JP2008510145A

JP2008510145A - 回腸炎診断アッセイ法

Info

Publication number: JP2008510145A
Application number: JP2007525772A
Authority: JP
Inventors: ジェレミージェイ．クロル; マイケルビー．ルーフ; マークエー．アイクマイヤー
Original assignee: ベーリンガーインゲルヘイムヴェトメディカアイエヌシー．
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2005-08-10
Publication date: 2008-04-03
Also published as: WO2006020730A3; DK1789800T3; WO2006020730A2; BRPI0514337A; CA2576867A1; EP1789800A2; US20060035287A1; ATE431930T1; AR050213A1; EP1789800B1; RU2007109151A; ZA200701868B; AU2005272872A1; TW200622247A; KR20070049643A; DE602005014560D1; US7550270B2; MX2007001758A; CN101065666A; EP1789800A4

Abstract

動物由来試料中の低濃度の抗ローソニア抗体の、迅速で、容易な検出を可能にする、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の防御のための、改良されたイムノアッセイ法が提供される。好ましいアッセイ法は、Ｌ．イントラセルラリスのリポ多糖の抗原性抽出物を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイ法である。

Description

本発明は、概して、ローソニア・イントラセルラリスに対する抗体を検出するための、Ｌ．イントラセルラリスのリポ多糖抽出物を含み、かつ、好ましくは本質的にそれらからなる、有効な抗原と同程度の、改良されたイムノアッセイに関する。さらに詳しくは、好ましいアッセイ法は、優れた特異性と感度をもち、病気の臨床症状が出現する前の感染初期段階における動物由来組織中の低レベル抗体を検出することができる、間接ＥＬＩＳＡ法である。

ブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）は回腸炎、腸腺腫症、出血性腸炎、または壊死性腸炎としても知られ、離乳子畜期から若い成体期のブタに被害を及ぼす自然発生病である。ＰＰＥは、かつてはカンピロバクター様の微生物あるいは回腸細胞内寄生虫により引き起こされると考えられていた。より近年では、病原体が、細胞内絶対寄生性のグラム陰性細菌、ローソニア・イントラセルラリスであることが明らかになってきている。この疾患は、罹患した動物での、死亡損耗、投薬コスト増大、体重増加不良、および食料変換の減少のため、経済的に重要である。

ＰＰＥの合理的な治療法と効果的な制御において、主たる要素は迅速かつ正確な病原体の同定である。ＰＰＥは肉眼的病変を観察することによって診断でき、抗ローソニアモノクローナル抗体を用いた特殊な染色法によって細胞内の曲がった桿菌が示される、特異な組織病理学的病変を観察することによって確定できる。理想的には、最終判断が病原体の分離中にされるべきである。しかしながら、Ｌ．イントラセルラリスの分離と培養は特殊な細胞培養技術を必要とする。

過去においては、抗ローソニア抗体の検出に関して迅速アッセイ法開発のための試みられてきた。間接蛍光抗体法（ＩＦＡＴ）および免疫ペルオキシダーゼ法（ＩＰＭＡ）のような、現在の血清学的アッセイ法は、生体ブタ血清中の抗ローソニア抗体検出において、よい感度とよい特異性を示している。クニッテルＪＰ、ジョーダンＤＭ、シュワルツＫＪら、ローソニア・イントラセルラリス曝露ブタを検出するための、死亡前のポリメラーゼ連鎖反応と血清学的方法の評価、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎＲｅｓｅａｒｃｈ５９：７２２−７２６（１９９８）、ガイズＲＭＣ、ゲプハルトＣＪ、ディーンＪら、ブタ増殖性腸炎の血清学的試験法としてのイムノペルオキシダーゼ単層アッセイの検証、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１４：５２８−５３０（２００２）、それらの教示と内容は、本明細書に、参照により取り入れられている。しかしながら、これらのアッセイ法はどちらも、感染初期や発病間もない頃のブタの血清によくみられる低濃度の抗ローソニア抗体を検出するには感度が十分ではない。さらに加えれば、これらの既存のアッセイ法は、正確に検査を行い、結果を解釈するために、高度の技術をもつテクニシャンに依存している。例えば、顕微鏡を覗くことに何時間も費やすこと、ＵＶあるいは自然光に照らされたウェルを分析すること、および“陽性の”試料を示す蛍光グリーンやレッドに染色されたＬ．イントラセルラリスまたはＬ．イントラセルラリス感染細胞を探すことによって結果が主観的に得られる。

酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）もまた、抗ローソニア抗体を検出するために開発が行われてきた。これらのこれまでの尽力は、抗原の質量ともに悪いこと、抗体価のばらつき、適正な“カットオフ”値が無いために感染および非感染動物間での抗体価がオーバーラップすること、及びブタ抗体の非特異的抗原要素に対する交叉反応のせいで、十分に高感度で高特異性なアッセイ法を生み出せなかった。ホリオウクＰＫ、カトラーＲＳ、カプルＩＷ、モンクトンＲ．Ｐ．、ブタにおける、回腸共生イントラセルラリス特異的免疫的免疫グロブリンＧの血清中での反応を測定するための、酵素結合免疫吸着アッセイ、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３１：１９８０−１９８５（１９９４）、これの教示と内容は、本明細書に、参照により取り入れられている。

