JP2008520734A - Ｐｆ４ファーマコフォア及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、ペプチド模倣体、及びＰＦ４活性を調節可能な他の化合物(例えば、インヒビター、アゴニスト又はアンタゴニスト)の同定に有用な、新規のＰＦ４ファーマコフォアを提供する。また、細胞において、ＰＦ４活性を調節する、突然変異ＰＦ４ポリペプチド配列も提供する。

Description

１．発明の分野
本発明は、一般的に、ＰＦ４活性を調節するための組成物と方法に係り、より詳細には、例えば血管新生、細胞増殖、細胞遊走及び免疫系プロセスのようなＰＦ４-媒介性プロセスを調節するための組成物と方法に関する。特に、本発明は、成熟野生型ヒトＰＦ４分子についてファーマコフォアの三次元構造をエミュレートしたファーマコフォア分子と、かかるファーマコフォア分子の突然変異体(mutants)又は変異体(variants)、並びにＰＦ４リガンドの構造と実質的に同一であるか、又はＰＦ４リガンドとは機能決定面において異なるファーマコフォア又はファーマコフォア様三次元構造を有し、ＰＦ４活性を調節可能な模倣化合物(例えば、ペプチド模倣体又は小分子)に関する。また本発明は、ＰＦ４活性を調節するかかる模倣化合物の使用方法、並びに小分子を含むさらなる模倣化合物を同定するためのスクリーニング方法にも関する。

２．発明の背景
ケモカイン類は、炎症反応の間、主として白血球遊走に影響を与える、構造的に関連した分泌型走化性ペプチドのスーパーファミリーである。それらの配列は類似しており、Ｎ末端の４-システインモチーフにより特徴付けられる。構造的には、全てのファミリーメンバーは、フレキシブルなＮ末端領域と、それに続くループ、次に３つの逆平行βストランド及び単一Ｃ末端αヘリックスを有する。ＣＸＣと命名されているケモカイン類の一サブクラスは、第１の２つのＮ末端システインの間に介在残基を含む。ＩＬ-８は最も良く特徴付けられているＣＸＣケモカインであるが、他のものは、Ｇｒｏ-α及びＧｒｏ-β、血小板因子-４(ＰＦ４)及びＩＬ-１０を含む。ＣＸＣケモカイン類は、Ｒが１−６の群から選択される整数を示すＣＸＣＲと命名されるレセプターを介してシグナル伝達する。全ての既知のＣＸＣＲは、７つの膜貫通スパンαヘリックスドメインを有するＧタンパク質共役型レセプターである。

ＣＸＣケモカイン類は、ヒトの急性及び慢性炎症性疾患、例えば関節炎、呼吸器疾患、及び動脈硬化、さらにはいくつかの急性疾患、例えばヘパリン誘発性血小板減少症に関与している。いくつかのＣＸＣケモカイン類は、血小板機能のアゴニスト及び好中球の刺激剤として機能する。最近、いくつかのケモカイン類は、内皮細胞遊走及び増殖を調節することが示されており、血管新生における役割が示唆されている(Murdochら, Cytokine 1999; 9: 704-712)。

ＣＸＣＬ４としても知られている血小板因子４(ＰＦ４)は、血小板から誘導されるケモカイン類のＣＸＣサブファミリーのメンバーである。好ましいＰＦ４アミノ酸配列は記載されており(例えば、Ponczら, Blood 1987, 69:219-223を参照)、GeneBankデータベース(受託番号P02776)から入手可能である。この完全長ＰＦ４アミノ酸配列は、ここでも図１Ａ(配列番号：３２)に示す。完全長ＰＦ４アミノ酸配列には、好ましくは配列番号：３２(図１Ａ)のアミノ酸残基１−３１を含むシグナルペプチド配列が含まれる。典型的には、シグナルペプチド配列は、ＰＦ４ポリペプチドが細胞により分泌される際に切断される。よって、本発明の好ましいＰＦ４ポリペプチドは、実際には、配列番号：３２(図１Ａ)のアミノ酸残基３２−１０１を含んでなる「成熟型」ＰＦ４ポリペプチドである。

他の「変異型」ＰＦ４ポリペプチドもまた知られている。例えば、ＰＦ４ｖａｒ１と称されている好ましい一変異体はGreenら(Mol. Cell. Biol. 1989, 9:1445-1451)により記載されており、GeneBankデータベース(受託番号P10720)から入手可能である。この完全長ＰＦ４ｖａｒ１配列は、図１Ｂ(配列番号：３３)にも示している。図１Ａ(配列番号：３２)に示されている野生型ＰＦ４(ＷＴＰＦ４)と同様、ＰＦ４ｖａｒ１には、好ましくはポリペプチドが細胞から分泌される際に典型的には切断される配列番号：３３(図１Ｂ)のアミノ酸残基１−３４を含むシグナルペプチド配列が含まれる。よって、好ましいＰＦ４ｖａｒ１ポリペプチドは、実際には、配列番号：３３(図１Ｂ)のアミノ酸残基３５−１０４を含んでなる「成熟型」ポリペプチドである。便宜上、図１Ａ及び１Ｂ(配列番号：３２−３３)に示されているＰＦ４ポリペプチドは、ここではそれぞれ野生型ＰＦ４(ＷＴＰＦ４)及びＰＦ４ｖａｒ１と言う。しかしながら、本発明は、主として成熟ＷＴＰＦ４配列(すなわち、配列番号：３２の残基３２−１０１)に関して(便宜上)記載しており、双方の配列が、好ましい自然に生じるＰＦ４ポリペプチドのポリペプチド配列を表すものと理解される。同様に、他のＰＦ４断片、例えば国際公開第９９／４１２８３号に記載されている断片、及び国際公開第０１／４６２１８号に記載されている関連ペプチドもまた知られている。

ＰＦ４は血小板凝集中に血小板から放出され、内皮細胞への好中球の付着を刺激し、ＴＮＦ等の同時刺激性サイトカイン類の存在下では、損傷に応答して好中球脱顆粒を誘導する(Kasperら, Blood 2003, 103:1602-1610)。さらに、ＰＦ４はヒトナチュラルキラー細胞を誘導して、強力な好中球化学誘引物質及び活性化因子である関連ＣＸＣＬ分子ＩＬ-８を合成し放出する(Martiら, J Leukoc Biol. 2002;72(3):590-7)。ＰＦ４はまた高い親和性でヘパリンと結合し、ＰＦ４、ヘパリン及びＩｇＧを含む免疫複合体を生成する。さらにこれらの複合体により、血小板上のＦｃγＲＩＩａレセプターへのＩｇＧ Ｆｃの結合を介して血小板の活性化を生じ、ヘパリンを受容した個体において血小板減少症及び／又は血栓症を生じせしめる。

最近、ＰＦ４は、活性化Ｔ細胞に直接結合し、それらの増殖並びにＩＦＮガンマの放出を阻害することが示されている(Fleischerら, J Immunol. 2002;169(2):770-7)。さらに、ＰＦ４のアミノ酸残基３４−５８を含んでなるペプチドは、マウスの造血前駆細胞の増殖を３０−４０％阻害した(Lecompte-Racletら, Biochemistry. 2000;39(31):9612-22)。この活性は、ＰＦ４の３４−５８位にあるαヘリックスモチーフに起因しており、５４−５６位のＤＬＱモチーフが前駆細胞に結合するようにする。ＰＦ４によるヒト白血病性／巨核球性細胞株の阻害も、ある種のＣ末端残基に依存性であった(残基１−２４及び１３−２４であり、残基１６−２４ではない)(Lebeurierら, J Lab Clin Med. 1996;127(2):179-85)。ＰＦ４阻害活性の抑止又は亢進は、１３−２４領域内の特定の残基での突然変異により改変させることができる。

ＰＦ４、特にアミノ残基４７−７０を含んでなるＣ末端断片の他の重要な阻害活性は、血管新生抑制活性である。ＰＦ４は線維芽細胞増殖因子２(ＦＧＦ２)に結合し血管内皮細胞へのＦＧＦ-２の結合を防止することにより、血管新生を阻害する(Hagedornら, FASEB J. 200;15(3):550-2)。ＰＦ４はまた血管内皮細胞成長因子、内皮細胞に対する分裂促進因子の結合を破壊し、よってその活性を阻害する(Gengriniovitchら, J. Biol. Chem. 1995;270(25):15059-65)。ＥＬＲ配列を含むＰＦ４の修飾Ｃ末端断片(又は関連する修飾モチーフＤＬＲ)は、未修飾のペプチドより数倍大きい血管新生抑制活性を有する(Hagedornら, Cancer Res. 2002;62(23):6884-90)。残基５２での単一アミノ酸残基突然変異(Ｃｙｓ５２Ｓｅｒ)は、全ての阻害活性を無効にした(上掲のHagedornら, 2001)。溶液中におけるＣ末端阻害断片の立体構造は決定されており、特定の１：１複合体でＦＧＦと相互作用する２つのヘリックスサブドメインからなることが見出されている。双方のサブドメインが、線維芽細胞成長因子誘導有糸分裂誘発の阻害に必要とされると思われる(Lozanoら, J. Biol. Chem. 2001;276(38):35723)。

最近、以前から知られているＣＸＣレセプターのスプライスバリアント、ＣＸＣＲ３が、高い親和性でＰＦ４と結合し、ＰＦ４に対する機能的レセプターとして作用することが示されている(Lasagniら, J. Exp. Med. 2003; 197: 1537-49)。ヒト微小血管内皮細胞株におけるＣＸＣＲ３-Ｂと命名されたこの変異体の過剰発現が、ＤＮＡ合成を減少させ、アポトーシスを増加させた。

ＰＦ４のＮＭＲ及び結晶構造は、分子がホモ四量体として存在していることを示している(Mayoら, Biochemistry. 1995;34(36):11399-409;及びZhangら, Biochemistry. 1994;33(27):8361-6)。上述したように、ＰＦ４の単量体形態における明白な構造的モチーフから、分子に特定の活性を付与する異なる残基が同定されている。しかしながら、当該分野では、ペプチド模倣体、並びにこれらのモチーフ内のアミノ酸残基上の官能基を模倣又は保存可能な小分子類似体、免疫応答及び血管新生の特定の調節因子としての使用に対する必要性がなお残っている。

蛍光標識されたヒト組換えＰＦ４を使用する研究では、その分子がインビボにおいて活性な血管新生の領域で優先的に結合することが示されているらしい。Hansellら, Am. J. Physiol. (1995) 269 (3 Pt 2):H829-836。これにより、ＰＦ４がある種の腫瘍、特に乳癌における血管新生のイメージングマーカーとして有用かもしれないという示唆に至る。Borgstromら(Anticancer Res. (1998) 18(6A):4035-4041)、及びMoyerら(J. Nucl. Med. (1996) 37(4):673-679)は、ＰＦ４のヘパリン-結合領域を含むと言われる^９９ｍＴｃ-標識ポリペプチドを使用することを記載している。MoyerらがＰ４８３Ｈと称しているこのペプチドは、インビボでの感染のハイコントラストな画像を提供すると言われている。しかしながら、血漿中において分子の半減期が短いことにより、造影剤としてのＰＦ４の有用性は限られている。よって、ＰＦ４の結合活性を模倣又は保存可能で、インビボにおける有用な造影剤となりうる、ペプチド模倣体及び小分子を含む分子が必要とされている。
このような分子の開発には、ＰＦ４及び／又はＰＦ４変異体(例えば、ＰＦ４ｖａｒ１)の全ファーマコフォア構造の解明と、与えられた活性に対して必須な官能基と必須でない官能基を厳密に同定することが必要となる。

このセクションと明細書全般にわたる文献の引用及び／又は考察は、本発明の説明を明確にするためだけに提供するものであり、そのようないずれの文献も、ここに記載される本発明の「先行技術」であることを自認するものではない。

３．発明の概要
ＰＦ４活性調節のための上述した必要性の一又は複数に応じて、本発明は、ＰＦ４アゴニストであり、あるいはＰＦ４インヒビターである新規なペプチド模倣体又は小分子等の新規化合物の同定にとりわけ有用な新規ファーマコフォアを提供する。特に、本発明は、以下の表１に記載の、ＰＦ４ポリペプチドにおける対応する官能基の配置と実質的に同一である形で三次元空間に配置されている(例えば図２Ａ−２Ｂを参照)少なくとも７、好ましくは１０の官能基を有するＰＦ４ファーマコフォアを提供するものである；但し、ファーマコフォアはＰＦ４それ自体でも先に論議した先行技術にある上述のいずれのペプチドでもない。

好ましい側面では、本発明は、ＰＦ４と相互作用する、及び／又はＰＦ４様又はＰＦ４拮抗活性を有する新規又は既存化合物を同定する方法を提供する。このような化合物にはペプチド模倣体及び小分子が含まれる。これらの方法に従って同定される物質は、設計(例えばインシリコ)し合成するか、あるいはそれらは、例えばインシリコでのスクリーニングにより既存化合物のライブラリーから選択することもできる。これらの方法に従って同定された物質は、アゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターとして、ＰＦ４活性を調節するであろう。ある実施態様では、これらの方法は、ＰＦ４ファーマコフォア(好ましくは、ここに実質的に記載されているＰＦ４ファーマコフォア)の三次元と、候補化合物の三次元構造を比較することを含む。これらの方法に従ってスクリーニング可能な多くの化合物の三次元構造は既に解明されており、例えば公に入手可能なデータベース又は他の入手源から得ることができる。あるいは、候補化合物の三次元構造が解明されていない場合、その構造はしばしば常套的な技術(例えば、Ｘ線回折又はＮＭＲ分光法)を使用して決定することができる。これらの三次元構造間の類似性と付随する分子内特性(例えば、プロトン供与体又は受容体として水素結合を形成する特性、疎水性相互作用、スルフィド結合形成特性、及び静電相互作用)により、候補化合物がＰＦ４活性を調節する化合物であることが予測される。特に、２つの三次元の間の二乗平均平方根偏差(ＲＭＳＤ)は、好ましくは約１．０を越えない。また、予め選択された化合物が、ファーマコフォア分子の存在下、又は天然ＰＦ４の存在下で、所望の活性を有しているかどうかについて試験することもでき、後者はインビトロ又はインビボである。あるいは、ＰＦ４ファーマコフォアを示すＰＦ４模倣体は、あるならばＰＦ４調節活性を有している化合物のインビトロスクリーニングライブラリにおいてＰＦ４の「代用(stand-in)」となりうる。

他の実施態様では、本発明は、細胞中でＰＦ４活性を調節(亢進又は妨害)する突然変異ＰＦ４ポリペプチドであってよいＰＦ４模倣体を提供する。本発明の突然変異ＰＦ４ポリペプチドは、好ましくは、図１Ｃ(配列番号：１)に記載の成熟ＰＦ４アミノ酸配列、又は本発明のファーマコフォアを形成する１１の主要残基中に一又は複数のアミノ酸置換を有する少なくとも５から２３残基を含むその断片を含む。例えば、限定するものではないが、野生型ＰＦ４(ＷＴＰＦ４)及びその変異体(例えばＰＦ４ｖａｒ１)は、そのリジンアミノ酸を介してヘパラン硫酸と相互作用することが理解されている。この主な経路において、ＰＦ４は、内皮細胞の表面と相互作用することにより血管新生抑制剤として作用する。よって、一実施態様では、アミノ酸置換は、例えばアミノ酸置換Ｌｙｓ６１→Ｇｌｎ、Ｌｙｓ６２→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ６５→Ｇｌｎ及び／又はＬｙｓ６６→Ｇｌｕ等、ヘパラン硫酸へのＰＦ４の結合性に影響を及ぼすファーマコフォア上の少なくとも一の置換を含む。ヘパラン硫酸結合は、保存、減少又は増加させることができる。この実施態様の特に好ましい例は、以下に詳細に記載するものであり、以下の実施例(特に以下の表３−４を参照)に記載され、ここではＰＦ４-Ｍ１(配列番号：２)と称している突然変異体を含む。

ＰＦ４突然変異体の他の実施態様では、アミノ酸置換には、ＤＬＱ配列モチーフにおける置換、例えば一又は複数のアミノ酸置換Ｇｌｎ９→Ａｒｇ、Ｇｌｎ９→Ａｌａ及びＡｓｐ７→Ａｌａが含まれる。他の好ましいアミノ酸置換には、一又は複数のＬｅｕ１１→Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３→Ｇｌｎ、Ｔｈｒ１６→Ａｌａ、Ｇｌｎ１８→Ａｌａ、Ｖａｌ１９→Ｓｅｒ及びＨｉｓ２３→Ａｌａが含まれる。これらのＰＦ４突然変異体の模倣体も、元々の及び変異した主要残基(その修飾を含む)の三次元構造及び分子内特性が保存されている限り、また本発明内にあることを記しておくべきである。また、三次元構造が保存されている限り、ＰＦ４突然変異体又はその模倣体の主要残基間に存在するリンカー構造にかなりの自由度がある。例えば、本発明は、その範囲内において、上述した主要残基置換のいずれかに加えて、一又は複数のアミノ酸の付加又は欠失を含む突然変異ＰＦ４ポリペプチドをさらに提供する。本発明の好ましい突然変異ＰＦ４アミノ酸配列は、配列番号：２−３０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。また、以下の表３を参照。

ファーマコフォアのバリデーションに使用される突然変異体は、このような突然変異誘発の点が、活性に重要であると考えられている一又は複数の残基を、活性に重要ではないと考えられている他の残基で置き換えるものであるので（すなわち、このような残基の置き換えにより、活性が無効又は調節されると予想される)、活性ではない。突然変異体が野生型分子と比較して全ての(それともいくつかの)生物活性が奪われているならば、このことは、残基が生物活性にとって重要であり、ファーマコフォアの定義に含まれるべきであることを意味している。

