定できる。結合標識量は、ハイブリッド形成したDNA量に対応する。標準化ライブラリーに対してハイブリッド形成シグナルが減少すれば、標準化プール中で反復配列が減少したことを示している。
本発明の別の実施形態では、核酸は、2種以上の原核生物及び/又は小型真核生物に由来し、それらのありとあらゆる組合せも含む。
ゲノムの組合せから発現ライブラリーを作製するために用いる原核生物(複数種も)及び/又は小型真核生物(複数種も)は、進化的に多様な生物であることが好ましい。本明細書で使用する場合、「進化的に多様な」という用語は、遺伝子レベルで比較した場合、相当程度の遺伝子多様性を示す生物を意味するものと解釈する。本明細書で使用する場合、「相当程度の遺伝子多様性」という用語は、原核生物又は小型真核生物の遺伝子同士が、核酸レベルで少なくとも約10%から30%異なることを意味するものと解釈する。より好ましくは、原核生物又は小型真核生物の遺伝子配列が、核酸レベルで少なくとも約30%から40%異なる。より好ましくは、原核生物又は小型真核生物の遺伝子配列が、核酸レベルで少なくとも約50%異なる。より好ましくは、原核生物又は小型真核生物の遺伝子配列が、核酸レベルで少なくとも約70%、又はより好ましくは、核酸レベルで少なくとも約80%、又は核酸レベルで90%異なる。
2種のヌクレオチド配列がこのように規定したパーセント表示の同一性範囲内に入るか否かを判定する際、該ヌクレオチド配列のつき合わせ比較を行うことが可能であることは、当業者であれば認識されよう。このような比較又はアライメントでは、そのアライメントを実施するために用いるアルゴリズムに応じて、同一でない残基の位置決めに差異が生じるであろう。この点に関しては、2種以上のヌクレオチド配列間でのパーセント表示の同一性及び類似性に言及する場合、それは、当業者に公知の任意の標準的アルゴリズムを用いて決定した際、前記配列間の各々同一残基数及び類似残基数を指すものと解釈する。具体的には、ヌクレオチドの同一性及び類似性は、米国のComputer Genetics Group, Inc., University Research Park, Maddison, Wisconsinのソフトウェアを用いて、例えば、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970のアルゴリズムを利用したDevereaux et al., Nucl. Acids Res. 12, 387-395, 1984のGAPプログラムを用いて計算される。あるいは、Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680, 1994のCLUSTAL Wアルゴリズムを用いて、多数の配列のアライメントが得られ、その場合、同一/類似残基の数を最大化し、アライメント中の配列ギャップの数及び/又は長さを最小化することが必要であるか、又は望ましい。ヌクレオチド配列のアライメントは、多様な他の市販配列分析プログラム、例えば、NCBIで入手できるBLASTプログラムを用いて実施することもできる。
代替の一実施形態では、原核生物又は小型真核生物の遺伝子配列は、標準的なコット解析において交叉ハイブリッドを形成できない。標準的なコット解析により、対応する核酸の再結合速度を用いることによって、ヌクレオチドレベルで2種のヌクレオチド配列間の類似性が決定されることは、当業者であれば認識されよう(例えば、Britten and Kohne Science, 161, 529-540, 1968)。
複数の実質的に配列決定されたゲノムを用いて発現ライブラリーを作製する場合、個々の原核生物又は小型真核生物からの断片は、その原核生物又は小型真核生物のゲノムの複雑度及び大きさに比例した量で使用することも好ましい。原核生物及び/又は小型真核生物のゲノムを配列決定するとき、そのゲノムの近似的大きさが決定される。したがって、ライブラリーは、最終的なライブラリーに組み込まれるゲノム全てからの核酸の量が等しいことを保証するために、標準化される。
好ましい一実施形態では、核酸断片発現ライブラリーは、原核生物又は小型真核生物
の各々からの核酸断片が等しい量で組み込まれるように、標準化される。例示的一実施形態では、発現ライブラリーに使用すべきゲノムの大きさ(Mbp又は分子量単位で)を比較し、各ゲノムからの核酸を、最小使用ゲノムの大きさに対するゲノムサイズの比に比例する量でライブラリーのために使用する。例えば、T. rubripesのゲノムは、約120MbpにすぎないA.thalianaのゲノムと比較して、大きさが約400Mbpである。したがって、T. rubripesとA.thalianaとのゲノム核酸断片の組合せについては、T. rubripesの核酸断片対A.thalianaの核酸断片の比率は、約4:1.2(w/w)となろう。発現ライブラリーを構築するための多数のゲノムに由来する核酸断片の相対的貢献度は、表1に示した情報から容易に計算される。
Figure 2008522954
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好ましいゲノムの組合せは、以下のものからなる群から選択される：
a)以下のものからなる群から選択される2種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ。；
b)以下のものからなる群から選択される3種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
c)以下のものからなる群から選択される4種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
d)以下のものからなる群から選択される5種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
e)以下のものからなる群から選択される6種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
f)以下のものからなる群から選択される7種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
g)以下のものからなる群から選択される8種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
h)以下のものからなる群から選択される9種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
i)以下のものからなる群から選択される10種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ。
j)以下のものからなる群から選択される11種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
k)以下のものからなる群から選択される12種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
l)以下のものからなる群から選択される13種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
m)以下のものからなる群から選択される14種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
n)以下のものからなる群から選択される15種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
o)以下のものからなる群から選択される16種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
p)以下のものからなる群から選択される17種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
q)以下のものからなる群から選択される18種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
r)以下のものからなる群から選択される19種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
s)以下のものからなる群から選択される20種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
t)以下のものからなる群から選択される21種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
u)以下のものからなる群から選択される22種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
v)以下のものからなる群から選択される23種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
w)以下のものからなる群から選択される24種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
x)以下のものからなる群から選択される25種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
y)以下のものからなる群から選択される26種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ；
z)以下のものからなる群から選択される27種の生物由来の核酸断片: アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ。
特に好ましい一実施形態では、核酸断片は、以下の生物:アエロピラムペルニクス、ガンビアハマダラカ、シロイヌナズナ、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、シーエレガンス、トラコーマクラミジア、ダニオレリオ、キイロショウジョウバエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、シネコシスティスPCC 6803、タキフグルブリペス、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマに由来する。
特に好ましい一実施形態では、以下の細菌に由来する核酸断片が単一の発現ライブラリー中に組み合わされる:アエロピラムペルニクス、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ。
特に好ましい別の実施形態では、以下の細菌に由来する核酸断片が単一の発現ライブラリー中に組み合わされる: アーケオグロブスフルギディス、アクイフェクスエリティクス、アエロピラムペルニクス、アクイフェクスエオリクス、枯草菌、パラ百日咳菌 TOX6、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、メタノサーモバクターサーモオートトロフィクス、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、ピレルラ 種、パイロコッカスホリコシ、緑膿菌、シネコシスティス種、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ。
好ましい一実施形態では、核酸断片は、以下のものからなる群から選択される2種以上の生物に由来する: アエロピラムペルニクス、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、デスルホビブリオブルガリス、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム、サーマスサーモフィラス及びサーモトガマリティマ。
別の好ましい実施形態では、核酸断片は、以下のものからなる群から選択される2種以上の生物に由来する: アーケオグロブスフルギディス、アクイフェクスエオリクス、アエロピラムペルニクス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌 K12、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、髄膜炎菌、パイロコッカスホリコシ、緑膿菌、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム、サーモトガマリティマ、アシドバクテリウムカプスレイタム、ハロバクテリウムサリナラム、デスルホバクテリウムオートトロフィカム、ハロフェラックスボルカニロドピレルラバルチカ、サーマスサーモフィラス HB27及びプロクロコッカスマリナス MED4。
未修飾であろうと、あるいは1個又は複数のリンカー、コザック含有オリゴヌクレオチド、コザック含有断片、又は転写ずれもしくは翻訳ずれを賦与する配列を含む核酸により修飾されていようと、核酸断片は、プロモーター配列と作動可能に連結して配置され、その結果組換え遺伝子構築体を産生する。
「遺伝子構築体」という用語は、できる限り広い意味に取るべきであり、核酸断片と作動可能に連結して配置されるプロモーター配列を包含する。プロモーター配列を含む核酸は、当分野で公知の技法、例えばPCR又は制限酵素消化を用いて単離される。あるいは、プロモーター配列を含む核酸は、オリゴヌクレオチドの合成品である。オリゴヌクレオチドを作製する方法は、当分野で公知であり、例えばOligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxfordのテキスト全体、特にその中のGait, pp1-22; Atkinson et al., pp.35-81; Sproat et al., pp.83-115; 及びWu et al., pp.135-151による論文に記載されている。
「プロモーター」という用語は、できる限り広い意味に取るべきであり、TATAボックス又は開始エレメントを含めた、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含むが、該開始エレメントは、発生上及び/又は外部の刺激に反応して遺伝子発現を改変する追加の調節配列(即ち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー)と共に、又はそれなしで正確な転写を開始するのに必要である。この点に関しては、「プロモーター」という用語は、それ自体が作動可能に連結しており、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子の発現を賦与、活性化又は強化する、組換え、合成又は融合の分子又は誘導体を記述するためにも使用される。好ましいプロモーターは、1個又は複数の特異的調節配列のコピーを更に含有することにより、発現を更に強化し、及び/又は前記核酸分子の空間的発現及び/又は時間的発現を変更することができる。
核酸分子をプロモーターの調節的制御下、即ちそれ「と作動可能に連結して」配置することは、発現がプロモーター配列によって制御されるように前記分子を位置づけることを意味する。プロモーターは、一般に、それに制御されるコード配列の5'側(上流)に位置づけられる。プロモーター/構造遺伝子の異種組合せを構築するためには、プロモーターと、自然の状態でそれにより制御される遺伝子、即ち、プロモーターの由来源の遺伝子との距離とほぼ同じ、遺伝子転写開始部位からの距離にプロモーターを位置づけることが一般に好ましい。当分野で知られているように、この距離のある程度の変動は、プロモーター機能を損なわずに受け容れることができる。同様に、制御下に配すべき異種遺伝子に対する、ある調節配列エレメントの好ましい位置決めは、自然の状態、即ちその由来源である遺伝子における該エレメントの位置取りにより規定される。当分野で知られているように、この距離のある程度の変動も、やはり起こることができる。
細菌細胞、例えば、大腸菌、ブドウ球菌(Staphylococcus sp.)、コリネバクテリウム菌(Corynebacterium sp.)、サルモネラ菌(Salmonella sp.)、バチルス菌(Bacillus sp.)及びシュードモナス菌(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される細菌細胞中で発現するのに適当な典型的プロモーターには、それだけに限らないが、laczプロモーター、Ippプロモーター、温度感受性λLもしくはλRプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、又はIPTG誘導tacプロモーターもしくはlacUV5プロモーターなどの半人工プロモーターが挙げられる。細菌細胞中で核酸断片を発現するための他の幾つもの遺伝子構築系は、当分野で周知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、米国特許第5,763,239号 (Diversa Corporation)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
酵母細胞、例えば、ピチアパストリス(Pichia pastoris)、S.セレビシエ及びS.ポンベからなる群から選択される酵母細胞中で発現するのに適当な典型的プロモーターには、それだけに限らないが、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター又はTEF1プロモーターが挙げられる。
昆虫細胞又は昆虫内で発現するのに適当な典型的プロモーターには、それだけに限らないが、OPEI2プロモーター、ムリ種カイコガ(Bombyx muri)から単離した昆虫アクチンプロモーター、ショウジョウバエ(Drosophila sp.)のdshプロモーター(Marsh et al Hum. Mol. Genet. 9, 13-25, 2000)、及び誘導メタロチオネインプロモーターが挙げられる。組換えポリペプチドの発現に好ましい昆虫細胞は、BT1-TN-5B1-4細胞及びスポドプテラフルギパーダ(Spodoptera frugiperda)細胞(例えば、sf19細胞、sf21細胞)からなる群から選択される昆虫細胞を包含する。核酸断片の発現に適当な昆虫にはショウジョウバエ(Drosophila sp.)が挙げられるが、それだけに限らない。S.フルギパーダ(S. frugiperda)の使用も想定されている。
植物細胞中でペプチドを発現するためのプロモーターは当分野で公知であり、それには、それだけに限らないが、ホーデウムブルガーレ(Hordeum vulgare)アミラーゼ遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、ノパリンシンターゼ(NOS)遺伝子プロモーター、ならびにオーキシン誘導植物プロモーターP1及びP2が挙げられる。
哺乳類細胞、哺乳類組織又は哺乳類そのものにおいて発現するのに適当な典型的プロモーターは、例えば、レトロウイルスLTRエレメント、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CMV IE(サイトメガロウイルス前初期)プロモーター、EF1αプロモーター(ヒト伸長因子1α由来)、EM7プロモーター、UbCプロモーター(ヒトユビキチンC由来)からなる群から選択されるプロモーターを包含する。
核酸断片の発現に好ましい哺乳類細胞には、上皮細胞、線維芽細胞、腎細胞、T細胞又は赤血球系細胞が挙げられ、COS、CHO、マウス10T、MEF、NIH3T3、MDA-MB-231、MDCK、HeLa、K562、HEK293及び293Tからなる群から選択される細胞系も含む。新生腫、例えば白血病細胞の使用も、本明細書で想定されている。
核酸断片の発現に好ましい哺乳類には、それだけに限らないが、マウス(即ちMus sp.)及びラット(即ちRattus sp.)が挙げられる。
一実施形態では、プロモーター配列を含む核酸は、原核生物もしくは小型真核生物からの核酸断片又はその修飾体に、当分野で公知の技法を用いて連結される。
別の実施形態では、プロモーター配列を含む核酸は、1個又は複数のリンカー、アダプター、コザック含有オリゴヌクレオチド、コザック含有断片、又は転写ずれもしくは翻訳ずれを賦与する配列を含む核酸の付加により修飾され、更に原核生物又は小型真核生物からの核酸断片に、当分野で公知の技法を用いて連結される。
更に別の実施形態では、プロモーター配列を含む核酸は、1個又は複数のスペーサー、コザック配列、又は転写ずれもしくは翻訳ずれを賦与する配列を含む核酸を含んだ別の核酸を有するか、又は有していないオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。
好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、原核生物又は小型真核生物からの核酸断片に隣接する領域に相補的又は相同的なヌクレオチド配列、例えばアダプターを含む。このような相補配列又は相同配列により、プロモーター領域及びリボソーム結合手段(例えば、コザック配列又はシャイン・ダルガーノ配列)、ならびに単一断片としての該核酸断片を含む核酸を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが可能となる。このようにして、プロモーター配列、リボソーム結合手段及び該核酸断片を含む遺伝子構築体が、該増幅核酸を用いて容易に構築される。
代替の一実施形態では、プロモーター配列を含む核酸は、1個又は複数のスペーサー、コザック配列、又は転写ずれもしくは翻訳ずれを賦与する配列を含む核酸を含んだ別の核酸を有するか、又は有していないオリゴヌクレオチド中に組み込まれ、更に前記オリゴヌクレオチドは、例えばライゲーションによって核酸断片に作動可能に連結される。
一実施形態では、核酸断片はインビトロで発現される。この実施形態によれば、遺伝子構築体は、好ましくは原核生物又は小型真核生物の核酸断片、ならびにプロモーター配列及び適当なリボソーム結合部位を含むが、後二者は、共に発現ベクター中に存在するべきか、又は前記核酸断片を該ベクター中に挿入する前に、その断片に付加すべきである。核酸断片をインビトロで発現するための典型的なプロモーターには、それだけに限らないが、T3又はT7(Hanes and Pluckthun Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 4937-4942 1997)のバクテリオファージプロモーターが挙げられる。
別の実施形態では、遺伝子構築体は、転写終結部位及び/又は翻訳終結コドンを適宜含む。このような配列は当分野で公知であり、原核生物又は小型真核生物の核酸断片を増幅するために用いるオリゴヌクレオチド中に組み込んでもよいし、あるいは、核酸断片を挿入する前の発現ベクター又は遺伝子構築体に存在してもよい。
別の実施形態では、遺伝子構築体は発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、細胞内又は無細胞発現系内で、それが作動可能に連結している核酸断片の発現を賦与する能力を有する核酸分子を指す。本発明に関しては、発現ベクターは、本明細書に定義するプロモーター、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス部分遺伝子性もしくは遺伝子性断片、又は異種DNAを発現可能な形式で維持及び/又は複製できる他の核酸を含み得ると理解すべきである。多数の発現ベクターが、多様な細胞中で発現するために市販されている。適当なベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に入る。
インビトロ発現又は無細胞発現のための典型的な発現ベクターは、これまで記載されており、それだけに限らないが、TNT T7及びTNT T3系(Promega)、pEXP1-DEST及びpEXP2-DESTベクター(Invitrogen)を包含する。
細菌細胞中の組換えポリペプチド及び効率的なリボソーム結合部位を発現させるためのおびただしい発現ベクター、例えば、とりわけPKC30(Shimatake and Rosenberg, Nature 292, 128,1981); pKK173-3(Amann and Brosius, Gene 40, 183, 1985), pET-3(Studier and Moffat, J. Mol. Biol. 189, 113, 1986); pCRベクター一式(Invitrogen)、pGEM-T Easy ベクター(Promega)、pL発現ベクター一式(Invitrogen)、アラビノース誘発性プロモーターを含むベクターのpBAD/TOPOもしくはpBAD/thio-TOPOシリーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)であって、そのうち後者が、発現タンパク質の立体配座制限のためにTrxループと融合タンパク質も産生するように設計されているシリーズ; 発現ベクターのpFLEXシリーズ(Pfizer nc., CT, USA); 発現ベクターのpQEシリーズ(QIAGEN, CA, USA)、又は発現ベクターのpLシリーズ(Invitrogen)がこれまで記載されてきた。
酵母細胞中で発現させるための発現ベクターは好ましいものであり、それだけに限らないが、pACTベクター(Clontech)、pDBleu-Xベクター、pPICベクター一式(Invitrogen)、pGAPZベクター一式(Invitrogen)、pHYBベクター(Invitrogen)、pYD1ベクター(Invitrogen)、及びpNMT1、pNMT41、pNMT81 TOPOの各ベクター(Invitrogen)、pPC86-Yベクター(Invitrogen)、ベクターのpRHシリーズ(Invitrogen)、ベクターのpYESTrpシリーズ(Invitrogen)を包含する。特に好ましいベクターは、pACTベクター、pDBleu-Xベクター、pHYBベクター、pPC86ベクター、pRHベクター及びpYESベクターであり、いずれも本明細書に記載の様々な「n」ハイブリッドアッセイにおいて有用である。更に、pYD1ベクターは、S.セレビシエ(S. cerevesiae)における酵母ディスプレイ実験に特に有用である。酵母細胞中で核酸断片を発現させるための、他の幾つもの遺伝子構築系が当分野で周知であり、例えば、Giga-Hama and Kumagai (Foreign Gene Expression in Fission Yeast: Schizosaccharomyces Pombe, Springer Verlag, ISBN 3540632700, 1997の中)及びGuthrie and Fink (Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Academic Press, ISBN 0121822540, 2002の中)に記載されている。
適当なプロモーター及び調節配列を含み、昆虫細胞で発現させるための各種の適切な発現ベクターは、当分野で公知であり、それだけに限らないが、pAC5ベクター、pDS47ベクター、pMTベクター一式(Invitrogen)、及びpIBベクター一式(Invitrogen)が挙げられる。
さらに、植物細胞中でポリペプチドを発現させるためのプロモーター及び調節配列を含む発現ベクターも、当分野で公知であり、例えば、pSS、pB1121(Clontech)、pZ01502、及びpPCV701(Kuncz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 131-135, 1987)の群から選択されるプロモーターを含む。
哺乳類細胞又は哺乳類中で発現させるために、適当なプロモーター配列を含む発現ベクターには、それだけに限らないが、Invitrogenから供給されるpcDNAベクター一式、pCIベクター一式(Promega)、pCMVベクター一式(Clontech)、pMベクター(Clontech)、pSIベクター(Promega)、VP16ベクター(Clontech)及びpDISPLAYベクター(Invitrogen)が挙げられる。pDISPLAYベクターは、Igκリーダー配列を有し、PDGFR膜貫通ドメインとの融合を介して細胞膜に結合する、細胞表面を標的とする発現核酸断片を用いた哺乳類ディスプレイ研究において、特に有用である。pM 及びVP16ベクターは、哺乳類のツーハイブリッド研究において特に有用である。
コードされたポリペプチドを発現させるために、DNAを核酸ベクター中にクローニングする方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、又はSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
核酸断片は、例えば、線虫(例えば、シーエレガンス(C. elegans))及び魚類(例えば、D.レリオ(D. rerio)及びT.ルブリペス(T. rubripes)を含めて、他の生物の細胞又は生物そのものにも発現される。線虫に使用するプロモーターには、それだけに限らないが、osm-10 (Faber et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 179-184, 1999)、unc-54及びmyo-2 (Satyal et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 5750-5755, 2000)が挙げられる。魚類に使用するプロモーターには、それだけに限らないが、ゼブラフィッシュのOMPプロモーター、GAP43プロモーター、及びセロトニン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子調節領域が挙げられる。
好ましい一実施形態では、発現ライブラリーは、インビトロで転写され、翻訳される。核酸断片を転写し、生成mRNAを翻訳する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、米国特許第5,763,239号(Diversa Corporation)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に、例えば、大腸菌(E. coli) S30溶解物(Promegaからキットで入手できる)の使用に関して記載されている。
好ましい一実施形態では、遺伝子構築体は、核酸断片と作動可能に連結した第2の核酸を含む。この第2の核酸は、融合パートナーをコードする。本明細書で使用する場合、「融合パートナー」という用語は、核酸断片がコードするペプチドと結合しているポリペプチドを意味するものと解釈する。このような融合パートナーは、発現ライブラリーによりコードされる全てのポリペプチドに共通の機能又は能力を賦与する。適切な融合パートナーには、それだけに限らないが、提示構造として、標的細胞中へのペプチドの取り込みを促進するポリペプチド、核の局在化を起こすポリペプチド、分泌を起こすポリペプチド、ミトコンドリアの局在化を起こすポリペプチド、膜の局在化を起こすポリペプチド、又はこのような配列のいずれかの組合せが挙げられる。
そのような過程が本発明に必須であると示唆するわけではないが、発現ライブラリーによりコードされるペプチドは、その立体配座が制限されるように発現することもでき、又は「提示構造」で発現することもできる。このような制限は、標的タンパク質又は標的核酸との結合に十分な立体配座を有するタンパク質ドメイン又はペプチドを発現するために、一般に必要ではないが、より柔軟性の高い配列を含むペプチドをディスプレイするために、あるいは、タンパク質分解酵素に対する安定性を高めるために有用である(Humphrey et al, Chem Rev 97, 2243-2266, 1997)。
提示構造は、該ポリペプチドのアミノ末端に融合する第1成分、即ちポリペプチド、及び該ペプチドのカルボキシル末端に融合する第2成分を一般に含むであろう。このような提示構造の例には、それだけに限らないが、システイン連結(ジスルフィド)構造、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド及びトランスグルタミナーゼ連結構造が挙げられる。
好ましい一実施形態では、該提示構造は、少なくとも2個のシステイン残基を含むことにより、そのシステイン残基間にジスルフィド結合が形成され、その結果立体配座が制限されたペプチドを生じる配列である。
別の実施形態では、発現ライブラリーによりコードされるペプチドは、融合タンパク質としての第2のポリペプチド内に発現される。このような目的に使用するポリペプチドは、別のタンパク質のアミノ及び/又はカルボキシル末端の柔軟性を減少できる。好ましくは、このようなタンパク質は、該タンパク質のための剛直な足場又は踏み台となる。その上、このようなタンパク質は、タンパク質分解などから保護することができ、及び/又は溶解性を高めることができるのが好ましい。好ましくは、立体配座制限性タンパク質は、サイズが小さく(一般に、アミノ酸約200個以下の長さ)、構造が剛直で、既知の三次元立体配座を有し、その構造をさほど破壊せずにタンパク質の挿入を受け容れることができる。このようなタンパク質の鍵となる特徴は、ペプチドを挿入できる箇所(例えば、Trxループ)が溶媒曝露表面上に利用可能なことである。立体配座制限性タンパク質産生遺伝子が、多種の原核及び真核宿主中、又は適切な無細胞系中で高度に発現でき、しかも該タンパク質が可溶で耐プロテアーゼ分解性であることも好ましい。
立体配座制限性タンパク質の例には、チオレドキシン又はTrxループ及び他のチオレドキシン様タンパク質、ヌクレアーゼ(例えば、RNase A)、プロテアーゼ(例えば、トリプシン)、プロテアーゼ阻害剤(例えば、ウシすい臓トリプシン阻害剤)、抗体又は構造剛直なその断片、コノトキシン、及びプレクストリン相同性ドメインの活性部位が含まれる。立体配座制限性ペプチドは、任意の適当な長さを取ることができ、単一のアミノ酸残基にさえなり得る。
この技法は、触媒不活性形ブドウ球菌ヌクレアーゼ又はTrxを用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおける使用(Norman et al, Science, 285, 591-595, 1999; 及びColas et al, Nature 380, 548-550, 1996)以外に、Trx足場を用いる細菌におけるペプチドの細菌ディスプレイにも使用して成功した(Blum et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2241-2246 2000)。
別の実施形態では、発現ベクター又は遺伝子構築体は、その発現系で作動する転写終結因子を場合により含む。更に、遺伝子構築体は、その発現系で作動するポリアデニル化シグナルの配列を含んだ核酸も含む。
遺伝子構築体を細菌細胞中に導入及び/又は維持及び/又は増殖及び/又は発現しようとする場合、前記遺伝子構築体の生成中又は前記遺伝子構築体のスクリーニング中に、該遺伝子構築体は、少なくとも細菌細胞中で作動可能な複製起点を含むことが好ましい。特に好ましい複製起点はColE1複製起点である。複製起点を含む幾種もの遺伝子構築体系は、当分野で周知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、米国特許第5,763,239号(Diversa Corporation)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