従って、高感度かつ高特異性で、感染初期段階で動物由来組織中の低濃度の抗体の正確な検出ができる、改良された抗ローソニア抗体アッセイの技術に対する需要がある。

リポ多糖（ＬＰＳ）は、細菌の構造維持に大きく貢献し、宿主免疫防御からそれらを守る、Ｌ．イントラセルラリスのようなグラム陰性細菌の主要な高次構造体である。ＬＰＳはグラム陰性細菌の細胞壁の一部を構成し、３つの部分：糖側鎖、コア多糖、およびリピドＡ、からなる。リピドＡは一般的でない脂肪酸（例えば、ヒドロキシミステリン酸）を含み、一方では、コア多糖は一般的でない糖（例えば、ＫＤＯ、ケトデオキシオクツロン酸およびヘプツロース）をしばしば含む。糖側鎖は細菌のO抗原に関係する。ＬＰＳは、マクロファージのＣＤ１４レセプターに結合でき、マクロファージ／内皮細胞の全カスケードのトリガをひいて炎症サイトカインを分泌するため、エンドトキシンとして機能する。

本発明は、上述の諸問題を解決し、ローソニア・イントラセルラリスに対する抗体の存在を、ＰＰＥの早期検出のために利用できる、高度の特異性と感度で検出するための改良されたイムノアッセイ法を提供する。

大枠でいうと、本発明のアッセイは、動物由来試料が、Ｌ．イントラセルラリスのリポ多糖の少なくとも一部を含む有効量の抗原と接触し、抗原と抗体の複合体形成を引き起こし、その後に、そのような抗原−抗体複合体を検出するイムノアッセイである。好ましい態様では、このアッセイ法は間接ＥＬＩＳＡテストである。

動物由来試料は、もっとも好ましくは血清であるが、初乳、関節液、唾液、組織ホモジェネート又は糞便を含んでもよい。これらの試料はアッセイ目的のための通常の技術に基づいて調製することができる。本発明は特にブタのＰＰＥ検出に関するものであるが、類似のローソニアに起因する疾患についても、ブタ、ハムスター、青ギツネ、エミュー、シカ、イヌ、モルモット、ウマ、アカゲザル、ダチョウ、ウサギ、又はラットにおいて検出可能である。本発明の方法を使って検出される抗体は、一般にＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭよりなる群から選ばれる。

本発明のイムノアッセイで使うための好ましい抗原は、Ｌ．イントラセルラリスのリポ多糖の一部又は抽出物である。この抽出物は、好ましくは、分子量約１５−２５ｋＤａであり、より好ましくは、約１８−２０ｋＤａである。抽出物又はその一部は必要な分子量を有しており、かつ、有効量の抗原が投与された時に、動物に免疫応答を誘導する抗原性を有するべきである。さらには、抽出物又はその一部は、ＬＰＳ抗体とともに抗体−抗原複合体を形成するための十分な大きさを有さねばならない。特に好ましい形態では、細菌エンドトキシン試験において、ＬＰＳ抗原が約３−７５ＥＵ／ｍｌ（より好ましくは、約１０−６０ＥＵ／ｍｌ、より一層好ましくは約２０−５０ＥＵ／ｍｌ、さらにより一層好ましくは約２５−４０ＥＵ／ｍｌ）の内毒性を示す。抗原は、好ましくはＬＰＳ抽出物のみから成り、Ｌ．イントラセルラリスＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７株の抽出物で良い結果が得られている。

本出願では、ＥＬＩＳＡ法に限らず、競合又は阻害アッセイを含み、また、直接および間接のアッセイ法、同様にサンドイッチ法又はキャプチャー法を含む様々なタイプのイムノアッセイ法が利用できることが判明している。もっとも好ましいイムノアッセイ法は、最初にマイクロタイタープレートのウェルをＬＰＳでコーティングし、続いて室温で一晩インキュベートする手順を含む、間接ＥＬＩＳＡ法である。ブロッキング試薬がそのあと加えられ、さらに一晩４℃でインキュベートされる。選ばれた希薄な検出抗体がそのあとに加えられ、３７℃で１時間インキュベートされ、次に、希薄な酵素標識抗体が加えられ、さらに１時間、３７℃でインキュベートされる。次に、ＴＭＢ色素が加えられ、室温で５分間インキュベートされる。この時点で２Ｍ硫酸を加えることによって反応が停止させられ、波長４５０ｎｍでプレートが読まれる。