また変異の種類も重要である。例えば、双方が典型的には同じタイプの相互作用に至るため、親水性残基を疎水性のもの(例えばアラニン)で置き換えることは、有益ではない場合もある。突然変異のために選択される残基の環境もまた重要である。例えば、隣接残基が、突然変異により強要又は解放される制約を(例えば立体構造変化により)補償するために、変異が誤ったポジティブな又はネガティブな結果をもたらすおそれがある。これは結果の誤った解釈に至るおそれがある。さらに変異の種類は、ＩＬ８に対してのＰＦ４の活性のシフトを回避するように選択されるのが好ましい。さもないと、得られる突然変異体はＩＬ-８様特性を有しうる。

突然変異体は興味ある生物活性を有していないため、ここに記載されるバリデーション突然変異体の座標は重要ではない。ＰＦ４の模倣体は、ファーマコフォアを用いて容易に決定することができる。「候補模倣体」がファーマコフォアに合致する(すなわち、三次元的に重なり合う)ならば、それは本物の模倣体である。候補剤がファーマコフォアの一部のみを含むならば、それは、タンパク質標的と結合し、ＰＦ４と競合可能であるが、標的を活性化させることはできないアンタゴニストでありうる。少なくとも一のこのような模倣体が本発明で提供され、以下に詳細に検討される。

好ましい実施態様では、本発明は、例えばＰＦ４アゴニスト及び／又はアンタゴニストとして、ＰＦ４活性を調節する新規な物質を提供する。例えば、本発明は、次の化学式：

を有する化合物を提供する。

本発明で提供されるさらなる他の化合物は、図８及び９Ａ−９Ｂに示されている式ＩＩからＶＩＩＩに記載されている。さらに、例えば本発明のＰＦ４アゴニスト及び／又はアンタゴニストとして使用可能なペプチドベースの化合物が提供される。これらには、Ｐ３４−５６(配列番号：１５７)、Ｐ３７−５６(配列番号：１５８)、Ｐ３４−５３(配列番号：１５９)及びＰ３５−５３(配列番号：１６０)と以下の実施例において呼ばれているペプチドが含まれる。特に好ましいＰＦ４アゴニストは、ペプチド部分Ｐ３４−５６(配列番号：１５７)であるが、ペプチド部分Ｐ３４−５３(配列番号：１５９)が特に好ましいＰＦ４アンタゴニストである。

他の実施態様では、本発明は、ＰＦ４レセプター等の、ＰＦ４結合部位を検出するのに有用な検出可能マーカーを提供する。これらの検出可能マーカーは、一般には、そこに結合する検出可能標識を有する本発明のＰＦ４アンタゴニストを含む。一般的に言えば、これらの検出可能マーカーは、(ａ)個体に検出可能マーカーを投与し；(ｂ)個体における検出可能マーカーの存在を検出することにより、(例えばＭＲＩ等の医療用映像技術等)個体におけるＰＦ４結合部位を検出するために使用することができる。以前の報告では、ＰＦ４が、個体の感染及び／又は血管新生の部位に好ましくは結合し、乳癌等のある種の腫瘍を検出するのに使用可能であることが示されている。よって、この発明の方法は、個体における感染及び／又は血管新生の部位を検出するために使用することもできる。
本発明のこれらの及び他の側面については、以下のセクションにおいて詳細に記載する。

５．詳細な説明
本発明は、血小板因子４すなわち「ＰＦ４」とここで呼ばれるサイトカインに対するファーマコフォア分子に関する。また、ＰＦ４サイトカインは、ＣＸＣＬ４としても知られている。ＰＦ４アミノ酸配列は過去に開示されている(例えば、Deuelら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977, 74:2256-2258; Walzら, Thromb. Res. 1977, 11:893-898; 及びPonczら, Blood 1987, 69:219-223を参照)。配列はまた例えば受託番号P02776(GI No.130304)でGenBankデータベースからも入手可能である(Bensonら, Nucleic Acids Research 2003, 31:23-27)。

便宜上、本発明は、こでは主として、そのアミノ酸配列が図１Ｃ(配列番号：１)に記載されている成熟ＰＦ４ポリペプチドに関して記載している。この成熟ＰＦ４ポリペプチドは、ここでは成熟野生型ＰＦ４すなわち「ＷＴＰＦ４」とも言う。またＰＦ４変異体も本発明で使用することができる。例えば、ここでＰＦ４ｖａｒ１と称される既知の好ましい一変異体の完全長アミノ酸配列を図１Ｂ(配列番号：３３)に示す。好ましくは、本発明で使用されるＰＦ４ポリペプチドは「成熟」ＰＦ４ポリペプチドである。よって、変異ＰＦ４ポリペプチド、例えばＰＦ４ｖａｒ１を使用する実施態様では、ポリペプチドは、好ましくはシグナルペプチド配列(例えば、配列番号：３３のアミノ酸残基１−３４)を含まないが、成熟ポリペプチドのアミノ酸残基(例えば、配列番号：３３の残基３５−１０４)を含む。一般に、変異ＰＦ４とＷＴＰＦ４(配列番号：１)の成熟配列間のアミノ酸配列同一性のレベルは高く、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０又は９５％である。また、(以下の実施例で記載されているＰＦ４「突然変異体」とは異なり)変異体と野生型ＰＦ４配列との間の如何なる差も、好ましくはファーマコフォアの如何なるポイントも修飾しない。種々のＰＦ４ポリペプチド配列を整列させ、互いの配列同一性のレベルを、種々の既知の配列アラインメントアルゴリズム、例えばBLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等の任意のものを使用して決定できる。

ＷＴＰＦ４の場合、完全長ＰＦ４サイトカイン(配列番号：３２)は、１０１のアミノ酸残基のポリペプチド鎖として表される。この「完全長」ＰＦ４アミノ酸配列の最初の３１アミノ酸残基は、一般的に「シグナル配列ドメイン」と称されるドメインに相当する一方、残りのアミノ酸残基(すなわち、配列番号：３２の残基３２−１０１)は、一般に「成熟」ＰＦ４アミノ酸配列と称されるものに相当する。プロセシングの際、ＰＦ４シグナル配列ドメインが切断されて、ＰＦ４サイトカイン活性を示す「成熟」ＰＦ４ポリペプチドが細胞によって分泌される。よって、本発明のファーマコフォア分子は、成熟ＰＦ４のファーマコフォア構造を含む。便宜上、成熟野生型ヒトＰＦ４アミノ酸配列は、図１Ｃ(配列番号：１)に提供される。しかしながら、上に説明したように、この配列の変異体も、本発明で使用することができる。一つのそのような変異体、ＰＦ４ｖａｒ１の完全長配列は、図１Ｂ(配列番号：３３)に提供されており、そのアミノ酸残基１−３４がシグナル配列に相当する。よって、好ましい成熟、変異ＰＦ４ポリペプチドは、図１Ｂ(配列番号：３３)に示されているＰＦ４ｖａｒ１配列のアミノ酸残基３５−１０４の配列を含む。

また、ＰＦ４の三次元構造は、Ｘ線結晶学(Zhangら, Biochemistry 1994, 33:8361-8366) 及びＮＭＲ分光法(Mayoら, Biochemistry 1995, 34:11399-11409)により決定することができる。これらの構造の座標は、それぞれ受託番号1RHP及び1PFMでProtein Data Bank (Bermanら, Nucleic Acids Research 2000, 28:235-242)から入手可能である。便宜上、成熟ヒトＰＦ４に対する好ましい三次元構造からの座標リストは、以下に、アペンディクスとして、ＰＤＢファイル形式にて、ここに提供する。

５．１．ＰＦ４ファーマコフォア
本発明を記述するために使用される「ファーマコフォア」なる用語は、特定の三次元立体配置における(例えば原子等の)特定の一群の官能基を有する化合物又は分子を意味する。より詳細には、ファーマコフォアなる用語は、(ここでは「プロトタイプ」タンパク質又は化合物と呼ばれる)関心あるタンパク質又は他の化合物におけるそれらの三次元配置と実質的に同一である三次元立体配置でこの官能基群を有する化合物を意味する。本発明は、プロトタイプタンパク質ＰＦ４に関する。よって、本発明のファーマコフォアは、好ましくは、ＰＦ４におけるそれらの三次元配置と実質的に同一の三次元立体配置にある官能基群を有する。例えば、ファーマコフォアと関心ある原型化合物の官能基間のＲＭＳＤは、例えばQUANTA(Molecular Simulations, Inc., San Diego, Californiaから入手可能)等の分子モデリングプログラム内のMolecular Similarityモジュールを使用して算出した場合、好ましくは約１オングストローム以下であるべきである。

好ましいファーマコフォアは、例えばＸ線結晶学又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法により実験的に決定される関心あるタンパク質(好ましくはタンパク質の成熟又は活性型)又は他のプロトタイプ化合物の三次元構造から誘導される。しかしながら、適切なファーマコフォアは、関連化合物の構造に基づく相同性モデル、又は三次元構造-活性関係性から誘導することもできる。例えば、本発明の好ましいファーマコフォアは、ＰＦ４ポリペプチドにおける点突然変異を分析し、その突然変異がＰＦ４活性について有する効果を評価することにより得られる。ついで、適切なＰＦ４ファーマコフォアは、例えば、成熟ＰＦ４の三次元相同モデルにこのような変異の影響を相関させることにより、推定又は誘導することができる。

本発明の好ましい実施態様では、ＰＦ４アンタゴニストは、ＰＦ４レセプター分子、又は他のＰＦ４結合部位を検出するために使用することができる。このようなＰＦ４結合部位の検出の有用性当該分野でよく知られている。例えばMoyerら(J. Nucl. Med. (1996) 37(4):673-679)は、ＰＦ４のヘパリン結合ドメインを含むと言われている彼らがＰ４８３Ｈと呼ぶポリペプチドを記載している。このポリペプチドの^９９ｍＴｃ標識型はインビボでの感染のハイコントラストな画像を提供すると言われている。他には、ある種の腫瘍−特に乳癌における血管新生のイメージングマーカーとしてＰＦ４が有用かもしれないと示唆されている。Borgstromら, Anticancer Res. (1998) 18(6A):4035-4041。

従って、本発明は、ＰＦ４結合分子(例えば、ＰＦ４レセプター分子)及びＰＦ４結合を検出するために使用可能な検出可能マーカーを提供する。このような検出可能マーカーは、一般的には、検出可能標識がそれに結合したＰＦ４アンタゴニストを含む。ＰＦ４アンタゴニストは、レセプターを活性化させることなく、さもなければＰＦ４媒介性活性を誘発することなく、ＰＦ４レセプター又は結合部位に結合する任意の化合物でありうる。小分子アンタゴニストの一例を図９Ａに示す一方、図９Ｂは、アンタゴニストが、例えば磁気共鳴映像法用の造影剤として、そこに結合した検出可能標識を有する例示的な実施態様を示す。

図９Ａ−９Ｂは、ＰＦ４アンタゴニストが小分子である任意の実施態様を示しているが、ペプチド、ポリペプチド又はペプチド模倣体であるＰＦ４アンタゴニストも、これらの方法において使用することができる。よって、本発明は、ＰＦ４アンタゴニストとして、配列番号：２−３０に記載のＰＦ４ポリペプチドのいずれか、又は国際公開第９９／４１２８３号及び国際公開第０１／４６２１８号に記載されたＰＦ４ペプチドのいずれかを含む検出可能マーカーも含む。これらには、以下に記載する配列番号：３４−１５６に記載のペプチドのいずれかを含む。さらなる他のＰＦ４アンタゴニストペプチドは、Ｐ３５−５３と命名されたペプチド(配列番号：１５９)を含み、以下の実施例において提供される。

ＰＦ４アンタゴニスト部分は、当業者にとってよく知られまた常套的な任意の技術に従い、検出可能標識に容易に結合させることができる。好ましい実施態様では、検出可能マーカーは、例えば医療診断又はイメージングアッセイ、特に磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)又はコンピュータ断層撮影(ＣＡＴ)等において、インビボでのＰＦ４結合部位を検出するのに使用される。ＰＦ４アンタゴニストは、金属、放射性同位体、及び放射線不透性剤(例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素、及びリン-含有化合物)、放射線透過性剤、造影剤、染料(例えば、蛍光染料及び発色団)、及び熱量測定又は蛍光定量反応を触媒する酵素を含む、このような使用のための様々な造影剤又は検出剤の任意のものに結合させうる。一般的に、このような薬剤は、当該分野で知られている様々な技術の任意のものを使用して任意の配向で付着させることができる。例えば、米国特許第５３３０７４２号；同第５３８４１０８号；同第５６１８５１３号；同第５８０４１５７号；同第５９５２４６４号；及び同第６７９７２５５号を参照のこと。一又は複数の水溶性ポリマー部分、例えばポリ-エチレングリコールすなわち「ＰＥＧ」をまた例えば検出可能マーカーの溶解度及び／又は生物学的利用能を高めるためにＰＦ４アンタゴニストに結合させることもできる。

上述したように、このような検出可能マーカーは、個体においてＰＦ４レセプターの存在を含むＰＦ４結合部位の存在を検出又は同定するために使用することができる。一般的に、このような方法は、個体に検出可能マーカーを投与し、例えば検出可能標識の存在を検出することにより、その存在を検出する工程を含む。過去の報告では、ＰＦ４が、個体における血管新生及び／又は感染の部位に好ましくは結合するであろうことが示されている。よって、これらの方法は、個体における血管新生及び／又は感染の部位を検出するのにも使用することができる。血管新生の検出方法は、特に個体における腫瘍又は他の癌の部位を検出するのに有用である。

好ましい実施態様では、これらの方法では、既知の医療画像法、例えば磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)を使用してＰＦ４結合部位を検出する。しかしながら、本方法は、検出可能標識の存在を検出するための、当業者が利用できる任意の技術を使用して実施することができる。例えば、本方法は、例えば検出可能標識用の蛍光部分を使用し、インシトゥーで(例えば、個体からの組織サンプルにおいて)検出可能標識の存在を検出することによっても実施することができる。

本発明のファーマコフォアは、(インビトロ又はインビボのいずれかで)細胞におけるＰＦ４活性を調節するペプチド模倣体又は小分子(すなわち、好ましくは約２ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約１ｋＤａ未満の分子量の有機又は無機分子)等の化合物を同定するのに特に有用である。例えば、ある種の実施態様で、本発明のファーマコフォアは、例えばＰＦ４レセプターに結合することにより、ＰＦ４の天然活性を模倣する化合物を同定するのに使用することができる。ＰＦ４活性を増加又は亢進させることができるこのような化合物は、ここではＰＦ４「アゴニスト」又は「アゴニスト化合物」と呼ぶ。他の実施態様では、本発明のファーマコフォアは、例えばＰＦ４レセプターへの結合について、ＰＦ４と競合するがそれら自身では何のＰＦ４活性も生じない化合物を同定するのに使用することができる。よって、このような化合物は、ＰＦ４活性を効果的に阻害又は低減させ、ここではＰＦ４「アンタゴニスト」又は「アンタゴニスト化合物」と呼ばれる。

本発明のファーマコフォア分子は、分子がＰＦ４活性に必要な独特な官能基又はエレメントから本質的になるが、そのような活性に影響を与えない官能基又はエレメントがあるとしてもごくわずかな場合に、一般的にはより効果的であり、よって、好ましい。しかして、このようなファーマコフォアにより、候補化合物とファーマコフォアとの間で比較されなければならない官能基の数が大きく低減されるため、ＰＦ４アゴニスト及びアンタゴニストの探索が簡略化される。従って、本発明は、好ましい実施態様において、少なくとも７で１０を越えない官能基、又は上述した空間的関係を有する「ファーマコフォアポイント」から本質的になるＰＦ４ファーマコフォアを提供する。好ましいファーマコフォアポイントは与えられた数であり、以下の表１に記載する。これらのポイントの各々は、図１(配列番号：１)に記載する成熟ＰＦ４ポリペプチド配列中の特定のアミノ酸側鎖に対応する。より詳細には、各ポイントは、その配列のアミノ酸側鎖上の特定の独特の原子又は官能基に対応する。従って、表１のファーマコフォアポイントは、それらが位置している箇所のアミノ酸残基と、その残基側鎖の特定の原子又は官能基の双方を特定することにより示される。表１に列挙される１０の官能基の７つが血管新生抑制活性に必須である。血管新生抑制活性に必須の７つの官能基は、ＰＦ４のＮ末端近傍のＤＬＱ(Ａｓｐ７-Ｌｅｕ８-Ｇｌｎ９)モチーフに対応するファーマコフォアポイントＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶＩＩＩ、及びＬｅｕ１１及びＶａｌ１３の疎水性中心に対応するファーマコフォアポイントＩＸ及びＸを含む。血管新生抑制活性のために必須ではないが好ましい官能基は、Ｇｌｎ１８及びＨｉｓ２３に対応するファーマコフォアポイントＶ、ＶＩ及びＶＩＩを含む。これらの後者のポイントが、他の点でファーマコフォアに一致する化合物から除外された場合、化合物は内皮細胞に結合するが、それらの細胞を活性化させない。

一貫性を保つため、表１中の原子及び官能基は、以下のアペンディクスに記載するＰＤＢファイルで使用したものと同一の表記を使用する。

図２Ａ及び２Ｂは、成熟ＰＦ４自体上のファーマコフォアポイントを示している。特に、図２Ａには、以下のアペンディクスに記載の座標に基づき、成熟ＰＦ４ポリペプチド骨格の例示的三次元構造が示されている。ＰＦ４の官能基を含むアミノ酸残基は、ファーマコフォアの各官能基が円で囲まれ、上述の表１の対応するローマ数字で標識されて示されている。図２Ｂには、特定の官能基に対応する各ポイントを有するＰＦ４ファーマコフォア構造が示されている。これらの官能基間の距離は、図２Ｂにおける種々の官能基の間に引かれた線により示されている。これらの距離は、例えば以下のアペンディクスに記載の座標等、成熟ＰＦ４の三次元構造における対応する官能基間の距離を測定又は算出することにより、使用者によって容易に決定し評価されうる。便宜上、これらの官能基間の好ましい距離をまた以下の表２に記載する。