遺伝子構築体を酵母細胞中に導入及び/又は維持及び/又は増殖及び/又は発現しようとする場合、前記遺伝子構築体の生成中又は前記遺伝子構築体のスクリーニング中に、該遺伝子構築体は、少なくとも酵母細胞中で作動可能な複製起点を含むことも好ましい。好ましい一複製起点はCEN/ARS4複製起点である。特に好ましい別の複製起点は2ミクロン複製起点である。複製起点を含む幾種もの遺伝子構築体系は、当分野で周知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
別の実施形態では、核酸断片を含有する遺伝子構築体は、選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含んだ別の核酸カセットを含む。
本明細書で使用する場合、「選択可能マーカー」という用語は、前記選択可能マーカーを保有していない細胞が示すことのない表現型を、前記選択可能マーカーを発現する細胞に賦与するタンパク質又はペプチドを意味するものと解釈する。選択可能マーカーの例には、それだけには限らないが、メソトレキセート耐性を賦与するdhfr耐性遺伝子(Wigler, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527)、ミコフェノール酸耐性を賦与するgpt耐性遺伝子(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072)、アミノグリコシドG-418耐性を賦与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1)、及びハイグロマイシン耐性遺伝子(Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147)が挙げられる。あるいは、マーカー遺伝子は、可視的な結果を起こす反応を触媒し(例えば、基質分子5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシドの存在下で、βガラクトシダーゼを発現する際の青色沈殿の生成)、又は特定のアミノ酸の合成能を賦与する(例えば、HIS3遺伝子はヒスチジン合成能を賦与する)。
一実施形態では、核酸断片によりコードされるペプチドは、インビトロ又はインビボで細胞による該ペプチドの浸透又は取り込みを高め、増加させ、又は補助することができるペプチド配列と共に、融合タンパク質として発現する。例えば、浸透又は取り込みを高め、増加させ、又は補助することができる該ペプチド配列は、ショウジョウバエ(Drosophila)ペネトラチン指向配列である(「タンパク質導入ドメイン(PTD)」)。このペプチド配列は、少なくとも次のアミノ酸配列:
CysArgGlnIleLysIleTrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys (配列番号29)
を含み、更に最後のLys残基の後に(Xaa)n、それに続いてCysを含み、式中Xaaは任意のアミノ酸であり、nは1以上の値を有する。あるいは、前記配列の相同体、誘導体又は類縁体が使用される。前記配列の使用は、核酸断片によりコードされるペプチドがインビトロで合成され、又は宿主細胞から分泌され、核酸断片によりコードされる前記ペプチドをスクリーニングするために、ある細胞に取り込ませなければならない場合に、特に有用である。
当業者であれば、ペプチドの細胞内への取り入れを進めるために、シグナル、例えばHIVのtat配列の類似した使用も認識されていよう。
代替の一実施形態では、核酸断片によりコードされる該ペプチドは、インビトロ又はインビボで細胞による浸透又は取り込みを高め、増加させ、又は補助することができるペプチドと混合される。細胞の浸透又は取り込みを増加させ、又は補助することができるペプチド配列は、合成ペプチドPep1であり、それは少なくとも次のアミノ酸配列: LysGluThrTrpTrpGluThrTrpTrpThrGluTrpSerGlnLysLysLysLysArgLysVal (配列番号30)
を含む。
Pep1ペプチドは、核酸断片によりコードされる該ペプチドと複合する必要はない。更に、Pep1は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドから解離する。したがって、Pep1は、標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を形成するペプチドを妨害することはなかろう。Pep1は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドをスクリーニング用の細胞又は生物に添加する前に、単離した場合だけに有用である。したがって、Pep1は、インビトロのライブラリーをスクリーニングする際に特に有用である。
他のタンパク質導入ドメイン(PTD)は、当分野で公知であり、本発明において明らかに有用である。そのようなものは、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)アンテナペディアの第43〜58番アミノ酸、ポリアルギニン、PTD-5、トランスポータン及びKALA (Kabouridis, TRENDS in Biotechnology, 21: 498-503, 2003に総説)である。
代替のタンパク質導入ドメイン(PTD)は、当分野で公知であり、例えば、TAT断片第48〜60番(GRKKRRQRRRPPQ, 配列番号31)、シグナル配列系ペプチド1(GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV, 配列番号32)、シグナル配列系ペプチド2(AAVALLPAVLLALLAP, 配列番号33)、トランスポータン(GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL, 配列番号34)、両親媒性モデルペプチド(KLALKLALKALKAALKLA, 配列番号35)、ポリアルギニン(例えば、RRRRRRRRRRR, 配列番号36)が挙げられる。
一実施形態では、発現ライブラリーを細胞宿主又は生物中に導入し、好ましくはその中で発現することにより、発現ライブラリーを生成し、また、遺伝子構築体を前記細胞宿主又は前記生物中に導入するのが好ましい。遺伝子構築体を発現用細胞又は生物中に導入する方法は、当業者には公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。遺伝子構築体を導入するために選択する方法は、遺伝子構築体を発現させようとする細胞型に依存する。
一実施形態では、細胞宿主は細菌細胞である。組換えDNAを細菌細胞中に導入する手段には、それだけに限らないが、エレクトロポレーション、又は形質転換を可能とするように予備処理した細胞中への化学的形質転換が挙げられる。
別の実施形態では、細胞宿主は酵母細胞である。組換えDNAを酵母細胞中に導入する手段には、エレクトロポレーション及びPEG媒介形質転換からなる群から選択される方法が挙げられる。
別の実施形態では、細胞宿主は植物細胞である。組換えDNAを植物細胞中に導入する手段には、Agrobacterium媒介形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、プロトプラストのPEG媒介形質転換、植物組織の粒子媒介衝突、及び植物細胞又はプロトプラストのマイクロインジェクションからなる群から選択される方法が挙げられる。
更に別の実施形態では、細胞宿主は昆虫細胞である。組換えDNAを植物細胞中に導入する手段には、バキュロウイルスによる感染、及び例えばセルフェクチン(Invitrogen)を用いた、リポソームを媒介とするトランスフェクションからなる群から選択される方法が挙げられる。
更に別の実施形態では、細胞宿主は哺乳類細胞である。組換えDNAを哺乳類細胞中に導入する手段には、マイクロインジェクション、DEAEデキストランを媒介とするトランスフェクション、リン酸カルシウムを媒介とするトランスフェクション、例えばリポフェクタミン(Invitrogen)及び/又はセルフェクチン(Invitrogen)を用いたリポソームを媒介とするトランスフェクション、PEG媒介DNA取り込み、エレクトロポレーション、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス又はレトロウイルスによる形質導入、ならびに例えばタングステン又は金のDNA被覆粒子を用いた微粒子衝突(Agacetus Inc., WI, USA)からなる群から選択される手段が挙げられる。
代替の一実施形態では、発現ライブラリーはインビトロディスプレイライブラリーである(即ち、発現ライブラリーの原核生物又は小型真核生物由来核酸断片がコードするペプチドは、その発現ペプチドが、宿主細胞の不在下で提示されるように発現源の核酸に連結されている、インビトロディスプレイを用いてディスプレイされる)。したがって、インビトロディスプレイ技術により作製される発現ライブラリーは、形質転換又はトランスフェクションの効率によって制限されない。したがって、このような任意のライブラリーは、インビボディスプレイライブラリーより複雑度がはるかに高い。インビトロディスプレイ法の例には、それだけには限らないが、リボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイ及びmRNAディスプレイを含む群から選択される方法が挙げられる。
一実施形態では、インビトロディスプレイライブラリーはリボソームディスプレイライブラリーである。当業者であれば、リボソームディスプレイライブラリーは、該発現ライブラリーがコードするmRNAをそれがコードするペプチドと直結させることを認識されよう。リボソームディスプレイライブラリーを作製する手段では、核酸断片が、適当なプロモーター配列及びリボソーム結合配列と作動可能に連結されること、即ち遺伝子構築体を形成することが要求される。好ましいプロモーター配列は、バクテリオファージのT3及びT7プロモーターである。
好ましくは、該核酸断片は、スペーサー配列及び終止配列を除いた修飾終止配列と作動可能に連結される。
本明細書で使用する場合、「スペーサー配列」という用語は、該ペプチドに融合しているあるペプチドをコードする一連の核酸を意味するものと解釈する。スペーサー配列は、該スペーサー配列によりコードされるペプチドが翻訳後のリボソームトンネル内に留まり、同時に、自由に折り畳まれ、別のタンパク質又は核酸と相互作用できる間に、遺伝子構築体中に組み込まれる。
好ましいスペーサー配列は、例えば、線状ファージM13 mp19の遺伝子IIIの第211〜299番アミノ酸をコードする核酸である。
該ディスプレイライブラリーは、当分野で公知の方法を用いてインビトロで転写、翻訳され、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載されている。
インビトロで転写及び翻訳をする系の例には、例えば、Promega供給のTNTインビトロ転写・翻訳系が挙げられる。発現反応の氷上での冷却により、翻訳が一般に終結する。リボソーム複合体は、例えば、酢酸マグネシウム又はクロラムフェニコールなどの試薬の添加によって、ペプチド及び/又はそのコードmRNAからの解離に対して安定化される。このようなインビトロディスプレイライブラリーは、本明細書に記載されるような各種の方法によってスクリーニングされる。
別の実施形態では、該発現ライブラリーはリボソーム不活性化ディスプレイライブラリーである。この実施形態によれば、核酸断片は、第1のスペーサー配列をコードする核酸と作動可能に連結している。このスペーサー配列は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドが、自由に折り畳まれ、標的のタンパク質又は核酸と相互作用することを可能にする多グリシン/セリン配列であることが好ましい。
第1のスペーサー配列は、リボソームを不活性化する毒素をコードする核酸に連結している。該毒素は、真核細胞リボソームを不活性化するリシンAを含み、mRNA又はコードされるペプチドを放出せずに、翻訳複合体上にリボソームを引き止めるのが好ましい。
該毒素をコードする核酸は、第2のスペーサー配列をコードする別の核酸と連結している。第2のスペーサーは、リボソームのトンネルを占有するアンカーとして必要とされ、ベプチド、毒素の双方が正しく折り畳まれ、活性化することを可能にする。このようなスペーサー配列の例は、M13バクテリオファージの遺伝子IIIに由来する配列である。
リボソーム不活性化ディスプレイライブラリーは、Promegaから入手できるウサギ網状赤血球溶解系などの系を用いて、インビトロで一般に転写、翻訳される。毒素をコードするmRNAが翻訳され、このタンパク質が正しく折り畳まれるときに、コードされるポリペプチド、その翻訳源のmRNAの両方になお結合したまま、リボソームが不活性化される。
別の実施形態では、該発現ライブラリーはmRNAディスプレイライブラリーである。この実施形態によれば、核酸断片は、多グリシン/セリン配列などのスペーサー配列をコードする核酸と作動可能に連結しており、該スペーサー配列は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドが、自由に折り畳まれ、標的のタンパク質又は核酸と相互作用することを可能にする。
該スペーサー配列をコードする核酸は、転写終結因子と作動可能に連結している。
mRNAディスプレイライブラリーは、当分野で公知の方法、例えば、Promegaから入手できるHeLaScribe Nuclear Extract インビトロ Transcription Systemを用いて、一般にインビトロで転写される。その後、コードされるmRNAは、当分野で公知であり、例えば、Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302 (1997)に記載の技法を用いて、リボソームに結合する分子、例えばピューロマイシンに共有結合で連結しているDNAオリゴヌクレオチドに、共有結合で連結される。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、ソラーレン部分と共有結合で連結しており、それにより、オリゴヌクレオチドは、発現ライブラリーによりコードされるmRNAに光架橋される。
次いで、発現ライブラリーから転写された該mRNAは、当分野で公知であり、例えば、Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987の中)、及びSambrook等(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001の中)に記載の方法を用いて翻訳される。リボソームがmRNAとオリゴヌクレオチドとの接合部に達すると、リボソームは留まり、ピューロマイシン部分がリボソームのホスホトランスフェラーゼ部位に進入し、このようにして、コードされるポリペプチドがその発現源のmRNAと共有結合で連結される。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーは共有結合ディスプレイライブラリーである。この実施形態によれば、核酸断片は、コード源のDNAと相互作用するタンパク質をコードする第2の核酸断片と作動可能に連結している。該DNAと相互作用するタンパク質の例には、それだけに限らないが、大腸菌バクテリオファージP2ウイルスAタンパク質(P2A)、ならびにファージ186、HP1及びPSP3から単離される等価なタンパク質が挙げられる。
P2Aタンパク質は特に好ましい。P2Aタンパク質は、P2Aタンパク質をコードする核酸内に位置する画定された開始配列TCGGA(配列番号31)を認識し、遊離端ヌクレオチドの1つと共有結合を形成しながら、ストランドの1本にニックを挿入する。したがって、発現ライブラリーを含んだ遺伝子構築体中に、少なくとも配列TCGGA(配列番号31)を含めることが好ましい。
該タンパク質の結合部位は、核酸断片がそれにコードされるペプチドと共有結合で連結されるように位置づけることが、特に好ましい。
共有結合ディスプレイ遺伝子構築体は、Promegaから入手できるウサギ網状赤血球溶解系などの系を用いて、インビトロで転写、翻訳される。ペプチドとP2Aタンパク質との融合体を翻訳する際、P2Aタンパク質は、配列番号31の配列の核酸にニックを入れ、それと共有結合を形成する。したがって、核酸断片は、それにコードされるペプチドと共有結合で連結される。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーはファージディスプレイライブラリーであり、その場合、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインは、例えば、米国特許第5,821,047号及び米国特許第6,190,908号に記載のように、バクテリオファージの表面上にディスプレイされる。記載されている基本原理は、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む第1の核酸と、ファージコートタンパク質、例えば、M13タンパク質3 、M13タンパク質7又はM13タンパク質8の群から選択されたファージコートタンパク質をコードする配列を含む第1の核酸との融合体に関する。その場合、このような配列は、適当なベクター、例えば細菌細胞中で複製できるベクター中に挿入される。次いで、適切な宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)をその組換えベクターで形質転換する。前記宿主細胞には、核酸断片を作動可能に連結した非修飾形コートタンパク質をコードするヘルパーファージ粒子も感染させる。組み換え、感染させた宿主細胞は、融合タンパク質の複数コピーをその粒子表面上に含む組換えファージミド粒子の形成に適切な条件下で培養する。この系は、ウイルス粒子、例えば、λファージ、T4ファージ、M13ファージ、T7ファージ及びバキュロウイルスからなる群から選択された、ウイルス粒子の生成に有効であることが判明した。次いで、このようなファージディスプレイ粒子をスクリーニングすることにより、標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するディスプレイタンパク質を同定する。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーはレトロウイルスディスプレイライブラリーであり、その場合、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインは、レトロウイルス粒子の表面上にディスプレイされる。レトロウイルスディスプレイは、このような系でディスプレイされるタンパク質及びペプチドが、ペプチド又はタンパク質ドメインに対して、活性のために必要な翻訳後修飾を何度も実行できる真核細胞中に生成するとき、特に有用である。このようなレトロウイルスディスプレイ系は、米国特許第6,297,004号(Cambridge Drug Discovery Holding, Limited)に記載されている。このような系を本発明に適合させる際、核酸断片は、レトロウイルスのエンベロープタンパク質と、より好ましくはスパイク糖タンパク質と作動可能に連結される。このようなタンパク質の一例は、Moloneyマウス白血病ウイルスの成熟エンベロープタンパク質である。レトロウイルスエンベロープタンパク質と作動可能に連結される核酸断片を含む遺伝子構築体は、長い末端反復配列、tRNA結合部位及びポリプリン領域とも作動可能に連結されることにより、感染哺乳類細胞における逆転写及びキャプシド内RNAの組み込みが保証される。その上、このような遺伝子構築体は、キャプシド内封入シグナル配列を含むべきである。キャプシド内封入シグナル配列は、ウイルス粒子中へのその核酸の封入を媒介するウイルス粒子成分によって認識される核酸である。次いで、このような遺伝子構築体は、非修飾スパイク糖タンパク質をコードするレトロウイルスに予め感染させた適当な宿主細胞中、例えばCOS細胞又はNIH3T3細胞中で発現される。このような系では、修飾形及び非修飾形のスパイク糖タンパク質の混合物を保有する、キメラレトロウイルス粒子が生成する。このような組換えレトロウイルス粒子を用いて、標的のタンパク質又は核酸に結合するディスプレイペプチドを同定する。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーは細菌ディスプレイライブラリーであり、その場合、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインは、細菌細胞の表面上にディスプレイされる。次いで、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインをディスプレイする細胞は、例えば、米国特許第5,516,637号に記載のようにバイオパンニングに使用される。細菌ディスプレイは、異種タンパク質が細菌表面タンパク質との融合体として発現し、標的のタンパク質又は核酸に対する結合能についてアッセイされるという知見に基づいている。したがって、このような系では、核酸断片は、細菌細胞表面上へのコードされたペプチドの取り込みを誘導する固定化用モチーフ又はアミノ酸配列をコードする、第2の核酸と作動可能に連結される。細菌細胞表面上へのペプチドの取り込みを誘導する好ましいアミノ酸配列には、それだけに限らないが、大腸菌の鞭毛上にタンパク質を局在させる鞭毛主要サブユニットFliC、ラクトバチルスカゼイ(Lactobacillus casei)の細胞壁プロテイナーゼPrtPの細胞選別シグナル、コレラ菌のOmpSマルトプロテイン、枯草菌のプロテインA、枯草菌(Bacillus subtilis)のLysA及び枯草菌のActAが挙げられる。次いで、このような遺伝子構築体を含む発現ライブラリーは、適当な宿主細胞、例えば大腸菌又は枯草菌中に導入され、発現したペプチドが細菌細胞の表面上にディスプレイされる。このようにディスプレイされるライブラリーは、標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドのスクリーニングにおいて特に有用である。
代替の一実施形態では、核酸断片によりコードされるペプチドは、細菌胞子の表面上への該コードペプチドの取り込みを誘導するペプチドをコードする配列を含む、第2の核酸とも融合される。このような方法は、細胞内で発現した場合、又はスクリーニング条件が特に苛酷な場合、例えば、有機溶媒もしくは高温の存在下など、細菌に有毒であるペプチドのディスプレイにおいて特に有用である。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーは、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインが酵母細胞の表面上にディスプレイされる、ディスプレイライブラリーである。この方法は、真核生物由来の核酸によりコードされるペプチドのディスプレイに特に有用であるが、その理由は、原核種では真核配列によりコードされる構造に形成できないものがあるからである。このような酵母ディスプレイ法は、米国特許第6,423,538号に記載されている。この方法を本発明に適合させる際、核酸断片は、aga2遺伝子によりコードされる膜結合αアグルチニン酵母接着受容体をコードする、第2の核酸断片に作動可能に連結される。発現ライブラリーは、適当な宿主細胞中、例えばS.セレビシエ又はS.ポンベ中に導入される。適当な宿主細胞中に導入後、融合タンパク質が細胞から分泌される。次いで、該融合タンパク質は、ジスルフィド結合の形成によって、細胞表面上のAga1タンパク質と結合する。このような酵母細胞のスクリーニングによって、標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドが発現されるか否かを判定する。
更に別の実施形態では、該発現ライブラリーは、発現されたペプチド又はタンパク質ドメインが哺乳類細胞の表面上にディスプレイされる、ディスプレイライブラリーである。このような系は、例えばStrenglin et al EMBO J, 7, 1053-1059, 1988に記載されている。哺乳類ディスプレイは、真核生物由来のペプチドのディスプレイに特に有用であるが、その理由は、原核種及び一部の下等真核種では真核配列によりコードされる構造に形成できないものがあるからである。哺乳類ディスプレイの背後をなす機構は、核酸断片と、分泌されるタンパク質を誘導するペプチドリーダー配列、例えばIgκ分泌シグナルをコードする、第2のヌクレオチド配列との融合体に関する。更に、該核酸断片は、そのペプチドを膜に固定するペプチドをコードする別の核酸、例えば、PDGFRの膜貫通ドメインの配列と作動可能に連結される。このような配列を含むベクターの一例は、Invitrogenから入手できるpDISPLAYである。このようなベクターにより発現されるタンパク質は、哺乳類細胞の表面上にディスプレイされるため、このような細胞は、標的のタンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を取るペプチドのスクリーニングに特に有用である。
別の実施形態では、該発現ライブラリーは、配列された発現ライブラリーである。本明細書で使用する場合、「配列された発現ライブラリー」とは、個々のペプチド及び/又はそれをコードする核酸が容易に同定されるように、該ライブラリーを集合させることを意味するものと解釈する。例えば、本発明のライブラリーによりコードされる各ペプチドを個別に生成し(即ち、他のペプチドから隔離して)、次いで多数又は複数の異なるペプチドをプールする。次いで、このようなペプチドプールの2つ以上をプールし、必要であれば、このプロセスを繰り返す。したがって、数千又は数百万のペプチドのプールを作り得る。次いで、これらのプール中最大のプールをスクリーニングすることによって、標的のタンパク質及び/又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドが含まれるか否かを判定する。このようなプールに標的のタンパク質及び/又は核酸と結合するペプチドが含まれれば、より小さなペプチドプール(即ち、サブプール)の一群又は複数群をスクリーニングすることによって、対象とするそのペプチドが含まれるか否かを判定する。対象とするその個別ペプチドが単離されるまで、規模の大きい順のプールに対して、このプロセスを繰り返し反復できることは明らかである。あるいは、もっと少数(例えば、10又は100)のペプチドのプールを直接スクリーニングすることによって、あるとすればそれらのペプチド中のいずれが、標的のタンパク質及び/又は核酸との結合に十分な立体配座を有するかを判定し、更に前記のペプチド又はコード核酸の配列を決定する(例えば、バイオセンサーチップと共に質量分析を用いて)。
当業者には明らかと思われるが、本発明が多種のライブラリーの使用を包含することは明白である。したがって、本発明は1種又は複数のプールしたライブラリーのスクリーニングも包含する。例えば、本発明は2種以上のライブラリーをプールすることを包含する。一実施形態では、該ライブラリーは同一の生物(複数も)に由来する。別の実施形態では、該ライブラリーは異なる生物に由来する(例えば、1つのライブラリーは小型ゲノムを含む真核生物に由来し、もう1つのライブラリーは細菌に由来する)。
当業者には明らかと思われるが、配列又はプールされたライブラリーは、1種又は複数の生物のゲノムに由来する核酸断片、及び/又は前記断片を含むベクター、及び/又は核酸断片によりコードされるペプチド、及び/又は前記ペプチドを発現する細胞を含んでもよい。
別の実施形態では、配列された発現ライブラリーが作製され、又は分析用チップに結合もしくは複合される。このようなチップを作製するために、本発明のペプチド(及び/又は前記ペプチドをコードする核酸、及び/又は前記核酸を含むベクター、及び/又は前記ペプチドを発現する細胞)は、固体支持体、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、酸化ケイ素、金又は窒化ケイ素の上で合成されるか、又は合成した後、それに結合される。この固定化は、直接的(例えば、共有結合的連結、例えばシッフ塩基の形成、ジスルフィド連結、又はアミドもしくはウレア結合の形成により)、間接的のいずれかである。タンパク質チップを生成する方法は、当分野で公知であり、例えば、米国特許出願第20020136821号、第20020192654号、第20020102617号、及び米国特許第6,391,625号に記載されている。タンパク質を固体支持体に結合するためには、例えば、アルデヒド含有シラン試薬、又はLee et al, Proteomics, 3: 2289-2304, 2003に記載のカリックスクラウン誘導体を用いて、その表面上に化学反応基を創出するように、固体支持体を処理することが必要である。ストレプトアビジンチップも、ビオチンと複合化しておいたタンパク質及び/又はペプチド及び/又は核酸及び/又は細胞を捕捉するために有用である(例えば、Pavlickova et al., Biotechniques, 34: 124-130, 2003)。あるいは、Arenkov et al. Anal. Biochem. 278: 123-131, 2000に記載のように、ペプチドを微細加工したポリアクリルアミドゲルパッド上に捕捉し、微量電気泳導を用いてそのゲル中へ加速させる。
標的のタンパク質及び/又は核酸を結合できるチップ上でペプチドを決定する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、タンパク質チップを用いて分析すべき試料を、当分野で公知の方法を用いて検出可能なレポーター分子、例えば、蛍光分子、放射性分子、酵素又は抗体に結合する。したがって、タンパク質チップを標識試料と接触させた後、任意の未結合タンパク質を洗浄して除くことにより、結合したタンパク質及び/又は核酸の存在が、当分野で公知の方法、例えばDNAマイクロアレイを用いて検出される。
あるいは、生体分子相互作用分析-質量分析(BIA-MS)を用いて、複雑な生体試料中に存在するfmole量前半からそれ未満のタンパク質を急速に検出し、その特性を決定する(Nelson et al. Electrophoresis 21: 1155-1163, 2000及びNeedelkov and Nelson, Biosensors and Bioelectronics, 16: 1071-1078, 2001)。タンパク質チップの分析に有用な一技法は、タンパク質チップに結合したタンパク質の特性を決定するための表面増強レーザーデソープション/イオン化-飛行時間型質量分析(SELDI-TOF-MS)である。あるいは、タンパク質チップは、米国特許出願第20020139751号に記載のようにESIを用いて分析される。
ライブラリースクリーニング法
スクリーニング法の選択段階は、既知機能又は予想機能を発揮するペプチドを単に選択するのではなく、ミモトープ又は模倣ペプチドを同定することである。自然の環境で標的タンパク質又は標的核酸に結合しないペプチドを選択する適切な方法は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列を決定するか、又は前記ペプチドをコードする対応核酸のヌクレオチド配列を決定し、前記ヌクレオチド配列からアミノ酸配列を誘導すること、該アミノ酸配列の既知機能を決定すること、及び該既知機能と関連する標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを除外することを含む。
その代替又は追加として、該選択は、アッセイ対象の結合反応に関わる特定の生化学経路又はシグナル伝達経路を有していない生物からの核酸断片を含む、発現ライブラリーの使用を伴う。
その代替又は追加として、該選択は、アッセイ対象の結合反応に関する結合性パートナーの1種又は複数を発現しない生物からの核酸断片を含む、発現ライブラリーの使用を伴う。本発明は、既知の機能を発揮するだけのペプチドをスクリーニング法から除外するために、バイオインフォマティクス分析と、アッセイ対象の結合反応を実行することが不明な生物からのライブラリー成分の選択との併用を明らかに想定している。したがって、このような選択により、選択されたペプチド又はタンパク質ドメインが、自然の環境で標的タンパク質又は標的核酸に結合しないことが保証される。
本発明の特に好ましい一実施形態では、標的のタンパク質又は核酸の生物活性を調節できるペプチド又はタンパク質ドメインの同定が得られ、その場合、調節される生物活性は、別のタンパク質又は核酸に対する標的のタンパク質又は核酸の結合能であり、調節される結合は、レポーター分子を用いて決定される。本明細書で使用する場合、「レポーター分子」という用語は、測定できる上、標的タンパク質又は核酸の生物活性の変化と相関付けのできるように変化する、物理的測定が可能な性質を表示する分子を意味するものと解釈する。レポーター分子は当分野で公知であり、それだけに限らないが、蛍光を示すタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、基質の存在下で色変化を誘発するタンパク質、例えば大腸菌(E coli)のβ-ガラクトシダーゼ、宿主細胞に増殖特性を賦与する分子、例えばHIS1、ならびに宿主細胞の死又は増殖能低下を誘発する分子、例えばURA3及びCYH2又はCYH3が挙げられる。
本発明の一実施形態は、DNA配列に結合できる立体配座を有するペプチドをコードする核酸の同定に関する。標的DNA配列に結合できるペプチドを決定するために、Chong and Mandel (Bartel and Fields, The Yeast Two-Hybrid System, New York, NY pp 289-297, 1997)に記載されるようなワンハイブリッドアッセイを使用する。標準的ワンハイブリッド技法を本目的に適合させる際、標的ヌクレオチド配列が、その発現を前記のように決定できるレポーター遺伝子(複数も)のプロモーター領域中に取り込まれる。発現ライブラリーによりコードされるペプチドは、転写活性化ドメイン(例えば、GAL4タンパク質、LexAタンパク質、VP16タンパク質、B42タンパク質、又はNFκBタンパク質由来)と融合タンパク質を形成するように発現される。転写活性化ドメインは、発現ペプチドと標的ヌクレオチド配列との機能的相互作用を介してプロモーターに動員される。その後、転写活性化ドメインは、細胞の基礎転写機構と相互作用し、レポーター遺伝子の発現を活性化させる。