好ましいＥＬＩＳＡテストは、約３４．７５ＥＵ／ｍｌのエンドトキシンレベルをもつＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７の、開始ＬＰＳ抽出物試料の場合に最適化されている。そのような例の場合には、抗原が約１：２５０から１：８０００の希釈率で存在すべきであり、より好ましくは約１：４００から１：６０００であり、より一層好ましくは約１：５００から１：４０００であり、さらにより一層好ましくは約１：６００から１：３０００であり、より一層好ましくは１：７５０から１：２０００であり、さらにより好ましくは約１：９００から１：１５００であり、最適は１：１０００である。検出抗体は約１：２０−１：３２０、１：２５−１：２４０、１：３０−１：１２８、１：３５−１：６０の希釈レベルで存在するべきであり、最適は１：４０である。ＥＬＩＳＡコンジュゲートは、約１：２５０−１：２０００、１：３００−１：１５００、１：３５０−１：１０００、１：４００−１：６００のレベルで存在するべきであり、最適は１：５００である。もちろん、開始抗原がこの発明の好ましい産物とは異なるエンドトキシンレベルをもつ場合には、適切な希釈率レベルが直ちに計算されよう。

本発明は組換えＬＰＳ抗原が抗原ソースとして使われる場合にもまた向いている。そのような場合には、ＬＰＳ抗原又はその一部が通常の組換え技術によって作製される。たとえば、ＬＰＳ抗原又はその適切な部分をコードするＤＮＡが、発現ベクタに組み込まれ、発現ベクタが適切なＬＰＳ抗原又はその一部をそれから発現できる、発現コントロール配列に操作可能にリンクされてもよい。発現された抗原はそれから回収され、本発明に従って使用される。もちろん、本技術におけるスキルは、本発明に従って組換え抗原を製造し回収する様々な方法に精通している。全ての例において、組換え抗原は、本発明に従って、Ｌ．イントラセルラリス抗体に選択的に結合又はハイブリダイズするだろう。

次の実施例はイムノアッセイのための抗原ソースとしてローソニアＬＰＳの作製と使用のための、現時点で望ましい技法を述べるものである。そうした例にはローソニア抗体に対する間接ＥＬＩＳＡイムノアッセイが含まれている。しかし、そうした例は説明のための手段としてのみによって提供され、そのことによって本発明の全範囲を制限すると解釈されてはならないと、理解されるべきである。

ＬＰＳをもとにした間接ＥＬＩＳＡアッセイの開発と確立
細菌抗原の準備
細菌分離株は高継代（感染した腸から最初に分離後、２０代を超える継代を行った）のＬ．イントラセルラリス分離株＃１５５４０（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７）と決定された。この分離株は急性出血性増殖性腸症（ＨＰＥ）に罹患したデンマークの雌ブタから得られたものであり、定常的な組織学的及び免疫組織化学的な（ＩＨＣ）染色によって確認され、以前記載された方法によってＬ．イントラセルラリスの純粋培養を得るために共培養された。ローソンＧＨＫ、マクオリストＳ、ジャスニら、ブタ増殖性腸炎の細胞内細菌：イン・ビトロの培養と管理、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３１：１１３６−１１４２（１９９３）、これの教示と内容は、本明細書に、参照により取り入れられている。バイオリアクター（アプリコン社，フォスターシティ，ＣＡ）の中で新鮮なマッコイ細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号１６９６）懸濁液を使い、並列３０ＬバッチでＬ．イントラセルラリス＃１５４０を培養した。活性のある培養では８０−１００％の細胞感染率に達するまで培養を行い、それから、アバンティベックマンＪ−２０Ｉ遠心機（ベックマン・インスツルメンツ社，フラートン，ＣＡ），ＪＡ−１０ローターを用い、１７，０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心分離を行い、集菌を行った。各バッチの上清は廃棄され、細胞外Ｌ．イントラセルラリスとＬ．イントラセルラリスに感染したマッコイ細胞の両方を含む細胞ペレットは３０ｍｌの滅菌１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁され、−８０℃に保存された。