好ましくは、本発明のファーマコフォアは、ファーマコフォアの各ポイントが三次元空間におけるその位置を表す及び／又は示す少なくとも３座標のセットにより記載されている座標系を使用して記述される。このようにして、ファーマコフォアの主要なポイントの配置は、(例えば、以下に記載するINSIGHT II等の、分子構造をモデリングするための様々なプログラム及びアルゴリズムを使用することにより)容易にモデル化及び／又は可視化することができる。またファーマコフォアの座標は、ペプチド模倣体又は他の候補化合物におけるポイントを用い、以下に記載するようにして、ファーマコフォア構造を比較するために容易に使用することもできる。

さらなるパラメータを、個々のファーマコフォアポイントの他の特性を記述するために使用することもできるし、使用するのが好ましい。水素結合のドナー又はアクセプターであるファーマコフォアポイントの場合には、これらには、水素結合の好ましい方向、配向、大きさ及び／又は距離を示すパラメータを含めることができる。使用可能な他のパラメータには、疎水性ファーマコフォアポイントに対しては、好ましい疎水性相互作用の大きさ(例えば距離又は体積)を示すパラメータが含まれる。

特に好ましい座標系と好ましいＰＦ４ファーマコフォアを記述するためのその使用についての例は、以下の実施例６．２．５に示している。この系では、各ファーマコフォアポイントの位置を示すためにデカルト又は球座標のいずれかを使用することができる。当業者であれば、与えられた点のデカルト座標を、実施例にまた示されている２つの座標系間のよく知られた数学的関係を使用し、球座標のセットに、またその逆にも、容易に変換できることが分かるであろう。水素結合の好ましい大きさ及び配向を記述するため、実施例には、各水素結合のドナー及びアクセプターに対して、好ましい水素結合の方向を指す水素結合ベクトルＡの座標が提供されている。好ましい水素結合ポテンシャルの表面積Ｓも、ファーマコフォアにおける各水素結合ドナー及びアクセプターについて提供されている。このパラメータは、水素結合の形成が好ましい面に対応する水素結合ベクトルＡの周囲の球形キャップの表面を定める。各疎水性ファーマコフォアポイントについて、実施例には、所望されない相互作用(例えば、親水性又は極性残基、又は極性溶媒との相互作用)を回避すべきであるファーマコフォアポイントに最も近い距離にあるポイントを示すポイントｍが提供されている。

５．２．ペプチド模倣体
上述したように、本発明のＰＦ４ファーマコフォアは、ＰＦ４活性のアゴニスト及び／又はアンタゴニストであるペプチド模倣体及び他の化合物として特に有用である。従って、本発明は、ＰＦ４活性のアゴニスト又はアンタゴニストであるペプチド模倣体を提供する。
ペプチド模倣体は、例えばGourらの国際公開第０１／５３３１Ａ２号に一般的に記載されている。このような化合物は、例えば、成熟ＰＦ４ファーマコフォアにおける官能基の立体配置と立体配置が実質的に同様なファーマコフォアポイントを含むＰＦ４アミノ酸配列(又はその類似体)の一部を含むペプチド及びペプチド類似体でありうる。しかしながら、ペプチド模倣体における一又は複数のファーマコフォアポイントは、例えば特定のファーマコフォアポイントを示すアミノ酸残基を置き換えることにより、ＰＦ４活性に影響を与えるように修飾することができる(アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして)。あるいは、ペプチド模倣体の少なくとも一部は、ファーマコフォアにおける官能基の三次元構造が少なくとも部分的に保持されるように、一又は複数の非ペプチド構造に置き換えることができる。換言すれば、ＰＦ４ペプチド内の１、２、３又はそれ以上のアミノ酸残基が非ペプチド構造で置き換えられてもよい。さらに、少なくとも一の主要アミノ酸残基は、異なる特徴(例えば、疎水性、親水性、プロトンドナー又はアクセプター特性、静電特性等の異なる性質)を有する他のものによって置き換えられることもできる。また、ペプチド又はペプチド模倣体の他の部分も、非ペプチド構造で置き換えることができる。

典型的には、ペプチド模倣体(ペプチド及び非-ペプチジル類似体の双方)は、ＰＦ４ペプチドよりも、それらを製薬用組成物にさらに適切なようにする改善された特性(例えばタンパク質分解性の低減、保持率の増加、又は生物学的利用能の増加)を有し得る。また、ペプチド模倣体は、改善された経口的有用性も有し得る。本発明のペプチド模倣体は、類似した二次元構造、例えば配列及び構造式を有していても有していなくてもよい。しかしながら、同じ活性を有する本発明の全てのペプチド模倣体は、互いに共通した三次元構造及び幾何性を共有しており、全てが、天然ヒトＰＦ４のファーマコフォアの三次元構造に近いであろう。本発明の各ペプチド模倣体は、一又は複数の独特の付加的結合エレメントをさらに有していてもよい。本発明は、ペプチド模倣体を同定するための方法(以下に記載)を提供する。

ここで提供される全てのペプチド模倣体は、上述した天然分子上に示されたファーマコフォアの三次元構造に実質的に類似した三次元構造を有する。一般的に、化合物の三次元は、２つの構造が、例えばQUANTAプログラムを用いたMolecular Similarityモジュール(Accelrys, Inc., San Diego, Californiaから入手可能なINSIGHT IIプログラムのバイオポリマーモジュール)を使用して、又は当業者に利用されている他の分子モデリングプログラム及びアルゴリズムを使用して算出した場合に、約１オングストローム以下のＲＭＳＤを有するならば、ファーマコフォアの三次元構造に実質的に類似していると考えられる。好ましい実施態様では、本発明の化合物は、約１．０オングストローム以下のＲＭＳＤを有する。本発明の化合物は、より好ましくは０．５オングストローム、さらに好ましくは約０．１オングストローム以下のＲＭＳＤを有する。特に、本発明のペプチド模倣体は、ＰＦ４ファーマコフォアの三次元構造に実質的に類似した又は類似していると予測される(例えば、アブイニシオモデリングによる)少なくとも一の低エネルギー三次元構造を有しているであろう。

低エネルギー立体構造は、例えばCHARMMプログラム(Brooksら, J. Comput. Chem. 1983, 4:187-217)を使用し、立体構造エネルギーを算出することにより同定することができる。エネルギーなる用語は、結合距離エネルギーを含む、結合及び非結合の用語を含む。また、化合物の立体構造エネルギーは、様々な他の商業的に入手可能な量子力学又は分子力学プログラムの任意のものを使用して算出可能であることは明らかである。一般的に、低エネルギー構造は、全エネルギー最小値の５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内である立体構造エネルギーを有する。

例として、限定するものではないが、低エネルギー立体構造は、２つの手順の組合せを使用して同定することができる。第１の手順は、シミュレーションアニーリング分子動力学的アプローチに関連している。この手順において、(設計されたペプチド模倣体と水の分子を含む)系を室温以上、好ましくは約６００ケルビン度(すなわち６００Ｋ)まで加熱し、約５０〜１００ｐｓ(例えば７０ｐｓ)又はそれ以上の期間、シミュレートした。徐々に系の温度を、例えば約５００Ｋまで低下させて、約１００ｐｓ又はそれ以上の期間シミュレートし、さらに徐々に４００Ｋまで低下させて、１００ｐｓ又はそれ以上の期間シミュレートする。ついで、系の温度を再度約３００Ｋまで低下させ、約５００ｐｓ又はそれ以上の期間シミュレートする。この解析中、原子軌道を記録する。このようなシミュレーションアニーリング手順は当該分野でよく知られており、タンパク質又は他の化合物の立体配座「空間」を効果的に探査する能力のために、特に有利である。すなわち、この手順を使用すると、化合物に対して多種多様の考えられる立体構造をサンプリングし、最も低いエネルギーを有する立体構造を迅速に同定することができる。

第２の手順は、Wu & Wang, J. Physical Chem. 1998, 102:7238-7250により記載されているような、自己誘導式分子動力学(ＳＧＭＤ)の使用を含む。ＳＧＭＤ法は、極めて高められた立体構造探査能力を有することが証明されている。よって、ＳＧＭＤ法を使用すると、３００Ｋで、１０００ｐｓ又はそれ以上でシミュレーションが実施されてよく、解析のために原子軌道が記録される。

また、ペプチド模倣体及び他の化合物の立体構造分析は、INSIGHT II分子モデリングパッケージを使用して実施することもできる。まず、(上述したような)分子動力学的シミュレーションから生じた軌道を使用し、クラスター解析を実施することができる。各クラスターから、このクラスターの代表的な立体構造として、最も低いエネルギーの立体構造を選択し、他の立体構造クラスターと比較することができる。クラスター解析では、主要な立体構造クラスターを同定し、環状ペプチド(類)の解構造と比較することができる。
特に、ペプチド模倣体又は他のアゴニスト／アンタゴニスト化合物は、例えば、CATALYST.TM. (Molecular Simulations, Inc., San Diego, Calif)で実施されているように、当業者によく知られている計算方法を使用し、ファーマコフォアモデルに最適に重ね合わされる。構造とファーマコフォアモデルの重ね合わせは、分子とファーマコフォアの対応する特徴の重心間の二乗平均平方根距離の最小化として定められる。次に、CERIUS^２ .TM (Molecular Simulations, Inca, San Diego, Calif.)等のコンピュータプログラムを使用し、重ね合わせた構造の周囲のファンデルワールス面を算出する。また、プログラムINSIGHT II内のMolecular Similarityモジュールを使用することにより、立体構造比較を実施してもよい。

また、構造の類似性は、図式において三次元構造を目で比較することにより、又は任意の様々な演算比較により評価することもできる。例えば、原子当量を、ペプチド模倣体及びファーマコフォアの三次元構造で定義し、フィッティング操作を使用して類似性レベルを確立することができる。ここで使用される場合、「原子当量」とは、２つの構造における保存原子セットである。「フィッティング操作」は、候補化合物の構造が環状ペプチド構造との最適フィットを得るように翻訳され、回転される任意のプロセスでありうる。フィッティング操作は剛性フィッティング操作であってよい(例えば、ファーマコフォア構造は剛性を保持して維持でき、ペプチド模倣体の三次元構造を、ファーマコフォア構造と最適フィットを得るように翻訳し、回転することができる)。あるいは、フィッティング操作では、当量原子の特定の対に対するフィットの二乗平均平方根の差が最小となるように、移動化合物構造に適応される最適な翻訳及び回転を演算する最小二乗フィッティングアルゴリズムを使用してもよい。好ましくは、原子当量は使用者により確立することができ、フィッティング操作は、多様な入手可能なソフトウエアアプリケーション(例えば、INSIGHT II (Accelrys Inc. San Diego, Californiaから入手可能)又はQUANTA(Molecular Simulationsから入手可能))の任意のものを使用して実施される。実質的な類似性の確立に使用される候補化合物の三次元構造は、(例えばＮＭＲ又はＸ線結晶技術を使用し)実験的に決定することもできるし、又は例えばここに提供される方法を使用し、アブイニシオでコンピュータ演算されてもよい。ペプチド模倣体を比較し同定するためのこのようなモデリング及び実験方法の使用は、当該分野においてよく知られている。例えば、それらの全てが出典明示によりここに援用される国際公開第０１／５３３１号及び国際公開第９８／０２４５２号を参照(以下のセクション７を参照)のこと。

一例として、限定するものではないが、化学ライブラリー(例えばヒダントイン及び／又はオキソピペラジン化合物を含む)は、コンビナトリアルケミストリー技術を使用して作製され、最初にインシリコでスクリーニングして、本発明のＰＦ４ファーマコフォアのエレメントを有し、よってＰＦ４アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかであると思われる化合物を同定することができる。コンビナトリアルケミストリー技術は、高信頼性の化学反応とロボット機器を用い、定まった化学成分の系統的付加を介して有機化合物の平行合成を可能にする。化合物の大きなライブラリーは、一つの部位で実施可能な全ての起こり得る反応と、第２、第３又はそれ以上の数の部位で実施可能な全ての起こり得る反応との組合せから生じる。このような方法は、固形担体に付着する混合物として、又は個々の分離化合物として、数千から何億もの新規な化学化合物を生じさせる可能性を有している。

本発明のＰＦ４ファーマコフォアは、ＰＦ４の効果的なアゴニスト又はアンタゴニストである可能性が最もある化合物を同定するためのこのような化学ライブラリーのスクリーニングを、大きく単純化し容易にするために使用することができる。その結果、ライブラリー合成では、標的(例えば、ＰＦ４レセプター又はＰＦ４ポリペプチドそれ自体)と最も相互作用しそうなライブラリーメンバーに焦点を合わせることが可能で、ライブラリーの可能性のある全てのメンバー(しばしば、多すぎて扱いにくい程の数の化合物になる)を合成する必要がなくなる。構造に基づいた設計とコンビナトリアルケミストリー技術の統合アプリケーションにより、薬剤開発に効果的な相乗的改善が生じる可能性がある。例を示すと、ヒダントイン及びオキソピペラジンライブラリーは、ヒダントイン又はオキソピペラジン骨格へのヒスチジン及びバリン代用物の添加のみを含む化合物に限定することができる。

また本発明のペプチド模倣化合物は、本来のＰＦ４ペプチドに関係ないか、又は関係ないと思われる化合物も含むが、組織分布的模倣体となる非ペプチド骨格上に位置する官能基を含む。このようなペプチド模倣体は、ここでは「非ペプチジル類似体」と称される。非ペプチジル類似体は、例えば大きな化学データベースのライブラリースクリーニングを使用して同定することができる。このようなスクリーニングではファーマコフォアの三次元立体構造を使用して、三次元空間におけるこのようなデータベースを探査する。単一の三次元構造をそのような探査のファーマコフォアモデルとして使用することができる。あるいは、ファーマコフォアモデルは、複数の三次元構造内に存在する重要な化学構造的特徴を考慮することにより、作成されてもよい。

様々な三次元構造のデータベースのいずれかを、このような探査に使用することができる。また、三次元構造のデータベースは、化合物の三次元構造を生じさせ、機械読み取り可能データでコードされるデータ保存材料の形態で三次元構造を保存することにより、作成することができる。三次元構造は、三次元グラフ描写表示を示すことが可能な機械に表示され、データを使用するための説明書と共にプログラムされうる。好ましい実施態様においては、三次元構造は、三次元構造を定義する座標セットとして提供される。

好ましくは、三次元(３Ｄ)構造データベースは、特に好ましい比較的単純な化学構造を有する小さな非ペプチジル分子と共に、少なくとも１０００００の化合物を含む。また、データベース中の化合物の３Ｄ座標は、正確かつ的確に表されていることが重要である。国立癌研究所(NCI)３Ｄデータベース(Milneら, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1994, 34:1219-1224)及びAvailable Chemicals DIrector (ACD; MDL Information Systems, San Leandro, Californiaから入手可能)は、上述したもの等の分子モデリング方法を使用し、三次元構造のデータベースを作製するために使用可能な２つのデータベース例である。いくつかの低エネルギー立体構造を有しうるフレキシブルな分子に対しては、複数の立体構造を保存し探査することが望ましい。Chem-Xプログラム(Oxford Molecular Group PLC, Oxford, United Kingdom)により、フレキシブルな化合物に対しての数千又は数百万の立体構造を探査することができる。Chem-Xのこの性能は、複数の立体構造を採用可能な化合物を扱う際に真の利点をもたらす。このアプローチを使用すると、何億もの立体構造を、３Ｄファーマコフォア探査プロセスで探査することができる。

典型的には、ファーマコフォアの探索は、少なくとも３つの工程を含む。これらの第１は、ファーマコフォアクエリーの作成である。このようなクエリーは、ファーマコフォアの三次元構造における距離の評価から開発することができる。例えば、図２Ａには、以下のアペンディクスに記載の座標に基づく、成熟ＰＦ４ポリペプチド骨格の例示的三次元構造が示されている。ＰＦ４ファーマコフォアの官能基を含むアミノ酸残基は、ファーマコフォアの各官能基が円で囲まれ、上述の表１に使用されている番号付けに対応するローマ数字で標識されて示されている。図２Ｂには、ＰＦ４ファーマコフォア構造が示されている。特に、図２Ｂにおける各ポイントは、(上述の表１に使用されている番号付けに対応するローマ数字により示されている)ＰＦ４ファーマコフォアの特定の官能基に対応する。ファーマコフォアの探索において好ましく使用される重要なファーマコフォアの距離は、図２Ｂにおける種々の官能基間に引かれた線により示される。これらの距離は、(例えば以下のアペンディクスに記載の座標を使用して)例えば成熟ＰＦ４ポリペプチドの三次元構造における対応する官能基間の距離を測定することにより、使用者が容易に決定し評価することができる。

ファーマコフォアクエリーの使用により、距離ビットスクリーニングが、要求されている幾何制約を満たす化合物を同定するためにデータベースについて好ましく実施される。第１に、候補化合物がそれらの重要な物理学的ポイント(すなわち水素結合ドナー、水素結合アクセプター、疎水容積等)、及び重要な幾何学的パラメータ(すなわち重要な物理学ポイントの相対距離)を決定するためにスキャンされる。化学基(すなわち疎水性、ＮＨ_４ ^＋、カルボニル、カルボキシラート)が、各候補化合物の表面へのマッピングに使用される一方、相互作用場が、候補分子内の主要なポイントの数及び性質を抽出するのに有用である。候補化合物から、重要な物理的ポイント及び幾何学パラメータを自動的に抽出するGRIDプログラム(Molecular Discovery Ltd., London, United Kingdom; Goodford, 1985)等の、多くのよく知られた技術が存在する。