別の実施形態では、Payan他の米国特許第6,316,223号及びBartel and Fields, The Yeast Two-Hybrid System, New York, NY, 1997に記載のツーハイブリッドアッセイを用いて、標的のタンパク質又はペプチドに結合できるポリペプチドが同定される。記載の基本的機構では、結合性パートナーが、2種の異なる融合タンパク質として適当な細胞中、例えば、細菌細胞、酵母細胞及び哺乳類細胞中に発現されることが必要である。標準的ツーハイブリッドスクリーニングを本目的に適合させる際、第1の融合タンパク質は、標的タンパク質に融合したDNA結合性ドメインからなり、第2の融合タンパク質は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドに融合した転写活性化ドメインからなる。該DNA結合性ドメインは、1種又は複数のレポーター遺伝子の発現を制御するオペレーター配列に結合する。該転写活性化ドメインは、発現ライブラリーによりコードされるペプチドと標的タンパク質との機能的相互作用を介してプロモーターに動員される。その後、転写活性化ドメインは、細胞の基礎転写機構と相互作用し、それによりレポーター遺伝子(複数も)の発現を活性化し、その発現量が決定できる。
Zhang等(Bartel and Fields, The Yeast Two-Hybrid System, New York, NY pp 289-297, 1997の中)に記載のスリーハイブリッドアッセイを使用することにより、標的RNA配列と結合するペプチドが決定される。記載のスリーハイブリッド技法を本発明に適合させる際、第1の融合タンパク質は、既知のRNA結合タンパク質、例えば、バクテリオファージMS2のコートタンパク質に融合したDNA結合性ドメインからなる。RNA結合タンパク質、例えばMS2結合配列に結合することが知られているRNA分子と、標的RNA結合配列との融合体からなる、RNAハイブリッド分子も形成される。第2の融合タンパク質は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドに融合した転写活性化ドメインからなる。第1の融合タンパク質のDNA結合性ドメインは、1種又は複数のレポーター遺伝子の発現を制御するオペレーター配列に結合する。該RNA融合分子は、RNA結合タンパク質と、前記RNA結合タンパク質と相互作用することが知られているRNA分子との機能的相互作用を介して、第1の融合タンパク質に動員される。該転写活性化ドメインは、本発明の核酸によりコードされるペプチドの標的RNA配列との機能的相互作用を介して、1種又は複数のレポーター分子のプロモーターに動員される。
ツーハイブリッドスクリーニングの他の変法は、当分野で公知であり、例えば、PolIIIツーハイブリッド系、Tribrid系、ユビキチン依拠分割タンパク質センサー系、及びVidal and Legrain Nucl. Acid Res. 27(4), 919-929 (1999)に記載のSos動員系がある。このような系は、全て特別に想定されている。
本発明の特に好ましい一実施形態は、標的のタンパク質又は核酸と別のタンパク質又は核酸との相互作用に拮抗し、又はそれを阻害するペプチドの同定に関する。したがって、逆「N」-ハイブリッドスクリーニングを採用して、アゴニスト分子を同定する。逆ハイブリッドスクリーニングは、標的のタンパク質又は核酸と別のタンパク質又は核酸との相互作用に抗して選択するために、逆選択可能レポーターマーカー(複数も)、例えば、URA3遺伝子、CYH2遺伝子又はLYS2遺伝子を使用する点で、上記の順ハイブリッドスクリーニングと異なる。細胞生存率又は細胞増殖率は、薬物の存在下、又は、逆選択マーカーによって有毒化合物に変換される、例えば、薬物5-FOAの存在下で致死性をもたらすURA3遺伝子産物などの逆選択可能レポーター遺伝子産物の毒物産生基質の存在下、低減又は抑止される。したがって、標的タンパク質と別のタンパク質又は核酸との相互作用が阻止又は阻害される細胞は、該物質の存在下で生存している。これは、逆選択可能レポーター分子が発現されないため、該基質が有毒産物に変換されないか、又は該薬物(シクロヘキシミドの場合)が、レポーター遺伝子によりコードされる必須標的に攻撃作用を示さないからと思われる。このような結果は、発現ライブラリーによりコードされるペプチドは、標的のタンパク質又は核酸と別のタンパク質又は核酸との相互作用の阻害剤であることを示唆する。
特に好ましい一実施形態では、本発明のスクリーニング法は、タンパク質-タンパク質相互作用又はタンパク質-核酸相互作用のアンタゴニストを同定する。この実施形態によれば、本発明は、1種又は複数のタンパク質結合性パートナーが関わる標的のタンパク質-タンパク質相互作用又はタンパク質-DNA相互作用を、部分的又は完全に阻害する阻害アミノ酸配列を同定するために、例えば、Watt他(米国特許出願第09/227652号)に本質的に記載されている逆ツーハイブリッドスクリーニング法であって、
(i)以下の(a)及び(b)をそれぞれ含む細胞を用意し：(a)標的に細胞毒性又は細胞抑制化合物を与えることにより(例えば、シクロヘキシミドに対する感受性を賦与するCYH2遺伝子)、あるいは基質を細胞毒性又は細胞抑制産物に変換することにより(例えば、5-FOAを有毒産物に変換するURA3遺伝子)、細胞の増殖率又は生存率を低下させることができるポリペプチドをコードする逆選択可能レポーター遺伝子を含む核酸であって、前記遺伝子は、前記遺伝子の発現がプロモーターの制御下で作動可能となるように、シス作用領域を含む前記プロモーターの下流に位置し、アッセイ対象のタンパク質-タンパク質相互作用又はタンパク質-DNA相互作用のタンパク質結合性パートナーは、前記シス作用領域に結合する核酸と、(b)(i)シス作用領域に結合することにより、逆選択可能レポーター遺伝子の発現を活性化する、DNA-タンパク質相互作用のタンパク質をコードする核酸、及び(ii)1種のタンパク質結合性パートナーがシス作用領域に結合し、タンパク質結合性パートナー同士が相互作用する、タンパク質-タンパク質相互作用の2種のタンパク質結合性パートナーをコードする核酸であって、シス作用領域との前記結合及び前記相互作用が、逆選択可能レポーター遺伝子の発現を活性化するために必要とされる核酸:からなる群から選択される核酸；
(ii)発現ライブラリーの単一の遺伝子構築体が、形質転換又は形質移入した各細胞中に存在するように、前記細胞又は前記細胞の一部を発現ライブラリーで形質転換又は形質移入し；
(iii)タンパク質結合性パートナー(複数も)が、発現ライブラリーによりコードされるアミノ酸配列によって、タンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用の阻害がない状態で、逆選択可能レポーター遺伝子の発現を活性化するのに十分な時間及び条件の下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(iv)発現ライブラリーのアミノ酸配列が、前記形質転換細胞又は形質移入細胞の各々において、あるいは前記形質転換細胞又は形質移入細胞のある割合において発現されるのに十分な条件下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(v)発現された逆選択可能レポーター遺伝子が、タンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用を阻害する発現ライブラリーのアミノ酸配列によって前記発現を減少させない限り、細胞の増殖率又は生存率を低下させるように、該基質又は該細胞毒性もしくは細胞抑制化合物の存在下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(vi)発現ライブラリーのアミノ酸配列を発現しない細胞と比較して、増殖率又は生存率が増加した細胞を選択する、ただし、増殖率又は生存率の増加が、該アミノ酸配列によるタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用の部分的又は完全な阻害を示唆する；及び
(vii)自然の環境においてタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用のタンパク質又は核酸に結合しない、(vi)における細胞により発現されるペプチドを選択すること
を含む方法を提供する。
タンパク質-タンパク質相互作用がアッセイ対象の場合、好ましくは、2種のタンパク質結合性パートナーの結合によって、例えば、該結合性パートナーは融合タンパク質として発現するが、各融合タンパク質は、他方の部分がなければ転写を調節しない転写調節タンパク質の一方の部分を含むことによって(例えば、転写活性化ドメインを含む1つの融合タンパク質及びDNA結合性ドメインを含む1つの融合タンパク質)、機能性の転写調節タンパク質が再構成される。特に好ましい一実施形態では、一方の融合タンパク質はSCLに融合したGal4 DNA結合性ドメインを含み、他方の融合タンパク質はLMO2タンパク質の転写活性化ドメイン及びSCLと相互作用するドメインを含んでおり、この実施形態では、URA3逆選択可能レポーター遺伝子が、Gal4上流活性化配列(Gal4 UAS)を含むプロモーターの作動可能な制御下にあり、その結果、URA3遺伝子の転写活性化のために、Gal4/SCL融合体のGal4 UASへのドッキング及びSCL、LMO2間の結合が必要とされ、それにより5-フルオロオロチン酸(5-FOA)の存在下で増殖する細胞に致死性が与えられる。発現ライブラリーのスクリーニングでは、5-FOAの存在下で生存している細胞だけが選択される。
例えば、Gal4のDNA結合性ドメインの場合のように、特異的な受容体がDNA結合性ドメイン融合タンパク質として発現され、GAL4活性化ドメインの場合のように、前記受容体のリガンドが活性化ドメイン融合タンパク質として発現される。これらの融合タンパク質は、CYH2逆選択可能マーカーと作動可能に連結している酵母細胞中で発現され、その場合、CYH2遺伝子の発現には、Gal4 DNA結合性ドメインとGAL4活性化ドメインとの物理的相互作用が要求される。この物理的関係は、例えば、Gal4 DNA結合性ドメインと結合する、プロモーター含有ヌクレオチド配列の制御下に、該マーカー遺伝子の発現を配することによって実現される。レポーター遺伝子を発現している細胞は、シクロヘキシミドの存在下で増殖しない。発現ライブラリーは酵母細胞中で発現され、シクロヘキシミドの存在下で次いで増殖する細胞は、例えば、候補ペプチド阻害剤をコードする核酸の分析などで更に分析される。
特に好ましい別の実施形態では、一方の融合タンパク質はJUN1に融合したGal4 DNA結合性ドメインを含み、他方の融合タンパク質はLMO2タンパク質の転写活性化ドメイン及びJUN1と相互作用するドメイン(例えば、JUNZ)を含んでおり、URA3逆選択可能レポーター遺伝子が、Gal4上流活性化配列(Gal4 UAS)を含むプロモーターの作動可能な制御下にあり、その結果、URA3遺伝子の転写活性化のために、Gal4/JUN1融合体のGal4 UASへのドッキング及びJUN1、JUNZ間の結合が必要とされ、それにより5-フルオロオロチン酸(5-FOA)の存在下で増殖する細胞に致死性が与えられる。発現ライブラリーのスクリーニングでは、5-FOAの存在下で生存している細胞だけが選択される。
当業者には公知のことと思われるが、簡単に前記した逆「n」-ハイブリッド法は、1-ハイブリッド、2-ハイブリッド又は3-ハイブリッドアッセイに使用するために容易に改変される。
代替の実施形態では、例えば、Erickson他(国際特許公開第95/26400号)により本質的に記載されているように、アンタゴニストは、逆分割ツーハイブリッド法を用いて同定されるが、その場合、負の転写調節剤であるリレー遺伝子が、相互作用性タンパク質(例えば、ベイト及びプレイ)が相互作用するときに正の読出しレポーター遺伝子の転写を抑制するために使用され、その結果、レポーター遺伝子発現は、リレー遺伝子産物がコードするタンパク質の非存在下だけに誘発される。この実施形態によれば、1種又は複数のタンパク質結合性パートナーを伴う標的のタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用を部分的又は完全に阻害する、阻害性アミノ酸配列を同定する方法であって、
(i)以下の(a)、(b)及び(c)をそれぞれ含む細胞を用意し：(a)負の転写調節剤をコードする核酸(例えば、Gal80又はmdm2腫瘍性タンパク質コード遺伝子)であって、前記核酸は、シス作用領域を含むプロモーターの下流に位置し、アッセイ対象のタンパク質-タンパク質相互作用又はタンパク質-DNA相互作用のタンパク質結合性パートナーが、前記シス作用領域に結合する核酸と、(b)(i)前記シス作用領域に結合することにより、負の転写調節剤の発現を活性化する、DNA-タンパク質相互作用のタンパク質をコードする核酸、及び(ii)1種のタンパク質結合性パートナーがシス作用領域に結合し、タンパク質結合性パートナー同士が相互作用する、タンパク質-タンパク質相互作用の2種のタンパク質結合性パートナーをコードする核酸であって、シス作用領域との前記結合及び前記相互作用が、負の転写調節剤の発現を活性化するために必要とされる核酸:からなる群から選択される核酸と、(c)負の転写調節剤が結合することにより、正のレポーター遺伝子(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子もしくは他の抵抗性遺伝子、又はスクリーニング細胞において栄養要求性変異を補足する遺伝子)の発現を阻害又は抑制するシス作用領域(例えば、Gal80に結合できるGAL4結合性部位、又はGal80、又はmdm2腫瘍性タンパク質に結合するp53のトランス活性化ドメイン)に、作動可能に連結した該正のレポーター遺伝子を含む核酸；
(ii)発現ライブラリーの単一の遺伝子構築体が、形質転換又は形質移入した各細胞中に存在するように、前記細胞又は前記細胞の一部を発現ライブラリーで形質転換又は形質移入し；
(iii)タンパク質結合性パートナー(複数も)が、発現ライブラリーによりコードされるアミノ酸配列によって、タンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用の阻害がない状態で、負の転写調節剤の発現を活性化するのに十分な時間及び条件の下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(iv)発現ライブラリーのアミノ酸配列が、前記形質転換細胞又は形質移入細胞の各々において、あるいは前記形質転換細胞又は形質移入細胞のある割合において発現されるのに十分な条件下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(v)発現された負の転写調節剤が、標的のタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用を阻害する発現ライブラリーのアミノ酸配列によって前記発現を減少させない限り、正のレポーター遺伝子の発現を抑制し、それにより細胞の増殖率又は生存率を低下させるように、正のレポーター遺伝子が細胞に抵抗性を賦与する対象の化合物の存在下で、該形質転換細胞又は形質移入細胞を培養し；
(vi)発現ライブラリーのアミノ酸配列を発現しない細胞と比較して、増殖率又は生存率が増加した細胞を選択し、ただし増殖率又は生存率の増加が、該アミノ酸配列によるタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用の部分的又は完全な阻害を示唆する；及び
(vii)自然の環境においてタンパク質-タンパク質相互作用又はDNA-タンパク質相互作用のタンパク質又は核酸に結合しない、(vi)における細胞により発現されるペプチドを選択すること
を含む方法が提供される。
タンパク質-タンパク質相互作用がアッセイ対象の場合、好ましくは、2種のタンパク質結合性パートナーの結合によって、機能性の転写調節タンパク質が再構成される。特に好ましい一実施形態では、一方の相互作用性タンパク質はLexA融合タンパク質を含み、他方の相互作用性タンパク質はVP16融合タンパク質を含んでおり、両者は相互作用すると、lexAオペレーターにより調節されるGAL80レポーター遺伝子の発現を誘発する。この実施形態では、正のレポーター遺伝子(例えば、栄養要求変異を補足する遺伝子)が、Gal4上流活性化配列(Gal4 UAS)を含むプロモーターの制御下に作動可能に配され、その結果、正のレポーター遺伝子の転写を抑制するために、Gal80負の転写調節剤のGal4 UASへのドッキング及びSCL、LMO2間の結合が必要とされ、それにより細胞の増殖を防止する。反対に、LexA融合体とVP16融合体との相互作用が抑制されると、GAL80の発現が防止されるため、スクリーニング細胞中、特に内因性Gal4タンパク質を発現する細胞中で栄養要求変異を補足する正のレポーター遺伝子の発現が可能となり、対応する栄養要求変異により依存性が賦与された栄養の非存在下で、細胞の増殖が可能となる。
本発明の好ましい一実施形態では、標的タンパク質又は標的核酸に結合するポリペプチドをコードする核酸断片は、例えば、変異誘発PCR、又は「変異誘発」細菌株中での前記断片の発現を用いて選択操作を更に受ける。これにより、選択核酸の多様性が増加する。前記選択核酸は、標的タンパク質又は標的核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドをコードする核酸を求めて、再度スクリーニングされる。低濃度の標的タンパク質又は核酸によるスクリーニング及び選択を多数回経て、標的タンパク質又は核酸に最高の親和性を示すペプチドが選択される。
関連する一実施形態では、標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドをコードする核酸断片の配列は、最適にアライメントされ、更にそれらの配列を比較して、標的タンパク質又は核酸との結合に特に望ましいアミノ酸をコードする核酸が同定される。その上、この情報を用いて、ペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列、あるいは標的タンパク質又は核酸との結合に特に望ましいアミノ酸を含有する合成ペプチドが生成される。
好ましくは、標的タンパク質又は核酸と結合するペプチドは、回収され、例えば、同定されたペプチド又はタンパク質ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列の決定などの更なる分析に使用される。最初に、ペプチドをコードする核酸断片は、当分野で公知の方法、例えば、とりわけPCR、RT-PCR及び核酸単離を用いて単離される。次いで、単離された核酸断片は、核酸配列決定などの方法によって特性決定がなされる。このような方法は当分野で公知である。
一実施形態では、単離核酸断片は、当分野で公知であり、本明細書に記載した方法を用いて発現ベクター中に挿入する。このような核酸断片は、単一のリーディングフレーム中だけに、一方向だけに発現されるにすぎない。この方法は、核酸断片のありとあらゆるオープンリーディングフレームを試験するまで反復され、標的タンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するポリペプチドをコードする核酸断片が同定される。本明細書で使用する場合、「ありとあらゆるオープンリーディングフレーム」という用語は、核酸断片内に形成されるオープンリーディングフレーム、例えば、第2ATG開始コドン、コザック配列、シャイン・ダルガーノ配列又はIRES(internal rebosome entry sequence)を含める以外に、核酸断片全体も含めたオープンリーディングフレームを包含するものとする。好ましくは、このような翻訳開始部位は、mRNAのキャップ部位後に現れる第1のコザック配列からの不均衡に強度の高い開始を補償するために、発現構築体のリボソーム結合性領域の5'末端から3'末端へ強度の低い順に取り込まれる。次いで、発現したペプチドは全て適当なスクリーニング系でスクリーニングし、標的タンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドを決定する。したがって、このようなペプチドをコードする核酸の分析を用いて、そのペプチドのアミノ酸配列を決定する。ExPasyで入手できるTranslateツールなどのソフトウェアが使用される。本明細書で使用する場合、「ExPasy」という用語は、Swiss Institute of Bioinformatics (CMU-Rue Michel-Servet 1 1211 Geneve 4 Switzerland)により提供されるExPasyプロテオミクスサーバーを意味するものと理解する。
標的タンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドをコードする核酸の単離後、発現ライブラリーを生成するために用いる生物のゲノムから、この配列の全相同体を単離することが好ましい。相同性核酸領域を単離する方法は、当分野で公知であり、例えば、Dieffenbach (編)and Dveksler (編)(PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995)に記載されている。そのような方法には、PCR及び縮重PCRが含まれる。次いで、当分野で公知であり、本明細書に記載の適切なスクリーニング系を用いた、ありとあらゆるリーディングフレームにおいてこのような相同体をスクリーニングする。
同定したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を、あらゆる公知の配列を使用する相同体探索のための「参照配列」として用いることは、更に好ましい実施形態である。このような参照配列は、データベース中の全てのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列と比較するヌクレオチド又はアミノ酸配列である。ヌクレオチド配列及び/又は推定したアミノ酸配列を含み、本発明で陽性と特定された核酸、又はペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質ドメインの配列に実質的に相同な全ての公知配列の同定に特別有用な源泉データベースが、幾つも利用できる。このようなデータベースは、当分野で公知であり、例えば、Genbank (NCBIにて)ならびにSWISS-PROT 及びTrEMBL (ExPasyで入手可能)を包含する。このような配列探索を行う幾多の異なる方法が当分野で公知である。次いで、クローンの配列データは、2種以上の配列間の相同性を測定するように設計されたアルゴリズムを用いて、1種又は複数のデータベース中の配列にアライメントさせる。
一実施形態では、公知の核酸の相同性探索で同定された核酸は、当分野で公知の多様な方法の1つ、例えば、該核酸が天然で見つかる生物のゲノムDNA又はcDNAの特異領域のPCR増幅を用いて、単離される。単離核酸の配列は、決定され、本明細書で記載のように遺伝子構築体を生成するために使用され、標的タンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドをコードするか否かを決定するために、スクリーニングされる。
別の実施形態では、公知のアミノ酸配列の相同性探索で同定されたアミノ酸配列をコードする核酸は、当分野で公知の技法、縮重PCRを用いて単離される。次いで、単離核酸を用いて本明細書に記載のように遺伝子構築体が生成され、標的タンパク質又は核酸との結合に十分な立体配座を有するペプチドをコードするか否かを決定するために、スクリーニングされる。
標的タンパク質又は核酸と結合する立体配座を有するポリペプチドをコードする核酸を分析して、自然の環境では前記標的タンパク質又は核酸と結合しないポリペプチドをコードする核酸断片を選択することは、特に好ましい実施形態である。本明細書で使用する場合、「自然の環境」という用語は、核酸断片を単離した遺伝子がコードするタンパク質を意味するものと理解する。したがって、本発明の目的は、例えば、元のタンパク質中に自然に出現する場合は結合できない標的タンパク質又は核酸と結合することによって、該タンパク質のサブドメインの機能をディスプレイするポリペプチドを同定することである。
本発明のライブラリーのスクリーニングで単離されるポリペプチドの公知の機能(複数も)は、例えば、NCBI又はPrositeから入手できる配列分析ソフトウェアを用いて決定される。本明細書で使用する場合、「Prosite」という用語は、Swiss Institute of Bioinformatics (CMU-Rue Michel-Servet 1 1211 Geneve 4 Switzerland)により提供されるExPasyプロテオミクスサーバーの一部をなすPrositeタンパク質データベースを意味するものと理解する。したがって、自然の環境では標的タンパク質又は核酸と結合することが知られているポリペプチドは、これ以上のいずれの分析からも除外される。更に、例えばNCBIから入手できるバイオインフォマティクス情報の分析は、タンパク質の元の機能の決定の補助となる。このような分析により、例えば、改変が起こっている経路は、ペプチドが特定される起源の生物中に存在するか否か、又は標的タンパク質又は核酸は、発現ライブラリーを生成するために用いた生物のいずれかに見出されるか否かが決定されよう。
発現ライブラリーが、標的タンパク質又は核酸を自然に発生させる生物とは異なる、生物から単離された核酸断片を用いて生成されることは、特に好ましい。例えば、人類(Homo sapiens)のc-Junタンパク質との結合に十分な立体配座を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するためには、発現ライブラリーは、アエロピラムペルニクス、アクイフェクスエオリクス、アーケオグロブスフルギディス、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム及びサーモトガマリティマ(Thermotoga maritima)の各生物から生成される。これにより、自然の環境でc-Junタンパク質と相互作用するペプチドを同定する可能性は減少しよう。
別の実施形態では、発現ライブラリーはアフィニティー精製を用いてスクリーニングされる。アフィニティー精製技法は、当分野で公知であり、例えば、Scopes(Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)に記載されている。アフィニティー精製の方法は、通常、本発明の核酸断片ライブラリーによりコードされるペプチドを特定の標的タンパク質又は核酸と接触後、洗浄し、該標的タンパク質又は核酸と結合しているペプチドを溶出することを伴う。前記標的タンパク質又は核酸は、精製を容易にするために、別の分子、例えば、プロテインA、プロテインG、アガロース、ビオチン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)及びFLAGエピトープと結合させる。したがって、該標的タンパク質又は核酸は、遠心分離により、あるいは別の分子、例えばストレプトアビジンへの結合、又は特異抗体、例えば抗FLAG抗体もしくは抗GST抗体の結合により、簡単に単離される。親和性マトリックスと共有結合した標的タンパク質又は核酸を用いる方法は、特に好ましい。
別の実施形態では、発現ライブラリーは、FACS分析を用いた結合ペプチドの同定を実現するために発現される。FACS分析を用いたライブラリーのスクリーニングは、米国特許第6,455,63号(Rigel Pharmaceutical Incorporated)に記載されている。その手順を本発明に適合させる際、発現ライブラリーが、例えば、インビトロディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ又は哺乳類ディスプレイを用いてディスプレイされるように、発現されることが特に好ましい。
好ましくは、インビトロディスプレイは、FACS選別によりスクリーニングされる。インビトロでディスプレイされるタンパク質は、FACS選別に適した粒子又はビーズ、例えば、とりわけ、ガラス、例えばポリスチレンなどのポリマー、ラテックスもしくはSepharoseなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、テフロンに共有結合される。
粒子又はビーズに結合した、ディスプレイされたライブラリーは、標識成分、例えば、蛍光分子又は第2の蛍光分子で検出される分子で標識しておいた、標的タンパク質又は核酸に添加される。標的タンパク質又は核酸を標識する方法は、当分野で公知であり、直接連結を用いる方法又はリンカーを用いる方法を包含する。その後、ビーズを洗浄し、FACSにより選別すると、蛍光性標的タンパク質又は核酸を結合したビーズを、蛍光性標的タンパク質又は核酸が結合していないビーズから分離することが可能である。
あるいは、該ライブラリーは、バイオセンサー準拠アッセイ、例えばBiacoreセンサーチップ技術(Biacore AB, UK)を用いてスクリーニングされる。Biacoreセンサーチップは、カルボキシメチル化デキストランで修飾された金の薄層で被覆されたガラス表面であり、標的タンパク質又は核酸が該デキストランに共有結合している。次いで、発現ライブラリーによりコードされるペプチドを、標的タンパク質又は核酸を含むBiacoreセンサーチップにかける。
好ましくは、核酸断片及びコードされたそのポリペプチドは、例えばディスプレイ技術を用いて連結される。
Biacoreセンサーチップは、例えば、表面プラズモン共鳴を用いた結合親和性の分析を介して、発現ライブラリーによりコードされるペプチドと標的タンパク質又は核酸との相互作用の速度分析に更に使用される。表面プラズモン共鳴は、本質的には、屈折率変化の測定を介して、チップ表面に近い水性層の質量変化を検出する。したがって、発現ライブラリーによりコードされるペプチドが標的タンパク質又は核酸に結合すると、屈折率が増加する。このようなアッセイは、更に、ペプチドの標的タンパク質又は標的核酸に対する親和性の決定を可能にする。
当業者には明らかと思われるが、例えば、エバネッセントバイオセンサー、膜系バイオセンサー(豪州特許第623,747号、米国特許第5,234,566号及び米国特許出願第20030143726号に記載)又は微小カンチレバー(米国特許出願第20030010097号に記載)は、本発明のペプチドをスクリーニングするために有用である。
ペプチド構造の決定
好ましい一実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング法を用いて選択又は同定した、1種又は複数のペプチド(好ましくは複数のペプチド)の構造が決定される。複数のペプチドの構造を決定することによって、本発明では、ペプチド相互の間で保存されている二次及び/又は三次構造の同定が可能となる。好ましくは、前記保存された構造を有するペプチドが選択される。
一実施形態では、該保存構造(又は、選択ペプチドの構造)は、自然において標的タンパク質又は標的核酸と相互作用するタンパク質又はその断片の保存構造とは異なる。
代替の一実施形態では、該保存構造(又は、選択ペプチドの構造)は、自然において標的タンパク質又は標的核酸と相互作用するタンパク質又はその断片の保存構造と同一であるか、又は類似している。
バイオインフォマティクス及び/又は実験的手段を、スクリーニングで同定されたペプチドの1種又は複数の二次及び/又は三次構造を決定するために採用するのが好ましい。多種のペプチドに関する構造解析を行なうことが厳密には必要ではないが、異なるペプチド中に特定の構造的特徴が保存され、又は反復すれば、標的タンパク質又は標的核酸との結合におけるその構造の妥当性が確認される。このことは、タンパク質データベース中に既に同定又は記載された構造的特徴でさえ当てはまる。したがって、スクリーニング処理過程で選択した異なるペプチドの構造的特徴を比較することは、特に好ましい。
ペプチドの構造を決定する実験的方法及び/又は手段は、当業者には明らかであろうが、例えば、原子吸光分光(AAS)、オージェ電子分光(AES)、コヒーレント反ストークス分光(CARS)、円二色性(CD)、転換電子メスバウアー分光(CEMS)、化学イオン化質量分光、化学誘起動的電子/核分極(CIDEP/CIDNP)、交叉分極マジック角回転(CP-MASS)、複合回転多重パルス分光(CRAMPS)、分極移動無ひずみ増強(DEPT)、二次元核磁気共鳴分光、電子線回折(ED)、エネルギー分散X 線分光、電子エネルギー損失分光、電子電子二重共鳴、電子分光、電子衝撃質量分光、電子核二重共鳴(ENDOR)、電子常磁性共鳴分光、電子スピン共鳴分光(ESR)、交換分光、遠赤外レーザー磁気共鳴、蛍光分光、フーリエ変換赤外線分光(FTIR)、気相電子線回折(GED)、異核相関分光(HETCOR)、異核オーバーハウザー効果分光、超ラマン分光、赤外線分光(IR)、レーザー脱離質量分光、レーザー誘起蛍光、レーザー磁気共鳴分光、磁気円二色性、マイクロ波分光、マイク分光、マイクロ波光学二重共鳴分光、メスバウアー分光、多光子イオン化分光、多段質量分光(MS/MS)、多光子励起蛍光分光、核ガンマ線共鳴分光、核オーバーハウザー分光、核四重極共鳴分光、光学二重共鳴分光、光電子分光、光イオン化質量分光、ラマン分光、ラマン誘起カー効果分光、回転フレーム核オーバーハウザー効果分光、回転ラマン分光、回転分光、共鳴ラマン分光、二次イオン質量分光、全相関分光、振動分光、可視線分光、X線回折、X線蛍光分光、X線光電子分光、相関分光(COSY)、クーロン爆発、HPLC、質量分析(例えば、MALDI、MALDI-TOF、LC-MS、MS-MS、GC-MS、LC/MS-MS、ES-MS、LC-ES-MS)が挙げられる。
ラマン分光法
例えば、ラマン分光法は、ハイスループットのスクリーニング、及び/又は多数の試料の分析に有用である。化合物のラマンスペクトルは、化合物の化学的性質、及び化合物の物理的状態両方についての情報を提供する。例えば、ラマンスペクトルは、適切な、もしくは望ましい試料を同定し、又は多数の試料を分類するための、試料の、分子内及び分子間の相互作用、包接、塩の形態、結晶の形態、ならびに水和の状態(又は溶媒和の状態)についての情報を提供する。ラマン分光法は、試料又は対象の化合物の水和状態における変化の動態を試験するのにも有用である。調製物における一般の溶剤又は構成成分には水からの強力なラマンシグナルがないので、多くの応用に関連のあるやり方でラマンデータがin-situで収集できるようになる。ラマン分光法の適切な方法は、例えば、Matsousek et al. J. Raman Spectroscopy. 32: 983-988, 2001、及び米国特許出願第2005/0,130,220号に記載されている。
赤外分光法
赤外(IR)分光法も、溶液中のタンパク質の二次構造を評価するのに貴重な技術である。IR分光法の1つの特定の形態である、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)は、タンパク質の二次構造の研究に好ましい形態のIR分光法となっている。FTIRは他の形態の赤外線分光法に比べて、感度及び信号対雑音(S/N)比の優れた、正確で高分解能のスペクトルを提供するので、二次構造を迅速に決定するのに有用である。FTIRの適切な方法は、例えば、Kumosinski & Unruh, (1994) in ACS Symposium Series 576, Molecular Modeling: From Virtual Tools to Real Problems, (Kumosinski & Liebman, eds.) pp. 71-98; Susi & Byler, (1986) Method. Enzymol. 130: 290-311; Susi & Byler, Method. Enzymol. 130: 290-311, 1986; Byler & Susi Biopolymers 25: 469-87, 1986; ならびにMiyazawa et al., J. Chem. Phys. 24(2): 408-18., 1956に記載されている。