マッコイ細胞からＬ．イントラセルラリスを精製するため、不連続パーコール密度勾配遠心分離法が、以前に記載の方法を若干変更した方法に従って、準備された。ホリオウクＰＫ、カトラーＲＳ、カプルＩＷ、モンクトンＲＰ、ブタにおける血清中の中腸共生イントラセルラリスに特異的イムノグロブリンＧの反応を測定するための酵素結合免疫吸着測定法、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３１：１９８０−１９８５（１９９４）、この教示と内容は、本明細書に、参照により取り入れられている。手短にいえば、２２５ｍｌのパーコール（アマシャムバイオサイエンス社，ファルマシアバイオテク社，ウプサラ，スウェーデン）を２６０ｍｌの試薬グレード（ＲＧ）純水および１５ｍｌの５Ｍ食塩水（ＮａＣｌ，フィッシャーブランド）と混合した。上述の回収された培養物は２５ゲージの針を２０回超通過させ、細菌／マッコイ細胞ホモジェネートの５ｍｌを２５ｍｌの調製済パーコール密度勾配液とあわせ、３０ｍｌ容ポリカーボネート塩沈管に移した。チューブは転倒混和により混合し、３７，０００×ｇ、１時間、４℃の条件で遠心分離を行った。その結果生じる混濁液はチューブの上部５０％に分散した細胞破砕片を含み、また同時に浮遊密度１．０７５ｇ／ｍｌの位置に一本の明瞭な細胞バンドパターンを見ることができた。密度勾配の上半分を取り除き、先のバンドを、５ｍｌポリプロピレンピペットを使って注意深く吸い取り、２０ｍｌの滅菌ＰＢＳを入れた新しい３０ｍｌ容量遠沈管に移した。チューブを３７，０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心分離し（アバンティベックマンＪ−２０１，ＪＡ−１７ローター）、このプロセスは各試料からパーコールを洗除するために最大３回まで繰返し行った。最後の遠心分離ステップの後、各ペレットをそれぞれ１から２ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、ひとつにまとめ、１．８ｍｌ容量クリオバイアルチューブ（ナルゲン社，ナルジェヌンクインターナショナル社，ロチェスター，ＮＹ）に分注し、−８０℃に保管した。高度に濃縮されたパーコール精製Ｌ．イントラセルラリス＃１５５４０を含む再懸濁液の試料は、小さな湾曲した桿菌が存在していることと完全なマッコイ細胞が存在していないことを確認するため、暗視野顕微鏡観察が行われた。ＬＰＳ抗原成分がパーコール精製Ｌ．イントラセルラリス＃１５５４０抗原から、熱フェノール水により、先に記載の方法をすこし改変して、抽出した。ヴェストファール，Ｏ．とルーデリッツ，Ｏ．グラム陰性細菌のリポ多糖に関する化学的研究、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ６６：４０７−１７（１９５４）、これの教示と内容は、本明細書に、参照により取り入れられている。手短にいえば、１８ｍｌのパーコール精製Ｌ．イントラセルラリスと３．７５ｍｌのフェノールクロロホルム（アメレスコ社，ソロン，ＯＨ），ｐＨ８．０、が別個に６５℃のウォーターバスで１０分間インキュベートされた。最初のインキュベーション時間の後、４．５ｍｌのパーコール精製Ｌ．イントラセルラリスが４．５ｍｌの９０％（ｖ／ｖ）熱フェノール水懸濁クロロホルムを入れた各チューブに移され、穏やかに転倒混和された。チューブはさらなる２５分間６５℃ウォーターバス中で、インキュベーション中を通じて５分ごとに転倒混和しながら、インキュベートされ、４℃で一晩冷却された。液相と固相のわずかな相分離が各チューブ内で、冷蔵中に、起こった。各チューブは、７，７００×ｇで２５分間、４℃で遠心分離（アバンティベックマンＪ−２０１，ＪＡ−１７ローター）され、全４本のチューブからのＬＰＳを含む上清は、まとめられ、保存されたが、一方、細胞ペレットは捨てられた。上清はプレ滅菌された透析チューブ（スペクトラムラボラトリーズ社，ランチョドミンゴ，ＣＡ）に移され、４Ｌのプラスチックビーカー内に設置され、試薬グレード（逆浸透）冷水で２４から４８時間、試料からフェノールクロロホルムを除去するために透析された。試薬グレード水は新しい水に２から４時間ごとに、洗浄ステップが完了するまで、交換された。結果的に得られた精製Ｌ．イントラセルラリスＬＰＳ抽出物は注意深く収集され、使用するまで−８０℃に保存された。

ＬＰＳ抽出物の確認は、４−１２％のビス−トリスプレキャストゲル（ＮｕＰＡＧＥ，インビトロゲン社，カールスバッド，ＣＡ）上で、ＭＯＰＳ泳動緩衝液中のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による、分離によって、目に見えるようにされた。ＬＰＳ抽出物は、パーコール精製全細胞Ｌ．イントラセルラリス及び非感染全細胞マッコイ細胞と比較された。試料は、それぞれ１：２に４×ドデシル硫酸リチウム塩（ＬＤＳ）変性緩衝液で希釈し、８５℃に１０分間インキュベートすることによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに準備された。ゲルは、バイオラッド社銀染色説明書を変更した手順に従った、過ヨウ素酸銀染色であった。要するに、ゲルは、４０％メタノール（ＭｅＯＨ，フィッシャーブランド，ハノーバーパーク，ＩＬ）／１０％酢酸（フィッシャーブランド）（ｖ／ｖ）中で２０−３０分間、その後、０．７％過ヨウ素酸を含む４０％メタノール／１０％酢酸中でさらに室温で５分間の第一固定に供された。第二固定は、ゲルを１０％エタノール（ＥｔＯＨ）／５％酢酸（ｖ／ｖ）に５分間、続いて、酸化試薬（バイオラッド社，ヘルクレス，ＣＡ）中に５分間の酸化、その後、脱イオン水で黄色い色がゲルからなくなるまで洗浄、を含んだ。ゲルは、０．１６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む水中で５分間インキュベートされ、室温で２０分間銀試薬（バイオラッド社）中で染色された。ゲルは脱イオン水中で２０−４０分間一度洗浄され、現像試薬（バイオラッド社）中に、望むバンドの強さが出るまで置かれた。反応は、５％（ｖ／ｖ）酢酸中に２０分間、室温で停止され、脱イオン水で一度洗浄された。タンパク質は、１０から２２０ｋＤａのタンパク質マーカー（ベンチマーク，インビトロゲン社）を使い、それらの分子量によって同定された。