主要な点が候補化合物から抽出されると直ぐに、候補化合物と本発明のファーマコフォアとが重ね合わされるか又は整列される。ファーマコフォアポイントと、候補化合物の対応する主要なポイントの間の類似度合いが算出され、利用されて、２つの分子間の類似度合いが決定される。本発明のファーマコフォアと候補化合物とを比較するために利用可能な重ね合わせ法の詳細は、以下の論文、De Eschら, J Med Chem. 2001 24:1666-74 及びLemmenら, J Med Chem. 1998 41(23):4502-20に見出される。ファーマコフォア容積への化合物のフィッティングは、当該分野でよく知られている他の演算方法を使用して実施することができる。目視検査及び活性部位容積への化合物のマニュアル結合は、QUANTA (Molecular Simulations, Burlington, Mass., 1992)、SYBYL (Molecular Modeling Software, Tripos Associates, Inc., St. Louis, Mo., 1992)、AMBER (Weinerら, J. Am. Chem. Soc., 106: 765-784, 1984)、又はCHARMM (Brooksら, J. Comp. Chem., 4: 187-217, 1983)等のプログラムを使用して実施することができる。このモデリング工程には、CHARMM又はAMBER等の、標準力場を使用するエネルギー最小化を続けることができる。他のより専門化されたモデリングプログラムには、GRID(Goodfordら, J. Med. Chem., 28: 849-857, 1985)、MCSS(Miranker & Karplus, Function及びGenetics, 11: 29-34, 1991)、AUTODOCK(Goodsell & Olsen, Proteins: Structure, Function 及びGenetics, 8: 195-202, 1990)、及びDOCK (Kuntzら, J. Mol. Biol., 161:269-288 (1982))が含まれる。さらに、化合物は、 LUDI(Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design, 6: 61-78, 1992)、LEGEND (Nishibata & Itai, Tetrahedron, 47: 8985, 1991)、及びLeapFrog (Tripos Associates, St. Louis, Mo.)等のコンピュータプログラムを使用し、既知のインヒビターの所定の部分を含む活性部位又は空の活性部位に、新規に構築されてもよい。

重ね合わせ手順の後、高い整合スコア又は高い類似度合いを有する分子が、それらの類似性をさらに検証するために選択される。(例えば、Minitab Statistical Software (Minitab, State College, Pa)を用いて実施される)ANOVA等のプログラムは、本発明のファーマコフォアと候補分子との間の定められたｐ値(好ましくは、ｐ値は０．０５未満である)に対して統計的に有意な差を抽出する。定められたｐ値以下のｐ値を有する候補分子は拒絶される。

多数の異なる数学的指標を、ファーマコフォアと候補化合物との間の類似性を測定するために利用することができる。本発明に対して関心ある数学的指標は、一般的にはソフトウェアパッケージに含まれている。数学的指標の選択は、多くの因子、例えば関心あるファーマコフォア、候補分子のライブラリー、及び活性に必須であると同定された官能基に依存するであろう。この話題についての概説は、Frederiqueら, Current Topics in Medicinal Chem. 2004, 4: 589-600を参照のこと。

幾何学的要求を満足させる少なくとも一の低エネルギー立体構造を有する化合物は、「ヒット」と見なされ、ＰＦ４アゴニスト又はアンタゴニストの候補化合物である。本発明の特定の実施態様では、本発明の化合物は、ＰＦ４、ＰＦ４突然変異体、ＩＬ-８、又は：PHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：３４); PHSPTVQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：３５); PYSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQEP(配列番号：３６); PHSPQTELIV KLKNGQKISL DLQAP(配列番号：３７); PHSPTAQLIA TLKNGQKISV DLQAP(配列番号：３８); AHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：３９); AHSPTVQLIA TLKNGQQISL DLQAP(配列番号：４０); AYSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQEP(配列番号：４１); AHSPQTELIV KLKNGQKISL DLQAP(配列番号：４２); AHSPTAQLIA TLKNGQKISV DLQAP(配列番号：４３); PHSATAQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：４４); PHSATVQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：４５); PYSATAQLIA TLKNGQKISL DLQEP(配列番号：４６); PHSAQTELIV KLKNGQKISL DLQAP(配列番号：４７); PHSATAQLIA TLKNGQKISV DLQAP(配列番号：４８); AHSATAQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：４９); AHSATVQLIA TLKNGQQISL DLQAP(配列番号：５０); AYSATAQLIA TLKNGQKISL DLQEP(配列番号：５１); AHSAQTELIV KLKNGQKISL DLQAP(配列番号：５２); AHSATAQLIA TLKNGQKISV DLQAP(配列番号：５３); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAPLY(配列番号：５４); PHSPTVQLIA TLKNGQKISL DLQAPLY(配列番号：５５); AHSATAQLIA TLKNGQKISL DLQAPLY(配列番号：５６); PHSPQTELIV KLKNGQKISL DLQAPRY(配列番号：５７); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAPRY(配列番号：５８); PHSTAAQLIA TLKNGQKISL DLQAPLY(配列番号：５９); PHCPTAQLIA TLKNGRKICL DLQAP(配列番号：６０); PHSPTPQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：６１); PHSTAPQLIA TLKNGQKISL DLQAPLY(配列番号：６２); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：６３); PHSPTVQLIA TLKNGQKISL(配列番号：６４); PYSPTAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：６５); PHSPQTELIV KLKNGQKISL(配列番号：６６); PHSPTAQLIA TLKNGQKISV(配列番号：６７); AHSPTAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：６８); AHSPTVQLIA TLKNGQQISL(配列番号：６９); AYSPTAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：７０); AHSPQTELIV KLKNGQKISL(配列番号：７１); AHSPTAQLIA TLKNGQKISV(配列番号：７２); PHSATAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：７３); PHSATVQLIA TLKNGQKISL(配列番号：７４); PYSATAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：７５); PHSAQTELIV KLKNGQKISL(配列番号：７６); PHSATAQLIA TLKNGQKISV(配列番号：７７); AHSATAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：７８); AHSATVQLIA TLKNGQQISL(配列番号：７９); AYSATAQLIA TLKNGQKISL(配列番号：８０); AHSAQTELIV KLKNGQKISL(配列番号：８１); AHSATAQLIA TLKNGQKISV(配列番号：８２); PHSPTAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：８３); PHSPTVQLIA TLKNGRKISL(配列番号：８４); PYSPTAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：８５); PHSPQTELIV KLKNGRKISL(配列番号：８６); PHSPTAQLIA TLKNGRKISV(配列番号：８７); AHSPTAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：８８); AHSPTVQLIA TLKNGRQISL(配列番号：８９); AYSPTAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：９０); AHSPQTELIV KLKNGRKISL(配列番号：９１); AHSPTAQLIA TLKNGRKISV(配列番号：９２); PHSATAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：９３); PHSATVQLIA TLKNGRKISL(配列番号：９４); PYSATAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：９５); PHSAQTELIV KLKNGRKISL(配列番号：９６); PHSATAQLIA TLKNGRKISV(配列番号：９７); AHSATAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：９８); AHSATVQLIA TLKNGRQISL(配列番号：９９); AYSATAQLIA TLKNGRKISL(配列番号：１００); AHSAQTELIV KLKNGRKISL(配列番号：１０１); AHSATAQLIA TLKNGRKISV(配列番号：１０２); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１０３); PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１０４); PYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１０５); PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELR(配列番号：１０６); PHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELR(配列番号：１０７); AHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１０８); AHSPTVQLIA TLKNGQQISL ELR(配列番号：１０９); AYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１１０); AHSPQTELIV KLKNGQKISL ELR(配列番号：１１１); AHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELR(配列番号：１１２); PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１１３); PHSATVQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１１４); PYSATAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１１５); PHSAQTELIV KLKNGQKISL ELR(配列番号：１１６); PHSATAQLIA TLKNGQKISV ELR(配列番号：１１７); AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１１８); AHSATVQLIA TLKNGQQISL ELR(配列番号：１１９); AYSATAQLIA TLKNGQKISL ELR(配列番号：１２０); AHSAQTELIV KLKNGQKISL ELR(配列番号：１２１); AHSATAQLIA TLKNGQKISV ELR(配列番号：１２２); PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１２３); PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１２４); DYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１２５); PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELR(配列番号：１２６); PHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELR(配列番号：１２７); AHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１２８); AHSPTVQLIA TLKNGRQISL ELR(配列番号：１２９); AYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１３０); AHSPQTELIV KLKNGRKISL ELR(配列番号：１３１); AHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELR(配列番号：１３２); PHSATAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１３３); PHSATVQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１３４); PYSATAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１３５); PHSAQTELIV KLKNGRKISL ELR(配列番号：１３６); PHSATAQLIA TLKNGRKISV ELR(配列番号：１３７); AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１３８); AHSATVQLIA TLKNGRQISL ELR(配列番号：１３９); AYSATAQLIA TLKNGRKISL ELR(配列番号：１４０); AHSAQTELIV KLKNGRKISL ELR(配列番号：１４１); AHSATAQLIA TLKNGRKISV ELR(配列番号：１４２); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY(配列番号：１４３); PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY(配列番号：１４４); AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY(配列番号：１４５); PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELRAPRY(配列番号：１４６); PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPRY(配列番号：１４７); PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY(配列番号：１４８); PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY(配列番号：１４９); PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY(配列番号：１５０); AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY(配列番号：１５１); PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELRAPRY(配列番号：１５２); PHCPTAQLIA TLKNGRKICL DLQAP(配列番号：１５３); PHSPTPQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：１５４); PHSTAPQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY(配列番号：１５５)又はPHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAP(配列番号：１５６)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドではない。

当業者であれば、例えばここで提供されたスクリーニングを使用し、化合物の構造が最適化されることが分かるであろう。これらのスクリーニング内では、三次元構造に対する候補化合物の特定の改変の効果は、例えばＰＦ４ファーマコフォアに対する三次元類似性を最適にするために評価することができる。このような改変には、例えば疎水性、立体容積、静電特性、大きさ及び結合角における変化が含まれる。これらの方法により同定される候補アゴニスト及びアンタゴニストの生物学的検査が、それらの活性を確認するためにまた好ましくは使用される。

活性なペプチド模倣体が同定されると、関連する類似体も、例えば二次元類似性探査により同定することができる。このような探査は、例えばプログラムISIS Base(Molecular Design Limited)を使用して実施することができる。二次元類似性探査により、生物活性を最適化するために容易にスクリーニングされ得る他の入手可能で密接に関連している化合物の同定も可能になる。

６．実施例
本発明はまた以下の実施例によって記載され立証される。しかしながら、明細書のいずれにおいても、これら及び他の実施例の使用は例示のみであって、本発明又は例証される任意の用語の範囲及び意義を限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載される任意の特定の好ましい実施態様に限定されるものではない。実際、本発明の多くの修正及び変更が、この明細書を読んだ当業者には明らかであろうし、そのような変形は、精神又は範囲において本発明を逸脱することなく、なされる。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲と、その特許請求の範囲によって与えられるものと均等の全範囲によってのみ制限されるべきである。

６．１．実験手順
６．１．１ 組換えＰＦ４産生
組換えＰＦ４を、ＰＦ４部分の直前の独特なメチオニン残基を含むタンパク質として、大腸菌において産生させた。より詳細には、発現プラスミドを、プラスミドｐＥＴ-１５ｂ(Novagen, Fontenay-sous-Bois, Franceから入手可能)の複数の制限酵素部位領域においてＮｃｏｌとＸｈｏｌとの間の天然配列ＰＦ４をコードする合成遺伝子をクローニングすることにより構築した。突然変異ＰＦ４遺伝子を、鋳型として野生型コンストラクトと合成オリゴヌクレオチドプライマーの標準的ＰＣＲ増幅を使用して産生した。全てのコンストラクトを独立して配列決定し、検証した(Genome Express, Grenoble, France)。

ＰＦ４プラスミドを有しているＢＬ２１(ＤＥ)細菌(Novagen, Fontenay-sous-Bois, Franceから入手可能)を、１Ｍのグルコースと適切な抗生物質を含むＥＺｍｉｘ ２ｘ ＹＴ培地において３７℃で培養した。タンパク質の発現を、４時間、１ｍＭのＩＰＴＧを含有するこれらの細胞培養物において誘導した。遠心分離により細菌細胞を収集し、リゾチーム処理(１ｍｇ／ｍｌ)と超音波処理を施した。得られた融合タンパク質を、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のトリス-ＨＣｌに６Ｍの尿素、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのＤＴＴを用い、溶解ペレットから抽出した。ついで、抽出物をイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、ＰＦ４タンパク質を、０−１ＭのＮａＣｌ勾配を用い、続いて０．５ＮａＣｌを含有するＰＢＳにおいて透析することにより溶出させた。最終的なタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬の使用により決定した。このようにして産生された組換えＰＦ４タンパク質の均一性を、ＰＦ４に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット及びＳＤＳ-ＰＡＧＥにより検証した。

６．１．２ 内皮細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を過去に記載された(Jaffeら, J Clin Invest. 1973; 85(11):2745-56)ようにしてコラゲナーゼ(Roche Diagnostics)消化により単離した。
１５％のウシ胎児血清(ＦＣＳ)、５％のヒト血清、２ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＭ１９９培地で細胞を成長させた。培養物を、加湿雰囲気下、３７℃、５％のＣＯ_２に維持した。３−４日毎に、培養物をトリプシン処理により収集し、希釈し、再播種し、コンフルエンスになるまで成長させた。第２又は第３継代からコンフルエンスまで成長したＨＵＶＥＣが、ここに記載した実験に好ましく使用される。

６．１．３ 内皮細胞増殖アッセイ
ＤＮＡ合成の阻害を、[^３Ｈ]-チミジン取り込みアッセイにより測定した。細胞を、２．５％のＦＣＳを含有する０．５ｍｌの培地において、２４ウェルプレートのウェル毎に１５０００細胞を蒔き、３７℃で４時間、付着させておいた。ついで、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ-２、ＶＥＧＦ_１６５又はＶＥＧＦ_１２１の添加により、増殖を誘導した。濃度が増加した精製組換えＰＦ４タンパク質をいくつかのウェルに添加し、ＨＵＶＥＣをさらに４８時間インキュベートした。インキュベートの最後の２０時間の間に、[^３Ｈ]-チミジン(１μＣｉ／ウェル)を添加した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷の１０％(ｗ／ｖ)トリクロロ酢酸を用いて３０分処理した。得られた沈殿物を１ＭのＮａＯＨで可溶化させ、取り込まれた放射能を、Beckman LS-6500多目的シンチレーションカウンターで測定した。

６．１．４ ＨＵＶＥＣ遊走アッセイ
ＨＵＶＥＣ遊走を、修正ボイデンチャンバー(Boyden chamber)アッセイで評価した。多孔質のポリカーボネートフィルター(８μＭのポアサイズ)を有するトランスウェル細胞培養チャンバー挿入物を、０．２％のゼラチンでコートした。２．５％のＦＣＳが補填された培地に懸濁させたＨＵＶＥＣを、ウェル当たり４ｘ１０^４細胞で、挿入物に添加した。挿入物を、走化性刺激物(１０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ_１６５)を含むチャンバーに配し、ＣＯ_２インキュベータ内において、３７℃で４時間、細胞を遊走させた。阻害実験のために、組換えＰＦ４タンパク質を、下部と上部の双方のチャンバーに添加した。インキュベート後、フィルターをＰＢＳですすぎ、１％のパラホルムアルデヒドで固定し、Harris (EMD Chemicals Inc. Gibbstown, NJ)のヘマトキシリンで染色した。
フィルターの上面を消毒綿でこすり取り、非遊走細胞を除去した。フィルターの上面を、高倍率(ｘ２００)の光学顕微鏡で観察し、顕微鏡の可視化場内の細胞の数を記録した。それぞれの実験ポイントを三組実施し、２０の視野をフィルター毎に分析した。

６．１．５ 分子モデリング
ＩＬ８及びＰＦ４ポリペプチド分子を、３００ケルビン度(すなわち３００Ｋ)、７００ｐｓで実行した分子動態シミュレーションでモデル化した。分子を、約８０００の水分子と共に６２Åｘ６２Åｘ６２Åの箱において周期的境界条件でモデル化した。帯電を中和するために、７つのＣｌ⁻イオンをＰＦ４分子のシミュレーションに含ませ、４つのＣｌ⁻イオンをＩＬ８分子のシミュレーションに含ませた。
ペプチド類の分子動態シミュレーションを、９００Ｋ、７００ｐｓで実行した。ペプチド類を、約７６８０の水分子及び７２０のトリフルオロエタノール分子と共に６２Åｘ６２Åｘ６２Åの箱において周期的境界条件でモデル化した。ペプチド類のＮＭＲ分析からのデータを、分子動態シミュレーションに含めた。結合定数、同じ分子の異なる配座異性体の相対的集団、化学シフト異方性、双極子間緩和率、及び他の実験的要因を理論データと比較した場合、ＮＭＲ実験とシミュレーションプロトコルとの間の相似性が得られるように、結合定数及び速度と共に調和距離拘束を調整した。