タンパク質は、立体配座の認識をもたらし、アミドA、B、及びI-VIIバンドとして知られている、9個の特徴的な吸収バンドを中赤外領域(約1250cm-1から1850cm-1)に有することが知られている(Susi & Byler, Method. Enzymol. 130: 290-311, 1986)。タンパク質の二次構造は、主に、アミドI及びIIのバンドの振動数を特徴としている。
核磁気共鳴分光法
別の好ましいクラスの分光法は、核磁気共鳴(NMR)である。核磁気共鳴(NMR)分光法は、高磁場及び高周波パルスを使用して、核のスピン状態を操作する。核の例には、例えば、非ゼロスピン角運動量を有する1H、13C、及び15Nがある。そのような核を含む分子では、結果は、その位置及び強度が化学的な環境、及び分子内における核の位置を反映するピークのあるNMRスペクトルとなる。タンパク質構造の分析に適用するので、NMR分光法で現在達成することができる正確さは、X線結晶学で得られるものと比較可能である。
このような方法の例には、例えば、単一パルスで、水ピークが飽和され、CPMG(即ち核スピン緩和時間に基づいて編集される)などのスピンエコーで、拡散により編集されるような1Dスペクトル; J分解(JRES)、NOESY、COSY、TOCSY、及びこれらの誘導体などの1H-1Hに相関する方法、HETCORなどの直接検出方法などの1Hをへテロ核(例えば、13C、15N、19F、及び31Pを含む)に相関させる方法、ならびに1H-13C HMQC、HSQC、及びHMBOなどの逆検出法などの2Dスペクトル; 2D方法の組合せである、多くの変形を含む、例えば、HMQC-TOCSY、NOESY-TOCSYなどの3Dスペクトルを含む、1D、2D、及び3D-NMRが含まれる。これらのNMR分光法の技術をマジック角度回転(MAS)と組み合わせて、異方性の組成を特徴とする等方性の液体以外の試料を研究することもできる。
円偏光2色性
円偏光2色性分光法は、異なる軸に沿って振動する2つの平面偏光のビーム(例えば、速いものと遅いもの)に光を分ける複屈折板を通して平面偏光を通過させることにより行われる。ビームの一方が90°遅延される場合(4分の1波長板を用いて)は、現在、相の90°外側にある2つのビームが加えられ、結果は一方向の円偏光となる。代わりのビームが他方向の円偏光よりも遅延するように2つの軸を反転することにより、生成される。光学的に活性な試料を通過した右及び左の円偏波を加えた結果が楕円偏光であり、したがって円偏光2色性は、楕円率に等しい。溶液中の精製したペプチドの吸収を様々な波長で測定し、吸収を、既知の構造のタンパク質及び/又はペプチドで得られた吸収と比べることにより、ペプチドに構造が割り当てられる。
X線結晶学
別の一実施形態では、X線結晶学を用いてペプチドの構造を決定する。X線結晶学は、分子の3次元構造を解析するのに有用な方法である。結晶を回折格子として用いて、X線回折のパターンから分子の構造を計算する。タンパク質分子の3次元構造は、そのタンパク質の濃縮した水溶液から成長した結晶から生じる。例えば、X線結晶学のプロセスには、以下のステップが含まれる:
(a)ペプチドを合成し、単離する(さもなければ得る)、
(b)ペプチドを含む水溶液から結晶を成長させる、及び
(c)結晶からX線回折パターンを収集し、単位格子の寸法及び対称性を測定し、電子密度を測定し、ペプチドのアミノ酸配列を電子密度に適合させ、構造を精密にする。
ペプチドを生成するのに適する方法は、上記に記載してある。
次いで、様々な技術の任意のものにより、精製し濃縮したペプチドを含む水溶液から、結晶を成長させる。これらの技術には、バッチの、液体の、架橋の、透析の、蒸気拡散の、及び懸滴の方法が含まれる(McPherson John Wiley, New York, 1982; McPherson Eur. J. Biochem. 189:1-23, 1990; Webber Adv. Protein Chem. 41:1-36, 1991)。
例えば、一般的には、ペプチドの天然の結晶を、ペプチドの濃縮した溶液に沈殿剤を加えることにより成長させる。沈殿剤は、タンパク質を沈殿させるのに必要な濃度を少々下回った濃度で加える。蒸発をコントロールすることにより水を除去して沈殿する条件を生成し、結晶の成長が止まるまでこれを維持する。
結晶が成長した後、結晶をガラス製のキャピラリーチューブ又は他の取付け装置に配置し、X線発生装置及びX線検出装置に接続している据付け装置上に搭載する。X線回折パターンを収集したものは、当技術分野では知られている(例えば、Ducruix and Geige, (1992), IRL Press, Oxford, England、及びそこに引用されている参考文献)。X線のビームが、結晶に入り、次いで結晶から回折する。X線検出装置を利用して、結晶から発散する回折パターンを記録する。適切なX線検出装置には、フィルム又はデジタル記録装置が含まれる。適切なX線源には様々なタイプがあるが、高輝度の線源、例えばシンクロトロンビーム線源を用いると有利である。
結晶の形態のペプチド分子又は分子複合体の3次元構造を得るための方法は、当技術分野では知られている(例えば、Ducruix and Geige, (1992), IRL Press, Oxford, England、及びそこに引用されている参考文献)。
例えば、X線回折パターンを結晶から収集した後、結晶における単位格子の寸法及び配向を決定する。単位格子の寸法及び配向は、回折発光の間の間隔、及びこれらの発光から作成されたパターンから決定する。単位格子の寸法は、オングストローム単位(1オングストローム=10-10メートル)の3次元を特徴とし、各頂点における角度を特徴とする。結晶における単位格子の対称性は、また、この段階で特徴決定される。結晶における単位格子の対称性により、繰り返しパターンを同定することにより収集したデータの複雑さを単純化する。
各回折パターン発光はベクトルとして特徴決定され、この方法のこの段階で収集したデータは、各ベクトルの大きさを決定する。ベクトルの位相は、多くの技術を用いて決定することができる。一方法では、重原子を結晶中に浸漬し(同形置換)、これらの重原子をX線分析の対照ポイントとして用いることによりベクトルの位相を決定する。(Otwinowski, (1991), Daresbury, United Kingdom, 80-86)。同形置換法は、通常、1個を超える重原子の誘導体を利用する。
別の一方法では、既に構造が決定している結晶のポリペプチドからのベクトルの大きさ及び位相を、未知の構造の結晶のペプチドからのベクトルの大きさに適用し、引き続き、これらのベクトルの位相を決定する。この方法は、分子置換として知られており、基準として用いられるタンパク質の構造は、対象のタンパク質に緊密に関連した構造を有していなければならない(Naraza Proteins 11:281-296, 1994)。例えば、c-Junの構造は、c-Junに結合しているペプチドの分子置換分析に有用である。
結晶の単位格子を示しているベクトルの位相を決定した後、ベクトルの大きさ及び位相、単位格子の寸法、ならびに単位格子の対称性を、フーリエ変換機能における項として用いる。フーリエ変換機能は、これらの測定から単位格子における電子密度を計算する。単位格子における、分子の1つ又は分子複合体の1つを示す電子密度は、電子密度マップと呼ぶことができる。アミノ酸の配列の構造、又は結晶のポリペプチドと複合している化合物の分子構造を、次いで、様々なコンピュータプログラムの任意のものを用いて、電子密度に適合させる。プロセスのこのステップは、モデル構築と呼ばれることがあり、Turbo/FRODO、又は"O"などのコンピュータプログラムを用いて行うことができる(Jones Methods in Enzymology 115:157-171, 1985)。
次いで、理論上の電子密度マップをアミノ酸構造から計算し、実験的に決定した電子密度に適合させる。理論上の、及び実験的な電子密度マップを、相互に比較しこれらの2つのマップ間の一致をパラメータにより示す(R要因)。R要因が低値であるということは、理論上の電子密度マップと実験的な電子密度マップとの間で重複する電子密度の度合いが高いことを示している。
次いで、理論上の電子密度マップを精密にするコンピュータプログラムを用いることにより、R要因を最小にする。当業者であれば、X-PLORなどのコンピュータプログラムを、モデル精密化に用いることができる(Briinger Nature 355:472-475, 1992)。双方向性のプロセスで精密化を実現する。例えば、第1のステップは、電子密度マップで規定した電子の立体配座を変更することを含む。原子の立体配座は、温度の上昇を擬することにより変更され、温度の上昇は、結合の振動の振動数を増大させ、構造における原子の位置を修飾する。原子の摂動プロセスにおける特定の点では、許容される結合の角度及び結合の長さに関して原子間の相互作用を通常規定する力場、ファンデルワールス相互作用、水素結合、イオンの相互作用、及び疎水性の相互作用を原子のシステムに適用する。好ましい相互作用は、自由エネルギー、及び自由エネルギーの最小値を達成するまで多くの反復を超えて移動する原子に関して記載されるものである。精密化のプロセスは、R要因が最小値に達するまで反復することができる。
分子又は分子複合体の3次元構造は、R値が最小であることを特徴とする理論上の電子密度に適合する原子により記載される。
インシリコ法
本発明は、本明細書に記載する方法を用いて同定されるペプチドの構造を決定するためのインシリコ法も企図するものである。
例えば、構造上の特徴は、例えば、X線結晶学及び/又はNMR分光法を用いて決定される3次元の生体分子の構造を含めてNCBI Molecules Modelling Database(MMDB)などにより、National Institutes of Health, 8600 Rockville Pike, Bethesda MD 20894にある、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のウェブサイト上で入手可能である好適なソフトウェアを用いて決定する。NCBIが保存するドメインのデータベース(CDD)には、3D構造ビューア(Cn3D)へのリンクとともに、よく知られているSmart and Pham collectionsからのドメインが含まれている。NCBI Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)は、それらのドメイン構造により、予め計算された近隣のタンパク質に対するドメインの指定を使用している。
タンパク質又はペプチドの二次構造を予測するためのさらなる方法は、当技術分野では知られており、かつ/又は、例えば、Moult, Curr. Opin. Biotechnol. 7:422-27, 1996; Chou et al., Biochemistry 13:222-45, 1974; Chou et al., Biochemistry 113:211-22, 1974; Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-48, 1978; Chou et al., Ann. Rev. Biochem. 47:251-276, 1978; 又はChou et al., Biophys. J. 26:367-84, 1979に記載されている。
さらに、タンパク質又はペプチドの二次構造の予測を助けるための、コンピュータプログラムが現在入手可能である。二次構造を予測するこのような方法の1つは、相同性モデリングに基づくものである。例えば、配列の同一性が30%を超え、又は類似性が40%を超える、2つのポリペプチドもしくはタンパク質、又はペプチド及びポリペプチドもしくはタンパク質の断片は、構造上のトポロジーが類似であることが多い。タンパク質の構造上のデータベース(PDB)が最近発展し、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含めた、二次構造の予測可能性の改善をもたらしている(Holm et al., Nucleic Acids Res. 27:244-47, 1999)。
例えば、ペプチドの構造を決定するための方法は、例えば、米国特許出願第2002/0,150,906号(California Institute of Technology)に記載されており、又は、例えば、MODELLERなどのコンピュータプログラム又はアルゴリズムを使用するものである(Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234, 779-815, 1993)。これらの技術は、ペプチドの構造を、特徴決定された構造を有するペプチド又はタンパク質の配列にアライメントすることに頼っている。このようなアライメントのアルゴリズムは、当技術分野では知られており、例えばNCBIのBLASTなどのソフトウェアパッケージによりアクセスされる。問い合わせペプチドの構造上の情報、即ち3次元構造を、次いで、以前に特徴決定されているタンパク質又はペプチドにアライメントした配列又は部分配列に対応する構造上の情報に基づいて予測する。この方法で、発現ライブラリーから発現されたペプチドの3次元構造のライブラリーを生成することが可能である。この情報を用いて、標的のタンパク質又は核酸に結合するのに十分な立体配座を採用するこれらの配列を決定する。
二次構造を予測するさらなる方法には、例えば、「スレッディング」(Jones, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87, 1997; Sippl et al., Structure 4:15-19, 1996)、「プロファイル分析」(Bowie et al., Science, 253:164-70, 1991; Gribskov et al., Methods Enzymol. 183:146-59, 1990; Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84:4355-58, 1989)、及び「進化上の連鎖」が含まれる。
好ましい一実施形態では、ペプチドの二次構造をスレッディングにより決定する。タンパク質配列の従来のスレッディングを用いて、タンパク質の3D構造骨格を予測する。典型的には、スレッディングは、配列を組み入れるスコア関数、ならびに二次構造及び溶剤の曝露などの局所のパラメータを使用することにより、タンパク質の配列を、潜在的な構造上の鋳型のライブラリーにスレッディング(又は比較)することにより、タンパク質の折り畳みを指定するプロセスである(Rost et al. 270: 471-480, 1997; Xu and Xu Proteins: Structure, Function, and Genetics 40: 343-354, 2000); ならびにPanchenko et al. J. Mol. Biol. 296: 1319-1331, 2000)。例えば、スレッディングプロセスは、アミノ酸配列の二次構造、及び問い合わせ配列の各残基に対する溶剤の接近容易性を予測することから開始する。予測された構造の一次元(1D)の得られたプロファイルを、既知の3D構造のライブラリーの各メンバー中にスレッドする。配列-構造の各対に対する最適のスレッディングを、ダイナミックプログラミングを用いて得る。全体の最良の配列-構造対は、問い合わせ配列に対して予測された3D構造を構成する。このような技術を用い、本発明者らは、本発明の方法を用いて数々のペプチドの構造を決定してきた。適切なスレッディング法のさらなる記載を、以下の実施例に提供する。
別の一実施形態では、天然で標的のタンパク質又は標的の核酸に結合しているタンパク質(又はその断片)の構造と異なる二次及び/又は3次構造を有するペプチドを選択する。例えば、本発明者らは、c-Junに結合しc-Junの二量化を阻害することができ、自己二量化するc-Junの領域に類似した構造を形成しない数々のペプチドを同定してきた。
代替の一実施形態では、この方法は、天然において標的のタンパク質又は標的の核酸に結合しているタンパク質(又はその断片)の構造と同一の、又は類似する二次及び/又は3次構造を有するペプチドを選択することを含む。例えば、本発明者らは、c-Junに結合してロイシンジッパー様ドメイン(即ち、自己二量化するc-Junの領域に類似した構造)を形成することが予測されているc-Junの二量化を阻害することができる数々のペプチドを同定してきた。
本発明の好ましい一実施形態は：
(a)発現ライブラリーをスクリーニングして、標的のタンパク質又は標的の核酸に結合している、ライブラリーによって発現される複数のペプチドを同定し；
(b)その天然の環境で、前記標的のタンパク質又は核酸に結合していない(a)から複数のペプチドを選択し；
(c)複数の選択されたペプチドの構造を決定し；
(d)2個又はそれを超える選択されたペプチド間に保存されている二次及び/又は3次構造を決定し；
(e)保存されている二次構造及び/又は3次構造を有する(c)から1個又は複数のペプチドを選択し；
それにより、標的核酸又は標的タンパク質に結合しているペプチドを決定するステップと
を含む標的核酸又は標的タンパク質に結合しているペプチドを決定する方法を提供する。
好ましくは、標的のタンパク質はc-Junであり、c-Junと相互作用をするペプチドはc-Junの二量化をさらに阻害する。
好ましい一実施形態では、ペプチドはロイシンジッパー様ドメインを含み、例えば、ロイシンジッパー様ドメインは、間に最大で6から12個の残基が間に入った複数のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及びこれらの混合からなる群から選択される。好ましくは、アミノ酸残基は、6から7個のアミノ酸残基が間に入っている。
好ましい一実施形態では、複数のアミノ酸残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及びそれらの混合からなる群から選択される少なくとも6個のアミノ酸残基を含む。
アミノ酸残基に疎水性のアミノ酸が散在しているのが好ましい。例えば、各疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンからなる群から選択される1個又は複数のアミノ酸残基の、3又は4個以内のアミノ酸である。
好ましい一実施形態では、ペプチドは酸性ドメインをさらに含む。例えば、酸性ドメインは、4個又はそれを超えるアルギニン残基を含む。
当業者であれば前述から明らかであるが、本発明は、c-Junに結合しているペプチドを決定する方法を提供し、前記方法は：
(a)発現ライブラリーをスクリーニングして、c-Junに結合している、ライブラリーによって発現される複数のペプチドを同定し；
(b)その天然の環境で、c-Junに結合していない(a)から複数のペプチドを選択し；
(c)複数の選択されたペプチドの構造を決定し；
(e)ロイシンジッパー様ドメイン、及び場合により酸性ドメインを有する(c)から1個又は複数のペプチドを選択し；
それにより、c-Junに結合しているペプチドを決定すること：
を含む。
好ましくは、この方法は、
(f)c-Junの二量化を阻害する(e)で選択されたペプチドを決定すること：
をさらに含む。
一実施形態では、同定したペプチド又はタンパク質のドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列を決定する。好ましくは、ライブラリーの特定のスクリーニングで同定したいくつかの別個のペプチドの配列をアライメントし、比較し、かつペプチド又はタンパク質のドメイン内の、高度に保存されている一次及び/又は二次構造を決定する。あるいは、又は、それに加えて、あまり保存されていない構造も決定する。より好ましくは、高度に保存されている構造上の特徴を用いて、最初のスクリーニングで同定されたペプチドと結合性の特徴が同じ又は増強されているさらなるペプチドを、デザインし、かつ/又は生成する。
同定されたペプチドのさらなる特徴決定
本明細書で例示するように、本発明者らは、ペプチドを細胞内に導入し(例えば、組換え発現により)、細胞の表現型に対するペプチドの作用を決定することにより、一次又は二次のスクリーニングで同定されたペプチドをさらに特徴決定している。
例えば、本発明者らは、例えば、レポーター遺伝子をAP-1エンハンサーエレメントの制御下に作動可能に配置することにより、その発現が、作動可能にc-Jun二量化の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を生成している。c-Junの自己二量化が起こる細胞は、レポーター遺伝子の発現を検出することにより決定される。本発明の方法により同定されるペプチドは、次いで、細胞で発現され、レポーター遺伝子の発現量を決定することにより、c-Junの二量化のレベルが決定される。レポーター遺伝子の発現を低減させるペプチドは、c-Junの二量化に結合し阻害すると考えられている。
したがって、一実施形態では、本発明は、標的のタンパク質又は標的の核酸に結合しているペプチドを決定するための方法を提供し、この方法は、上記に記載した方法を使用してペプチドを同定し又は決定することを含み、
(a)ペプチドを標的核酸又は標的タンパク質を含み又は発現する細胞において発現させ、あるいは、標的核酸又は標的タンパク質を含み又は発現する細胞中に導入し；
(b)ペプチドが、細胞において標的核酸又は標的タンパク質と相互作用をする能力を決定すること：
を含むプロセスを行うことにより選択されたペプチドを特徴決定することをさらに含む。
一実施形態では、ペプチドが、細胞中で標的核酸又は標的タンパク質と相互作用する能力を、その発現が、ペプチドの標的核酸又は標的タンパク質との相互作用の制御下に作動可能に配置されているレポーター遺伝子の発現量を決定することにより決定する。
好ましくは、ペプチドは、標的核酸又は標的タンパク質と、別の核酸又はタンパク質との相互作用を阻害し、ペプチドが、細胞において標的核酸又は標的タンパク質と相互作用する能力は、標的核酸又は標的タンパク質と、他の核酸又はタンパク質との間の相互作用のレベルの減少を決定することにより決定する。
例えば、標的核酸又は標的タンパク質が、細胞において他の核酸又はタンパク質と相互作用をする能力を、その発現が、標的核酸又は標的タンパク質と、他の核酸又はタンパク質との相互作用の制御下に作動可能に配置されているレポーター遺伝子の発現量を決定することにより決定する。
本明細書に例示するように、AP-1エンハンサーエレメントの制御下に作動可能に配置されているレポーター遺伝子は、例えば、c-Junと結合し、かつ/又はc-Junの二量化を阻害するペプチドを決定するのに有用である。
別の一実施形態では、ペプチドを発現する細胞、又はその中にペプチドが導入されている細胞で、標的の遺伝子又は核酸が媒介する表現型のレベルを検出し、又は決定することにより、ペプチドと、標的のタンパク質又は標的の核酸との相互作用を決定する。
例えば、本発明者らは、本発明のスクリーニングにより同定したペプチドを細胞中に導入し、c-Junが媒介する細胞死のレベルを決定している。例えば、アポトーシス誘導因子(例えば、TNF-α)を加えることにより、又は細胞を紫外線照射に曝露することにより、又は細胞に低酸素状態を誘発することにより、細胞死を引き起こす。したがって、好ましい一実施形態では、ペプチドは、(i)ペプチドを細胞中に導入し、又は細胞でペプチドを発現させること、(ii)細胞死を引き起こすのに十分な条件下に細胞を維持すること、及び(iii)細胞死を防止するペプチドを選択することを特徴とする。
好ましい一実施形態では、細胞は、細胞死を低減させ、又は防止するその能力を特徴とする。好ましくは、細胞死は：
(a)細胞を腫瘍壊死因子α(TNFα)に、細胞死を引き起こすのに十分な時間及び条件下で接触させること；
(b)細胞を紫外線照射に、細胞死を引き起こすのに十分な時間及び条件下で曝露すること；
(c)細胞をグルタミン酸に、細胞死を引き起こすのに十分な時間及び条件下で接触させること
からなる群から選択されるプロセスを行うことにより引き起こされる。
細胞死のレベルを決定するための方法は、当業者であれば明らかである。例えば、APOPTEST(Immunotechから入手可能)は、アポトーシス初期の細胞を染色し、細胞試料の固定を必要としない(Martinら、1994年)。この方法は、アネキシンV抗体を利用して、アポトーシスを起こしている細胞に特徴的である細胞膜の再構成を検出する。このように染色したアポトーシス細胞を、次いで、蛍光活性化細胞選別機(FACS)、ELISAにより、又は固定化したアネキシンV抗体を使用して接着及びパンニングにより選別することができる。
あるいは、本明細書に例示するように、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ビオチン化UTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイを用いて、細胞死のレベルを決定する。TUNELアッセイは、酵素であるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、アポトーシスの間に生成されるDNAの3'-OH末端をビオチン化したヌクレオチドで標識する。ビオチン化したヌクレオチドを、次いで、検出可能なマーカーと複合しているストレプトアビジンを用いて検出する。TUNEL染色用のキットは、例えば、Intergen Company, Purchase, NY.から入手可能である。
あるいは、又は、それに加えて、活性化したカスパーゼ、例えば、カスパーゼ3などを検出する。いくつかのカスパーゼは、アポトーシスのエフェクターであり、その結果、プログラムされた細胞死を起こしている細胞で有意な量まで活性化されるにすぎない。活性化したカスパーゼを検出するためのキットは、例えば、Promega Corporation, Madison WI, USA.から入手可能である。このようなアッセイは、細胞死の、免疫細胞化学分析、又はフローサイトメトリー分析の両方で有用である。
あるいは、又は、それに加えて、細胞死のマーカー、例えばアネキシンVを、本明細書に例示したFACS分析などを用いて検出する。
標的の検証
本明細書に例示するように、核酸断片の発現ライブラリーを、例えば、JUNなどの、タンパク質の二量化を阻害し、又は拮抗し、又は阻止する、コードされたペプチドに対してスクリーニングする。このようなペプチドアンタゴニスト(「ペプチドブロッカー」)は、発作の治療的処置における細胞の標的としてc-Junを検証するのに特に有用である。本明細書に例示するように、JUN1とJUNZ(ロイシンジッパードメインを含むc-JUNの断片)との間の相互作用をアッセイする逆2ハイブリッドスクリーニングを首尾よく用いて、c-JUNの二量化のいくつかの特異的なペプチドブロッカーが同定されている。
したがって、選択されたペプチド又はタンパク質のドメイン、及び/又はそれをコードする核酸を回収することができ、治療上の標的を検証するのに用いる(即ち、標的の検証の試薬として用いる)ことができることは、明らかである。特定の標的タンパク質又は標的の核酸に結合しているその能力のおかげで、生物(例えば、細菌、植物、又は、例えば実験動物もしくはヒトなどの動物)で同定されたペプチド又はタンパク質のドメインを発現することにより、標的のタンパク質又は標的の核酸の活性を調節するインビボの効果を決定することは当業者の知力の限界内に十分ある。本発明のこの態様によると、同定されたペプチド又はタンパク質のドメインを発現する生物の表現型を、その他の同質遺伝子型の生物(即ち、同じ種又は系統の生物であり、実質的に同一の遺伝子型を含むが、ペプチド又はタンパク質のドメインを発現しない)の表現型と比較する。これは、標的のタンパク質又は標的の核酸を伴う表現型を誘発するのに十分な条件下で行う。ペプチド又はタンパク質のドメインが、好ましくは、望ましくない副作用又は多面発現性の副作用なしに、表現型の発現を特異的に防ぐ能力は、標的のタンパク質又は標的の核酸は治療試薬/予防試薬を開発するための適切な標的であることを示している。
好ましくは、標的のタンパク質又は標的の核酸が調節する生物の表現型の決定は、生物を、選択されたペプチドを発現しない、他の点では同質遺伝子型の生物と比べることを含む。例えば、発作の動物モデルは、c-Junの二量化、及び動物に適用した発作誘発条件を阻止するペプチド又はタンパク質のドメインの存在下及び非存在下でアッセイすることができる。発現されたペプチドが発作の損傷を改善し、又は発作を防止することにより、c-Junの二量化は介入に適する標的であることが示され、その際、ペプチドは、直接治療的介入をするために適切に調合され、あるいは同定されたペプチド又はタンパク質のドメインの模倣（ミメティック）である小分子が同定される。
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のデータベース
本発明は、本明細書に記載するように発現ライブラリーをスクリーニングすることにより選択される核酸のデータベースも提供する。核酸断片は、ゲノムが実質的に配列決定された生物に由来するので、この情報を用いて、本明細書に記載したようにスクリーニングした発現ライブラリーの構築において生成した核酸断片のヌクレオチド配列のデータベースを作成することは可能である。
データベースの有用性は、発現ライブラリーをスクリーニングすることにより決定したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を求めて、技術者がデータベースを探索する能力にある。この方法では、特定の標的のタンパク質又は核酸に結合しているのに十分な立体配座を採用しているペプチドをコードする核酸断片を同定することが可能である。さらに、データベースにより、ユーザーは、それがどの種を由来とするかを決定することだけでなく、核酸に相同である配列を同定することができるようになる。配列を同定したら、PCRなどの当技術分野では周知の技術を用いて、発現ライブラリーから特定の核酸を単離し、発現されたペプチドを分析する。
発現ライブラリーの核酸断片のヌクレオチド配列は、例えばNCBI又はTIGRなどの多くの公的に知られているデータベースの任意の1つから引き出される、というのは、本明細書に記載するように、スクリーニングされた発現ライブラリーの生成で用いられている生物は、実質的に配列決定されたゲノムを有するからである。
このようなデータベース(即ち、発現ライブラリーの核酸断片の配列を含み、かつ/又は各核酸断片がコードするペプチドのアミノ酸配列を含む)を用いて、直接化学合成により、又はその代わりにコードする核酸を生成し、適切な発現系で前記核酸を発現することのいずれかにより、例えば、コードしたペプチドの合成を指示する。
データベースに見られるアミノ酸配列は、スクリーニングされた発現ライブラリーから選択されたヌクレオチド配列の概念的な翻訳によって引き出される。ヌクレオチド配列の概念的な翻訳は、既知のコドン使用頻度のルールを適用して、両方向、及び各可能な方向に対する3つのリーディングフレーム全てにおいてヌクレオチド配列を翻訳することにより、仮定のペプチド配列を得ることを含む。ヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳するためのソフトウェアは、当技術分野では知られており、例えば、Translate tool at ExPasyが含まれる。核酸断片が発現されるべき生物の既知のコドン使用頻度を用いてヌクレオチド配列を翻訳するには、注意を払う。このようなコドン使用頻度の情報は、当技術分野では知られている。アミノ酸配列は、また、発現されたペプチドの配列決定によって引き出される。ペプチド及びタンパク質の配列決定をする方法は、当技術分野では知られている。
本明細書に記載するライブラリーによりコードされるペプチドの配列の概念的な翻訳は、複合体の混合物からのこれらのペプチドの同定及び/又は単離を助けるものである。
関連の一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列のデータベースを分析して、ドメインの構造のデータベース、又は発現ライブラリーにより発現されたペプチドによって形成されている3次元構造を生成する。ペプチドの3次元構造を予測するための方法は、当技術分野では知られており、上記に記載してある。
c-Jun二量化のペプチド阻害剤の合成
本明細書で例示するように、本発明者らは、個々のc-Jun阻害ペプチドの数々を同定しており(表4及び5)、そのアミノ酸配列を配列リストに記載してある。これらは、c-Jun阻害ペプチドの非網羅的なリストを含むことを理解されたい。当業者であれば、本明細書に提供する教示にしたがって、例えば、例示したものと異なるゲノムの源に由来するライブラリーを含む、記載された方法にしたがって生成された様々なライブラリーを用いて、さらなるc-Jun阻害ペプチドを容易に生成することができる。
特に好ましい一実施形態では、c-Jun二量化阻害ペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む：
本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドは、当技術分野では周知の方法及び/又は本明細書に記載した方法を用いて、組換え手段により容易に合成される。例えば、ペプチドをコードする核酸は、推定のアミノ酸配列から合成される(例えば、表5に記載するように)。
あるいは、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドは、標準の技術、例えば、BOC又はFMOC化学を用いて、その決定されたアミノ酸配列から容易に合成される。合成ペプチドを、固相、液相、もしくはペプチド濃縮、又はそのあらゆる組合せの既知の技術を用いて調製し、天然及び/又は非天然のアミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に用いられるアミノ酸は、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963のオリジナルの固相手順の脱保護、中性化、カップリング及び洗浄のプロトコールを有し、あるいは、Carpino and Han, J. Org. Chem., 37:3403-3409, 1972に記載された塩基に不安定なNα-アミノ保護した9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸を有する、標準のBoc(Nα-アミノ保護されたNα-t-ブチルオキシカルボニル)アミノ酸樹脂であることができる。Fmocも、Boc Nα-アミノ保護したアミノ酸も、様々な市販の供給源から、例えば、Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, or Peninsula Labsから入手することができる。