ＬＰＳを基にした間接ＥＬＩＳＡ
抗ローソニア免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、Ｌ．イントラセルラリスＬＰＳを基にした間接酵素免疫測定法（ＬＰＳ−ＥＬＩＳＡ）を使い、検査試料中で検出された。ローソニア・イントラセルラリスＬＰＳが１００μｌ／ウェルでイムロン２ＨＢプレート（ダイネックス社，チャンティリー，ＶＡ）に、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸ナトリウムコーティング緩衝液中に１：１０００希釈で、コーティングされ、マイラープレートシーラー（サーモラブシステムズ社，フランクリン，ＭＡ）でシールされ、さらに、室温で２４時間インキュベートされた。それぞれのプレートは、３５０ｍｌ／ウェル、ソークタイム０秒、１洗浄サイクルの条件で、０．０５％ツイーン２０（フィッシャーブランド）、０．１３７Ｍ食塩（フィッシャーブランド）、０．００５Ｍ塩化カリウム（ＫＣｌ，シグマ社，セントルイス，ＭＯ），０．００９Ｍリン酸水素ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４，シグマ社）、０．００１Ｍリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４，シグマ社）、ｐＨ７．２から７．４、を試薬グレードの水に含む洗浄緩衝液で、ウルトラウオッシュプラス（ダイネックス社）を使い、洗浄された。抗原にコートされたプレートは、３００ｍｌ／ウェルで、５％（ｖ／ｖ）脱脂粉乳（バイオラッド社）、をシーブロック^ＴＭ（ピアースバイオテク社，ロックフォード，ＩＬ，スティールヘッド血清及び０．１％酸化ナトリウムをＰＢＳに含む）に含むブロッキング緩衝液を使い、試験血清のプレートへの非特異的結合を防ぐために、４℃で、２４時間、ブロッキングされた。その後、各プレートは上に述べたように３サイクル、洗浄された。

ウェルあたり５０マイクロリットルの血清が、各プレートに２連で移され、シールされ、３７℃で１時間、インキュベートされた。洗浄ステップは、ヒツジ抗ブタＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（キルケガード・アンド・ペリー社，ガイザーズバーグ，ＭＤ）をブロッキング緩衝液で１：５００希釈したもののうち、５０μｌ／ウェルを加える前に、３サイクル繰り返された。洗浄ステップはさらに３サイクル繰り返され、その後、２−コンポーネント３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＫＰＬ）からなるペルオキシダーゼ基質の５０μｌがそれぞれのプレートにアプライされ、室温で５分間インキュベートされた。これは、それぞれの試験試料中に抗原−抗体複合体の存在を観察するために行われた。発色反応は、２M硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４，フィッシャーブランド）のうち５０μｌ／ウェルを移すことにより停止された。プレートは、Ｖ−マックス９６ウェルマイクロタイタープレートリーダー（メドテックス社，チャペルヒル，ＮＣ）上、波長４５０ｎｍで、各サンプルに対する光学濃度（ＯＤ）値を測定するために、読まれた。高い陽性から低い陽性までの範囲を含むスタンダードのコントロール（最も高い陽性サンプルのブロッキング緩衝液による２倍希釈系列）及びＬ．イントラセルラリスＬＰＳ抽出物に対する抗体が、それぞれのプレートに含まれた。試験プレートは、決定係数（ｒ^２値）がスタンダードのＯＤ値の直線回帰分析において０．９であれば、適正と判断された。試験あるいはコントロール試料を含まない空のウェルは、すべての試験に対して、ブランクコントロールとして利用された。