被験ペプチドの多様性を増加させるため、ランジュバン動力学、又は明確な水溶媒を用いる周期的境界条件の使用を回避する他の迅速な技術を使用して、仮想ペプチドをモデル化した。コンピュータ操作を介して、仮想ペプチドを生物学的に活性な残基でランダムに突然変異させた。分子動態後、仮想ペプチドを、QSARフィルターを使用して推定の活性について選択し、合成し、細胞培養物で検査した(Grassy G, Calas B, Yasri A, Lahana R, Woo J, Iyer S, Kaczorek M, Floc'h R, Buelow R. Computer-assisted rational design of immunosuppressive compounds. Nat Biotechnol. 1998;16(8): 748-52)。
ランジュバン動態シミュレーションは、ペプチド骨格に対する調和拘束下、９００Ｋ、７００ｐｓで実行した。所定の密度システムのクエンチされた動態を、距離依存性誘電定数(ε)と共に使用し、再平衡のため、３００Ｋまでシミュレートシステムを冷却した。クエンチされた動態の終わりに得られた最後の立体構造を、最終的に３００Ｋでの分子動力学の５００ｐｓまで提示した。

６．１．６ 統計的解析
実験ポイント当たり３組の測定を、ほとんどの実験に対して実施し、その結果を別々の実験から組合せたデータに対し、平均±一つの二乗平均平方根偏差(ＳＤ)として表す。グループ間の差異の有意性は、不対データに対する標準的なスチューデントｔ検定により決定した。

６．２． 結果
図１Ｃに示された成熟ＰＦ４ポリペプチド配列(配列番号：１)のペプチド断片を生成させ、ＨＵＶＥＣ細胞に対するそれらの血管新生効果(細胞遊走及び増殖)を、上述したセクション６．１に記載のアッセイを使用して評価した。これらのペプチドを、分子モデリング及び定量的構造活性相関(ＱＳＡＲ)技術を使用してさらに詳細に調べ、血管新生抑制活性を示したペプチドにどの立体構造(類)及び構造的特性が共通しているかが決定された。
完全長ＰＦ４及び関連ＩＬ８ポリペプチドの分子動力学計算もまた実施した。活性ペプチドが、完全長ＰＦ４におけるＡｓｐ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ３連構造と同じ立体構造を有するＮ末端近傍の三連構造のアミノ酸残基Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ(ＤＬＱ)を有していることが見出された。

次に、ＰＦ４表面を、部位特異的突然変異を使用してマッピングした。特に、一連の変異ＰＦ４ポリペプチドを生じさせ、ＨＵＶＥＣ細胞におけるそれらの血管新生活性を、上述したセクション６．１に記載のもの等のアッセイを使用して詳細に調べた。以下の表３には、各ポリペプチドの名と配列同定番号(配列番号：)と共に、生じたＰＦ４ポリペプチドのアミノ酸配列を列挙している。ＷＴＰＦ４と命名された最初の配列は、図１Ｃ(配列番号：１)にも表された野生型の成熟ＰＦ４アミノ酸配列に対応する。表３に表される他の配列は、アミノ酸配列において太字で下線が付されて示されている一又は複数のアミノ酸置換を含む。

上述の表３に記載された各突然変異の有意性を、ＰＦ４活性に対する変異の予期される効果の記載と共に、以下の表４に要約する。

これらの突然変異の活性を特徴付け、ＰＦ４の三次元構造と結果を相関させることにより、その分子に対してより完全なファーマコフォア構造を同定した。特に、このＰＦ４ファーマコフォアは、本質的に少なくとも７〜１０までの主要な官能基と、ＰＦ４とＰＦ４-レセプターとの特異的相互作用にとって重要であると考えられるそれらの空間的関係からなる。このファーマコフォア構造における各ポイントは、図１Ｃ(配列番号：１)に記載の成熟ＰＦ４配列のアミノ酸側鎖上の特定の独特の原子又は官能基に対応する。これらのポイントは、上述の表１と、また以下の表５にも説明されている。特に、表５は、ファーマコフォアポイントに対応するその側鎖の特定の原子又は官能基と共に、ＰＦ４ファーマコフォアにおける各ポイントが位置しているアミノ酸残基を特定している。また表５の左端の欄には、ファーマコフォアとＰＦ４特異的レセプターの間の可能性のある相互作用の性質を記述する注釈的記載が提示されている。

図２Ａ及び２Ｂには、プロトタイプ分子、天然の成熟ヒトＰＦ４に対するこのファーマコフォアの例示が与えられている。特に、図２Ａには、以下のアペンディクスに記載の座標に基づき、成熟ＰＦ４ポリペプチド骨格の三次元構造が示されている。ＰＦ４ファーマコフォアの官能基を含むアミノ酸残基は、ファーマコフォアの各官能基が円で囲まれ、上述の表１中の対応するローマ数字で標識されて示されている。図２Ｂには、特定の官能基に対応する各ポイントを有するＰＦ４ファーマコフォア構造が示されている。これらの官能基間の距離は、図２Ｂにおける種々の官能基の間に引かれた線により示されている。これらの距離は、例えば以下のアペンディクスに記載の座標等、成熟ＰＦ４の三次元構造における対応する官能基間の距離を測定又は算出することにより、使用者が容易に決定し評価することができる。便宜上、これらの官能基間の好ましい距離をまた以下の表６に示す。

６．３． 座標系可視化及び結合ポテンシャル
本発明のＰＦ４ファーマコフォアをさらに可視化して、ファーマコフォアポイントのそれぞれの周囲の結合及び疎水性ポテンシャルを明らかにした。上述したように、各ファーマコフォアポイントは、水素結合アクセプター、水素結合ドナーのいずれかとして、又は疎水性相互作用に関与しているとして分類される。座標系上へこれらのポイントを可視化することにより、疎水性容積及び水素結合球面キャップは、アゴニスト／アンタゴニスト設計の目的に対してよりよく理解することができる。

デカルト及び球座標系の双方が描かれるところを０として原点を選択し定めた。図２Ｂからの三次元図形を、上述したように官能基間の臨界距離を使用して作成した。この図を、疎水性容積及び水素結合ベクトル方向を説明するためにデカルト及び球座標系に重ね合わせた。図３Ａには、三次元でのこのファーマコフォアの例が提示されている。ファーマコフォアにおける各ポイントは、２つの幾何学系(デカルト座標と球座標)により定められている。当業者であれば、これら２つの座標系間のよく知られた数学的関係を使用し、与えられたポイントに対するデカルト座標を球座標に容易に転換することができ、またその逆もしかりである。特に球座標γ、θ及びψは、以下の関係：

を使用し、与えられたデカルト座標ｘ、ｙ及びｚから、容易に決定することができると理解される。

同様に、デカルト座標ｘ、ｙ及びｚは、以下の関係：

を使用し、与えられた球座標γ、θ及びψから、容易に決定することができる。

便宜上、ファーマコフォアポイントに対する好ましいデカルト及び球座標を、以下の表７に記載する。

ポイントＭを、所望しない相互作用を回避しうる疎水性ファーマコフォアポイントに最も近い点として定めた。ファーマコフォアポイントの周囲の疎水性容積は４／３π(ｒ_ｈｙ)^３と定められ、ここでｒ_ｈｙは疎水性容積の表面上のポイントＭとファーマコフォアポイントとの距離である。図３Ｂには、ファーマコフォアポイントＶＩの周囲の疎水性容積の例が示されている。球ポイント(ｍポイント)の外側の疎水性容積に対する好ましいデカルト及び球座標を以下の表８に示す。

さらに、一又は複数の水素結合ベクトルＡを、標準的な電気陰性度のデータを使用し、極性のファーマコフォアポイントのそれぞれについて算出した。図３Ｂには、ファーマコフォアポイントＶからの一水素結合ベクトルの例が提示されている。ついで、水素結合ポテンシャルの球状キャップを、その半径が水素結合ベクトルの長さの１／２である球体において、水素結合ベクトルの長さの１／４の凹面深さを有するとして、各水素結合ベクトルに対して定めた。図４には、水素結合供与性及び水素結合受容性水素結合ポテンシャルの球状キャップ双方のグラフ表示が示されている。

水素結合キャップの表面積は２πＲ_ｃａｐｈとして定められ、ここでＲ_ｃａｐは球体の半径であり、ｈは球状キャップの凹面深さである。便宜上、このファーマコフォアに対する水素結合ベクトル点(Ａ点)の好ましいデカルト及び球座標を以下の表８に示す。同様に、このファーマコフォアに対する疎水性容積(「ｖｏｌ」)及び水素結合キャップ表面積(「Ｓ」)を以下の表９に示す。

６．４． 化合物設計におけるファーマコフォアの使用
この実施例は、ＰＦ４レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとすることができる化合物を同定し、設計し、合成するために、本発明のファーマコフォアが、如何にして使用されうるかを示している。特に、ここではＢＱ-Ａ０１１０４と称されるリード化合物(式Ｉ)が開示される。

ＢＱ-Ａ０１１０４は、一アニオン性基(カルボン酸基)とカチオン性基(ピペリジニウム環中の第４級アミン)を有する中性分子である。化合物は塩化ナトリウムの水溶液に可溶性である。化合物は、上述の表５に列挙されたＰＦ４ファーマコフォアポイントの１０全てを有しており、便宜上、７つの異なるサブユニット又は「領域」を概念化可能な骨格により、構造的に剛性を保持している。ＢＱ-Ａ０１１０４の化学構造は、１０のファーマコフォアポイントのそれぞれが上述の表５に列挙された対応するローマ数字により示されて、図５に示されている。それぞれの構造的サブユニット又は「領域」も、対応するアラビア数字により示されている。これらの構造的サブユニットは、図６Ａ−６Ｇに個々に示され、以下で検討される。水中での分子の高温分子動力学(ＭＤ)シミュレーション(９００Ｋで１ナノ秒)により、分子が構造的に安定しており、全ての構造的拘束を保持していることが明らかになる。すなわち、骨格は全てのＭＤ軌道に沿って剛性のままである。

領域１(図６Ａ)、第１の化学サブユニットは、フレキシブルな化学アームにより環に結合したファーマコフォア基ＩないしＩＶ及びＶＩＩＩを担持しているピペリジニウム環を含む。このサブユニットにおける第４級アミンのｓｐ^３ハイブリッド形成により、三次元空間におけるファーマコフォアポイントの良好な提示が可能になる。領域１と領域２をつないでいる二面角Ｄ１(図６Ａに示す)周囲の回転は、窒素含有環と脂肪族炭素(炭素２７)とが近接しているために制限される。この二面角は約４６．９°の値を有しており、ファーマコフォアポイントの良好な提示を提供する。

領域２(図６Ｂ)は、脂肪族骨格中のｓｐ^３炭素(Ｃ３８)を介してファーマコフォアポイントＸに対応するエチルオキシ側鎖の提示を維持している。ファーマコフォアポイントＸを正しく提示するために、ケトン酸素により、曲げ角度に対して望ましい屈曲性が与えられる。
領域３(図６Ｃ)は、ファーマコフォアポイントＩＸを有する側鎖にある程度の剛性を付与するペプチド結合を含む。このサブユニット(図６Ｃに示す)に対する二面角Ｄ１、Ｄ２及びＤ３は、それぞれ−１５５．６°、５３．３°及び２２．３°の平均値を有する。この立体配置により、ファーマコフォアポイントＩＸに対応する芳香環を、上述した化学サブユニットの方向に配向させることができる。

領域４(図６Ｄ)は、高温ＭＤシミュレーション中でさえ剛性であるペプチド結合により、固定角で互いに領域３及び５に結合している。
領域５(図６Ｅ)は、一方の分枝部(分枝部２として図６Ｅに標識)上のファーマコフォアポイントＶ及びＶＩ、他方の分枝部(分枝部３として図６Ｅに標識)上のファーマコフォアポイントＶＩＩ、及び第３の分枝部(分枝部１として図６Ｅに標識)上の残ったファーマコフォアポイントＩ−ＩＶ及びＶＩＩＩ−Ｘの間の、エネルギー的に好ましい相対配向を維持している芳香環を含む。

領域６(図６Ｆ)は、ファーマコフォアポイントＶＩＩを有する側鎖に剛性を付与するペプチド結合を含む。平均二面角値Ｄ１及びＤ２(図６Ｆに示す)は、それぞれ−１０８°と２６°である。この立体配置により、ファーマコフォアポイントＶＩＩに対応するベンゾイミダゾール環を、効果的な活性のために正しく配向させることができる。
領域７(図６Ｇ)は、ファーマコフォアポイントＶＩＩに適合させるため、３つの窒素原子を正しく配向するベンゾイミダゾール環を含む。

ファーマコフォアポイントＩ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩは、フレキシブルな脂肪族鎖を介して、ＢＱ-Ａ０１１００４の骨格サブユニットに結合している。それに反して、ファーマコフォアポイントＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸは、比較的剛性があり、拘束されている鎖により、ＢＱ-Ａ０１１００４の骨格サブユニットに結合している。よって、これら後者のファーマコフォアポイントは、前者と比べて、相対的に拘束されている。このことは、ＰＦ４ポリペプチドそれ自体における種々のファーマコフォアポイントの相対的フレキシビリティを反映している。例えば、ＰＦ４(配列番号：１)のＡｌａ４３及びＬｅｕ４５アミノ酸残基に位置するファーマコフォアポイントＸ及びＩＸの抑制されたフレキシビリティは、ＰＦ４活性に必要なαへリックスの存在により課される。このへリックスの安定性は、Ｎ末端に存在するキャッピングボックスにより維持されている。よって、ＰＦ４ポリペプチド(配列番号：１)において、残基Ｖａｌ１３及びＬｅｕ１１の移動は、２つのジスルフィド架橋により課せられるＰＦ４骨格の剛性のために拘束される。

６．４．１ ＢＱ-Ａ０１１０４の調製
ＢＱ-Ａ０１１０４及びＰＦ４レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかであると同定され設計された他の化合物は、標準的なよく知られている合成法を介して得ることができる。
ＰＦ４レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかであると同定され設計される種々の化合物は、一又は複数のキラル中心を含んでおり、エナンチオマーのラセミ混合物又はジアステレオマー混合物として存在可能である。これらの異性体は非対称的に合成されるか、又はキラルカラム又はキラル分離剤等の標準的な技術を使用して分離されうる。例えば、Jacques, Jら, Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. Hら, Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 及びWilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E. L. Eliel編, Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, Ind., 1972)を参照のこと。

いくつかの簡便な方法を、スキーム１−４に示す。これらのスキームは、単に一つの合成経路の例示を意味しているが、これらの合成経路は、多様な化合物を生じせしめるために、当業者に明らかな方法で修正することもできる。本発明の化合物及びその中間体の調製に有用な出発物質は、商業的に入手可能であるか、又は既知の合成法及び試薬を使用して商業的に入手可能な物質から調製することができる。

本発明の化合物の合成法を次のスキームに示す。構造が化合物又は部分に対して与えられる化学命名法を使用する際に矛盾があるおそれがあるため、化学名ではなく、構造が化合物又は部分の定義を支配する。

スキーム１においては、中間生成物５を、クロロ酢酸を含む水中において塩化アルミニウムを用いて４-フェニルブチルアミン(１)(Aldrich Chemical Co.)を先ずアルキル化させ、フェニル酢酸化合物２を生成することにより、生成させる。化合物２を塩化チオニルと反応させ、酸塩化物を生じせしめ、これをベンゾイミダゾール-５-イル-メチルアミンと反応させてアミド化合物３を生成させる。ベンゾイミダゾール-５-イル-メチルアミンは、商業的に入手可能なベンゾイミダゾールカルボン酸(Aldrich Chemical Co.)から、(１)塩化チオニルでカルボン酸を処理して酸塩化物を生成させ、(２)アンモニアと酸塩化物を反応させて対応する第１級アミドを生成させ(Beckwithら, Zabicky The Chemistry of Amides Wiley, NY, 1970, pg. 73を参照)、(３)ＴＨＦ中水素化アルミニウムリチウムでアミドを還元して所望するメチルアミンを生成させる(Challisら, Zabicky The Chemistry of Amides Wiley, NY, 1970, pg. 795を参照)という３工程で作製される。ついで、化合物３を、水中において３-クロロプロピオン酸及び塩化アルミニウムを用いて再度アルキル化させて三置換フェニル化合物４を生成させる。最後に、化合物４を塩化チオニル及びアンモニアと反応させてカルボン酸をアミド中間体５に転換させる。

スキーム２において、中間体１２を、四酸化オスミウムを用いてシクロペンテニルアミド化合物(６)を１,３-ジカルボニル化合物(７)に転換させた後、過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、水と弱い還元剤、例えばＮａＨＳＯ_３で処理することにより生成させる。化合物６は、商業的に入手可能なシクロペンタノン(Aldrich Chemical Co.)から、(１)酢酸エチルのエノラートとシクロペンタノンをアルドール反応させ、(２)得られたアルコールを酸処理により脱水し、(３)アニリンのナトリウム又はリチウム塩との反応で、得られたα,β-不飽和エステルをその対応するアミドに転換させる(Majetichら, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 8727)という３工程で生成される。化合物７を、標準的な技術の使用、例えばＫＭｎＯ_４で処理することにより、カルボン酸化合物８に酸化させる。化合物８を塩化ビニルマグネシウムで処理し、得られたアルコールを続いて酸で脱水してジエン化合物９を生成する。化合物９のビニルアルケンを臭化水素で臭化した後、触媒量のパラジウムカーボンの存在下、水素ガスを用いてヘプテニルオレフィンを水素化させる。最後に、１-ブロモアルカンとマグネシウムを反応させてアルキルグリニャール試薬１０を生成させる。ついで、化合物１０を、エーテル中の３-アミノプロパナール(propanal)と反応させ、アルコール化合物１１を生成させる。最後に、化合物１１を、塩基、続いて臭化エチル、ついで酸と反応させ、エチルエーテル中間体１２を生成させる。