Merifieldの合成法(Merrifield, J Am Chem Soc, 85,:2149-2154, 1963)及び、その技術に対する多くの可能な改良は、当技術分野では記載されている(例えば、Synthetic Peptides: A User's Guide, Grant, ed. (1992) W.H. Freeman & Co., New York, pp. 382; Jones (1994) The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford, pp. 230.)を参照されたい); Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York; Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474。
合成ペプチドは、当技術分野では周知の技術を用いて生成することができ、例えば、Stewart and Young (In: Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)及び/又はFields and Noble (Int. J. Pept. Protein Res., 35:161-214, 1990)に記載されており、あるいは自動化された合成機を用いて生成することができる。したがって、本発明のペプチドは、特別な性質を伝達するために、Dアミノ酸、Dアミノ酸とLアミノ酸の組合せ、及び様々な非天然のアミノ酸(例えば、α-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、及びNα-メチルアミノ酸など)を含むことができる。合成のアミノ酸は、リジンに対してオルニチン、フェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニン、及びロイシン又はイソロイシンに対してノルロイシンを含むことができる。
c-Jun二量化阻害剤の類縁体
記載したc-Jun二量化阻害ペプチドのアミノ酸配列を、当業者に周知の方法にしたがって、そのc-Jun二量化阻害活性に有害な影響を及ぼさずに、特定の目的で修飾することができる。そのような類縁体は、化学的手段により、又はその代わりに本明細書に記載する類縁体をコードする核酸の組換え発現により生成することができる。
例えば、ペプチドの安定性を向上させ、又はペプチドの他の物質、特に脂質へのカップリングを可能にするために、特定のペプチド残基を、誘導体化し、又は化学的に修飾することができる。ペプチドの全体の構造を妨害しないで、ペプチド内の特定のアミノ酸を変更することも可能である。このような変更は、したがって「保存的」変化と呼ばれ、残基の親水性又は極性に頼る傾向がある。側鎖のサイズ及び/又は電荷も、どの置換基が保存的であるかを決定する上での関連のあるエレメントである。
当業者であれば、分子の規定された部分内に行われることがあり、許容できるレベルの生物学的活性の等しい分子をそれでも生じる変化の数には限度が存在するという概念は、生物学的に機能が等しいタンパク質又はペプチドの定義に本来備わっていることを十分理解されよう。生物学的に機能が等しいペプチドは、したがって、本明細書では、特定のアミノ酸が置換されていることがあるペプチドであると定義される。特定の実施形態は、ペプチドのアミノ酸配列に、1、2、3、4、5、又はそれを超える変異を有する変異体を含む。もちろん、様々な置換を有する個々のタンパク質/ペプチドの複数のものを容易に作成することができ、本発明にしたがって用いることができる。
当業者であれば、以下の置換:(i)アルギニン、リジン、及びヒスチジンを伴う置換、(ii)アラニン、グリシン、及びセリンを伴う置換、(iii)フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを伴う置換は、許容できる保存的置換であることに、十分気付くであろう。このような保存的置換を組み入れているペプチドは、本明細書では、生物学的に機能が等しいものと定義される。
タンパク質に対して双方向性の生物学的機能を付与するハイドロパシーのアミノ酸指数の重要性は、当技術分野では一般的に理解されている(Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132, 1982)。ある種のアミノ酸は、同様のハイドロパシーの指数又はスコアを有するアミノ酸に置換することができ、同様の生物学的活性を保持することができることが知られている。アミノ酸のハイドロパシーの指数は、機能が等しい分子を生成する保存的置換を決定する上で考慮することもできる。以下のように、各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷の特徴に基づいてハイドロパシーの指数が割り当てられている:イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(-0.4)、スレオニン(-0.7)、セリン(-0.8)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、プロリン(-1.6)、ヒスチジン(-3.2)、グルタミン酸(-3.5)、グルタミン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、アスパラギン(-3.5)、リジン(-3.9)、及びアルギニン(-4.5)。ハイドロパシーの指数に基づいて変化を行うには、ハイドロパシーの指数が+/-0.2以内であるアミノ酸の置換が好ましい。置換が、ハイドロパシーの指数が+/-0.1以内であるアミノ酸を伴うのがより好ましく、約+/-0.05以内であるのがより好ましい。
当技術分野では、本発明の場合におけるように(例えば、米国特許第4,554,101号)、生物学的に機能の等しいタンパク質又はそれにより作られたペプチドを免疫学的な実施形態で使用することを意図する場合には特に、類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行われることも理解される。実際、タンパク質の親水性の最大の局所平均は、その隣接のアミノ酸の親水性が支配するように、その免疫源性及び抗原性に相関する。米国特許第4,554,101号に詳しく述べられているように、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0 +/-0.1)、グルタミン酸(+3.0 +/-0.1)、セリン(+3.0)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、スレオニン(-0.4)、プロリン(-5.0 +/-0.1)、アラニン(-0.5)、ヒスチジン(-0.5)、システイン(-1.0)、メチオニン(-1.3)、バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、チロシン(-2.3)、フェニルアラニン(-2.5)、トリプトファン(-3.4)。類似の親水性の値に基づいて変化を行うには、親水性の値が互いに約+/-0.2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、約+/-0.1以内であるのがより好ましく、約+/-0.05以内であるのがさらにより好ましい。
ペプチド構造の主要な部分を模倣するために、他の立体的に類似の化合物を配合することができることも企図される。このような化合物を、ペプチドミメティックと呼ぶことができ、本発明のペプチドと同じやり方で用いることができ、したがって機能的同等物でもある。構造上の機能的同等物の生成は、当業者には知られているモデリング及び化学デザインの技術により実現することができる。このような立体的に類似の構成物は全て、本発明の範囲内であることが、理解されよう。
修飾したペプチドの「同等物」を決定するための別の方法は、機能的な取組みに関するものである。例えば、所与のペプチド類縁体を、例えば、本明細書に記載するあらゆるスクリーニング方法を用いて、c-Jun二量化を阻害するその能力について試験する。
本発明のペプチドの特に好ましい類縁体は、1つ又は複数の、天然に存在しないアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含む。例えば、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドは、1つ又は複数の天然に存在する遺伝的にコードされないLアミノ酸、合成Lアミノ酸、又はアミノ酸のD-エナンシオマーを含むことができる。より詳しくは、類縁体は、ヒドロキシプロリン、β-アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン(サルコシン)、オルニチン、シトルリン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、1,2,3,4-テトラヒドロticイソキノリン-3-カルボキシル酸β-2-チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、N-アセチルリジン、2,4-ジアミノ酪酸、p-アミノフェニルアラニン、N-メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε-アミノヘキサン酸、δ-アミノ吉草酸、2,3-ジアミノ酪酸、及びそれらの混合からなる群から選択される1つ又は複数の残基を含むことができる。
本発明のペプチド類縁体で、遺伝的にコードされないアミノ酸、及び存在することがあり、又はアミノ酸に置換されることがあるアミノ酸で通常遭遇するものには、それだけには限定されない、β-アラニン(b-Ala)、及び、3-アミノプロピオン酸(Dap)、2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr)、4-アミノ酪酸などの他のオメガアミノ酸; α-アミノイソ酪酸(Aib); ε-アミノヘキサン酸(Aha); δ-アミノ吉草酸(Ava); メチルグリシン(MeGly)、オミチン(omithine)(Orn)、シトルリン(Cit)、t-ブチルアラニン(t-BuA)、t-ブチルグリシン(t-BuG)、N-メチルイソロイシン(MeIle)、フェニルグリシン(Phg)、シクロヘキシルアラニン(Cha)、ノルロイシン(Nle)、2-ナフチルアラニン(2-Nal)、4-クロロフェニルアラニン(Phe(4-Cl))、2-フルオロフェニルアラニン(Phe(2-F))、3-フルオロフェニルアラニン(Phe(3-F))、4-フルオロフェニルアラニン(Phe(4-F))、ペニシラミン(Pen)、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシル酸(Tic)、β-2-チエニルアラニン(Thi)、メチオニンスルホキシド(MSO)、ホモアルギニン(hArg)、N-アセチルリジン(AcLys)、2,3-ジアミノ酪酸(Dab)、2,3-ジアミノ酪酸(Dbu)、p-アミノフェニルアラニン(Phe(pNH2))、N-メチルバリン(MeVal)、ホモシステイン(hCys)、及びホモセリン(hSer)が含まれる。
本明細書に記載するペプチド及びペプチド類縁体を作成するのに有用な他のアミノ酸残基は、例えば、Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc.、及びそこに引用される参考文献に見ることができる。
本明細書で用いられる「類縁体」には、ペプチドの化合物が修飾されてアミノ酸以外の1つ又は複数の化学部分を含む、「誘導体」又は「誘導体化されたペプチド化合物」が含まれる。化学部分は、例えば、アミノ末端のアミノ酸残基により、カルボキシル末端のアミノ酸残基により、又は内部のアミノ酸残基でペプチジル部分に共有結合していることができる。このような修飾には、ペプチドにおける反応性の部分に対する保護基又はキャッピング基の付加、検出可能な標識の付加、及びペプチド化合物の活性(例えば、c-Junに結合するその能力、及び/又はc-Jun二量化を阻害するその能力)を不利に破壊することがない他の変更が含まれる。
本明細書に記載されるペプチド化合物の「アミノ末端キャッピング基」は、ペプチド化合物のアミノ末端のアミノ酸残基に共有結合又は複合しているあらゆる化学化合物又は化学部分である。アミノ末端キャッピング基は、分子内環化又は分子間重合を阻害又は防止して、血液-脳関門(BBB)を越えたペプチド化合物の輸送を促進するのに、アミノ末端を他の分子との望ましくない反応から保護するのに、さらなる抗酸化活性をもたらすのに、又はこれらの特性の組合せをもたらすのに、有用であることができる。アミノ末端キャッピング基を有する本発明のペプチド化合物は、非キャップのペプチドと比べると、有効性が増強し、又は副作用が低減するなど、他の有益な活性を有することがある。本発明によるペプチドの化合物及び組成物を調製するのに有用であるアミノ末端キャッピング基の例には、それだけには限定されない、1から6個の天然に存在するL-アミノ酸残基、好ましくは1〜6個のリジン残基、1〜6個のアルギニン残基、又はリジン残基とアルギニン残基との組合せ; ウレタン、尿素化合物、リポ酸(「Lip」)、グルコース-3-O-グリコール酸部分(「Gga」)、又はペプチドのアミノ末端アミノ酸残基に共有結合しているアシル基が含まれ、本発明の化合物に有用なこのようなアシル基は、1個の炭素原子(例えば、アセチル部分におけるような)から25個の炭素(例えば、パルミトイル基である「Palm」(16:1)及びドコサヘキサノイル基である「DHA」(C22:6-3))までの範囲であるカルボニル基及び炭化水素鎖を有することができる。さらに、アシル基の炭素鎖は、Palmにおけるように飽和していてもよく、DHAにおけるように不飽和でもよい。ドコサヘキサエン酸、パルミチン酸、又はリポ酸などの酸が、アミノ末端のキャッピング基として示されている場合には、得られるペプチド化合物は非キャップのペプチド及び酸の濃縮された生成物であることが理解される。
本明細書に記載されるペプチド化合物の「カルボキシ末端のキャッピング基」は、ペプチド化合物のカルボキシ末端のアミノ酸残基に共有結合又は複合しているあらゆる化学化合物又は化学部分である。このようなカルボキシ末端キャッピング基の主な目的は、分子内環化又は分子間重合を阻害又は防止して、血液-脳関門を越えたペプチド化合物の輸送を促進し、これらの特性の組合せをもたらすことである。カルボキシ末端のキャッピング基を有する本発明のペプチド化合物は、また、非キャップのペプチドに比べて有効性が増強し、又は副作用が低減し、親水性が増強し、疎水性が増強するなど、他の有益な活性を有することがある。本明細書に記載されるペプチド化合物に特に有用なカルボキシ末端のキャッピング基には、ペプチド化合物のカルボキシ末端のアミノ酸のα-カルボキシ基にアミド結合により連結している第1又は第2アミンが含まれる。本発明に有用な、他のカルボキシ末端のキャッピング基には、脂肪族の第1及び第2アルコール、及びフラボノイドを含む炭素原子1から26個の芳香族フェノール性誘導体が含まれ、これらは、本明細書に記載されるペプチド化合物のカルボキシ末端のアミノ酸残基のカルボキシル酸基に連結している場合にエステルを形成する。
ペプチド又は類縁体の他の化学的修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化(N-末端アセチル化を含む)、カルボキシル化、カルボニル化、ホスホリル化、PEG化、アミド化、トランスオレフィンの付加、α-水素のメチル基との置換、既知の保護基/ブロック基による誘導体化、環化、タンパク質分解の切断の阻害(例えば、Dアミノ酸を使用して)、抗体分子又は他の細胞のリガンドへの連結などが含まれる。それだけには限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元などによる特異的な化学的切断を含む周知の技術により、多くの化学的修飾の任意のものを行うことができる。
本発明は、本明細書に記載するペプチドの等配電子体(isostere)を、さらに包含する。本明細書で用いられる「等配電子体」は、第1の構造の立体的な立体配座は、第2の構造に特異的な結合部位に適合するので、第2の化学構造に置換することができる化学構造を含むものとされる。この語は、当業者に周知のペプチドの骨核の修飾(即ち、アミド結合模倣物)を特に含む。このような修飾には、アミド窒素、α-炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置き換わり、伸長、欠失、又は骨核の架橋が含まれる。ψ[CH2S]、ψ[CH2NH]、ψ[CSNH2]、ψ[NHCO]、ψ[COCH2]、及びψ[(E)又は(Z)CH=CH]を含む、いくつかのペプチド骨核の修飾は知られている。上記で用いた命名法で、ψはアミド結合が非存在であることを示している。アミド基に置き換わる構造を、カッコ内に特定してある。
他の可能な修飾には、ラクタム及び他の環状構造を構築するための、N-アルキル(又はアリール)置換(ψ[CONR])、又は骨核の架橋が含まれる。本発明の調節化合物の他の誘導体には、C-末端ヒドロキシメチル誘導体、O-修飾された誘導体(例えば、C-末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル)、アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換されているアミドを含む、N-末端修飾されている誘導体、C-末端フェニルアラニン残基がフェネチルアミド類縁体で置き換わっている化合物(例えば、トリペプチドVal-Phe-Pheの類縁体としてのVal-Phe-フェネチルアミド)が含まれる。
c-Jun二量化阻害ペプチドの特に好ましい類縁体は、レトロ反転ペプチド類縁体(レトロインバーソペプチドとしても知られている)である。これらの類縁体は、アミノ酸配列の方向が逆転し(レトロ(retro))、例えばL-アミノ酸ではなくD-アミノ酸を用いて、その中の1個又は複数のアミノ酸のキラリティー、D-、又はL-が反転している(インバーソ(inverso))線状ペプチドの異性体であり、例えば、Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)である。D-エナンチオマーと逆方向の合成を組み合わせた最終的な結果は、各α炭素の側鎖基の位置はそのままであるが、各アミド結合におけるカルボニル基とアミノ基の位置が入れ替わることである。
レトロインバーソペプチドの利点は、タンパク質分解性の変質に対して抵抗性が改善されているので、そのインビボ活性が増強していることである(例えば、Chorev et al., Trends Biotech. 13, 438-445, 1995)。
一実施形態では、レトロインバーソペプチドは、例えば、C1〜C6低級アルキル基(例えば、メチル、エチル、もしくはプロピル基)、又は環状の、複素環の、多環式の、もしくは分枝のアルキル基などのアルキル基、あるいは1個又は複数のアミノ酸リンカー残基を含む修飾基でN-末端が修飾されている。
別の1実施形態では、レトロインバーソペプチドは、例えば、アミド基、アルキルもしくはアリールアミド基(例えば、フェニチルアミド)、又はヒドロキシ基(即ち、ペプチドアルコールを生じるペプチド酸の還元生成物)でC-末端が修飾されているもの、あるいは1個又は複数のアミノ酸リンカー残基、例えば、グリシン、システインなどである。
レトロインバーソペプチドが、1つ又は複数のターゲッティングドメインの含有によりさらに修飾されているのも(例えば、N-末端及び/又はC-末端に付加しているペネトラチン、TATなど)、本発明の範囲内である。このようなペプチド付加は、例えばグリシン、システインなどの1つ又は複数のリンカーにより、レトロインバーソペプチド部分から分離することができる。
レトロインバーソペプチド類縁体は、完全でも部分的でもよい。完全なレトロインバーソペプチドは、c-Jun二量化阻害ペプチドの完全な配列が逆転し、配列における各アミノ酸のキラリティーが反転している。部分的なレトロインバーソペプチド類縁体は、ペプチド結合のいくつかだけが逆転し、逆転した部分のこれらのアミノ酸残基だけのキラリティーが反転しているものである。例えば、本発明は、部分的なレトロインバーソペプチド類縁体、及び完全なレトロインバーソペプチド類縁体の両方を明らかに包含する。
例えば、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドのアミノ酸配列を完全に逆転し、全てのアミノ酸残基を反転し(即ち、対応するD-アミノ酸残基で置換し)て、ペプチドの完全なレトロインバーソ類縁体を生成することができる。
好ましいレトロインバーソ類縁体は、本発明のc-Jun二量化阻害ペプチドの完全なアミノ酸配列が逆転し、前記配列におけるグリシン以外のアミノ酸残基が反転して(即ち、対応するD-アミノ酸残基で置換されて)いる部分的な類縁体である。グリシン以外の全てのアミノ酸残基が反転していることが好ましい。この好ましい実施形態によると、本発明のレトロインバーソペプチド類縁体は、場合によりグリシンなどのアミノ酸リンカーによりレトロインバーソペプチド部分に融合しているペネトラチン又はTAT配列などのタンパク質形質導入ドメインを含む。
特に好ましい一実施形態では、本発明は、c-Jun二量化を阻害することができるペプチドの類縁体を提供し、前記類縁体は、配列番号132又は136に述べる完全な又は部分的に反転したアミノ酸配列を含み、反転したアミノ酸配列の1つ又は複数のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基である。
より好ましくは、本発明はc-Jun二量化を阻害することができるペプチドの類縁体を提供し、前記類縁体は、(i)配列番号132又は136に述べるアミノ酸配列の完全な又は部分的な逆転からなる配列を含む第1のペプチジル部分であって、反転したアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、(ii)アミノ酸スペーサーにより(i)から場合により分離されたタンパク質形質導入ドメインを含む。
さらにより好ましくは、グリシン以外の、2、又は3、又は4、又は5、又は6、又は7、又は8、又はなし(none)、又は10、又は11、又は12、又は13、又は14、又は15、又は16個のアミノ酸残基はD-アミノ酸である。一層より好ましくは、類縁体は、D-アルギニン、D-グルタミン酸、D-セリン、D-グルタミン、D-イソロイシン、D-チロシン、D-アラニン、D-リジン、D-プロリン、及びD-ロイシンからなる群から選択される1つ又は複数のD-アミノ酸を含む。
特に好ましい一実施形態では、類縁体は、配列番号181又は182に述べるアミノ酸配列を含む。
ペプチド/類縁体の単離
本発明の組成物及び方法において有用なペプチド化合物を生成し、又は合成した後、当技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。このような精製により、著しい量又は検出可能な量の望ましくない副反応生成物から解離した状態で、ペプチド化合物を修飾するのに用いる付着していない、又は非反応の部分の状態で、及び他の望ましくない部分(それだけには限定されない、他のペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物などを含む)から解離した状態で本発明のペプチドを提供することが好ましい。
単離した本発明のペプチド化合物を得るために、それだけには限定されない、様々な高速(又は高性能)液体クロマトグラフィー(HPLC)、及びHPLC以外のペプチド単離の手順、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、相分離法、電気泳動分離、沈降法、塩溶/塩析法、免疫クロマトグラフィー、及び/又は他の方法を含む、ペプチドを精製する標準の方法を使用する。
本発明の組成物及び方法において有用なペプチド化合物を単離する好ましい方法は、C4-、C8-、又はC18-シリカなどの、アルキル化したシリカカラムを用いた逆相HPLCを使用するものである。有機含有量を増大させていくグラジエントの移動相、例えば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含む水性バッファー中のアセトニトリルを、一般的に用いて精製を実現する。イオン交換クロマトグラフィーも用いて、電荷に基づいてペプチド化合物を分離することができる。ペプチド化合物の純度を、HPLC上の主要な大きなピークの同定を含めた、様々な方法で決定することができる。HPLCカラム上に投入した材料の少なくとも95%である単一のピークを生成するペプチド化合物が好ましい。HPLCカラム上に注入した材料の少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又はさらに99.5%である単一のピークを生成するポリペプチドがさらにより好ましい。
上記に記載した技術のあらゆるものを用いて得られたペプチド化合物が、本発明の組成物及び方法で使用するのに望ましいペプチド化合物であることを確認するために、化合物の組成の分析を、当技術分野で周知の様々な分析方法のあらゆるものにより決定する。このような組成物の分析は、ペプチドの分子量を決定するための高分解能マススペクトル法/質量分析法を用いて行うことができる。あるいは、ペプチドのアミノ酸含有量は、ペプチドを水性の酸で加水分解し、分離し、同定し、HPLC又はアミノ酸分析機を用いて混合物の構成成分を定量することにより確認することができる。連続的にペプチドを分解し、アミノ酸を順番に同定するタンパク質配列決定装置を用いて、ペプチドの配列を明確に決定することもできる。ペプチド化合物のいくつかは、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端のキャッピング基を含むので、配列分析の前に、キャッピング基又はキャップされたアミノ酸残基を取り除くことが必要なことがある。薄層クロマトグラフィー法を用いて、望ましいペプチド化合物の1つ又は複数の成分の基又は残基を立証することもできる。ペプチド化合物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、その後ゲルで分離されたタンパク質の構成成分を検出するために染色することにより、ペプチド化合物の純度を評価することもできる。
治療用組成物
当業者には明らかであろうが、本発明の方法で同定したペプチドは、疾患及び/又は障害の、治療的処置及び/又は予防的処置として有用である。本発明者らは、c-Jun二量化を阻害するペプチドを生成する他に、レトロインバーソペプチド(即ち、例示したペプチドの類縁体)も生成し、発作を含む虚血の細胞モデルでその有効性を示している。
したがって、本発明は、本発明の方法により同定されるペプチド又はその類縁体の有効量を、疾患及び/又は障害に罹患し、あるいは疾患及び/又は障害を発症し、かつ/又は罹患する危険にあり、かつ/又は処置を必要としている対象に投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法も提供する。
明らかに、本発明は、本発明の方法により同定されるペプチド又はその類縁体の、医薬における使用を包含する。さらに、本発明は、医薬に使用する場合の、本発明により同定されるペプチドを包含する。
当業者には明らかであろうが、本発明の方法で同定されるペプチド又はその類縁体は、c-Jun二量化を阻害するのに有用である。このような活性により、ペプチド及びその類縁体は、虚血又は虚血事象、例えば、発作に有用となっている。
当業者には明らかであろうが、本発明の方法により同定したペプチド又はその類縁体の障害を処置するための使用は、ペプチド又は類縁体を投与のための化合物中に調合することを必要とすることがある。
好ましくは、化合物は薬剤化合物である。
本発明の方法を用いて同定したペプチド又は核酸を含む薬剤組成物、又は滅菌の組成物を調製するために、ペプチドもしくはその類縁体、又は単離した核酸を、薬学的に許容できる担体又は賦形剤と混合する。治療用のペプチド又は核酸を含む組成物を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁剤の形態の、生理学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することなどにより、調製する(例えば、Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照されたい)。
選択される投与経路(例えば、液剤、乳剤、カプセル剤)により、薬剤化合物の調合は異なる。液剤又は乳剤では、適切な担体には、例えば、食塩水及び緩衝化した媒体を含む、水性の、又はアルコール性/水性の溶液、乳剤、又は懸濁剤が含まれる。非経口のビヒクルには、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウムと、乳酸加リンゲル、又は不揮発性油が含まれ得る。静脈内のビヒクルには、様々な添加剤、保存剤、又は液体、栄養又は電解質補充液などが含まれ得る(一般には、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Co., Pa., 1985を参照されたい)。吸入には、物質を可溶化し、投与用の適切なディスペンサー(例えば、アトマイザー、ネブライザー、又は加圧式噴霧ディスペンサーに充填することができる。
さらに、物質が、タンパク質、又はペプチド、又はそれらの類縁体である場合、物質を、組換えのタンパク質のインビボにおける発現により投与することができる。インビボにおける発現は、適切な方法により体細胞の発現により実行することができる(例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい)。この実施形態では、タンパク質をコードしている核酸を、送達用のレトロウイルスの、アデノウイルスの、又は他の適切なベクトル(好ましくは複製欠損性の感染性ベクター)中に組み込むことができ、あるいは、送達用のタンパク質を発現することができる形質移入又は形質転換された宿主細胞中に導入することができる。後者の実施形態では、細胞を、治療上有効な量のタンパク質を発現するのに有効な量で、移植し(単独で、又はバリア装置で)、注射し、又は他の方法で導入する。
当業者には明らかであろうが、インビボで活性のある化合物が特に好ましい。ヒト対象において活性のある化合物が、一層より好ましい。したがって、疾患の処置に有用である化合物を製造する場合は、確実に、ペプチドに加えるあらゆる成分が、前記ペプチド又は類縁体の活性を阻害し又は修飾しないことが好ましい。
治療用組成物に対する投与計画の選択は、生体の血清又は組織の代謝回転速度、症状のレベル、生体の免疫源性、及び生物学的マトリックスにおける標的細胞の接触性を含めた、いくつかの要因に依存する。好ましくは、投与計画は、許容できるレベルの副作用と一致して、患者に送達される治療用化合物の量を最大にする。したがって、送達される組成物の量は、特定の生体、及び処置する状態の重症度に、部分的に依存する。ペプチドの好適な投与量を選択する手引きは、入手可能である(例えば、Milgrom, et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon, et al. New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz, et al. New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh, et al. New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; 又はLipsky, et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい)。
ペプチドは、例えば、持続注入により、又は、例えば、1日、1週間、もしくは週に1〜7回などの間隔の投与により与える。組成物の投与は、静脈内に、皮下に、局所に、経口に、経鼻に、直腸に、筋肉内に、脳内に、又は吸入により与えることができる。好ましい投与のプロトコールは、著しい望ましくない副作用を避ける最大の投与量又は投与の頻度を伴うものである。1週間の全投与量は、B細胞を枯渇させるのに用いられる化合物のタイプ及び活性に依存する。例えば、そのような投与量は、少なくとも約0.05μg/kg体重、又は少なくとも約0.2μg/kg、又は少なくとも約0.5μg/kg、又は少なくとも約1μg/kg、又は少なくとも約10μg/kg、又は少なくとも約100μg/kg、又は少なくとも約0.2mg/kg、又は少なくとも約1.0mg/kg、又は少なくとも約2.0mg/kg、又は少なくとも約10mg/kg、又は少なくとも約25mg/kg、又は少なくとも約50mg/kgである(例えば、Yang, et al. New Engl. J. Med. 349:427-434, 2003; 又はHerold, et al. New Engl. J. Med. 346:1692-1698, 2002を参照されたい)。
特定の患者に対する有効量のペプチドは、処置する状態、患者の全体的な健康、投与の方法経路及び投与量、ならびに副作用の重症度などの要因に応じて変化することができ、例えば、Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; 又はDent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照されたい。
好適な投与量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼし、又は処置に影響を及ぼすことが予測される当技術分野では周知の、又は推測されているパラメータ又は要因を用いて、医師が行う。一般的には、投与量は、最適な投与量よりいくぶん低い量で開始し、その後少しずつ増大し、あらゆる負の副作用に対して、望ましい、又は最適の効果が達成するまで増大する。重要な診断上の尺度には、処置する疾患及び/又は障害の症状のものが含まれる。用いられる化合物が、処置の標的になる対象と同一の種に由来し、同一の種で使用するように適用され、その結果、試薬に対する体液の反応が最小になるのが好ましい。
治療上有効な量は、例えば、上記に記載したように疾患の症状を、典型的には少なくとも約10%、通常は少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約50%低減させる。
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚の適用、静脈による注射もしくは注入、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内又は肺の経路により、あるいは徐放システム、又は移植によるのが好ましい(例えば、Sidman et al. Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer, et al. J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 米国特許第6,350,466号及び第6,316,024号を参照されたい)。
虚血性障害の処置方法