ＬＰＳ−ＥＬＩＳＡの検証
ブタ血清は、ブタでの抗ローソニアＩｇＧ抗体の検出のためのＬＰＳ−ＥＬＩＳＡを検証するときに利用するための、次の研究から得られた。（ｉ）約３週齢の２匹のブタが、フロインドの不完全アジュバンド（シグマ社）で１：２の組成にされた、２ｍｌのＬ．イントラセルラリスＬＰＳ抽出物の筋肉注射によって過免疫された。約３週齢の一匹のブタが、フロインドの不完全アジュバンドで１：２の組成にされた、５％（ｗ／ｖ）のウシ血清（ＪＲＨバイオサイエンス社，レネクサ，ＫＳ）含有ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）からなる２ｍｌのプラセボの筋肉注射をされた。それぞれの接種のブースターは、陽性（Ｌ．イントラセルラリスに対する抗体）と陰性（Ｌ．イントラセルラリス抗体なし）の作製のために、接種後３週間と６週間に投与された。４から６ミリリットルの血清が、接種後３週間と６週間に、接種に先立って、それぞれのブタから採取され、血清試料中に抗ローソニア抗体が有るか無いかを確認するため、間接蛍光抗体法による血清学的試験（ＩＦＡＴ）、Ｌ．イントラセルラリス全細胞抗原の反応の検査が行われた。これは、クニッテルＪＰ、ジョーダンＤＭ、シュワルツＪＫら、ローソニア・イントラセルラリス曝露ブタの検出のための死亡前のポリメラーゼ連鎖反応および血清学的方法の評価、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＶａｔｅｒｉｎａｒｉａｎＲｅｓｅａｒｃｈ５９：７２２−７２６（１９９８）に従い、これの教示および内容は、本明細書に、参照により取り込まれている。接種後８週間目に。動物は殺され、最後の血清採取が得られた。それぞれのブタからの陽性コントロール血清がまとめられ、ＩＦＡＴによりＬ．イントラセルラリスに対する陽性反応を確認するために検査され、抗ローソニアＬＰＳ陽性および陰性のコントロール血清が１ｍｌに分注され、−８０℃に保存された。

２つの以前実施されたワクチンの効能に関する研究、すなわち、Ｋｒｏｌｌ，Ｊ．ら（２００４）、ローソニア・イントラセルラリスの無毒化生ワクチンを経口投与した結果起こる、ブタにおける防御免疫の評価、ＡＪＶＲ６５（５）：５５９−５６５は、その教示と内容が、本明細書に、参照により取り入れられているが、それからのブタ血清は、抗ローソニアＬＰＳ抗体の陽性／陰性のカットオフ限界を調べるために検査された。８０匹の６から９週齢の、従前に抗ローソニア抗体に対してＩＦＡＴ陽性であることが確認されているブタからの試験血清は、病原性の非相補的Ｌ．イントラセルラリス分離株Ｎ１０１４９４（ベーリンガーインゲルヘイムベトメディカ社，セントジョセフ，ＭＯ）の実験的な注射の後に作製された。ＩＦＡＴ陰性であると以前に確認された試験血清は３から９週齢のワクチンまたは攻撃をそれぞれの臨床研究の間を通じて受けたことがない、厳密にコントロールされたブタから採集された。

１７５個の血清試料が、Ｌ．イントラセルラリスワクチン、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（ベーリンガーインゲルヘイムベトメディカ社）の弱毒化生ワクチン注射の後か、病原性異抗原性Ｌ．イントラセルラリス分離株Ｎ１０１４９４についての抗原投与の後か、両方の後、２５匹のブタから採集された。さらなる７０個の血清試料が、研究の間ずっとワクチン注射も抗原投与も受けず、抗ローソニア抗体に対するＩＦＡＴ陰性である、１０匹の厳密なコントロールブタから採集された。研究計画は３５匹の、ランダムに３つの取り扱いグループに分けられた、３から４週齢のブタを含んだ。研究の０日目には、グループ１からの１５匹のブタは２ｍｌのワクチンの経口投与を受け、一方、グループ２及び３（ブタ１０匹／グループ）は、非感染のマッコイ細胞培地懸濁液の当量の偽薬を投与された。２１日目に、グループ１及び２は、Ｌ．イントラセルラリスＮ１０１４９４の感染性異抗原性純粋培養攻撃を胃内投与された。４２日目には、ブタは、ワクチン非投与、被攻撃ブタに比べてワクチン投与ブタの効能を見極めるために、検死され、病変の発達について評価された。糞便試料と血清が第０日目から４２日目まで、ワクチンあるいは攻撃の投与に従うＬ．イントラセルラリスの曝露と排出の割合を検出するための、ルーチンの診断検査のために、毎週採集された。病変はＰＥの存在を確認するために、４２日目のみに、下に記載するような組織学的及びＩＨＣの方法による、徹底的な検査によって、検査された。