スキーム３において、中間体１９を、商業的に入手可能な３-ブテナール(butenal)ジエチルアセタール(Aldrich Chemical Co.)から、(１)ＢＨ_３を用いてヒドロホウ素化させ、続いてＮａＯＨ／Ｈ_２Ｏ_２を用いて酸化させ、触媒ｐ-トルエンスルホン酸処理により、ジエチルアセタールをアルデヒドに転換させ、(３)４-ヒドロキシ-ブタナール(butanal)のアルコールを保護し、化合物１３を生成させる。この合成と他の合成工程における適切な保護基の選択は、当業者により容易に決定されるであろう。適切な保護基及び保護基の選択及び合成のための標準的な技術は、T.W. Greene及びP.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley-Interscience, New York, 1999)に見出すことができる。ついで、化合物１３をグリニャール試薬１４と反応させ、(１)マルコフニコフ条件下、４-フェニル-１-ブチン(Aldrich Chemical Co.)にＨＢｒを添加し、(２)エーテル中、得られた臭化ビニルとマグネシウムとを反応させる２工程でアルコール化合物１５を生成させる。例えばＮＥｔ_３等の塩基の存在下、塩化トシル、又は他の適切な脱離基前駆物質と化合物１５を反応させ、トシラート化合物１６を生成させる。４-ブロモブタナル(４-ブロモブタナルは、４-ヒドロキシ-ブタナル(上掲)から、塩化メチレンにおいて、２,４,６-トリクロロ[１,３,５]トリアジン、ＮａＢｒ及びＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドで処理することにより作製される；de Lucaら, Org. Lett., 2002, 4, 553-555)を、Ｐ^１に直交する保護基で保護することにより形成されるグリニャール試薬と、化合物１６とを反応させ、保護された化合物とマグネシウムとを反応させ、化合物１７を生成させる。化合物１７を脱保護して最初の保護基Ｐ^１を除去し、続いて遊離のアルコールを、例えばＣｒＯ_３を用い、カルボン酸に酸化させる。酸化後、トリブロモホスフィン(phospine)及び臭素ガスを用いて、中間体を臭化させ、α-ブロモカルボン酸を生成させる。ついで、カルボン酸を塩化チオニルで処理し、得られた酸塩化物をアンモニアで処理し、アミド化合物１８を生成させる。化合物１８のオレフィンを臭化水素で臭化させ、第１級臭化物を得て、第２の保護基(Ｐ^２)を中間体から除去し、スワーン(Swern)又はデス-マーチン(Dess-Martin)試薬を用いて処理する等の標準的な方法を使用し、得られたアルコールをアルデヒドに酸化させ、中間生成物１９を生成させる。

最後に、スキーム４において、ジブロモ中間体１９を、塩基とtert-ブチル-アンモニウムヨージド(ＴＢＡＩ)の存在下、アミン中間体１２とカップリングさせることで、ピペリジン中間体２０が得られる。中間体２０のカルボン酸を、ＤＣＣ及び触媒ＤＭＡＰの存在下、中間体５のアミンとカップリングさせ、続いて、ＫＭｎＯ_４等を用いて残ったアルデヒドを酸化させることにより、表題化合物Ｉ、ＢＱ-Ａ０１１０４が得られる。

６．５． 活性の最適化
化学合成及び修飾ための常套的な技術を使用し、この発明のファーマコフォアを使用して設計及び／又は同定される化合物の活性と、吸収、分布、代謝及び排出(ＡＤＭＥ)特性の双方を、さらに最適化することができる。例えば、ＰＦ４アゴニスト又はアンタゴニストの候補化合物は、ファーマコフォアポイントに対応する一又は複数の官能基を修飾することにより、又は骨格(例えばＢＱ-Ａ０１１００４については、上述したサブユニット又は「領域」)を修飾することにより、又はその双方により修飾することができる。図７には、化合物ＢＱ-Ａ０１１００４を最適化することが可能な、ある種の例示的な修飾が示されている。これらの修飾化合物(式ＩＩ−ＶＩ)の完全な化学構造を、図８Ａ−８Ｅに示す。よって、このような修飾とそれらを含む化合物は、それらがＰＦ４のアゴニスト又はアンタゴニストとして使用される場合、本発明の一部であると考えられる。例えば、化合物ＩＩ−ＶＩは、スキーム１−４の派生スキームである次の合成プロトコルから調製することができる。
式ＩＩの化合物の調製は、スキーム５−６に示されている。ＢＱ-Ａ０１１００４骨格に対する主要な修飾は、ピペラジン環のシクロヘキシル環への置換と、フェニルアミド基のイソプロピルアミド基への置換である。

ピペラジン環のシクロヘキシル断片への置換は、スキーム５ａ、５ｂに従い達成される。まず、ナトリウムエトキシド処理により、γ-カプロラクトン(Aldrich Chemical Co.)を対応する開環エステルに転換させる(スキーム５Ａ)。中間体エステルアルコールを、スワーン条件下で対応するエステルアルデヒドに酸化させ、触媒ｐ-ＴＳＡの存在下、エチレングリコールを用い、そのジオキソランとしてアルデヒドを保護する。ついで、ＬｉＡｌＨ_４を用い、エステルをアルコールに還元し、化合物２２を得る。Ｎ-ブロモスクシンイミドとメチルスルフィドを用いて化合物２２を処理し、アリルアルコールをその対応する臭化アリルに転換させる(Coreyら Tetrahedron Lett. 1972, 4339)。臭化アリルとアセトアルデヒドのリチウムエノラート(アセトアルデヒドとリチウムジイソプロピルアミドから形成)を反応させ、アルケンアルデヒド化合物２３を得る。

スキーム５Ｂに示すように、まず、３-フェニル-１-プロパノール(24, Aldrich Chemical Co.)を、スワーン条件下でアルデヒドに酸化させ、ビニルマグネシウムブロミドとアルデヒドを反応させると、反応が進行して対応するアリルアルコールが得られる。最初に、アリルアルコールをＮＢＳ及びＤＭＳと反応させて臭化アリルが得られ、マグネシウムを用いて臭化物を対応するグリニャール試薬(２５)に転換させる。ついで、化合物２５をアルデヒド２３に添加し、得られたアルコールを、塩基(例えばＮＥｔ_３)の存在下、塩化トシルを用いて対応するトシラート(２６)に転換させる。保護された４-ヒドロキシブチルグリニャール試薬を用いた処理によりトシラートを置き換えてジエン２７を生成させる。触媒量のホベイダ-グラブス(Hoveyda-Grubbs)第２世代触媒(２８)(Hoveydaら J. Am. Chem. Soc. 121, 791, 1999)を用い、続いてＰｄＣｌ_２を用いるワッカー酸化(Tsuji, J. Synthesis 1990, 739)により、化合物２７の閉環メタセシスで、環状ケトン２９を得る。

式ＩＩの化合物の残りはスキーム６に示すようにして作製される。化合物１０Ｃ（下記のスキーム９を参照）を３-ブロモプロピオンアルデヒドと反応させてアルコール３０を得る。ついで、そのアルコールを塩基（例えばNEt₃）の存在下で臭化エチルで処理して対応するエチルエーテルに転化させ、中間体化合物を金属マグネシウムを用いてその対応するグリニャール試薬（３１）に転化させる。ついで、グリニャール試薬３１を化合物２９に添加し、得られたアルコールを、酸処理で対応するアルケン（３２）まで脱水する（この工程でジオキソラン基がまた除去される）。ついで、化合物３２を水素とカーボン担持パラジウム触媒の存在下で水素化し、アルデヒドを、１）ＫＭｎＯ_４での酸への酸化、２）塩化チオニルでの酸の酸塩化物への転化、及び３）アンモニアとの酸塩化物の反応によって、その対応するアミドに転化させる。ついで、得られるアミド３３を、ＤＣＣとＤＭＡＰ触媒の存在下で化合物５とカップリングさせる（スキーム1を参照）。最後に、保護基Ｐ^２を除去し、得られたアルコールをＫＭｎＯ_４でその対応の酸に酸化させると式ＩＩの化合物が完成する。

式ＩＩＩの化合物の調製法はスキーム７−８に示す。ＢＱ-Ａ０１１００４骨格に対するキーとなる修飾はピペラジン環上に置換されているアミノカルボニル基をアミノカルボニルエチル基で置換し、アミノメチルベンズイミダゾール断片を４-[４-アミノブチル]-４,５-ジヒドロピラゾールで置換することである。

４-[４-アミノブチル]-４,５-ジヒドロピラゾール基の置換はスキーム７に示すように断片５Ａの合成によって達成される。Pechmann条件(T. L. Jacobs in R. C. Elderfield, Heterocyclic Compounds 5, 70 (New York, 1957))下でのジアゾメタンとの６-アミノヘプタイン(heptyne)（１Ａ）の反応により４-[４-アミノブチル]ピラゾールを得て、これをカーボン担持パラジウム触媒の存在下で水素を用いて対応する４,５-ジヒドロピラゾール（２Ａ）に還元する。ついで、ジヒドロピラゾール２Ａを、化合物２の酸塩化物とカップリングさせ（つまり、スキーム１からの化合物２の塩化チオニルとの反応）、アミド３Ａを生成する。ついで、水中３-クロロプロピオン酸及び塩化アルミニウムを用いて化合物３Ａをアルキル化して、三置換フェニル化合物４Ａを製造する。最後に、化合物４Ａを塩化チオニル及びアンモニアと反応させて、カルボン酸をアミド中間体５Ａに転化させる。

アミノカルボニルエチル基の置換を（上のスキーム３で調製される）化合物１７から達成する。スキーム８に示すように、化合物１７を脱保護して元の保護基Ｐ^１を取り除き、ついで遊離アルコールをスワーン条件下でアルデヒドに酸化する。酸化後、中間体をトリブロモホスフィン及び臭素ガスで臭素化しα-ブロモアルデヒド１８Ｂを生成する。α-ブロモアルデヒドを、Horner Wadworth Emmons条件下で（例えばＮＥｔ_３の存在下でジエチルクロロホスホナートと酢酸のｐ-ニトロフェニルエステルから調製される）α-(ｐ-ニトロフェノキシカルボニル)メチルジエチルホスホナートと反応させ、対応するα,β-不飽和γ-ブロモエステルを生成する。ついで、活性化エステルをアンモニアでの処理によって対応するアミド１９Ｂに転化する（Beckwith, A.L.J., Zabicky The Chemistry of Amides; Wiley: NY, 1970, p. 96を参照）。化合物１９Ｂのオレフィンを臭化水素で臭素化して第一級臭化物を得て、中間体から第二保護基（Ｐ^２）を除去し、得られたアルコールを、例えばスワーン又はDess-Martin試薬での処理のような標準的な方法を使用してアルデヒドに酸化する。最後に、α,β-不飽和アミドをカーボン担持パラジウム触媒の存在下で水素で水素化して断片２０Ｂを得る。式ＩＩＩの合成を完了させるために、化合物２０Ａを上のスキーム４に記載された条件下で化合物１２とカップリングさせる。ついで、得られた生成物を、ＤＣＣ及びＤＭＡＰ触媒の存在下で化合物５Ａ（スキーム５参照）とカップリングさせ、アルデヒドを例えばＫＭｎＯ_４で対応のカルボン酸に酸化する。

式ＩＶの化合物の調製法はスキーム９に示す。ＢＱ-Ａ０１１００４骨格に対するキーとなる修飾はピペラジン環のエトキシ基を２-メチルブチル基で置換しフェニルアミド基をイソプロピルアミド基で置換することである。これらの２つの修飾を有する化合物の合成は修飾断片１３Ｃの合成を経由して達成することができる（スキーム９）。断片１３Ｃは、シクロペンテニルイソプロピルアミド化合物（６Ｃ）を１,３-ジカルボニル化合物（７Ｃ）に四酸化オスミウムを用い、過ヨウ素酸ナトリウムで処理、ついで水及びＮａＨＳＯ_３のような弱い還元剤で処理して転化することによって生成させる。化合物６Ｃは、市販のシクロペンタノン(Aldrich Chemical Co.)から、（１）酢酸エチルのエノラートとシクロペンタノンをアルドール反応させ、（２）得られたアルコールを酸処理で脱水し、（３）得られたα,β-不飽和エステルをリチウムイソプロピルアミドと反応させてその対応するアミドへ転化させる３工程で生成する（Majetichら Tetrahedron Lett. 1994, 35, 8727)。化合物７Ｃは、例えばＫＭｎＯ_４での処理のような標準的な技術を使用しカルボン酸化合物８Ｃに酸化する。化合物８Ｃを塩化ビニルマグネシウムで処理し、続いて得られたアルコールを酸で脱水してジエン化合物９Ｃを得る。化合物９Ｃのビニルアルケンを臭化水素で臭素化した後、触媒量のカーボンパラジウムの存在下で水素ガスでヘプテニルオレフィンを水素化する。最後に、１-ブロモアルカンをマグネシウムと反応させてアルキルグリニャール試薬１０Ｃを生成する。ついで、化合物１０Ｃをエーテル中で３-アミノプロパナールと反応させた後、弱酸で処理してアルコール化合物１１Ｃを生成する。化合物１１Ｃを、例えばＮＥｔ_３のような塩基の存在下で塩化トシルで処理することによってその対応するトシラート１２Ｃに転化させる。最後に（エーテル中での３-メチル-１-ブロモブタン及びマグネシウムから生成される）臭化３-メチルブチルマグネシウムでのトシラート１２Ｃの処理により断片１３Ｃを得る。式ＩＶの化合物の合成の残りは、スキーム４（上掲）の化合物１２を化合物１３Ｃに置換し、化合物１９及び５との適切なカップリング反応を行わしめることによって達成することができる。

式Ｖの化合物の調製法はスキーム１０に示す。ＢＱ-Ａ０１１００４骨格に対するキーとなる修飾はフェニルアミド基をイソプロピルアミド基で置換することである。これらの２つの修飾を有する化合物の合成は修飾断片１２Ｄの合成を経由して達成することができる。スキーム１０において、中間体１２Ｄは、シクロペンテニルイソプロピルアミド化合物（６Ｃ）を１,３-ジカルボニル化合物（７Ｃ）に四酸化オスミウムを用い、過ヨウ素酸ナトリウムで処理、ついで水及びＮａＨＳＯ_３のような弱い還元剤で処理して転化することによって生成させる。化合物７は、例えばＫＭｎＯ_４での処理のような標準的な技術を使用しカルボン酸化合物８Ｃに酸化する。化合物８Ｃを塩化ビニルマグネシウムで処理し、続いて得られたアルコールを酸で脱水してジエン化合物９Ｃを得る。化合物９Ｃのビニルアルケンを臭化水素で臭素化した後、触媒量のカーボンパラジウムの存在下で水素ガスでヘプテニルオレフィンを水素化する。最後に、１-ブロモアルカンをマグネシウムと反応させてアルキルグリニャール試薬１０Ｃを生成する。ついで、化合物１０Ｃをエーテル中で３-アミノプロパナールと反応させた後、弱酸で処理してアルコール化合物１１Ｃを生成する。最後に、化合物１１Ｃを塩基とその後に臭化エチルと次に酸と反応させてエチルエーテル中間体１２Ｄを生成する。式ＩＶの化合物の合成の残りは、スキーム４（上掲）の化合物１２を化合物１２Ｄに置換し、化合物１９及び５との適切なカップリング反応を行わしめることによって達成することができる。

式ＶＩの化合物のＢＱ-Ａ０１１００４骨格に対するキーとなる修飾はアミノメチルベンズイミダゾール断片を４-[４-アミノブチル]-４,５-ジヒドロピラゾールで置換することである。その合成は、ＤＭＡＰ触媒の存在下でＤＣＣと共に化合物２０（スキーム４参照）と化合物５Ａ（スキーム７を参照）をカップリングさせた後、例えばＫＭｎＯ_４でアルデヒドを対応するカルボン酸に酸化することによって達成される。

本発明のファーマコフォア分子は、分子を、選択的に他のものを排除しながらＰＦ４ファーマコフォアの所定の点を含むように選択し又は修飾することによって選択又は修飾することもできる。例えば、如何なる特定の理論又は作用機序にも拘束されるものではないが、（ＰＦ４レセプターに結合するがそれを活性化しない）リードＰＦ４アンタゴニストは、標的（この例ではＰＦ４レセプター）活性化に必要とされるかそのために好ましい他の点を選択的に排除しながら、ＰＦ４レセプターへの結合に必要とされ及び／又はそのために好ましい所定のファーマコフォア点を含む化合物を同定することによって選択及び／又は同定することができる。上のセクション５．１．をまた参照のこと。

そのような一つの化合物の化学構造を図９Ａに示す（式ＶＩＩ）。この化合物はＰＦ４ファーマコフォア点ＩＸ、Ｘ及びＶＩ（以下の表１及び５）に対応する官能基を含む一方、残りのＰＦ４ファーマコフォア点（つまり点ＩからＶ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ）に対応する官能基が存在していない。この化合物は、標的を活性化させないでＰＦ４レセプターへの結合について野生型ＰＦ４（配列番号：１）及びＢＱ-Ａ０１１００４（式Ｉ）のような他の分子と競合することが予想される。よって、この化学構造を有する化合物は、本発明に係るＰＦ４アンタゴニストであると予想され、ＰＦ４アンタゴニストとして使用することができる。