本明細書に例示するように、本発明者らが単離したいくつかのペプチド及びペプチド類縁体は、虚血の様々なモデル、虚血性障害(例えば、発作)の処置に有用であることが示されている。したがって、本発明は、虚血、虚血性障害、虚血事象(例えば、発作)を処置する方法を提供し、前記方法は、本明細書のあらゆる実施形態によるペプチドもしくはその類縁体、又は前記ペプチドもしくは類縁体を含む薬剤組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む。
あるいは、本発明は、虚血性障害を処置する方法を提供し、前記方法は、あらゆる実施形態により本明細書に記載した核酸、又は前記核酸を含む薬剤組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む。
ペプチド、類縁体、又は核酸を投与する方法は、当業者であれば明らかである。例えば、ペプチド、類縁体、又は核酸を、静脈内投与、くも膜下腔内投与、動脈内投与、開頭術後の局所投与、及びこれらの混合からなる群から選択される方法により、対象に投与する。
本発明による、虚血性障害に罹患している患者における、ペプチド又はその機能上の類縁体の好ましい投与経路は、例えば、
(i)例えば、0.9%の食塩水溶液で、静脈内に；
(ii)例えば、18Gの針で腰椎穿刺後、又は引き続きくも膜下腔内のスペースにチップで腰椎外カテーテルの挿入後、ペプチド組成物をくも膜下内に与え；
(iii)例えば、マイクロカテーテルを大腿部動脈に挿入し、大脳動脈に導き、本発明のペプチドをその部位に潅流する、選択的動脈内デジタルサブトラクション血管造影法により；
(iv)開頭術後局所的に；
(v)適切なバッファー(例えば、食塩水)中に懸濁した合成ペプチド(もしくは類縁体)のカテーテルベースの送達を用いて、3.0mm×20mmの血管形成バルーンを装着し0.014インチの血管形成ガイドワイヤーで誘導された10mmのInfusaSleeveカテーテル(Local Med, Palo Alto, Calif.)などの適切な局所送達カテーテルを用いて冠動脈に局所的に注射(例えば、血管壁から心筋層中に注射することにより)する冠内送達により；
(vi)ペプチドが、例えば、Ultrafuse-Xデュアルルーメンカテーテル(SciMed, Minneapolis, Minn.)又は別の適切な装置により冠動脈の近位の開口部中に手動で注射する、ペプチド(又は誘導体)の冠内ボーラス注入により；
(vii)例えば、開胸術後の直視下で、又は胸腔鏡を用いて、又はカテーテルにより、合成ペプチド又は類縁体の心筋内送達によるものがある。
合成ペプチド又は類縁体の心膜送達は、典型的には、ペプチドを含有する溶液を心膜嚢中に設置することにより行う。心膜へは、右心房の穿刺、経胸腔の穿刺により、又は直接の外科的手法により接触する。接触が確立した後、ペプチド又は類縁体を心膜腔中に注入し、カテーテルを引き抜く。あるいは、ヘパリナルアルギネート(heparinal-alginate)又はエチレン酢酸ビニル(EVAc)などの持続放出ポリマーの助けにより送達を行う。どちらの場合も、ペプチド又は類縁体がポリマー中に組み込まれた後、望ましい量のペプチド/ポリマーを心外膜下脂肪下に挿入し、又は、例えば縫合術を用いて心筋の表面に確保する。さらに、ペプチド/ポリマー組成物を、冠状血管の外膜の表面に沿って配置することができる。
中枢神経系に直接到達しない経路によりペプチドを投与する場合は、ペプチドは、血液脳関門を通過しなければならないことがある。ペプチドが血液脳関門を越えることができるようにするための方法及び手段は、当技術分野では知られており、かつ/又は、例えば、米国特許出願第2005/0,142,141号に記載されている。例えば、本発明のペプチドを、ペプチドが血液脳関門を越えることができるようにする物質と複合する(例えば、トロイの木馬)。例えば、HIR Mab 83-14は、ヒトインスリン受容体(HIR)に結合している、マウスのMabである。この結合が、Mab83-14 (Pardridge et al, Pharm., Res. 12: 807-816, 1995)の、及びMabに付着しているあらゆる薬物又は遺伝子のペイロード(Wu et al., J. Clin. Invest., 100: 1804-1812, 1997)のBBBを超えた輸送を引き起こす。
薬物又は遺伝子を血液脳関門を越えて渡すために分子版トロイの木馬を使用することは、米国特許第4,801,575号、及び第6,372,250号に記載されている。薬物のMAB輸送ベクターへの連結は、アビジン-ビオチン技術の使用で促進される。この取組みでは、薬物又はタンパク質の治療薬をモノビオチン化し、抗体ベクターとアビジン又はストレプトアビジンとの複合体に結合する。薬物を抗体系輸送ベクターに連結するのを促進するアビジン-ビオチン技術の使用は、米国特許第6,287,792号に記載されている。薬物をMAb輸送ベクターに遺伝子的に融合する場合は、融合タンパク質も用いられる。
好ましい一実施形態では、本明細書に記載する治療用ペプチドを、対象が虚血事象(例えば、発作)に罹患しており、又は罹患していた場合に対象に投与する。このような投与のタイミングは、例えば、虚血事象後の再潅流の作用を低減するのに有用である。
別の一実施形態では、本明細書に記載する治療ペプチドを、対象が虚血事象後の再潅流傷害を起こす危険性のある場合に対象に投与する。
本発明を、以下の非限定的な実施例を参考にして、さらに記載する。
（実施例１）
ベクターpDEATH-Trpにおける生物多様な核酸断片発現ライブラリーの構築
核酸を、以下の細菌種から単離した：
1 アーケオグロブスフルギディス
2 アクイフェックスアエリティカス
3 アエロピラムペルニックス
4 枯草菌
5 百日咳菌TOX6
6 ライム病ボレリア
7 トラコーマクラミジア
8 大腸菌K12
9 インフルエンザ菌(rd)
10 ヘリコバクターピロリ
11 メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム
12 メタノコッカスヤッナシ
13 肺炎マイコプラズマ
14 髄膜炎菌
15 緑膿菌
16 パイロコッカスホリコシ
17 シネコシスティスPCC6803
18 サーモプラズマボルカニウム
19 サーモトガマリティマ
核酸断片を、各ゲノムのゲノムDNAから連続2回のプライマー伸長増幅を用い、5'-GACTACAAGGACGACGACGACAAGGCTTATCAATCAATCAN6-3'(配列番号38)の配列のタグ付けしたランダムオリゴヌクレオチドを用いて生成した。PCR増幅を、E.coliのDNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて、以下のプライマー伸長反応物で完結させた：
試薬 体積
DNA (100-200ng)
配列番号38 (25mM)を含むオリゴヌクレオチド 4μl
H2O 17.4μlまで
次いで、試料を3〜5分間煮沸して、細菌から単離した核酸を変性させて、その後、急激に冷却してタグ付けしたランダムオリゴヌクレオチドを前記核酸にアニールした。これらの試料を以下の試薬に加えた：
Klenowバッファー 3μl
dNTP(2mM) 3μl
Klenow 0.6μl
ポリエチレングリコール(8500) 6μl
次いで、プライマー伸長反応物を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後、37℃で15分間加熱した。
試料を5分間煮沸して核酸を再び変性させ、その後、急冷して前記核酸を再生させた。各反応物に大腸菌(E.coli)のDNAポリメラーゼIのKlenow断片の別の0.5μlを加え、試料を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後、37℃で15分間加熱した。
試料を煮沸し、その後急冷し、その後にタグ付けしたランダムオリゴヌクレオチド:
5'-GACTACAAGGACGACGACGACAAGGCTTATCAATCAATCAN9-3'(配列番号39)
を用いて、別の2回のプライマー伸長を完結させた。
これを完結するために、以下の試薬を、前のステップの試料に加えた：
配列番号39(25μM)を含むオリゴヌクレオチド 4μl
Klenowバッファー 1μl
dNTP(2mM) 3μl
Klenow 0.5μl
H2O 40μlまで
次いで試料を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後37℃で15分間加熱した。
試料を5分間煮沸して再び核酸を変性させ、その後、急冷して前記核酸を再生させた。大腸菌のDNAポリメラーゼIのKlenow断片の別の0.5μlを各反応に加え、試料を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後37℃で15分間加熱した。
プライマーの伸長増幅を完結させた後、全試料の体積をTEバッファーで500μlに増大し、Amiconスピンカラムに加えた。次いで、これらのカラムを、微量遠心機で、3800rpm15分間遠心した。次いで、カラムを逆さにし、TEバッファー30μlを加えた、その後、カラムを3800rpmで2分間遠心し、後で使用するためにこの分画を収集した。次いで、Klenowが増幅したDNAを、引き続きDNA操作で用いた。
ここで精製されたプライマー伸長生成物を、次いで、以下の配列:
Figure 2008522954
 を含むオリゴヌクレオチドとのPCR反応で用いたが、ここでは、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を太字で示し、3つの終止コドンに下線をつけてある。各終止コドンは、異なるリーディングフレームにあることに留意されたい。
こうして、以下のPCR反応物を用いた：
配列番号40(10μM)を含むオリゴヌクレオチド 12μl
PCRバッファー 5μl
dNTP(2mM) 5μl
Taqポリメラーゼ(Boehringer)5.5U/μl 0.4μl
H2O 26.6μl
Klenowで増幅したDNA 2μl
次いで、反応物を、以下のプログラムを用いてサーモサイクラーで繰り返した：
95℃で2分間、60℃で30秒間、72℃で1分間;
95℃で20秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間(29回繰り返し); 及び
72℃で5分間。
次いで、PCR産物を、サイズにより分画するAmiconスピンカラムを用いて精製した。
次いで、PCR産物を、標準のTAEアガロースゲル上の電気泳動により分析して、図2に示すように生成した核酸断片のおおよそのサイズを決定した。試料の核酸濃度も決定した。
次いで、19の細菌種の各々からのPCR産物をプールして、生物多様な核酸ライブラリーを生成した。これを行うために、ゲノムが最小である生物からのプールに加えた核酸の量と比較して等モル量の、各生物からのDNAを加えた。DNAを得る生物のゲノムのサイズに応じて、各生物から1μgと10μgの間のDNAを用いた。
核酸断片をpDEATH-Trpベクター(配列番号41、図3)中に効率よくクローニングさせるために、断片及びベクターの両者を、EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化した。制限酵素の消化物を、以下の反応で完結させた。
PCR産物の消化には、以下の反応条件を用いた:
PCR産物(1μg)
EcoRIバッファー(Promega) 17μl
BSA(10×) 17μl
EcoRI酵素(20U/μL)(Promega) 0.9μl
H2O 170μlまで
制限酵素の消化を、37℃で40分間進行させた。次いで、試料を、製造元の指示にしたがって、QIAクイックPCR精製カラムを用いて精製した。核酸を、H2O50μl中に溶出した。
pDEATH-Trpベクターの消化は、以下の反応条件を使用した:
pDEATH-Trp(25μg)
EcoRIバッファー(Promega) 100μl
BSA(10×) 100μl
EcoR1酵素(20U/μL) 4μl
H2O 1000μlまで
制限酵素の消化を、37℃で5分間進行させた。次いで、試料を製造元の指示にしたがって、3つのQIAクイックPCR精製カラムを用いて精製した。核酸を、H2O150μl中に溶出した。
次いで、PCR産物から生成した断片を、以下の反応物を用いて、pDEATH-Trpベクター(配列番号41)中に連結した:
pDEATH-Trp(2μg)
BGF-PCR断片(1μg)
ライゲーションバッファー(10×)(NEB) 20μl
T4DNAリガーゼ(NEB) 10μl
H2O 200μlまで
ライゲーション反応を、16℃で一晩進行させた。次いで、試料を65℃で30分間インキュベートすることにより、リガーゼを熱不活性化した。ライゲーション反応が完結した後、試料の体積をTEバッファーで500μlに増大し、Amiconスピンカラムに加えた。次いで、これらのカラムを、微量遠心機で、3800rpmで15分間遠心した。次いで、カラムを逆さにし、TEバッファー30μlを加え、その後、カラムを3800rpmで2分間遠心し、後で使用するためにこの分画を収集した。
次いで、生物多様な核酸断片を含むpDEATH-Trpベクターを、E.coliTOP10細胞中に形質転換した。次いで、標準の手順を用いて、細菌から発現ベクターを単離した。次いで、EcoRIを用いた単離したベクターの制限酵素の消化を用いて、図4に示すように、ライブラリーに含まれる挿入断片のサイズを特定した。
次いで、ベクターをプールし、酵母株PRT51中に形質転換した。酵母株PRT-51は、以下の遺伝子型を特徴とする:
MATα、his3、trpl、ura3、6 LexA-LEU2、lys2:3 cIop-LYS2、CYH2R、ade2:G418-pZero-ade2、metl5:Zeo-pBLUE-met15、his5::hygro。
この形質転換の結果は、6100万クローンのライブラリーである。組換えクローンは、各々、他のマーカーのFLAGエピトープをコードする別のポリヌクレオチド配列に融合しているペプチドを発現する。
（実施例２）
pDEATH-Trpベクターにおける生物多様な核酸断片発現ライブラリーの特徴決定
pDEATH-Trpベクター中にクローンした核酸を配列分析すると、断片は様々な生物に由来し、表2に示すように様々なタンパク質をコードしていることが示される。
Figure 2008522954
 （実施例３）
ベクターT7Select415-1における生物多様な核酸断片発現ライブラリーの構築
以下の細菌種から核酸を単離した：
1 アーケオグロブスフルギディス
2 アクイフェックスアエリティカス
3 アエロピラムペルニックス
4 枯草菌
5 百日咳菌TOX6
6 ライム病ボレリア
7 トラコーマクラミジア
8 大腸菌K12
9 インフルエンザ菌 (rd)
10 ヘリコバクターピロリ
11 メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム
12 メタノコッカスヤッナシ
13 肺炎マイコプラズマ
14 髄膜炎菌
15 緑膿菌
16 パイロコッカスホリコシ
17 シネコシスティスPCC6803
18 サーモプラズマボルカニウム
19 サーモトガマリティマ
核酸断片を、連続した複数回のKlenowプライマーの伸長を用いて、タグ付けしたランダムオリゴヌクレオチドを用いて、これらのゲノムの各々から生成した。
PCRの最終回では、オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、配列:
5'-AGAGGAATTCAGGTCAGACTACAAGGACGACGACGACAAG-3'(配列番号42)
を含んでいた。
次いで、生成したプライマー伸長産物を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCR反応の鋳型として使用し、
Figure 2008522954
ここで、配列番号42〜46における下線付きの配列が、PCR産物を増幅させる。さらに、太字で示した配列は、HindIII制限エンドヌクレアーゼの認識部位又はEcoRIの認識部位を強調するものである。さらに、配列番号45及び46それぞれにおけるEcoRI制限部位の後の、1個又は2個のヌクレオチドの付加に留意されたい(イタリック体で示してある)。これらのヌクレオチドにより、多数の順方向のリーディングフレームで増幅された核酸が発現されるようになる。
各DNA鋳型は、「片腕の」(即ち、たった1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて)PCRにより増幅され、各オリゴヌクレオチド(即ち、配列番号43〜46)が別々の反応(即ち、76反応)で増幅される。
各PCR反応物は、以下を含む：
鋳型DNA 1μl
Taqバッファー(10×)(Promega) 5μl
MgCl2(25mM) 4μl
dNTP(2mM) 5μl
配列番号43〜46(10pmol/μl)からなる群から選択されるプライマー 10μl
TaqDNAポリメラーゼ(Promega5U/μl) 0.4μl
H2O 50μlまで
次いで、反応物を、以下のプログラムを用いて、Perkin ElmerサーモサイクラーPE9700又はPE2400で繰り返した：
94℃で5分、その後、各サイクルが、94℃30秒その後55℃で30秒及びその後72℃で1分間]からなる30サイクル、その後72℃で5分間。
得られたPCR産物の試料を、2%アガロース/TAEゲルを用いて電気泳動により分析した。各PCR産物における核酸の量を、また、製造元が提供する指示に従って、ピコグリーン(picogreen)法を用いて決定した。
オリゴヌクレオチド配列番号43〜46の各々で生成したPCR産物をプールした。ゲノムが最小である生物からのプールに加えた核酸の量と比較して等モル量の、各生物からのDNAを加えた。
引き続き、オリゴヌクレオチド配列番号44、配列番号45、又は配列番号46を用いて増幅したPCR産物から生成したプールを、等しい割合(即ち、等量の核酸)で併せて、プールを形成した。
次いで、プールしたPCR産物を、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて、製造元の指示にしたがって精製した。このステップにより、取り込まれていないあらゆるオリゴヌクレオチド、dNTP、及び夾雑のタンパク質が除去される。
次いで、PCR産物のプールの各々を(6μg)を、3等分し、各部分を、以下の反応物で、AluI、HaeIII、又はRsaI(NEB)の異なる制限酵素の1つで消化した：
PCR産物(2μg)
制限エンドヌクレアーゼバッファー(10×)NEB 4μl
制限エンドヌクレアーゼ 1μl
H2O 40μlまで
反応を、37℃で2時間進行させ、その後65℃で20分間インキュベートすることにより、熱不活性化した。次いで、制限酵素の消化物を再びプールし、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて、製造元の指示にしたがって精製した。
AluI、HaeIII、及びRsaIの各酵素は、平滑末端を生成する。したがって、平滑末端アダプターを制限酵素が消化したPCR産物に連結して、T7Select415-1ベクター中に直接クローニングさせることは可能である。以下の配列を含む、平滑末端アダプターをコードするオリゴヌクレオチドを生成した：
5'-AATTCGAACCCCTTCG-3'(配列番号47)
5'-CGAAGGGGTTCG-3'(配列番号48)
5'-AATTCGAACCCCTTCGC-3'(配列番号49)
5'-GCGAAGGGGTTCG-3'(配列番号50)
5'-AATTCGAACCCCTTCGCG-3'(配列番号51)
5'-CGCGAAGGGGTTCG-3'(配列番号52)
5'-AGCTCGAAGGGGTTCG-3'(配列番号53)
5'-CGAACCCCTTCG-3'(配列番号54)
配列番号47と48との、配列番号49と50との、配列番号51と52との、配列番号53と54とのアダプター対を、次いで、相互にアニールした。このプロセスは、H2O中で、各オリゴヌクレオチドが50μMの濃度で完結した。アダプターの対を94℃で10分間インキュベートし、次いで、ゆっくりと室温に放冷した。
次いで、アニールしたアダプターを、別々のライゲーション反応で増幅したPCR産物のプールに連結した。配列番号53と54とのアニーリングによって形成したアダプターを、配列番号44、配列番号45、及び配列番号46に述べるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したPCR産物のプールに連結した。
ライゲーションは、以下の反応物中で行った:
プールしたPCR産物(平均長さ200bp) 2pmol
アニールしたアダプター 150pmol
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
T4DNAリガーゼ(3U/μl)(Promega) 1μl
H2O 10μlまで
次いで、試料を4℃で一夜インキュベートし、その後、65℃で20分間インキュベートすることにより熱不活性化した。
次いで、試料を、以下の反応物でT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega)を用いてリン酸化した:
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
rATP(10mM) 2μl
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(5U/μl) 1μl
H2O 20μl
試料を37℃で30分間インキュベートし、その後65℃で20分間インキュベートしてT4ポリヌクレオチドキナーゼを熱不活性化した。
ライゲーション及びリン酸化の後、オリゴヌクレオチド配列番号43を用いて増幅した核酸を含む3つの反応物の各々を等しい割合で、即ち等量の核酸と併せてプールを形成した。
配列番号43で最初に増幅した核酸を、次いで、以下の反応物において、制限エンドヌクレアーゼHindIIIで消化した：
PCR産物(2μg)
HindIIIバッファー(10×)(Promega) 8μl
HindIII(10U/μl)(Promega) 1μl
H2O 80μlまで
最初に、配列番号44〜46の1つにより増幅したプールの核酸を、以下の反応物で、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化した：
PCR産物(2μg)
EcoRIバッファー(10×)(Promega) 8μl
EcoRI(10U/μl)(Promega) 1μl
H2O 80μlまで
次いで、試料を、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて、製造元の指示にしたがって精製した。次いで、核酸濃度を、吸光光度法により260nmでUV吸収を測定して決定した。
核酸断片の両方のプール(即ち、EcoRIで消化したもの、及びHindIIIで消化したもの)を、次いで、等しい割合で、即ち等量の核酸と併せて1つのプールを形成した。その時、核酸断片のこのプールは、ベクターT7Select415-1(Novagen)をディスプレイするペプチド中にクローニングするのに適していた。T7415-1ベクターは、核酸がEcoRI及びHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位中に連結すべき形態で提供される。
次いで、核酸断片を、以下の反応物を用いてT7Select415-1ベクター中に連結した：
ライゲーションバッファー(10×)(Novagen) 0.5μl
rATP(10mM) 0.5μl
DTT(10mM) 0.5μl
T7Select415-1 EcoRI/HindIIIベクターアーム(0.02pmol) 1μl
核酸断片(独立した反応で0; 0.02; 及び0.06pmol)
H2O 5μlまで
反応物を16℃で一夜インキュベートした。
（実施例５）
生物多様な核酸断片発現ライブラリーのパッケージング及び増幅
実施例4のライゲーション反応物を、Novagenより入手可能な市販のパッケージング抽出物を用いてパッケージした。次いで、これらの反応物を、製造元の指示にしたがって、E.coliBL21細胞の感染により滴定した。3つの独立したライゲーションの各々から1μlを用いることにより、1.3×107と7×107プラーク形成単位(pfu)/mlの間の力価を得た。
全1μgのT7Select415-1ベクターを含む3つのライゲーション反応物をプールし、パッケージすることにより、2.75×107pfu、即ち2.75×107の最初の組換えイベントでライブラリーがもたらされた。ライブラリーを、すぐに、「プレート溶解産物の増幅」(製造元の指示にしたがって)により、180LBペトリ皿(直径14cm)上で増幅した。増幅した溶解物の力価は、1と5×1010pfu/mlの間で変動した。溶解物2リットルを回収し、プールし、1.5×1010pfu/ml、即ち、全部で3×1013pfuで力価を決定した。溶解物をCHCl3上、4℃で貯蔵し(製造元の指示にしたがって)、10%グリセロールを含むグリセロール保存株を、-80℃で保存した。
（実施例６）
T7をディスプレイする生物多様な核酸断片ライブラリーの特徴決定
実施例5に記載したライブラリーの増幅の間、低密度のプレートからの個々のプラークを収集し、PCRによりヌクレオチド配列のT7Select415-1に特異的なプライマーで分析した。
70bpを超える挿入断片のサイズのプラーク39個を、DNA配列解析分析により分析した。得られた配列を、表3にまとめる。
19個の細菌のゲノム中13個からのDNAを、分析した組換えファージで同定することができた。ほとんどの場合で、相同性は、ゲノムの出発物質に由来した領域で96と100%の間であった。さらに、プライマー及びアダプターを同定したが、挿入断片領域には、また、多くの場合の一連のアダプター及び複数のPCRプライマーが存在していた。分析したファージクローンの挿入したDNAは、最高250bpの長さであった。
Figure 2008522954
 （実施例７）
トラフグ(Takifigu rubripes)からの生物多様な核酸断片ライブラリーの生成及びスクリーニング
日本のフグであるトラフグからのゲノムのDNAから、以下の反応物で、酵素AluI及びHaeIIIでの制限酵素の消化を用いて、核酸断片を生成する：
ゲノムのDNA(20μg)
制限酵素バッファー(10×) 5μl
AluI(10U/μg) 4μl
HaeIII(10U/μg) 4μg
H2O 50μlまで
次いで、DNA断片を、2%アガロース/TAEゲルを用いて、電気泳動により分離する。90〜120bpの範囲における断片を、QIAクイックGel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて製造元の指示にしたがって単離する。
DNAの濃度を、分光光度法を用いて260nmで決定する。
次いで、配列番号47と48との、配列番号49と50との、配列番号51と52との、配列番号53と54とのアダプター対を、相互にアニールする。このプロセスは、各オリゴヌクレオチドの濃度が50μMのH2O中で完結する。アダプター対を94℃で10分間インキュベートし、次いで、ゆっくりと室温に放冷する。
次いで、アニールしたアダプターを、別々のライゲーション反応物で、単離した核酸断片に連結する。
ライゲーションは、以下の反応物で行う:
プールしたゲノムのDNA断片(断片の平均の長さ100bp) 2pmol
アニールしたアダプター 150pmol
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
T4DNAリガーゼ(3U/μl)(Promega) 1μl
H2O 10μlまで
次いで、試料を4℃で一夜インキュベートし、その後65℃で20分間インキュベートすることにより熱不活性化する。
試料を、以下の反応物でT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega)を用いてリン酸化する：
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
rATP(10mM) 2μl
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(5U/μl) 1μl
H2O 20μl
試料を37℃で30分間インキュベートし、その後65℃で20分間インキュベートして酵素を熱不活性化した。
各ライゲーション反応物からの核酸断片を、次いで、等しい割合で、即ち等量の核酸と併せて、1つのプールを形成する。そのとき、核酸断片のこのプールは、ペプチドディスプレイベクターT7Select415-1(Novagen)中にクローニングするのに適している。しかし、以下の反応物で、T7Select415-1ベクターをEcoRIで消化することが、最初に必要である：
T7Select415-1ベクター(1μg)
EcoRIバッファー(10×)(Promega) 3μl
BSA(10×) 3μl
EcoRI(20U/μl)(Promega) 2μl
H2O 30μlまで
反応を37℃で2時間進行させ、その後65℃で20分間反応物をインキュベートすることにより、酵素を熱不活性化する。次いで、試料を、QIAクイックPCR精製カラムを用い、製造元の指示を用いて精製する。次いで、核酸の濃度を、吸光光度法により260nmでUV吸収を測定して決定し、その後、DNAを希釈して最終濃度0.02μMとする。
次いで、核酸断片を、以下の反応物を用いて、T7Select415-1ベクター中に連結する。
ライゲーションバッファー(10×)(Novagen) 0.5μl
rATP(10mM) 0.5μl
DTT(10mM) 0.5μl
T7Select415-1(0.02pmol) 1μl
核酸断片
(独立した反応で0; 0.02; 及び0.06pmol)
H2O 5μlまで
反応物を16℃で一夜インキュベートする。次いで、試料を、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて精製し、その後、リン酸緩衝化食塩水1mlに希釈する。
次いで、トラフグから生成したライブラリーをD15タンパク質のエピトープのミモトープに対してスクリーニングする。D15タンパク質は、ウサギで免疫反応を誘発することが示されているインフルエンザ菌の80kDa外膜タンパク質である。これらのウサギから単離した抗体は、今度は、幼若ラットにインフルエンザ菌に対する抵抗性を与えることが示されている。ウサギから単離した、アフィニティー精製抗体は、幼若ラットを用いたスクリーニングで保護的であることも示されている(Thomas et al, Infect Immunol, 58(6), 1909-1915, 1990)。
D15タンパク質のエピトープのミモトープを同定しようと、トラフグから生成したファージディスプレイライブラリーを、Thomasら(1990年)が記載した親和性で精製した抗体に結合するのに十分な立体配座を有するこれらのペプチドに対してスクリーニングする。
ファージディスプレイライブラリーを、抗体でコーティングしたヤギ抗ウサギ結合磁性ビーズに結合しているアフィニティー精製抗体に加える。これらのビーズは、抗体10μgをDynalビーズ5mgとインキュベートし、25℃で1時間インキュベートし、その後HEGバッファー(HEPES-KOH35mM、pH7.5/0.1mMEDTA/100mMグルタミン酸ナトリウム)で6回洗浄して生成する。
ファージを、これらのビーズと0℃で1時間インキュベートし、その後、冷HEGバッファー/0.1%BSA5mlで3回洗浄する。次いで、ビーズをさらなる3回HEGバッファーで、テスラマグネット(Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany)などのマグネットを使用して洗浄して、ビーズを固定化する。次いで、結合しているファージを1%SDS0.5mlで溶出する。この方法により単離したファージを再スクリーニングし、あるいは、結合性のペプチドをコードする核酸断片をファージから単離し、分析する。例えば、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
（実施例８）
リボソームディスプレイのための生物多様な核酸断片の構築
核酸を、以下の細菌種から単離する：
1 アーケオグロブスフルギディス
2 アクイフェックスアエリティカス
3 アエロピラムペルニックス
4 枯草菌
5 百日咳菌TOX6
6 ライム病ボレリア
7 トラコーマクラミジア
8 大腸菌K12
9 インフルエンザ菌 (rd)
10 ヘリコバクターピロリ
11 メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム
12 メタノコッカスヤッナシ
13 肺炎マイコプラズマ
14 髄膜炎菌
15 緑膿菌
16 パイロコッカスホリコシ
17 シネコシスティスPCC6803
18 サーモプラズマボルカニウム
19 サーモトガマリティマ
核酸断片を、5'TTTCCCGAATTGTGAGCGGATAACAATAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGACTACAAAGAN9-3'(配列番号55)
の配列のタグ付けしたランダムオリゴヌクレオチドを用いて、PCRの連続した4回を用いて、これらのゲノムの各々から生成する。このオリゴヌクレオチドは、リボソーム結合部位を導入する。
これを完結するために、以下の試薬を試料に加える：
ゲノムのDNA(100〜200ng)
配列番号55を含むオリゴヌクレオチド(25μM) 4μl
Klenowバッファー 1μl
dNTP(2mM) 3μl
Klenow 0.5μl
H2O 40μlまで
試料を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後、37℃で15分間加熱する。
試料を5分間煮沸して前記試料中の核酸を再び変性させ、その後、急冷して前記核酸を再生させる。E.coliDNAポリメラーゼIのKlenow断片の別の0.5μlを核反応物に加え、試料を15℃で30分間、次いで室温で2時間インキュベートし、その後、37℃で15分間加熱する。
次いで、生成したPCR産物を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCR反応のための鋳型として用いる：
5'GGGGCCAAGCAGTAATAATACGAGTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCGAATTGTG-3'(配列番号56)
このオリゴヌクレオチドは、T7プロモーター及び配列番号53の領域に相同性である領域を含む。
各DNA鋳型を、別々の反応において(即ち19反応)配列番号54のオリゴヌクレオチドで、「片腕の」PCRにより増幅する。各PCR反応物は以下を含む:
鋳型DNA 1μl
Taqバッファー(10×)(Promega) 5μl
MgCl2(25mM) 4μl
dNTP(2mM) 5μl
配列番号56を含むオリゴヌクレオチド(10pmol/μl) 10μl
TaqDNAポリメラーゼ(Promega5U/μl) 0.4μl
H2O 50μlまで
次いで、反応をPerkin ElmerサーモサイクラーPE9700又はPE2400で、以下のプログラムを用いて繰り返す:
94℃5分+30×[94℃30秒、55℃30秒、72℃1分]+72℃5分。