ブタにおけるＰＥの確認
上記記載の臨床研究における、ブタの回腸あるいは結腸全般にわたる病変は、粘膜の厚さの重篤さに従ってスコア化された（１＝正常、２＝軽度の肥厚、３＝中程度の肥厚／炎症、４＝重度の肥厚／炎症／粘膜出血あるいはネクローシスが認められる）。クロール，Ｊ．ら（２００４）、ローソニア・イントラセルラリスの無毒化生ワクチンの経口投与の結果起こるブタにおける防御免疫の評価、ＡＪＶＲ６５（５）：５５９−５６５。長さ２から４ｃｍの、回腸あるいは結腸の試料は死後に採集され、緩衝ホルマリン中に浸漬により固定され、微視的な病変を検出するための処理をされた。これは、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）および特異的Ｌ．イントラセルラリスモノクローナル抗体に結合するＩＨＣ染色を含む。クロール，Ｊ．ら、ＡＪＶＲ（２００４）。後者はＬ．イントラセルラリスに実際にブタが感染している状態を評価するための現在の標準と考えられる。クロール，Ｊ．ら（２００４）。ＩＨＣ染色組織にみつかった微視的な病変は、Ｌ．イントラセルラリスに特異的な細胞伸長の重篤さに従って、別途にスコア化された（０＝正常、１＝軽度／局所的、２＝中程度／広汎、３＝重篤／広汎）。平均的な全体的および微視的な病変のスコアと、感染した組織に検出される病変の頻度が、グループ間比較のために算出された。平均的な全体的および巨視的病変のスコアは、従前の研究、クロール，Ｊ．ら（２００４）、における病原性異抗原性攻撃ワクチンの効果を測定するための第１のパラメタと考えられた。

好ましいＬＰＳ−ＥＬＩＳＡの材料と方法
次にあげるものは本発明に対応した、現時点で好ましいＬＰＳ−ＥＬＩＳＡアッセイ法を述べるものである。

Ａ．プロトコール
１．材料
ａ．ＬＰＳ結合プレート：
・イムロン２ＨＢ９６ウェルプレート、ダ
イネックス社カタログ番号３４５５、又は
相当品。
ｂ．希釈プレート：
・ファルコンプロバインドアッセイプレート
（フィシャーサイエンティフィク社，ピッ
ツバーグ，ＰＡ），９６ウェル，Ｕ底，リ
ッド無し（ポリスチレン，未滅菌），ベク
トン・デッキンソン社（サンディエゴ，Ｃ
Ａ）カタログ番号３５３９１０、又は相当
品。
ｃ．プレートシーラー：
・マイラープレートシーラー，サーモラブシ
ステムズ社（フランクリン，ＭＡ）カタロ
グ番号５７０１、又は相当品。
ｄ．コーティング緩衝液：
・０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液。
・１０．６ｇ炭酸ナトリウムシグ
マ社カタログ番号Ｓ６１３９、又は
相当品。
・１．０Ｌまで水（試薬級あるいは相
当品）で満たす。
・ｐＨ＝９．６±０．１に調整する。
・使用するまで２−７℃に保存する。
・使用期限：７日間。
ｅ．洗浄液：
・０．０５％ツイーン２０，０．１３７Ｍ
塩化ナトリウム，０．００５Ｍ塩化カリ
ウム，０．００９Ｍリン酸水素二ナトリ
ウム，０．００１Ｍリン酸二水素カリウ
ム。
・３２．０ｇ塩化ナトリウム。
・０．８ｇ塩化カリウム。
・２．４４ｇリン酸水素二ナト
リウム。
・０．８ｇリン酸二水素カリウ
ム。
・４．０Ｌまで純水（試薬級また
は相当品）で満たす。
・水酸化ナトリウム又は塩酸を用
いてｐＨを７．２から７．４に
調整。
・２．０ｍｌツイーンフィッ
シャーカタログ番号ＢＰ３３
７−１００、又は相当品。
・使用するまで室温（２５±５℃
）に保存する。
・使用期限：１週間。
ｆ．ブロッキング液：
・５％脱脂粉乳を含むシーブロック（商標）。
・２５．０ｇ脱脂粉乳バイオ
ラッド社カタログ番号１７０−
６４０４、又は相当品。
・シーブロック（商標）で５００
ｍｌにする。ピアースバイオテ
ク社カタログ番号３７５２７、
又は相当品。
・使用するまで２−７℃に保存す
る。
・使用期限：１ヶ月。
ｇ．抗原：
・Ｌ．イントラセルラリス由来リポ多糖全分
子の１：１０００希釈。
・４０μｌのＬ．イントラセルラ
リスリポ多糖を４０ｍｌのコ
ーティング緩衝液に溶かす。
・調製後、直ちに使用する。
ｈ．検出抗体：
・回復期ブタのＬ．イントラセルラリスに対
する血清抗体の１：４０希釈。
・３μｌのブタ血清又は相等品を
１２０μｌのブロッキング液に
いれる。
・使用するまで２−７℃に保存。
・使用期限：２４時間。
ｉ．酵素標識抗体：
・ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ワサビダ
イコンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１：
５００希釈キエルケガード・アンド・
ペリー・ラボラトリーズ社カタログ番号１
４−１４−０６、又は相当品。
・４０μｌ酵素標識抗体を２０ｍ
ｌのブロッキング液に混合する
。
・使用するまで２−７℃に保存。
・使用期限：２４時間。
ｊ．基質：
・ツーコンポーネントマイクロウェルペ
ルオキシダーゼ基質（ガイザーズバーグ，
ＭＤ）ＫＰＬ社カタログ番号５０−７６−
００、又は相当品。
・等容のＴＭＢペルオキシダーゼ
基質（試薬Ａ）とペルオキシダ
ーゼ溶液Ｂ（試薬Ｂ）を、使用
する直前に混合する。
・必要な容量＝プレートあたり５
ｍｌ、である。従って、検査プ
レート１枚につき、試薬Ａを２
．５ｍｌ＋試薬Ｂを２．５ｍｌ
である。
・使用するまで２−７℃に保存す
る。
・使用期限：プレミックス試薬は
製造元の提示する使用期限。混
合した基質溶液は直ちに使用す
る。
ｋ．停止液：
・２Ｍ硫酸
・換気フード内で注意深く混合す
る：４４４．４ｍｌの試薬グレ
ードの水。
・５５．６ｍｌの１８Ｍ硫酸フ
ィッシャー社カタログ番号Ａ３
００ｃ−２１２、又は相当品。
・使用するまで室温で保存する。
・使用期限：６ヶ月。
ｌ．陽性コントロール
・１：２５４６に希釈した、抗ローソニアＬ
ＰＳＩｇＧ抗体を含む過免疫ブタ血清。
・３．９μｌの陽性コントロール
、ロット番号０９０２０３を１
０ｍｌのブロッキング溶液に加
える。
・使用するまで２−７℃に保存す
る。
・使用期限：２４時間。
ｍ．陰性コントロール
・１：２５４６に希釈した、Ｌ．イントラセ
ルラリスＬＰＳ分子に対する抗体を含まな
い、過免疫ブタ血清。
・３．９μｌの陽性コントロール
、ロット番号０９０２０３を１
０ｍｌのブロッキング溶液に加
える。
・使用するまで２−７℃に保存す
る。
・使用期限：２４時間。