好ましい実施態様では、かかるＰＦ４アゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物はＰＦ４レセプターポリペプチド又はその断片を検出するために使用することができる。例えば、ＰＦ４アゴニスト又はアンタゴニストを検出可能な標識に結合させることができ、ＰＦ４レセプターへのアゴニスト分子の結合を、検出可能な標識を検出することによって検出することができる。特定の実施態様では、ＰＦ４アゴニストは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のような医療画像診断用途での検出のための造影剤に結合させられる。画像診断目的では、様々な診断薬の任意のものを薬学的組成物中に、組成物内に遊離に又は調節薬に結合させて導入することができる。診断薬には、他の生理学的な機能に一般に影響を与えないで患者内のある生理学的機能を明るくするために投与される任意の物質が含まれる。診断薬には、金属、放射性同位元素及び放射線不透性薬剤（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素及びリン含有化合物）、放射線透過性剤、造影剤、染料（例えば蛍光染料及び発色団）及び熱量測定又は蛍光測定反応を触媒する酵素 が含まれる。一般に、そのような薬剤は上述した様々な技術を使用して結合させることができ、任意の配向で存在しうる。そのような実施態様では、一又は複数の水溶性ポリマー（例えばポリエチレングリコール又は「ＰＥＧ」）をＰＦ４アゴニスト又はアンタゴニストに結合させることもできる。
好適な一実施態様を図９Ｂに示す。ここでは、リンカー部分を、造影剤又はＤＯＴＡ環内に入れられたランタニド原子のような他の検出可能な標識を結合させるために使用することができる。

６．６．更なるＰＦ４誘導ポリペプチド
更に他の実施態様において、本発明は、ＰＦ４のアミノ酸配列から誘導され、ここに記載の方法によって例えばＰＦ４アゴニスト及び／又はアンタゴニストとして有用な更に他のペプチドを提供する。これらの他の実施態様の特に好ましいポリペプチドには、次のアミノ酸配列の何れか一又は複数を有するポリペプチドが含まれる：

上記のＰ３４−５６（配列番号：１５７）と命名したペプチドは、図１Ｃに示す完全長成熟ＰＦ４アミノ酸配列（配列番号：１）の残基３４−５６に対応するアミノ酸配列からそれが誘導されているためそのように命名している。このペプチドはＰＦ４レセプターに結合しそれを活性化させると理解され、従って本発明の方法によるＰＦ４アゴニストとして特に有用である。如何なる特定の理論又は作用機序に限定するものではないが、Ｐ３４−５６（配列番号：１５７）の活性は、配列番号：１５７の残基５−１３を含むαへリックス領域の残基によって少なくとも部分的に媒介されると信じられる。この配列は配列番号：１のアミノ酸残基３８−４６の配列を含む成熟ＰＦ４ポリペプチド（図１Ｃ）のαへリックス領域に対応している。次に、Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）のαへリックスは、そのペプチドのアミノ酸残基１−４の配列に対応する「キャッピングボックス」部分によって少なくとも部分的に安定化されるものと理解される。このキャッピングボックス部分は、他の点ではＰ３４−５６の配列（配列番号：１５７）と同一であるＰ３７−５６（配列番号：１５８）と命名された第二ペプチドには存在していない。このキャッピングボックスの除去は、αへリックス部分を不安定にし、よって得られるペプチドを不活性にするものと理解される。よって、上掲のＰ３７−５６ペプチド（配列番号：１５８）は、ＰＦ４レセプターを活性化させない点で不活性であると理解される。

Ｐ３４−５３（配列番号：１５９）と命名されたペプチドは同様に図１Ｃに示す完全長成熟ＰＦ４アミノ酸配列（配列番号：１）の残基３４−５３に対応するアミノ酸配列からそれが誘導されているためそのように命名している。Ｐ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）は標的結合についてＰ３４−５６（配列番号：１５７）と競合するが、ＰＦ４レセプターを活性化しない。よって、このペプチドは本発明の方法によるＰＦ４アンタゴニストとして特に有用である。好ましい実施態様では、検出可能な標識をＰ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）に結合させることができ、そのペプチドを、例えば診断アッセイにおいてＰＦ４レセプターポリペプチドを検出するために使用することができる。特に好ましい実施態様では、Ｐ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）は、例えば磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）又は他の医療画像処理及び／又は診断アッセイの一部として、個体においてインビボでＰＦ４レセプターポリペプチド（又はその断片）を検出するために使用することができる。
Ｐ３５−５３（配列番号：１６０）と命名されたペプチドは、Ｐ３４−５３（配列番号：１５９）のＨｉｓ２残基が除去されている点を除いて、Ｐ３４−５３（配列番号：１５９）と同一である。この修飾はＰＦ４結合活性を無効にすることが理解され、よってＰ３５−５３ペプチド（配列番号：１６０）はＰＦ４レセプターを結合したり活性化させたりしない。

如何なる特定の理論又は作用機序にも拘束されるものではないが、これらのペプチドの活性は、本願において上に記載したＰＦ４ファーマコフォア点の必ずしも全てではないが幾らかに対応する所定のアミノ酸残基の立体配置に起因していると考えられる。これは、様々なペプチドの三次元構造をＰＦ４ファーマコフォア立体配置と比較することによってより容易に理解することができる。二つのそのような例示的な比較を図１０Ａ−１０Ｂにおいてここに提供する。
特に、図１０Ａの下半分はＰ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）骨格の三次元表示を提供するもので、それを図２Ａに示すＰＦ４ファーマコフォア構造（図１０Ａの上半分にも示されている）と比較する。簡単のために、Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）アミノ酸残基は、完全長成熟野生型ＰＦ４アミノ酸配列（配列番号：１）中の対応する残基の数を用いて図１０Ａにおいて標識している。

ＰＦ４ファーマコフォアはＰ３４−５６ペプチドには部分的に存在している。すなわち、Ｐ３４−５６（配列番号：１５７）中のＧｌｎ２３は野生型成熟ＰＦ４（配列番号：１）中のＧｌｎ９の位置と配向を模倣しており、よって上掲の表１に列挙したＰＦ４ファーマコフォア点ＩＩＩ及びＩＶに対応する官能基を提供する。Ｐ３４−５６（配列番号：１５７）中のＬｅｕ２２はＷＴＰＦ４（配列番号：１）の位置と配向を模倣しており、よってＰＦ４ファーマコフォア点ＶＩＩＩに対応する官能基を提供する。Ｐ３４−５６（配列番号：１５７）中のＡｓｐ２１は野生型ＰＦ４（配列番号：１）のＡｓｐ７位置と配向を模倣しており、よってＰＦ４ファーマコフォア点Ｉ及びＩＩに対応する官能基を提供する。Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）残基Ｌｅｕ１２はＷＴＰＦ４（配列番号：１）中のＬｅｕ１１アミノ酸残基の位置と配向を模倣しており、ファーマコフォア点Ｘに対応する官能基を提供する。Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）アミノ酸残基Ｉｌｅ９はＷＴＰＦ４（配列番号：１）残基Ｖａｌ１３を模倣しており、ＰＦ４ファーマコフォア点ＩＸを提供する。最後に、Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）のＨｉｓ２アミノ酸残基はＷＴＰＦ４（配列番号：１）のＧｌｎ１８を模倣している。従って、この アミノ酸残基はＰＦ４ファーマコフォアＶＩに対応する官能基を提供する。しかしながら、グルタミンとは異なり、ヒスチジン側鎖は酸素を含んでいない。よって、 Ｈｉｓ２と、拡大してＰ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）自体はＰＦ４ファーマコフォア点Ｖに対応する官能基を含んでいない。ＰＦ４ファーマコフォア点ＶＩＩに対応する官能基はまたＰ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）には存在していない。

上で説明したように、Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）は、配列番号：１で示されたＷＴＰＦ４アミノ酸配列のアミノ酸残基３４−５６の配列から誘導されそれに対応する。従って、当業者は、そのペプチド（配列番号：１５７）中のＨｉｓ２、Ｉｌｅ９、Ｌｅｕ１２、Ａｓｐ２１、Ｌｅｕ２２及びＧｌｎ２３は配列番号：１中の残基Ｈｉｓ３５、Ｉｌｅ４２、Ｌｅｕ４５、Ａｓｐ５４、Ｌｅｕ５５及びＧｌｎ５６にそれぞれ対応していることを理解するであろう。従って、これらの残基は、それらが誘導されそれらが対応するＷＴＰＦ４（配列番号：１）中の残基によって図１０Ａの下半分において特定されている。

図１０Ａの更なる検討はＰＦ４ファーマコフォアの点ＩからＩＶ及びＶＩＩＩの機能的な重要性に更なる洞察をもたらす。これらの点は全てＷＴＰＦ４アミノ酸配列（配列番号：１）中のアミノ酸残基配列Ａｓｐ７-Ｌｅｕ８-Ｇｌｎ９に位置している。Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）はまた残基２１−２３にＤＬＱモチーフを含んでいる。如何なる特定の理論又は作用機序にも拘束されるものではないが、Ｐ３４−５７（配列番号：１５７）中のこのＤＬＱモチーフは水素結合の網目構造によって安定化されるものと思われ、よってそのコンフォメーションはＷＴＰＦ４中の残基７−９のＤＬＱモチーフのＮ末端フォールディングを模倣している。

図１０Ｂは図２ＡのＰＦ４ファーマコフォアに対するＰ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）の同様の比較を示す。同様に、この図のペプチド残基は、それらが対応する完全長ＷＴＰＦ４のアミノ酸残基（配列番号：１）によって標識される。特に、Ｐ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）は配列番号：１のＨｉｓ３５、Ｉｌｅ４２及びＬｅｕ４５に対応するアミノ酸残基を含み、ＰＦ４ファーマコフォアの点ＶＩ、ＩＸ及びＸに対応する官能基を提示する。しかしながら、ＤＬＱ残基は、Ｐ３４−５６ペプチド（配列番号：１５７）には見いだされるが、Ｐ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）には存在せず、そのペプチドはファーマコフォア点ＩからＩＶ及びＶＩＩＩに対応する官能基は有していない。従って、Ｐ３４−５３ペプチド（配列番号：１５９）はＰＦ４レセプターへの結合についてＰＦ４と効果的に競合し、例えば本発明によるＭＲＩ画像処理研究に使用することができる。しかしながら、そのペプチドはＰＦ４レセプターを活性化せず、効果的なＰＦ４アゴニストではない。

７．引用文献
特許、特許出願及び様々な刊行物を含む数多くの文献を本発明の明細書において引用し検討している。このような文献の引用及び／又は検討は本発明の説明を明確にするためだけに提供するものであり、それらの如何なる文献もここに記載された発明に対して「先行技術」であることを自認するものではない。（例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰＤＢ又は他の公的なデータベースにおける生物学的配列又は構造の引用を含む）本明細書において引用され及び／又は検討されている全ての文献は、各文献が個々に出典明示によって援用されるのと同程度でその全体が出典明示によりここに援用される。

８．アペンディックス：ＰＦ４の結晶構造座標
Zhangら, Biochemistry 1994, 33:8361-8366とプロテインデータバンクの受託番号１ＲＨＰ（双方を出典明示によりその全体を援用する）をまた参照のこと。

図１Ａ−Ｃは、好ましいＰＦ４ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。図１Ａは、GenBank(受託番号P02776)からの完全長ＰＦ４ポリペプチド配列のアミノ酸配列(配列番号：３２)を表す。この完全長ＰＦ４ポリペプチドには、「シグナル配列」(残基１−３１)と、アミノ酸残基３２−１０１を含む「成熟」ＰＦ４配列を含む。 図１Ｂは、好ましい変異体、ＰＦ４ｖａｒ１のアミノ酸配列(配列番号：３３)を表す。この変異体も、「シグナル配列」(残基１−３４)と、残基３５−１０４を含有する「成熟」配列を含む。 図１Ｃは、好ましい成熟ヒトＰＦ４ポリペプチド(配列番号：３２の残基３２−１０１)のアミノ酸配列(配列番号：１)を表す。図１Ｃの破線は、システインアミノ酸残基の間の共有結合を示す。図１Ｃにおいて、配列の網掛け部は、本発明のファーマコフォアの一部であり、ヘパラン硫酸結合ドメイン(配列番号：１の残基２２−２３、４９−５０及び６１−６６)であるＤＬＱ結合モチーフ(配列番号：１の残基７−９及び５４−５６)に相当する。 図２Ａ−２Ｂは、本発明のＰＦ４ファーマコフォアの１０全ての主要な官能基の三次元配置を示す。図２Ａは、以下のアペンディクスに記載されている座標に基づく、成熟ＰＦ４ポリペプチド骨格の三次元構造を示し、いくつかが同じ残基にある１０の重要な官能基を強調表示している。天然の成熟ＰＦ４分子上に表示されているファーマコフォアの官能基を有するアミノ酸残基は、ファーマコフォアの各官能基を円で囲みローマ数字で標識している。 図２Ｂは、天然ＰＦ４ファーマコフォア(又はＰＦ４模倣体である本発明のファーマコフォア)における種々の官能基の幾何学的配置を示しており、官能基の各対間の距離を表示する線は図２Ａで使用したものと同じローマ数字で標識している。同心円で示された球は、水素結合アクセプターである官能基を表示する一方、グレーの球は水素結合ドナーを示す。これらの官能基に隣接する黒い球は、これら各官能基それぞれにおける理想的な水素結合の方向を付与する参照ポイントＡを示している。説明については、上述の実施例６．２．５を参照のこと。疎水性官能基ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸの周囲に描かれた網目は、それらのポイントの回りの疎水性領域の好ましい容積を示している。 図３Ａ−３Ｂは、同じ原点を有するデカルト及び球座標系での本発明のＰＦ４ファーマコフォアの三次元配置及び結合ポテンシャルを示す。図３Ａは、同じ原点を有するデカルト及び球座標系でのＰＦ４ファーマコフォアの１０全ての主要な官能基の三次元配置を示す。 図３Ｂは、図３Ａの座標系におけるファーマコフォアポイントＶＩの周囲の疎水性容積の配置、並びにファーマコフォアポイントＶからの２つの可能性のある水素結合ベクトルの一方の方向とその対応する水素結合ポテンシャル表面積を示す。 図４は、水素結合供与及び水素結合ベクトル及び可能性のある球を示す。理想的な水素結合ポテンシャルの球状キャップが算出され、極性ファーマコフォアポイントに対する理想的な水素結合表面積に対応する水素結合ベクトルの長さの１／４で分断されていることが示されている。 図５は、ＢＱ-Ａ０１１０４、つまり７つの異なるサブユニット又は「領域」として概念化された骨格により構造的に剛性を保持している上の表５に列挙された１０全てのＰＦ４ファーマコフォアポイントを含む特定の化合物の化学構造を示しており、ここで１０のファーマコフォアポイントのそれぞれは対応するローマ数字で表示され、構造的サブユニットのそれぞれは対応するアラビア数字で示されている。 図６Ａは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｂは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｃは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｄは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｅは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｆは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図６Ｇは、ＢＱ-Ａ０１１０４の骨格中の構造的サブユニット又は「領域」を示す。 図７は、化合物ＢＱ-Ａ０１１０４を最適化するためになされ得る所定の例示的な修飾を示す。 図８は、修飾した化合物(式ＩＩ−ＶＩ)の完全な化学構造を示す。 図９Ａ−９Ｂは、例示的なＰＦ４アゴニストの完全な化学構造を示す。図９ＡはＰＦ４アゴニスト(式ＶＩＩ)の好ましい一例の完全な化学構造を示す。 図９Ｂに示す化学構造(式ＶＩＩＩ)は、例えば磁気共鳴映像法(ＭＲＩ)等の医療イメージングアッセイにおいて、ＰＦ４ポリペプチドを検出するため、そこに結合せしめられた造影剤とＰＦ４アゴニストの好ましい例を表す。 図１０Ａ−１０Ｂは、ｗｔＰＴ４(配列番号：１)におけるファーマコフォアポイントの三次元構造に対してペプチドＰ３４−５６(配列番号：１５７)及びＰ３４−５３(配列番号：１５９)の三次元構造を比較したものである。図１０Ａでは、Ｐ３４−５６ペプチド(配列番号：１５７)の三次元構造の描写は、図の下半分に示されている。ｗｔＰＦ４(配列番号：１)におけるＡｓｐ７-Ｈｉｓ２３からの領域の三次元構造の描写は、ペプチドの上に示される。 図１０Ｂにおいて、Ｐ３４−５３ペプチド(配列番号：１５９)の三次元構造の描写は、Ａｓｐ７-Ｈｉｓ２３からの領域のｗｔＰＦ４(配列番号：１)の三次元構造の描写の下、図の下半分に示されている。Ｐ３４−５６及びＰ３４−５３ペプチド(それぞれ配列番号：１５７及び１５９)におけるアミノ酸残基は、それらが対応する完全長ＷＴＰＦ４アミノ酸配列(配列番号：１)の残基を示すように標識されている。

Claims (81)