得られたPCR産物を、2%アガロース/TAEゲルを用いて電気泳動し、50bpから250bpの間の核酸断片を、QIAクイックゲル抽出キット(QIAGEN)を用い、製造元の指示を用いて抽出する。核酸の濃度を、260nmで分光光度法でUV吸収を測定することにより決定する。
19の各細菌種の各々に由来するPCR産物のプールを生成する。これを行うために、ゲノムが最小である生物からのプールに加えた核酸の量と比較して等モル量の、各生物からのDNAを加える。
次いで、以下の反応物で、リョクトウヌクレアーゼ(NEB)を用いて、核酸断片を平滑末端化する：
核酸断片(2μg)
リョクトウヌクレアーゼバッファー(10×) 3μl
リョクトウヌクレアーゼ(10U/μl)(NEB) 2μl
H2O 30μlまで
反応を30℃で1時間進行させる。次いで、試料を、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて製造元の指示にしたがって精製する。
平滑末端アダプターをコードするオリゴヌクレオチドは、以下の配列を含んで生成される:
5'-TTTAAGCAGCTCGATAGCAGCAC-3'(配列番号57)及び、
5'-GTGCTGCTATCGAGCTGCTTAAA-3'(配列番号58)。
アダプターを相互にアニールする。このプロセスは、H2O中で、各オリゴヌクレオチドが50μMの濃度で完結する。アダプターの対を、94℃で10分間インキュベートし、次いで、ゆっくりと室温に放冷する。アニールしたアダプターを、以下の反応物中で核酸断片に連結する：
プールしたPCR産物(平均の長さ150bp) 2pmol
アニールしたアダプター 150pmol
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
T4DNAリガーゼ(3U/μl)(Promega) 1μl
H2O 10μlまで
次いで、試料を4℃で一夜インキュベートし、その後、65℃で20分間インキュベートすることにより熱不活性化する。次いで、ライゲーション反応物を、QIAクイックPCR精製キット(QIAGEN)を用いて精製する。
次いで、修飾した核酸断片を、配列番号56の配列、及び以下の配列のオリゴヌクレオチドとのPCR反応で増幅する:
5 'AGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGGAATTCACCTTTAAGCAGCTC-3'(配列番号59)
配列番号59のオリゴヌクレオチドに、終止コドンの除去された修飾されたリポタンパク質のターミネーターを導入する。
PCR反応を、以下の反応物で完結させる：
鋳型DNA 1μl
pfuバッファー(10×)(Promega) 5μl
MgCl2(25mM) 4μl
dNTP(2mM) 5μl
配列番号54のオリゴヌクレオチド(10pmol/μl) 10μl
配列番号57のオリゴヌクレオチド(10pmol/μl) 10μl
pfuDNAポリメラーゼ(Promega5U/μl) 0.4μl
H2O 50μlまで
PCR反応は以下のサイクリング条件で完結する:
94℃5分+30×[94℃30秒、55℃30秒、72℃1分]+72℃5分
次いで、PCR産物を、QIAクイックPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて精製する。
別の反応で、繊維状のファージM13の遺伝子IIIのアミノ酸211〜299を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅する:
5'-CGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTC-3'(配列番号60)
5'-TTAAGACTCCTTATTACGCAGTATGTTAGC-3'(配列番号61)。
配列番号60のオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega)を用いてリン酸化して、後に、PCR産物の定方向クローニングを行う。リン酸化は、以下の反応物で進行する：
オリゴヌクレオチド(配列番号60)
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 1μl
rATP(10mM) 2μl
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(5U/μl) 1μl
H2O 20μl
試料を、37℃で30分間インキュベートし、その後65℃で半分間インキュベートして、T4ポリヌクレオチドキナーゼを熱不活性化する。
次いで、オリゴヌクレオチドを以下のPCR反応物で用いる：
鋳型DNA 1μl
pfuバッファー(10×)(Promega) 5μl
MgCl2(25mM) 4μl
dNTP(2mM) 5μl
オリゴヌクレオチド配列番号60(10pmol/μl)10μl
オリゴヌクレオチド配列番号61(10pmol/μl)10μl
pfuDNAポリメラーゼ(Promega5U/μl) 0.4μl
H2O 50μlまで
次いで、反応を、Perkin ElmerサーモサイクラーPE9700又はPE2400で、以下のプログラムを用いて繰り返す：
94℃5分+30×[94℃30秒、59℃30秒、72℃1分]+72℃5分
反応物を、2%TAE/アガロースゲルで電気泳動し、1276bpの断片を、QIAクイックゲル精製キット(QIAGEN)を用いて単離する。
修飾した核酸断片、及びM13ファージから単離したスペーサー配列を、次いで、以下の反応物で連結する：
修飾した核酸断片(2μg)
スペーサー(2μg)
ライゲーションバッファー(10×)(Promega) 2μl
T4DNAリガーゼ(3U/μl)(Promega) 1μl
H2O 20μlまで
次いで、試料を4℃で一夜インキュベートし、その後、65℃で20分間インキュベートすることにより熱不活性化する。次いで、ライゲーション反応物を、QIAクイックPCR精製キット(Qiagen)を用いて精製する。
得られた遺伝子構築物を、Leslie et al, J. Biol. Chem. 266, 2632 - 1991のプロトコールの改変である、繊維状鋳型に対するPromega E.coli S30抽出システムを用い、製造元の指示にしたがってインビトロで転写し、翻訳する。
翻訳反応は、酢酸マグネシウム[Mg(OAc)2]を最終濃度の50mMまで、クロラムフェニコールを最終濃度の50μMまで添加し、試料を氷上で冷却することにより停止する。次いで、試料を、氷冷した洗浄バッファー(50mM Tris-HOAc、pH7.5/150mM NaCl/50mM Mg(Oac)2/0.1%Tween20)で8倍に希釈し、100000g、4℃で5分間遠心してあらゆる不溶性の成分を除去する。
次いで、インビトロのディスプレイされたライブラリーをスクリーニングして、α-FLAGモノクローナル抗体に結合するペプチドを単離する。モノクローナル抗体を、最初に、マイクロタイタープレートに吸着させる。マイクロタイタープレートの各ウェルを、蒸留水で2回すすぐ。α-FLAGモノクローナル抗体(α-FLAG M2、Sigma Aldrich)を、TBSバッファーで20μg/mlに希釈し、1ウェルにつき100μlを加える。抗体を、4℃で一夜吸着させる。次いで、マイクロタイタープレートをTBSバッファーで3回すすぎ、蒸留水に溶かした5%スキムミルクを満たす。遮断するために、スキムミルク溶液を室温で1時間、穏やかに揺すって結合させる。次いで、ディッシュを再蒸留水(ddH2O)で5回すすぎ、使用するまでddH2Oを満たす。
使用前に、マイクロタイタープレートの各ウェルを、氷冷した洗浄バッファーで洗浄し、遠心した翻訳混合物からの上清を適用する(1ウェルにつき200μl)。次いで、プレートを室温で1時間、穏やかに揺する。次いで、マイクロタイタープレートの各ウェルを、氷冷した洗浄バッファーで5回洗浄し、結合したリボソームをディスプレイするペプチドを、氷冷した溶出バッファー(50mM Tris-HOAc、pH7.5/150mM NaCl/10mM EDTA/50μg/ml E.coli tRNA)を用いて溶出する。ウェルごとに溶出バッファー(100μl)を加え、プレートを4℃で10分間、穏やかに揺する。遊離したmRNAを、製造元の指示を用いて、RNEasyキット(QIAGEN)を用いて回収する。
次いで、回収したmRNAを、Superscript逆転写酵素(Invitrogen)を用い、製造元の指示にしたがって、逆転写する。次いで、ポジティブの核酸断片を、PCRを用いてオリゴヌクレオチド(ランダム塩基のない、非常に早いもの)で増幅する。PCR産物を、2%TAE/アガロースゲルで電気泳動し、PCR産物を、QIAクイックゲル抽出キットを用いて回収する。次いで、回収した核酸を、Big Dye Terminatorシステム(Perkin Elmer)を用いて配列決定する。
（実施例９）
c-Jun二量化を阻害することができるペプチドの同定
実施例1に実質的に記載したように、生物多様な核酸断片ライブラリーを、ベクターpMF4-5(Phylogica Ltd, Australia)(配列番号62)で生成した。増幅した断片を、EcoRI及びAcc651で消化した。次いで、得られた断片を、QIAクイックPCR精製カラム(Qiagen)を用いて、実質的に製造元の指示にしたがって精製した。発現ベクターpMF4-5を、また、EcoRI及びAcc651で消化し、エビのアルカリホスファターゼで処理し、次いで、QIAクイックPCR精製カラム(Qiagen)を用い、実質的に製造元の指示にしたがって精製した。次いで、ライゲーションを、10:1のモル比の挿入断片:ベクターで行い、TOP10エレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)中に形質転換した。
次いで、これらのベクターを、標準の方法を用いて細菌から単離し、PRT51酵母株(遺伝子型MATα、his3、trp1、ura3、6LexA-LEU2、lys2::3、cIop-LYS2、CYH2R、ade2::G418-pZero-ade2、met15::Zeo-pBLUE-met15、his5::hygroR)中に形質転換した。次いで、形質転換体を等分し、15%グリセロールで瞬間凍結した。
本スクリーニングで用いたベイト及びプレイは、JUN1及びJUNZ(c-Junのこれらの領域を図8に示す)であった。手短に述べると、JUN1タンパク質をコードする核酸を、核局在化シグナル及びB42活性化ドメインと作動可能な関係で、プレイベクターpJFK(配列番号63、図5)中にクローンした。JUNZタンパク質をコードする核酸を、ベイトベクターpDD(配列番号64、図6)中に、LexA DNA結合性ドメインと作動可能な関係でクローンした。PDDベクターは、HIS3遺伝子をコードする核酸も含む(図6)。次いで、これらのベクターを、酵母株PRT480(遺伝子型MATα、his3、trp1、ura3、4LexA-LEU2、lys2::3、cIop-LYS2、CANR、CYH2R、ade2::2LexA-CYH2-ZEO、his5::1 LexA-URA-G418を有する)中に形質転換した。
ベイト及びプレイタンパク質、ならびに潜在的なブロッキングペプチドを保有する酵母を、次いで、集団交配し、約300,000のクローンから95個のポジティブを同定した(即ち、約1/3000)。
2つの分析方法を用いて、相互作用-ブロッキング活性を同定した。
これらの最初のものは、HTU培地を含有する平板上に、平板半分につき約500個の細胞を塗抹し、3日増殖後コロニー数を計数することを含む。これらの条件では、JUN1及びJUNZの相互作用により、細胞が増殖できるようになる。したがって、コロニー数が低減するということは、スクリーニングしたライブラリーがJUN1/JUNZ相互作用のペプチド阻害薬を含むことを示している。
第2のスクリーニング方法は、10個の別々のコロニーを単離し、新しいHTU培地を含む平板に画線し、新たな単一のコロニーの増殖を分析することを含む。3日後、ペプチド阻害薬を発現するものは、概して、新たな増殖が殆んど又は全くないが、ペプチド阻害薬を発現しないものは、画線状の単一コロニーを再増殖する。陽性対照として、JUN1/JUNZ相互作用の既知の阻害剤であるFosZを用いた。陰性対照として、ペプチド挿入断片のない空のpYTB3ベクター(Phylogica Ltd, Perth, Australia)を用いた。2つの対照試料に比べた各ペプチドの10個の個々のクローンの増殖に応じて、1〜10のスコアが与えられた。
次いで、方法1及び2からのスコアを組み合わせて、特定のコロニーがJUN1/JUNZ相互作用のペプチド阻害薬を発現したか否かを決定した。現在の場合では、ペプチド阻害薬を発現する細胞は、両テストにおいて、陰性対照に比べて>50%の増殖の減少を示したものであった。
スコア付けは全て、2つの独立した個体により行い、両個体のスコアを組み合わせた。
スクリーニングの後、60個のコロニーがJUN1とJUNZの相互作用を阻害することができることが見出された。
同定した60個のコロニー中、27個を配列決定し、BLAST-Pを用いて分析して、それらの最も可能性のある源を判定した。この分析の結果を、表4に述べる。
Figure 2008522954
同定したペプチドの30%は、その天然のリーディングフレームで発現されることに留意されたい(即ち、それらは天然に見られるタンパク質の領域と同一である)。これは、偶然に期待するよりも有意に大きい数(p<0.009)を表す(6断片のうち1つしか、その天然のリーディングフレームでは期待されないため)。
このスクリーニングで同定するペプチドの配列を、表5に示す。
Figure 2008522954
次いで、JUN1と相互作用するペプチドの能力を、順方向の2-ハイブリッドアッセイで確認した。JUN1とJUNZの相互作用を阻害することができる同定されたペプチドの数々を、ベイトベクターpDD(配列番号61、図6)中にクローンした。JUN1とJUNZの間の相互作用を阻害しないことが知られているペプチドをコードするさらなる核酸も、pDD中にクローンした。pDDベクター及びJUN1プレイベクターを、酵母株PRT480中に形質転換し、コードしたペプチドとJUN1の相互作用を、ウラシルの非存在下における増殖の量を決定することにより評価した。このようなスクリーニングの例を、図9に示す。
（実施例１０）
Jun二量化阻害ペプチドの構造はJunのロイシンジッパーの構造を模倣する
ペプチド22の構造を、スレッディングを用いて決定した。スレッディングは、例えば、標的のタンパク質の配列同一性について知られている情報がほんの少しである場合に、関連するタンパク質の構造に基づいて特定のタンパク質の構造を決定し、又は予測するのに有用である。この方法は、PDBに蓄積されている構造に由来する独特のタンパク質の折り畳みのライブラリーを使用するものである。標的のタンパク質の配列が、順番に各タンパク質の折り畳み上に最適にスレッドされ、ループ領域における相対的な挿入及び欠失を見込んでいる。様々な試行のスレッディングが、所与のスレッディングで残基間の2つ1組の相互作用を加算することに基づいて、「エネルギー」スコアにそれぞれ割り当てられている。折り畳みのライブラリーは、昇順のエネルギーで位置づけられ、エネルギーの最も低いものが最も有望なマッチングとして採用される。
ペプチド22の配列をJun-Jun2量体上にスレッドして、Swiss-PDB Viewerソフトウェア(Geneva Biomedical Research Institute)を用いてペプチドの二次構造を決定した。ペプチド22のスレッドした構造を、図10に示す。この方法の使用により、ペプチドが数々のロイシン残基(又はロイシン様残基、例えば、メチオニン、バリン、もしくはイソロイシン)、及びロイシン又はロイシン様アミノ酸の約3から4個のアミノ酸の後に位置する疎水性分子を含んで、ロイシンジッパー様構造を形成することが決定された。疎水性コアを有するペプチド22の構造を、図11に示す。ロイシンジッパー様構造は、Junのロイシンジッパーに結合していることができる。
さらにペプチドとの融合体として発現されているFLAGエピトープにおける酸性アミノ酸は、Junの塩基性領域に結合していることができる構造を形成していた。Junのこの領域は、通常DNAに結合している。JunのArg276、Lys-273、及びArg-270残基に結合しているFLAGエピトープのアミノ酸の構造を、図12及び13に示す。
上記に記載したスクリーニングで単離した他のペプチドを分析することにより、これらのペプチドの数々は、ロイシンジッパー様構造の形成を促進するように配置されている数々のロイシン残基及び疎水性アミノ酸も含んでいることが決定された。さらに、これらのペプチドのいくつかは、FLAGエピトープ、又はJunのDNA結合領域に結合しているのに適しているペプチドの領域のいずれかにより形成されている酸性領域も含んでいた。これらの各領域の位置、及び残基を表6に示す。さらに、ペプチドのアライメントを図14に示す。
Figure 2008522954
Figure 2008522954
Figure 2008522954
（実施例１１）
c-Jun二量化阻害薬はc-Junが媒介する遺伝子の発現を低減させる
K562細胞系を、Mercury Profiling Kit(Clontech, U.S.A.)のAP-1ルシフェラーゼレポーターで安定に形質移入し、クローン細胞系26を確立した。6ウェルの組織培養平板フォーマットで、K562-AP1細胞を、Lipofectamine2000(Life Technologies)を用いて、製造元の指示にしたがって、pcDNA3対照、pcDNA3-Jun、又はpcDNA-ペプチドのいずれかで形質移入した。形質移入細胞を48時間インキュベートし、細胞を収集し、Mercury Profilingキット及び関連のプロトコールにしたがってルシフェラーゼアッセイのためにタンパク質溶解物を抽出した。ルシフェラーゼアッセイを、独立して3回行い、各ペプチドに対する結果を統計的分析(SPSSソフトウェアパッケージ)を行って、それらがJun(AP-1活性化の陽性対照)又はpcDNA-3(AP-1活性化の陰性対照)と異なるか否かを決定した。
図15に示すように、ペプチドSP36(配列番号134)、SP35(配列番号130)、SP71(配列番号158)、及びSP34(配列番号126)は、対照の細胞に比べて、AP-1調節領域と作動可能な関係で配置されているレポーター遺伝子の発現を著しく低減することができる。AP-1が媒介する転写は、例えばc-Jun二量化により媒介されるので、これらの結果は、これらのペプチドは各々、c-Jun二量化を阻害し、又は低減することを示している。
これらの研究からの結果が指摘するのは、逆ハイブリッドスクリーニングを用いて同定される有意な比率のペプチドが(p<0.05)、AP-1が媒介する遺伝子発現を低減することができるということである。
（実施例１２）
c-Jun二量化阻害薬はc-Junに結合する
HEK293細胞を、DMEM+10%FCS、L-グルタミン2mMで培養した。形質移入の前日、細胞をトリプシン処理し、形質移入のために80〜90%の集密度に達するように、6ウェルの組織培養平板に分けた。細胞を、Lipofectamine2000試薬(Life Technologies, U.S.A.)を用いて、製造元の指示にしたがって、pcDNA3-Jun(1.3μg)及びpcDNA3-ペプチド(2.6μg)を共形質移入した。形質移入48時間後、形質移入した細胞を平板から掻き取り、遠心により収集し、タンパク質を低張性の溶解バッファー(Tris10mM、NaCl10mM、EDTA2mM、pH7.5+プロテアーゼ阻害薬(Roche, U.S.A.))で抽出した。NaClを加えることにより塩濃度を150mMに調節し、残骸をペレット状にし、上清中のタンパク質を新しい試験管に収集した。
小分量(40μl)のタンパク質を、ウェスタン分析用に確保した。残りを、製造元の指示にしたがって抗マウス磁性Dynabeads(Dynal Biotech, Norway)と予め複合した抗Flagを複合したアガロースビーズ(Sigma-Aldrich, U.S.A.)抗Flag抗体(Sigma-Aldrich)と、4℃で2時間回転することによりインキュベートした。複合したビーズと結合しているタンパク質複合体を、遠心により、又はDynalマグネットにより収集し、NET-2バッファー(Tris-Cl50mM pH7.5、NaCl150mM、0.05%Nonidet P-40)で5分間8回洗浄した。ビーズ及び結合している複合体を、3.3×Laemmli SDS添加液に再懸濁し、100℃で5分間インキュベートし、-20℃で貯蔵した。
共免疫沈降物及びタンパク質抽出物を、12%Tris-グリシンゲル上で分離し、メンブラン(Hybond C-super、Amersham)に移し、抗Jun一次抗体、抗ウサギ二次抗体(Amersham)でプローブし、オートラジオグラフ曝露、及びECL検出キット(Amersham)で可視化した。
FLAGを捕獲するための抗FLAG抗体は、それらが発現された哺乳動物細胞からのc-Jun阻害ペプチドをタグ付けした。SDS-PAGEによりタンパク質を分離し、メンブランに移した後、メンブランを抗c-Jun抗体でプローブした。図16に示すように、ペプチドSP15(配列番号86)、SP20(配列番号94)、SP30(配列番号114)、及びSP35(配列番号130)は、共免疫沈降物において検出可能なレベルまでc-Junと結合することができた。これらの結果は、試験したペプチドの大多数が、c-Junを共免疫沈降することができることが見出されたアッセイを表すものである。
さらに、細胞におけるc-Junの全レベルを、共免疫沈降で得られたものと比べることにより、いくつかのペプチドは、細胞で発現される有意な比率のc-Junと結合していることがわかる。
（実施例１３）
c-Jun二量化阻害薬はTNF-αが媒介する細胞死を低減する
神経細胞のPC12細胞に、c-Jun二量化阻害薬をコードする発現構築物(例えば、ペプチドSP34(配列番号126)、SP36(配列番号134)、SP71(配列番号158))を形質移入した。次いで、細胞を、この細胞系で細胞死を引き起こすことが示されているTNF-αに曝露した。
PC12細胞系は、移植可能なラット褐色細胞腫(ATCC受諾番号:CRL-1721)に由来する。細胞を、DMEM+10%ウシ胎児血清(FCS)、15%ウマ血清、及びL-グルタミン2mMに維持し、3日ごとに供給し、形質移入及びTNF曝露の前に1回だけ分割した。
第1日目、PC12細胞をトリプシン処理して多細胞集合体を分離し、計数し、各ペプチド及び対照に対して2回ずつ、24ウェル組織培養平板で、1ウェルにつき0.5ml中8×105個の細胞を接種した。各ウェルでは、細胞に、Lipofectamine2000試薬(Life Technologies, U.S.A.)を用いて形質移入するが、この場合Lipofectamine2000試薬4μlを、DMEM100μlに希釈したプラスミド1.6μgと複合体を形成したDMEM100μに希釈した。形質移入細胞を、37℃/5%CO2で一夜インキュベートした。
第2日目、形質移入したPC12細胞を遠心により収集し、次いでDMEM+L-グルタミン2mMに再懸濁し、新しい24ウェル組織培養平板に移した。DMEM+L-グルタミン2mMに希釈したTNFa(Roche, U.S.A.)を、各ウェルの細胞に加えて、最終体積1ml、及びTNFaの最終濃度を100ng/mlとし、細胞を48時間インキュベーターに戻した。
第4日目、2つ組の形質移入細胞を併せ、全細胞を遠心により収集し、荷電したスライド上に固定し、TUNELアッセイキット(Promega, U.S.A.)で、製造元のプロトコールにしたがって染色した。各スライドに対して、異なる6区画の150個の細胞についてアポトーシス(茶色、又は茶色の点状の染色)及び非アポトーシス細胞(緑色の対比染色)を計数し、アポトーシス細胞のパーセント値を計算し、次いで平均した。TNFaが誘発したアポトーシスに対するペプチドの保護を、アポトーシス細胞のパーセント値を、pcDNA3陽性対照のパーセント値と比べることにより、評価した(最大アポトーシス誘発)。
図17a〜dに示すように、TNFαは、対照の細胞でアポトーシスを誘発した。しかし、試験を行った各ペプチドは、TNFαが誘発するアポトーシスを阻害することができた。
図17eは、アポトーシスを起こしている細胞のパーセント値を示す(TUNELアッセイを用いて検出した)。明らかに、試験した各ペプチドは、対照試料に比べてアポトーシスのレベルを有意に低減している。
（実施例１４）
c-Jun二量化阻害薬はUVが媒介する細胞死を低減させる
細胞をUV B放射に曝露し、細胞死のレベルを測定した。手短に述べると、培養中の角質のケラチン生成細胞を10分間UV照射に曝した。曝露後、培地を通常の培地、又はペプチドを10マイクロモル含む培地のいずれかに置き換えた。引き続き、細胞をFACS分析用に準備した。FACS分析を用いてヨウ化プロピジウム及び細胞中のアネキシンVのレベルを検出して、壊死、初期アポトーシス、又は後期アポトーシスを起こしている細胞の数を決定した。
図18a〜cに示すように、SIRC細胞(UVBに曝露していない)の一部が壊死しており、一部が生存しているものを対照とする。UVBに曝露後、アポトーシスを起こしていることが観察されるSIRC細胞数は増大する。しかし、図18cに示すように、ペプチドSP36(配列番号134又は136)は、アポトーシスを起こす細胞の数を低減することができる。
（実施例１５）
c-Jun二量化阻害薬は、インビトロの虚血細胞モデルで細胞死を低減する
初代神経細胞を単離し、グルタミン酸(250μM)の存在下で25分間培養して、虚血が引き起こす細胞死のモデルとして、細胞死を誘発した。
ラットの初代神経細胞を胎児から単離し(標準のプロトコール)、細胞培養ディッシュに塗抹し、実験前に11日間培養物に維持した。培地にペプチドを15分間加え、その後、グルタミン酸を加えた。グルタミン酸を5分間37℃で加えて最終濃度を250マイクロモルとした。グルタミン酸培地を除去し、新しい培地を加えた。生細胞についてのアッセイを24時間後に行った。MTSアッセイを用いて、生細胞をアッセイした。
図19に示すように、グルタミン酸は、対照細胞に比べて、有意な比率の細胞に死を引き起こした。
ペプチドSP35(配列番号130)、SP36(配列番号134)、及びSP71(配列番号158)は、有意な比率の細胞を細胞死から救済することができた。実際、ペプチドSP36は、殆んど全ての細胞を細胞死から救済することができた。グルタミン酸への曝露を生き残ったこれらのペプチドを発現する細胞の数は、既知のc-Jun二量化阻害ペプチドTI-JTPを発現する細胞の数を大幅に超えていた(Barr et al., J Biol Chem. 279:36327-38, 2004)。
さらに、図20に示すように、ペプチドSP36は、約5μMのペプチドが約100%の細胞を救済する投与量依存のやり方で、グルタミン酸が誘発する細胞死から細胞を救済した。
（実施例１６）
c-Jun二量化阻害ペプチドの類縁体は、インビトロ虚血細胞モデルで細胞死を低減させる
虚血の処置におけるc-Jun阻害タンパク質のDアミノ酸形態の有効性を決定するために、実験を行った。Dアミノ酸を含むペプチドは、プロテアーゼ抵抗性であり、その結果、対象に投与した場合の半減期はより長い。
グリシン以外のDアミノ酸を含む、Dアミノ酸形態のペプチドSP35(D35と呼ぶ)(配列番号132)、及びSP36(D36と呼ぶ)(配列番号136)は、Lアミノ酸を含むペプチドSP35、SP36、及びTLJIP同様、合成で製造した。レトロ反転ペプチドは、反転ペプチド部分のC末端に融合し、それぞれの場合において単一のLグリシン残基によりそれから分離されるTATタンパク質の標的領域をさらに含んでいた。配列番号132及び136のレトロ反転ペプチド類縁体のアミノ酸配列を、それぞれ181及び182に述べる。
ラット初代神経細胞を単離し、当技術分野では周知の方法を用いて培養した。次いで、細胞を、試験ペプチド、陽性対照ペプチド(Ti JIP)、又は既知の小分子グルタミン酸阻害剤の組合せ(MK801及びCNQX)の存在下、又は非存在下で培養した。細胞を、グルタミン酸250μMの存在下で5分間インキュベートして、虚血が誘発する細胞死を代表する細胞死を誘発した。
図21に示すように、グルタミン酸の存在下では、約3%の対照細胞が生存する(グルタミン酸の非存在下で生存する細胞の数に比べて)。
各ペプチドのD型又はL型のどちらかを添加すると、グルタミン酸が誘発する細胞死から有意な比率の神経細胞を保護する(既知のグルタミン酸受容体阻害剤が付与する保護のレベルにおよそ等しい)。同じ濃度で用いると、D型の各ペプチドがもたらす保護は、L型のペプチドに等しく(SP36及びD36)、又はそれにまさる(SP35及びD35)。
（実施例１７）
c-Jun二量化阻害ペプチドは細胞を急性の虚血から保護する
虚血事象(例えば、発作)の中心の細胞は、壊死性の細胞死を引き起こす重篤なエネルギーの枯渇及びグルタミン酸の放出をもたらす嫌気性の状態にさらされている。細胞培養物を嫌気性条件下でインキュベートすることにより、このような状態を模倣する。
D又はLアミノ酸のいずれかを含むペプチド35(配列番号130)及び36(配列番号134)の、急性虚血作用に対する効果を決定するために、ラット初代神経細胞を単離し、培養した。合成のペプチドを培養物に加え、細胞を約35分間、嫌気チャンバーに維持した。次いで、細胞の生存を測定した。
手短に述べると、単離したラットの神経細胞を、傷害前に15分間ペプチドで処理した。ペプチド又は対照を添加した後、解糖を防ぐために、細胞を、デオキシグルコースを含むグルコースフリーの平衡塩類溶液で洗浄した。次いで、細胞を嫌気インキュベーターで35分間インキュベートした。傷害後、溶液を除去し、細胞に新しい培地を加え、24時間後に生細胞に対してMTSアッセイを行った。
図22に示すように、Dアミノ酸を含むペプチド35及び36は、急性の虚血により引き起こされる細胞死から有意な比率の細胞[を救済した]。Dアミノ酸を含むペプチドは、Lアミノ酸で相当する細胞の細胞死より多い細胞を細胞死から救済した。
（実施例１８）
発作を阻害することができるペプチドの同定
先行する実施例に記載したように同定したc-Jun二量化の高親和性のペプチド阻害薬を、アデノウイルスの発現ベクター中にクローンした。次いで、初代神経細胞培養物をペプチドに感染させ、10分の嫌気性インキュベーション時間を用いてインビトロの発作のシミュレーションにかける。神経細胞の生存能力を、虚血事象に引き続いた数々の時間点で確かめて、各ペプチドがアポトーシスに対してもたらす保護のレベルを決定する。
精製した、合成のTATペプチドの融合体を用いる。IV送達を用いてTATペプチドを上首尾に脳に送達することができるという意義深いインビボの証拠が存在する。最大のインビボの安定性及び送達可能性を示すこれらのペプチドを決定するために、ラットにTATペプチド融合体をIV注射し、引き続き数々の時間点及び投与量で脳組織の分析を行って、インビボ分析を受けるペプチドを決定する。
TATペプチド融合体を、虚血1時間前、及び虚血3、6、及び9時間後に、静脈内送達する。MCAモデルのラットの一時的閉塞を用いて、一過性の限局性の虚血を誘発する。限局性の虚血の誘発は、モノフィラメントナイロン縫合糸を配置して、中大脳動脈(MCA)を45分間閉塞し、血圧を90mmHgに維持し、その後、再潅流することを含む。MCA閉塞、及び血流の再確立は、レーザードップラーを用いてモニターする。動物は、MCA閉塞の間は麻酔して、レーザードップラー及び血圧のモニタリングを可能にする。再潅流72時間後に動物を屠殺し、冠状脳切片を、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を染色する塩化トリフェニルテトラゾリウムの2%溶液中でインキュベートすることにより、梗塞部位を決定する。染色した連続の1mmの脳スライスをスキャンし、NIH画像システムを用いて分析して、梗塞の体積を計算する。各スライスにおける梗塞部位を、スライスの厚さを乗じることにより、梗塞の全体積を計算し、反対側の無影響の半球の体積のパーセント値として表す。長期間の保護の研究では、梗塞の体積を、虚血3週間後に評価する。梗塞の程度を、脳全体の体積のパーセント値として表し、データをANOVAで分析し、その後、事後のBonferroni/Dunn検定を行う。
限局的な虚血後の行動試験を、虚血24、48、及び72時間後に行う。2つの試験を用いる。所与のスコアで尺度上で順に低くなる欠陥を全て包含する、欠陥の累積5点尺度である。スケールは、0=明らかな欠陥がない、1=非対称な足の伸展、麻痺側への捻転(わずかな欠陥)、2=左顔面及び肩への接触に対し反応なし(軽度の欠陥)、3=麻痺側への自発的な旋回(かなりの欠陥)、4=発作又は自発的運動なし(重度の欠陥)からなる。
これらの試験の他に、運動及び感覚の損傷を評価する両側非対称の足試験を使用する。この試験では、単一の20×14mmの長方形のマスキングテープ片を各前足の肉趾に等しい圧力で適用する。動物がテープを除去するのに必要とされる時間を記録する(仕事に許容できる最大時間は2分)。
TATペプチド融合体を、虚血1時間前、及び虚血3、6、及び9時間後に静脈中に送達する。低血圧モデルでのラットの2血管閉塞を用いて、一過性の全脳虚血を誘発する。これは、両方の頚動脈を閉塞し、8分間血圧を45mmHgに(動脈血を除くことにより)低下させ、その後、再潅流し血圧を回復することを伴う。血液のpH、血圧、血中のガス及びグルコース、EEG、身体及び頭蓋温度を、手技の間モニターする。このモデルで広範囲の虚血を8分した後、海馬のCAI神経細胞死は虚血後24時間まで全く、又は殆んどなかったが、48〜72時間までに著しいCAI神経細胞死があった。虚血7日後に、CAI神経細胞の生存は<5〜6%である。海馬の神経細胞の生存能力を、対照及び処置のラットからの海馬におけるブレグマ(bregma)切片3.8の1000pM領域で生存可能なCAI神経細胞の数を計数することにより、虚血7日後に評価する。長期の生存試験では、CAI神経細胞の計数を3ヶ月に行う。データをANOVA、その後、事後のBonferroni/Dunnにより分析する。
Olton及びSamuelsonが1976年に開発した、8アーム放射状迷路試験は、ラットにおける海馬の機能の研究において、参照記憶及び作業記憶、ならびに空間認識を試験する標準の取組みの1つになっている。プロトコールは、動物が、交互のアームに餌がある迷路の、餌があるアームだけに入ることを学習することを必要とし、様々なタイプの誤ったアームの(餌がない、又は既に褒美が与えられた)入り口の数が参照記憶及び空間の作業記憶の尺度を提供している。迷路の訓練は、迷路の習熟の3日以内に始まる。迷路の訓練後、次の7〜8日が実験の試験段階を形成する。毎日、各動物を、迷路の中央のプラットホーム上に1度配置し、餌がある4つのアーム全てから報酬を回収するまで、又は10分が経過するまで迷路に残す。課題を完了するまでに経過した総時間、迷路中でとった経路、及び全体的な態度(毛づくろい、排便、排尿のエピソード)の記録をつける。この尺度の組合せにより、自発運動活性のレベル、各タイプのエラーの数、及び用いた空間的戦略(学習した運動の順序空間地図の使用)を推定することができる。様々な実験的処置に曝された動物の成績の比較を、ANOVA、カイ二乗、及びSPSS統計プログラムの時間系列関数を用いて行う。
多数の進化上の多様性に富む生物からの核酸断片を含む、発現ライブラリーを生成する単純化した方法を示す概略図である。最初に核酸をこのような生物から単離し、確実に各ゲノムが等しく提示される方法でプールする。次いで、縮重PCRを用いてゲノムのプールからの配列を増幅し、その後特定のPCRを用いて、これらの核酸断片を発現ベクター中にクローニングすることができる方法で、核酸断片をさらに増幅する。 アーケオグロブスフルギディス、アクイフェックスアエリティカス、アエロピラムペルニックス、枯草菌、百日咳菌TOX6、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌K12、インフルエンザ菌(rd)、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、肺炎マイコプラズマ、髄膜炎菌、緑膿菌、パイロコッカスホリコシ、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム、サーモトガマリティマから単離したゲノムのDNAのランダムPCR増幅の増幅産物を示す写真図である。左端上に、分子量マーカーを示してある。 pDEATH-Trpベクター(配列番号36)の概略図である。pDEATH-Trpベクターは、酵母細胞でベクター中に挿入された核酸の構成的発現のための最小ADHプロモーター、細菌細胞で核酸断片を発現するためのT7プロモーター、あらゆる発現されたポリペプチドを酵母細胞の核中に強制的に挿入するためのSV-40核局在化シグナルをコードする核酸、酵母細胞で転写を終結させるためのCYC1ターミネーター、細菌細胞における分泌のためのアンピシリン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸、トリプトファンを欠く培地で栄養要求性の酵母を増殖させるTRP1をコードする核酸、細菌細胞でプラスミドを複製させるpUC複製開始点、酵母細胞でプラスミドを複製させる2μ複製開始点を含む。 pDEATH-Trpベクターを保有する細菌のクローンから単離した核酸断片を示す写真である。単離したベクターを、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し、得られた断片を電気泳動した。分子量マーカーを左端及び右端に示し、テキストは核酸断片のサイズ範囲を塩基対で示している。 pJFKベクター(配列番号60)の概略図である。pJFKベクターは、酵母細胞で核酸断片を誘導発現するためのGAL1プロモーター、あらゆる発現されたポリペプチドを酵母細胞の核中に強制的に挿入する核局在化シグナル、「n」ハイブリッドスクリーニングにおいて対象のポリペプチドとの融合体として発現するためのB42タンパク質に由来する活性化ドメインをコードする核酸、酵母細胞におけるADHターミネーター即ち転写の終結、酵母細胞でプラスミドを複製させるための2μ複製開始点、ヒスチジンを欠く培地で栄養要求性の酵母を増殖させるHIS5遺伝子、細菌細胞で分泌させるためのアンピシリン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸、及びカナマイシン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸を含んでいる。 pDDベクター(配列番号61)の概略図である。pDDベクターは、酵母細胞で核酸断片を誘導発現するためのGAL1プロモーター、「n」ハイブリッドスクリーニングにおいて対象のポリペプチドとの融合体として発現するためのLEXA1タンパク質をコードする核酸、酵母細胞におけるADHターミネーター又は転写の終結、酵母細胞でプラスミドを複製させるための2μ複製開始点、ヒスチジンを欠く培地で栄養要求性の酵母を増殖させるHIS5遺伝子、細菌細胞で分泌させるためのアンピシリン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸、及びカナマイシン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸を含んでいる。 pYTB3ベクター(配列番号62)の概略図である。pYTBベクターは、酵母細胞で核酸断片の構成的発現のための最小ADHプロモーター、発現したペプチドを酵母細胞の核を標的にして挿入する核局在化シグナル、酵母細胞で転写を終結させるためのCYC1ターミネーター、酵母細胞でプラスミドを複製させるための2μ複製開始点、トリプトファンを欠く培地で栄養要求性の酵母を増殖させるTRP1遺伝子、細菌細胞における選択のアンピシリン抵抗性を与えるペプチドをコードする核酸、細菌細胞でプラスミドを複製させるpUC複製開始点を含んでいる。pYTB3ベクターは、細菌細胞におけるペプチドの発現を促進し、インビトロの転写/翻訳系を用いるT7プロモーターも含んでいる。 JUNポリペプチドの概略図である。示したように、構築物JUN1もJUNZも、DNA結合ドメイン(DBD)、及びJUNのロイシンジッパー(LeuZ)ドメインを包含する。ロイシンジッパードメインは、JUNのホモ二量化に重要である。 JUN1及びJUN1と相互作用するペプチド(ペプチド22)、又はJUN1及びJUN1と相互作用しないペプチド(ペプチド9)を発現する酵母のコロニーを示す図である。ベイト(即ちJUN1)のみを発現する細胞も示す。相互作用をするポリペプチドを発現するこれらの細胞で増殖が増大することに留意されたい。 Jun2量体の構造を用いてスレッディングにより決定したペプチド22の構造を示す図である。ペプチドは、Junタンパク質のロイシンジッパー、特に、示すようにArg-276、Lys-273、及びArg-270残基と相互作用することが示されている。 Jun2量体の構造を用いてスレッディングにより決定したペプチド22の構造を示す図である。2本のα-へリックスを含むペプチドのコアを形成する非極性のアミノ酸を、青色で強調してある。ペプチドは、Junタンパク質のロイシンジッパー、特に、示すようにArg-276、Lys-273、及びArg-270残基と相互作用することが示されている。 Jun2量体の構造を用いてスレッディングにより決定したペプチド22の構造を示す図である。酸性アミノ酸を青色で強調してある。ペプチド22のFLAGエピトープからのアミノ酸は、JunのArg-276、Lys-273、及びArg-270残基と相互作用することが示されている。 JunのArg-276、Lys-273、及びArg-270残基と相互作用するエピトープ22のFLAGエピトープを示す図である。FLAGエピトープの構造は、ペプチド22の配列をJun2量体の構造上にペプチド22の配列をスレッディングすることにより決定した。 c-Jun二量化阻害ペプチドのいくつかの配列を示す図である。ロイシンジッパー様ドメイン(下線)の形成に関与するアミノ酸ロイシン又は同等物(即ち、バリン、イソロイシン、又はメチオニン)の位置も示してある。太文字は、DNAに結合しているJunの塩基性残基との相互作用に関与する酸性残基の位置を示す。Junの塩基性残基を、イタリック体で示してある。 本発明の方法を用いて同定した数々のペプチドの存在下で、AP-1調節エレメントの制御下で作動可能に配置されたレポーター遺伝子の発現量を示すグラフである。発現量を、対照(ペプチドなし)のパーセント値で示す。以下のペプチドを発現する細胞で同定した発現量を示す:SP35(配列番号130)、SP36(配列番号134)、SP71(配列番号158)、SP34(配列番号126)、及びdnJunの陽性対照。各ペプチドからの結果を表す柱を示す*,p<0.05。 本発明のペプチドに結合しているc-Junの免疫沈降を示す写真のコピーである。ペプチドを抗FLAG抗体で捕獲し、タンパク質をSDS-PAGEにより分離した。次いで、c-Junを抗c-Jun抗体で検出した(上のパネル)。各セルにおけるc-Junの全レベルを下のパネルに示してある。ペプチドの名称を、上のパネルの上部に示す。 PC-12細胞におけるTNF-αが誘発する細胞死のレベルを示す顕微鏡写真のコピーである。細胞をTNFαで処理し、アポトーシスをTUNELを用いて決定した。濃く染色されている細胞が、アポトーシスを起こしているものである。 ペプチドSP36(配列番号134)を発現するPC-12細胞でTNF-αが誘発する細胞死のレベルを示す顕微鏡写真のコピーである。細胞をTNFαで処理し、アポトーシスをTUNELを用いて決定した。 ペプチドSP71(配列番号158)を発現するPC-12細胞でTNF-αが誘発する細胞死のレベルを示す顕微鏡写真のコピーである。細胞をTNFαで処理し、アポトーシスをTUNELを用いて決定した。 ペプチドSP34(配列番号126)を発現するPC-12細胞でTNF-αが誘発する細胞死のレベルを示す顕微鏡写真のコピーである。細胞をTNFαで処理し、アポトーシスをTUNELを用いて決定した。 TNFα処理後アポトーシスを起こしたPC12細胞のパーセント値を示すグラフ図である(即ち、全細胞のパーセント値)。対照細胞からの結果をTNFαで標識する。ペプチドSP34(配列番号126)、SP36(配列番号134)、又はSP71(配列番号158)を発現する細胞からの結果を示す。 SIRC細胞の試料において細胞死のレベルを検出するための、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンVの発現を検出するためのFACS分析の結果を示す図である。生細胞及び様々な形態の細胞死を起こしている細胞が示される。 10分間UV Bの照射に曝露したSIRC細胞の試料における細胞死のレベルを検出するために、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンV発現を検出するためのFACS分析の結果を示す図である。生細胞及び様々な形態の細胞死を起こしている細胞が示される。 ペプチドSP36(配列番号134)を発現し、10分間UV Bの照射に曝露したSIRC細胞の試料における細胞死のレベルを検出するために、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンV発現を検出するためのFACS分析の結果を示す図である。生細胞及び様々な形態の細胞死を起こしている細胞が示される。 グルタミン酸に曝露後生存する初代神経細胞のパーセント値を示すグラフである(対照-グルタミン酸なしに対して)。結果を、対照(Co)、グルタミン酸処理細胞(glu)、SP35(配列番号130)を発現するグルタミン酸処理細胞、SP36(配列番号134)を発現するグルタミン酸処理細胞、SP71(配列番号158)、TIJIP、及びSP34(配列番号126)を発現するグルタミン酸処理細胞について示す。*,p<0.05。 グルタミン酸への曝露後生存する初代神経細胞のパーセント値を示すグラフである(対照-グルタミン酸なしに対して)。示すように、結果を、様々な投与量のペプチドSP36(配列番号134)について表す。 グルタミン酸が誘発する細胞死から救済された細胞のパーセント値を示すグラフである(グルタミン酸で処理していない対照細胞に対して)。示すように、細胞を、Lアミノ酸(L35)を含む様々な濃度のペプチド35(配列番号130)で、Dアミノ酸(D35)を含むペプチド35(配列番号130)で、Lアミノ酸(L36)を含むペプチド36で(配列番号134)、Lアミノ酸(D36)を含むペプチド36で(配列番号136)、TiJIP又は既知のグルタミン酸受容体阻害薬MK801及びCNQXで(阻害薬)処理した。 低酸素状態(急性の嫌気性状態に曝露)が誘発する細胞死から救済された細胞のパーセント値を示すグラフである(嫌気性状態に曝露していない対照細胞に比べて)。示すように、細胞を、Lアミノ酸を含む様々な濃度のペプチド35(L35)で、Lアミノ酸(D35)を含むペプチド35で、Lアミノ酸(L36)を含むペプチド36で、Lアミノ酸(D36)を含むペプチド36で、又は既知のグルタミン酸受容体阻害薬MK801及びCNQXで(阻害薬)処理した。

Claims (82)

  1. 標的核酸又は標的タンパク質に結合するペプチドを決定する方法であって、
    (a)発現ライブラリーによって発現され、標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを同定するために、発現ライブラリーをスクリーニングすること、
    (b)自然の環境においては前記標的のタンパク質又は核酸に結合しない、(a)からの任意の1種又は複数のペプチドを選択すること、及び
    (c)保存された二次構造及び/又は三次構造を有する、(a)又は(b)からの1種又は複数のペプチドを選択すること
    を含む方法。
  2. (b)において選択したペプチド(複数も)の構造を決定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
  3. ペプチドの構造を実験的に決定する、請求項2に記載の方法。
  4. ペプチドの構造を、核磁気共鳴分光、電子常磁性共鳴分光、電子・核二重共鳴分光、X線結晶解析、中性子結晶解析、赤外線吸収分光、紫外線吸収分光、旋光分散分析、円二色性及び蛍光偏光からなる群から選択される方法を用いて決定する、請求項3に記載の方法。
  5. ペプチドの構造をインシリコ法を用いて決定する、請求項2に記載の方法。
  6. インシリコ法がスレッド法である、請求項5に記載の方法。
  7. (a)において複数のペプチドを同定することを含む、請求項1に記載の方法。
  8. (b)において複数のペプチドを選択することを含む、請求項1又は請求項7に記載の方法。
  9. 選択されたペプチドの2種以上の間で保存される二次構造及び/又は三次構造を決定することを更に含む、請求項8に記載の方法。
  10. 発現ライブラリーを構築することを更に含む、請求項1に記載の方法。
  11. ライブラリーが、
    (a)2種以上の微生物及び/又は小型ゲノムを含む真核生物に由来する核酸から断片を作製すること、ただし前記微生物又は真核生物の各々が実質的に配列決定されたゲノムを有する、
    (b)(i)における核酸断片を適切な発現構築体中に挿入し、それによって組換え構築体を作製すること、ただし各断片は、その断片の発現を賦与できるプロモーター配列と作動可能に連結している、ならびに
    (c)組換え構築体(ii)によりコードされるペプチドを発現させ、それによって候補ペプチドを作製すること
    を含む方法によって作製される、請求項10に記載の方法。
  12. 微生物及び/又は小型ゲノムを含む真核生物の各々からの核酸が、該生物のゲノムの複雑度及び大きさに比例した量で、適切な発現構築体中に挿入される、請求項11に記載の方法。
  13. 前記核酸が、標的タンパク質又は標的核酸を自然環境で産生する生物とは異なる、2種以上の微生物及び/又は小型ゲノムを含む真核生物に由来する、請求項11又は12に記載の方法。
  14. 微生物が、アエロピラムペルニクス(Aeropyrum pernix)、アクイフェクスエオリクス(Aquifex aeolicus)、アーケオグロブスフルギディス(Archaeoglobus fulgidis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、パラ百日咳菌(Bordetella pertussis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、デスルホビブリオブルガリス(Desulfovibrio vulgaris)、大腸菌(Escherichia coli)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、メタノコッカスヤッナシ(Methanococcus jannaschii)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、パイロコッカスホリコシ(Pyrococcus horikoshii)、シネコシスティス(Synechocystis) PCC 6803、サーモプラズマボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus)及びサーモトガマリティマ(Thermotoga maritima)からなる群から選択される、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 微生物が、アーケオグロブスフルギディス(Archaeoglobus fulgidus)、アクイフェクスエオリクス、アエロピラムペルニクス(Aeropyrum pernix)、枯草菌、パラ百日咳菌、ライム病ボレリア、トラコーマクラミジア、大腸菌K12、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、メタノコッカスヤッナシ、髄膜炎菌、パイロコッカスホリコシ、緑膿菌、シネコシスティスPCC 6803、サーモプラズマボルカニウム、サーモトガマリティマ、アシドバクテリウムカプスレイタム(Acidobacterium capsulatum)、ハロバクテリウムサリナラム(Halobacterium salinarum)、デスルホバクテリウムオートトロフィカム(Desulfobacterium autotrophicum)、ハロフェラックスボルカニ(Haloferax volcanii)、ロドピレルラバルチカ(Rhodopirellula baltica)、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus) HB27及びプロクロコッカスマリナス (Prochlorococcus marinus) MED4からなる群から選択される、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
  16. ライブラリーが、酵母2-ハイブリッド、n-ハイブリッド、逆2-ハイブリッド、逆n-ハイブリッド、分割ツーハイブリッド、細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、共有結合ディスプレイ及びインビトロディスプレイからなる群から選択される方法によってスクリーニングされる、請求項1に記載の方法。
  17. ライブラリーが、逆2-ハイブリッド法によってスクリーニングされる、請求項16に記載の方法。
  18. 自然において標的タンパク質又は標的核酸と結合するタンパク質又はタンパク質ドメインの対応構造と異なる、保存された二次構造又は三次構造を有するペプチドを選択することを更に含む、請求項1に記載の方法。
  19. (d)標的タンパク質又は標的核酸を含むか又は発現する細胞中でペプチドを発現させ、あるいは標的核酸又は標的タンパク質を含むか又は発現する細胞中に該ペプチドを導入すること、及び
    (e)該ペプチドが細胞中で標的核酸又は標的タンパク質と相互作用する能力を決定すること
    を含む方法を実施することによって、(c)において選択された該ペプチドの特性を決定することを更に含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ペプチドが細胞中で標的タンパク質又は標的核酸と相互作用する能力は、前記ペプチドと標的核酸又は標的タンパク質との相互作用の制御下に、その発現が作動可能に配されているレポーター遺伝子の発現量を決定することによって、決定される、請求項19に記載の方法。
  21. 前記ペプチドが、標的核酸又は標的タンパク質と別の核酸又はタンパク質との相互作用を阻害し、前記ペプチドが細胞中で標的核酸又は標的タンパク質と相互作用する能力は、標的核酸又は標的タンパク質と前記別の核酸又はタンパク質との相互作用の減少量を決定することによって、決定される、請求項19に記載の方法。
  22. 標的核酸又は標的タンパク質が細胞中で前記別の核酸又はタンパク質と相互作用する能力は、標的核酸又は標的タンパク質と前記別の核酸又はタンパク質との相互作用の制御下に、その発現が作動可能に配されているレポーター遺伝子の発現量を決定することによって、決定される、請求項21に記載の方法。
  23. レポーター遺伝子が、AP-1エンハンサーエレメントの制御下に作動可能に配されている、請求項22に記載の方法。
  24. 前記タンパク質がc-Junであり、前記別のタンパク質がc-Junであり、c-Junの自己二量化によって、レポーター遺伝子の発現が誘発される、請求項23に記載の方法。
  25. 前記ペプチドが標的タンパク質又は標的核酸と相互作用する能力は、標的タンパク質又は標的核酸に媒介される細胞中の表現型の量を決定することによって、決定される、請求項19に記載の方法。
  26. 表現型が細胞死であり、前記ペプチドは細胞死を減少させるか、防止する、請求項25に記載の方法。
  27. 細胞死が、
    (a)細胞死を誘発するのに十分な時間及び条件の下で、細胞を腫瘍壊死因子α(TNFα)と接触させること、
    (b)細胞死を誘発するのに十分な時間及び条件の下で、細胞を紫外線に曝露すること、及び
    (c)細胞死を誘発するのに十分な時間及び条件の下で、細胞をグルタミン酸と接触させること
    からなる群から選択される方法を実施することによって誘発される、請求項26に記載の方法。
  28. 前記細胞が神経細胞である、請求項27に記載の方法。
  29. 標的核酸又は標的タンパク質に結合するペプチドを決定する方法であって、
    (a)発現ライブラリーによって発現され、標的タンパク質又は標的核酸に結合する複数のペプチドを同定するために、発現ライブラリーをスクリーニングすること、
    (b)自然の環境においては前記標的のタンパク質又は核酸に結合しない、複数のペプチドを(a)から選択すること、
    (c)複数の選択ペプチドの構造を決定すること、
    (d)選択ペプチドの2種以上の間で保存されている二次構造及び/又は三次構造を決定すること、及び
    (e)保存された二次構造及び/又は三次構造を有する、1種又は複数のペプチドを(c)から選択すること
    を含み、それによって標的核酸又は標的タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。
  30. 標的タンパク質がc-Junである、請求項1又は請求項29に記載の方法。
  31. c-Junと相互作用する前記ペプチドが、c-Junの自己二量化を更に阻害する、請求項30に記載の方法。
  32. 前記ペプチドが、ロイシンジッパー様ドメインを含む、請求項30又は31に記載の方法。
  33. ロイシンジッパー様ドメインが、最大6〜12残基分の間隔で離れている複数のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びその混合物からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
  34. アミノ酸残基が、6〜7アミノ酸残基分離れている、請求項33に記載の方法。
  35. ロイシンジッパー様ドメインが、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びその混合物からなる群から選択される少なくとも6アミノ酸残基を含む、請求項33又は34に記載の方法。
  36. アミノ酸残基に疎水性アミノ酸が散在している、請求項33から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 各疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンからなる群から選択される1種又は複数のアミノ酸残基のアミノ酸3個又は4個以内にある、請求項36に記載の方法。
  38. 前記ペプチドが、酸性ドメインを更に含む、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 酸性ドメインが、4個以上のアルギニン残基を含む、請求項38に記載の方法。
  40. c-Junに結合するペプチドを決定する方法であって、
    (a)発現ライブラリーによって発現され、c-Junに結合する複数のペプチドを同定するために、発現ライブラリーをスクリーニングすること、
    (b)自然の環境においてはc-Junに結合しない、(a)からの複数のペプチドを選択すること、
    (c)複数の選択ペプチドの構造を決定すること、
    (e)ロイシンジッパー様ドメインと、場合により酸性ドメインとを有する、(c)からの1種又は複数のペプチドを選択すること
    を含み、それによってc-Junに結合するペプチドを決定する方法。
  41. (f)自己二量化を阻害する(e)で選択したペプチドを決定すること
    を更に含む、請求項40に記載の方法。
  42. 標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを生成する方法であって、
    (i)請求項1から41のいずれか一項に記載の方法を実施し、それによって、標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを同定又は決定すること、
    (ii)場合により、該ペプチドの量を決定すること、
    (iii)場合により、該ペプチドの名称又は構造を提供すること、及び
    (iv)該ペプチドを提供すること
    を含む方法。
  43. 医療に使用するための標的タンパク質又は標的核酸に結合するペプチドを製造する方法であって、
    (i)請求項1から41のいずれか一項に記載の方法を実施し、それによって、標的のタンパク質及び/又は核酸に結合するペプチドを同定又は決定することと、
    (ii)医療に使用するための治療薬又は予防薬の製造において該ペプチドを使用することと
    を含む方法。
  44. 虚血障害の治療のためのペプチドを決定する方法であって、請求項30から41のいずれか一項に記載の方法を実施し、それによって、c-Junに結合するペプチドを同定し、それによって、該虚血障害の治療のためのペプチドを同定することを含む方法。
  45. 虚血障害の治療のためのペプチドを提供する方法であって、
    (i)請求項30から41のいずれか一項に記載の方法を実施し、それによって、c-Junに結合するペプチドを同定し、それによって、虚血障害の治療のためのペプチドを同定すること、
    (ii)場合により、該ペプチドの量を決定すること、
    (iii)場合により、該ペプチドの名称又は構造を提供すること、及び
    (iv)該ペプチドを提供すること
    を含む方法。
  46. 虚血障害の治療のための医薬の製造方法であって、
    (i)請求項30から41のいずれか一項に記載の方法を実施し、それによって、c-Junに結合するペプチドを同定し、それによって、虚血障害の治療のためのペプチドを同定すること、及び
    (ii)虚血障害の治療のための医薬の製造において該ペプチドを使用すること
    を含む方法。
  47. 虚血障害の治療用のペプチドであって、ロイシンジッパー様ドメインを含むペプチド。
  48. ロイシンジッパー様ドメインが、最大6〜12残基分の間隔で離れている複数のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びその混合物からなる群から選択される、請求項47に記載のペプチド。
  49. アミノ酸残基が、6〜7アミノ酸残基分の間隔で離れている、請求項48に記載のペプチド。
  50. 前記複数のアミノ酸残基が、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びその混合物からなる群から選択される少なくとも6アミノ酸残基を含む、請求項48又は49に記載のペプチド。
  51. アミノ酸残基に疎水性アミノ酸が散在している、請求項48から50のいずれか一項に記載のペプチド。
  52. 各疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンからなる群から選択される1種又は複数のアミノ酸残基のアミノ酸3個又は4個以内にある、請求項51に記載のペプチド。
  53. 前記ペプチドが、酸性ドメインを更に含む、請求項47から52のいずれか一項に記載のペプチド。
  54. 酸性ドメインが、4個以上のアルギニン残基を含む、請求項53に記載のペプチド。
  55. 請求項47から52のいずれか一項に記載のペプチドの類縁体。
  56. Dアミノ酸を含む、請求項55に記載の類縁体。
  57. 配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号110、配列番号112、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178及び配列番号180からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、単離又は組換えペプチド。
  58. 配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号109、配列番号111、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177及び配列番号179からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、単離又は組換えペプチド。
  59. 請求項57又は58に記載のペプチドの類縁体。
  60. Dアミノ酸を含む、請求項59に記載の類縁体。
  61. 配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号109、配列番号111、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177及び配列番号179からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
  62. 請求項47から54、57又は58のいずれか一項に記載のペプチド、あるいは請求項55、56、59又は60のいずれか一項に記載の類縁体を含む医薬組成物。
  63. 配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178及び配列番号180からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む医薬組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  64. 配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178及び配列番号180からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むペプチドの類縁体、又は該類縁体を含む医薬組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法であって、該ペプチド類縁体中のアミノ酸がDアミノ酸である方法。
  65. 配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177及び配列番号179からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるペプチド、又は該ペプチドを含む医薬組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  66. 対象が虚血に罹患中であるか、罹患したことがある、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。
  67. 対象が、虚血事象後の再潅流傷害を受ける危険に瀕している、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。
  68. 虚血が発作を含む、請求項63から67のいずれか一項に記載の方法。
  69. 配列番号134に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  70. 配列番号132に示したアミノ酸配列を含むペプチドの類縁体、又は該類縁体を含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法であって、前記類縁体中のグリシン以外のアミノ酸がDアミノ酸である方法。
  71. 配列番号136に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  72. 配列番号136に示したアミノ酸配列を含むペプチドの類縁体、又は該類縁体を含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法であって、前記類縁体中のグリシン以外のアミノ酸がDアミノ酸である方法。
  73. 配列番号130に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  74. 配列番号130に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  75. 配列番号158に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  76. 配列番号160に示したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含む組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  77. 請求項47から54、57又は58のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項55、56、59又は60のいずれか一項に記載の類縁体、又は請求項62に記載の医薬組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  78. 請求項47から54、57又は58のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸、又は前記核酸を含む医薬組成物を治療の必要な対象に投与することを含む、虚血を治療する方法。
  79. 前記のペプチド、類縁体、核酸又は医薬組成物を、静脈投与、くも膜下腔投与、動脈内投与、頭骨切開後の局所投与、及びその組み合わせからなる群から選択される方法によって対象に投与する、請求項63から78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 請求項47から54、57又は58のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項55、56、59又は60のいずれか一項に記載の類縁体の医療における使用。
  81. 請求項47から54、57又は58のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸の医療における使用。
  82. 配列番号182に示したアミノ酸配列を含むペプチド類縁体であって、該ペプチド類縁体中のグリシン以外のアミノ酸がDアミノ酸であるペプチド類縁体。
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