1. 図１Ｃ(配列番号：１)に記載のＰＦ４配列中のアミノ酸側鎖の官能基からそれぞれが選択される複数の官能基を有するＰＦ４活性を調節する化合物であって、該アミノ酸側鎖が：Ａｓｐ７、Ｌｅｕ８、Ｇｌｎ９、Ｌｅｕ１１、Ｖａｌ１３、Ｈｉｓ２３、Ｇｌｎ１８を含み、ＰＦ４、ＩＬ-８、ＰＦ４突然変異体又は配列番号：３４−１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドではない化合物。
2. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ１及びＯ２原子を含む、請求項１に記載の化合物。
3. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ８のＣＧ原子を含む、請求項１に記載の化合物。
4. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＮＥ２及びＯＥ１原子を含む、請求項１に記載の化合物。
5. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ１１のＣＧ原子を含む、請求項１に記載の化合物。
6. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｖａｌ１３のＣＢ原子を含む、請求項１に記載の化合物。
7. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｈｉｓ２３のＮＥ２原子を含む、請求項１に記載の化合物。
8. ファーマコフォアの官能基が、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＮＥ２及びＯＥ１原子を含む、請求項１に記載の化合物。
9. ＰＦ４アゴニストである、請求項１に記載の化合物。
10. ＰＦ４アンタゴニストである、請求項１に記載の化合物。
11. 検出可能標識をさらに有する、請求項１０に記載の化合物。
12. 前記化合物が、配列番号：１５７及び配列番号：１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
13. 官能基Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸを有するＰＦ４活性を調節する化合物であって、三次元における官能基間の距離が、ほぼ：
    ２．２５±０．０５Å 基ＩとＩＩの間；
    ６．０３±１．３７Å 基ＩとＩＩＩの間；
    ６．９２±１．６０Å 基ＩとＩＶの間；
    ８．５７±２．６０Å 基ＩとＶＩＩＩの間；
    １４．２０±１．５３Å 基ＩとＩＸの間；
    １２．５４±１．５１Å 基ＩとＸの間；
    ６．００±２．４３Å 基ＩＩとＩＩＩの間；
    ７．０１±１．８４Å 基ＩＩとＩＶの間；
    ９．０９±１．２２Å 基ＩＩとＶＩＩＩの間；
    １４．４５±０．２４Å 基ＩＩとＩＸの間；
    １３．２８±０．３７Å 基ＩＩとＸの間；
    ２．３１±０．０７Å 基ＩＩＩとＩＶの間；
    ９．１９±１．４０Å 基ＩＩＩとＶＩＩＩの間；
    １０．９１±１．７４Å 基ＩＩＩとＩＸの間；
    ７．０６±２．４９Å 基ＩＩＩとＸの間；
    ９．０２±０．６３Å 基ＩＶとＶＩＩＩの間；
    １０．４６±０．４６Å 基ＩＶとＩＸの間；
    ６．５２±１．２６Å 基ＩＶとＸの間；
    ６．８７±０．９６Å 基ＶＩＩＩとＩＸの間；
    ９．８４±１．０５Å 基ＶＩＩＩとＸの間；
    ７．２５±０．４９Å 基ＩＸとＸの間；
    であり、該化合物がＰＦ４、ＩＬ-８、ＰＦ４突然変異体、配列番号：３４−１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドではない化合物。
14. 官能基Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩをさらに有し、三次元における官能基間の距離が、ほぼ：
    ３０．２７±２．９２Å 基ＩとＶの間；
    ２９．９４±２．４９Å 基ＩとＶＩの間；
    ３０．４１±４．３１Å 基ＩとＶＩＩの間；
    ３０．８３±１．９９Å 基ＩＩとＶの間；
    ３０．３３±１．９７Å 基ＩＩとＶＩの間；
    ３１．２４±４．０３Å 基ＩＩとＶＩＩの間；
    ２６．３５±２．７６Å 基ＩＩＩとＶの間；
    ２６．５７±２．０２Å 基ＩＩＩとＶＩの間；
    ２６．３１±３．０５Å 基ＩＩＩとＶＩＩの間；
    ２５．５８±１．４０Å 基ＩＶとＶの間；
    ２５．８０±１．３１Å 基ＩＶとＶＩの間；
    ２５．３４±２．８１Å 基ＩＶとＶＩＩの間；
    ３．８５±１．５４Å 基ＶとＶＩの間；
    １０．２１±２．２１Å 基ＶとＶＩＩの間；
    ２３．１０±２．２１Å 基ＶとＶＩＩＩの間；
    １７．２９±１．６８Å 基ＶとＩＸの間；
    １９．２５±２．１２Å 基ＶとＸの間；
    １４．０７±０．９４Å 基ＶＩとＶＩＩの間；
    ２１．８４±２．７４Å 基ＶＩとＶＩＩＩの間；
    １６．４２±２．０３Å 基ＶＩとＩＸの間；
    １９．９５±２．０２Å 基ＶＩとＸの間；
    ２５．３８±４．３９Å 基ＶＩＩとＶＩＩＩの間；
    ２０．６０±３．５７Å 基ＶＩＩとＩＸの間；及び
    １８．７６±３．７２Å 基ＶＩＩとＸの間；
    である、請求項１３に記載の化合物。
15. 官能基Ｉが、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ１原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
16. 官能基ＩＩが、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ２原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
17. 官能基ＩＩＩが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＮＥ２原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
18. 官能基ＩＶが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＯＥ１原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
19. 官能基ＶＩＩＩが、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ８のＣＧ原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
20. 官能基Ｘが、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ１１のＣＧ原子に対応する、請求項１３に記載の化合物。
21. 官能基Ｖが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＯＥ１原子に対応する、請求項１４に記載の化合物。
22. 官能基ＶＩが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＮＥ２原子に対応する、請求項１４に記載の化合物。
23. 官能基ＶＩＩが、アミノ酸側鎖Ｈｉｓ２３のＮＥ２原子に対応する、請求項１４に記載の化合物。
24. 官能基ＩＸが、アミノ酸側鎖Ｖａｌ１３のＣＢ原子に対応する、請求項１４に記載の化合物。
25. 官能基の距離の二乗平均平方根偏差が１．０オングストローム未満である、請求項１３に記載の化合物。
26. 官能基の距離の二乗平均平方根偏差が０．５オングストローム未満である、請求項２５に記載の化合物。
27. 官能基の距離の二乗平均平方根偏差が０．１オングストローム未満である、請求項２６に記載の化合物。
28. ＰＦ４アンタゴニストである、請求項１３に記載の化合物。
29. ＰＦ４アンタゴニストである、請求項１３に記載の化合物。
30. 検出可能標識をさらに有する、請求項２９に記載の化合物。
31. 前記化合物が、配列番号：１５７及び配列番号：１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１３に記載の化合物。
32. ＰＦ４活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
    (ａ)候補化合物の三次元構造を、
    (ｂ)ＰＦ４ファーマコフォアの三次元構造、
    と比較することを含み、
    候補化合物とＰＦ４ファーマコフォアの間の類似性が、ＰＦ４活性を調節する候補化合物の能力の指標である方法。
33. 候補化合物とＰＦ４ファーマコフォアの三次元の間の二乗平均平方根偏差(ＲＭＳＤ)が、約１．０を越えない、請求項３２に記載の方法。
34. 候補化合物がペプチド模倣体である、請求項３２に記載の方法。
35. 候補化合物がＰＦ４アゴニストである、請求項３２に記載の方法。
36. 候補化合物がＰＦ４アンタゴニストである、請求項３２に記載の方法。
37. ＰＦ４ファーマコフォアが複数の官能基を有しており、各官能基が図１Ｃ(配列番号：１)に記載のＰＦ４配列中のアミノ酸側鎖の官能基から選択され、該アミノ酸側鎖が：Ａｓｐ７、Ｌｅｕ８、Ｇｌｎ９、Ｌｅｕ１１、Ｖａｌ１３、Ｈｉｓ２３、Ｇｌｎ１８を含み、ＰＦ４、ＩＬ-８、ＰＦ４突然変異体又は配列番号：３４−１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドではない、請求項３２に記載の方法。
38. 官能基が、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ１及びＯ２原子を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ８のＣＧ原子を含む、請求項３７に記載の方法。
40. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＮＥ２及びＯＥ１原子を含む、請求項３７に記載の方法。
41. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ１１のＣＧ原子を含む、請求項３７に記載の方法。
42. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｖａｌ１３のＣＢ原子を含む、請求項３７に記載の方法。
43. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｈｉｓ２３のＮＥ２原子を含む、請求項３７に記載の方法。
44. 官能基が、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＮＥ２及びＯＥ１原子を含む、請求項３７に記載の方法。
45. ＰＦ４ファーマコフォアが官能基Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸを有し、三次元における官能基間の距離が、ほぼ：
    ２．２５±０．０５Å 基ＩとＩＩの間；
    ６．０３±１．３７Å 基ＩとＩＩＩの間；
    ６．９２±１．６０Å 基ＩとＩＶの間；
    ８．５７±２．６０Å 基ＩとＶＩＩＩの間；
    １４．２０±１．５３Å 基ＩとＩＸの間；
    １２．５４±１．５１Å 基ＩとＸの間；
    ６．００±２．４３Å 基ＩＩとＩＩＩの間；
    ７．０１±１．８４Å 基ＩＩとＩＶの間；
    ９．０９±１．２２Å 基ＩＩとＶＩＩＩの間；
    １４．４５±０．２４Å 基ＩＩとＩＸの間；
    １３．２８±０．３７Å 基ＩＩとＸの間；
    ２．３１±０．０７Å 基ＩＩＩとＩＶの間；
    ９．１９±１．４０Å 基ＩＩＩとＶＩＩＩの間；
    １０．９１±１．７４Å 基ＩＩＩとＩＸの間；
    ７．０６±２．４９Å 基ＩＩＩとＸの間；
    ９．０２±０．６３Å 基ＩＶとＶＩＩＩの間；
    １０．４６±０．４６Å 基ＩＶとＩＸの間；
    ６．５２±１．２６Å 基ＩＶとＸの間；
    ６．８７±０．９６Å 基ＶＩＩＩとＩＸの間；
    ９．８４±１．０５Å 基ＶＩＩＩとＸの間；
    ７．２５±０．４９Å 基ＩＸとＸの間；
    であり、該化合物がＰＦ４、ＩＬ-８、ＰＦ４突然変異体、配列番号：３４−１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドではない、請求項３２に記載の方法。
46. ＰＦ４ファーマコフォアが官能基Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩをさらに有し、三次元における官能基間の距離が、ほぼ：
    ３０．２７±２．９２Å 基ＩとＶの間；
    ２９．９４±２．４９Å 基ＩとＶＩの間；
    ３０．４１±４．３１Å 基ＩとＶＩＩの間；
    ３０．８３±１．９９Å 基ＩＩとＶの間；
    ３０．３３±１．９７Å 基ＩＩとＶＩの間；
    ３１．２４±４．０３Å 基ＩＩとＶＩＩの間；
    ２６．３５±２．７６Å 基ＩＩＩとＶの間；
    ２６．５７±２．０２Å 基ＩＩＩとＶＩの間；
    ２６．３１±３．０５Å 基ＩＩＩとＶＩＩの間；
    ２５．５８±１．４０Å 基ＩＶとＶの間；
    ２５．８０±１．３１Å 基ＩＶとＶＩの間；
    ２５．３４±２．８１Å 基ＩＶとＶＩＩの間；
    ３．８５±１．５４Å 基ＶとＶＩの間；
    １０．２１±２．２１Å 基ＶとＶＩＩの間；
    ２３．１０±２．２１Å 基ＶとＶＩＩＩの間；
    １７．２９±１．６８Å 基ＶとＩＸの間；
    １９．２５±２．１２Å 基ＶとＸの間；
    １４．０７±０．９４Å 基ＶＩとＶＩＩの間；
    ２１．８４±２．７４Å 基ＶＩとＶＩＩＩの間；
    １６．４２±２．０３Å 基ＶＩとＩＸの間；
    １９．９５±２．０２Å 基ＶＩとＸの間；
    ２５．３８±４．３９Å 基ＶＩＩとＶＩＩＩの間；
    ２０．６０±３．５７Å 基ＶＩＩとＩＸの間；及び
    １８．７６±３．７２Å 基ＶＩＩとＸの間；
    である、請求項３２に記載の方法。
47. 官能基Ｉが、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ１原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
48. 官能基ＩＩが、アミノ酸側鎖Ａｓｐ７のＯＤ２原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
49. 官能基ＩＩＩが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＮＥ２原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
50. 官能基ＩＶが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ９のＯＥ１原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
51. 官能基ＶＩＩＩが、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ８のＣＧ原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
52. 官能基Ｘが、アミノ酸側鎖Ｌｅｕ１１のＣＧ原子に対応する、請求項４５に記載の方法。
53. 官能基Ｖが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＯＥ１原子に対応する、請求項４６に記載の方法。
54. 官能基ＶＩが、アミノ酸側鎖Ｇｌｎ１８のＮＥ２原子に対応する、請求項４６に記載の方法。
55. 官能基ＶＩＩが、アミノ酸側鎖Ｈｉｓ２３のＮＥ２原子に対応する、請求項４６に記載の方法。
56. 官能基ＩＸが、アミノ酸側鎖Ｖａｌ１３のＣＢ原子に対応する、請求項４６に記載の方法。
57. 図１Ｃ(配列番号：１)に記載のアミノ酸配列を有し、ＰＦ４とヘパラン硫酸の相互作用を調節する少なくとも一のアミノ酸置換を含むＰＦ４ポリペプチド。
58. 前記突然変異が：Ｌｙｓ６１→Ｇｌｎ、Ｌｙｓ６２→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ６５→Ｇｌｎ及びＬｙｓ６６→Ｇｌｕからなる群から選択される、請求項５７に記載のＰＦ４ポリペプチド。
59. 図１Ｃ(配列番号：１)に記載のアミノ酸配列を有し、Ｇｌｎ９→Ａｒｇ、Ｇｌｎ９→Ａｌａ及びＡｓｐ７→Ａｌａからなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸置換を含むＰＦ４ポリペプチド。
60. 図１Ｃ(配列番号：１)に記載のアミノ酸配列を有し、Ｌｅｕ１１→Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３→Ｇｌｎ及びＴｈｒ１６→Ａｌａからなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸置換を含むＰＦ４ポリペプチド。
61. 図１Ｃ(配列番号：１)に記載のアミノ酸配列を有し、Ｇｌｎ１８→Ａｌａ、Ｖａｌ１９→Ｓｅｒ及びＨｉｓ２３→Ａｌａからなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸置換を含むＰＦ４ポリペプチド。
62. 配列番号：２−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、突然変異ＰＦ４ポリペプチド。
63. 配列番号：１５７−１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
64. 化学式：
    

    

    を有する、請求項１に記載の化合物。
65. 前記化合物が、式ＩＩ−ＶＩＩ(図８)のいずれかに示す化学構造を有する、請求項１に記載の化合物。
66. 式ＶＩＩＩ(図９Ａ)に示す化学構造を有する、請求項１に記載の化合物。
67. (ａ)ＰＦ４アンタゴニストと；
    (ｂ)前記ＰＦ４アンタゴニストに結合した検出可能標識；
    を有する検出可能マーカー。
68. ＰＦ４アンタゴニストが式ＶＩＩ(図９Ａ)に示す化学構造を有する、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
69. 式ＶＩＩＩ(図９Ｂ)に示す化学構造を有する、請求項６８に記載の検出可能マーカー。
70. ＰＦ４アンタゴニストが、図１Ｃ(配列番号：１)に記載のＰＦ４配列中のアミノ酸側鎖の官能基から選択される複数の官能基を有しており、該アミノ酸側鎖が：Ａｓｐ７、Ｌｅｕ８、Ｇｌｎ９、Ｌｅｕ１１、Ｖａｌ１３、Ｈｉｓ２３及びＧｌｎ１８を含む、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
71. (ａ)ＰＦ４アンタゴニストが官能基Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸを有し、
    (ｂ)三次元における官能基間の距離が、ほぼ：
    ２．２５±０．０５Å 基ＩとＩＩの間；
    ６．０３±１．３７Å 基ＩとＩＩＩの間；
    ６．９２±１．６０Å 基ＩとＩＶの間；
    ８．５７±２．６０Å 基ＩとＶＩＩＩの間；
    １４．２０±１．５３Å 基ＩとＩＸの間；
    １２．５４±１．５１Å 基ＩとＸの間；
    ６．００±２．４３Å 基ＩＩとＩＩＩの間；
    ７．０１±１．８４Å 基ＩＩとＩＶの間；
    ９．０９±１．２２Å 基ＩＩとＶＩＩＩの間；
    １４．４５±０．２４Å 基ＩＩとＩＸの間；
    １３．２８±０．３７Å 基ＩＩとＸの間；
    ２．３１±０．０７Å 基ＩＩＩとＩＶの間；
    ９．１９±１．４０Å 基ＩＩＩとＶＩＩＩの間；
    １０．９１±１．７４Å 基ＩＩＩとＩＸの間；
    ７．０６±２．４９Å 基ＩＩＩとＸの間；
    ９．０２±０．６３Å 基ＩＶとＶＩＩＩの間；
    １０．４６±０．４６Å 基ＩＶとＩＸの間；
    ６．５２±１．２６Å 基ＩＶとＸの間；
    ６．８７±０．９６Å 基ＶＩＩＩとＩＸの間；
    ９．８４±１．０５Å 基ＶＩＩＩとＸの間；
    ７．２５±０．４９Å 基ＩＸとＸの間；
    である、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
72. ＰＦ４アンタゴニストが、配列番号：３４−１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
73. ＰＦ４アンタゴニストが、配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
74. 検出可能標識が、金属、放射性同位体、放射線不透性剤、放射線透過性剤、造影剤、染料、及び熱量測定又は蛍光定量反応を触媒する酵素からなる群から選択される、請求項６７に記載の検出可能マーカー。
75. 個体におけるＰＦ４結合部位を検出するための方法であって、
    (ａ)請求項６７に記載の検出可能マーカーを個体に投与し；
    (ｂ)個体における前記検出可能マーカーの存在を検出する；
    ことを含む方法。
76. 個体における血管新生部位を検出するための方法であって、
    (ａ)請求項６７に記載の検出可能マーカーを個体に投与し；
    (ｂ)個体における前記検出可能マーカーの存在を検出する；
    ことを含む方法。
77. 個体における感染を検出するための方法であって、
    (ａ)請求項６７に記載の検出可能マーカーを個体に投与し；
    (ｂ)個体における前記検出可能マーカーの存在を検出する；
    ことを含む方法。
78. ＰＦ４アンタゴニストが、式ＶＩＩ(図９Ａ)に示された化学構造を有する、請求項７５ないし７７のいずれか１項に記載の方法。
79. 検出可能マーカーが、式ＶＩＩＩ(図９Ｂ)に示された化学構造を有する、請求項７８に記載の方法。
80. ＰＦ４アンタゴニストが、配列番号：３４−１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項７５ないし７７のいずれか１項に記載の方法。
81. ＰＦ４アンタゴニストが、配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項７５ないし７７のいずれか１項に記載の方法。

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