２．方法
ａ．試料は二連で検査を行う。必要なプレートの数＝
全試料数／プレートあたり４０試料、である。端
数は切り上げて全プレート数とする。１１番目と
１２番目の列は、陰性及び陽性のコントロール血
清の１：１０希釈系列を入れる。
ｂ．Ｌ．イントラセルラリスＬＰＳ抗原を１：１０
００あるいは適切な希釈率にコーティング緩衝液
で希釈する。必要な容量＝プレートの数×プレー
トあたり１０ｍｌ、である。
ｃ．１００ｍｌの希釈抗原を各プレートの全てのウェ
ルに加える。
ｄ．プレートシーラーでプレートをシールし、室温で
一晩（１４−２４時間）インキュベートする。
ｅ．プレートを、ダイネックスウルトラウォッシュ
プラスを使い、３５０ｍｌ／ウェル、ソークタイ
ム０秒、１サイクル行う条件で、洗浄緩衝液で洗
浄する。プレートをペーパータオルに叩きつけ、
乾燥させる。
ｆ．３００ｍｌのブロッキング液を全てのウェルに注
ぐ。プレートをシールし、２−７℃で一晩インキ
ュベートする（１４−２４時間）。
ｇ．プレートを、ダイネックスウルトラウォッシュ
プラスを使い、３５０μｌ／ウェル、ソークタイ
ム０秒、３サイクル繰り返す条件で、洗浄緩衝液
で洗浄する。プレートをペーパータオルに叩きつ
け、乾燥させる。
ｈ．Ｕ底希釈プレートの場合には、１２０μｌのブロ
ッキング液試料を１番目から１０番目のウェル列
と１１番目と１２番目の列のＢからＨまでのウェ
ル行に加える。
ｉ．２４０μｌの陰性および陽性コントロールを１１
列目と１２列目のＡ行のウェルに、それぞれ加え
る。
ｊ．ウェルＡ−１１とＡ−１２の希釈コントロール血
清のうち１２０μｌを、５０−３００μｌ対応マ
ルチチャネルピペットを使い、陰性コントロール
を、プレートブランクとして使う１１列の最後の
ウェル（ウェルＨ−１１）に移さぬよう注意しな
がら、ウェルＢ−１１とＢ−１２に移し、各コン
トロール血清の１０倍希釈を作製する。
ｋ．検出抗体（回復期のブタの血清）を、試料３μｌ
を希釈プレートの各ウェルに加えた１２０μｌの
ブロッキング液に移すことによって、１：４０に
ブロッキング液で希釈する。毎回、異なった試料
をウェルＡ−１、Ｂ−１、Ｃ−１等に加えること
によって希釈する。
ｌ．５０−３００μｌマルチチャネルピペットを使い
、１列目のウェル内容物を少なくとも３回のピペ
ッティングにより混合し、５０μｌ／ウェルを抗
原コーティングＬＰＳ結合検査プレートの１列目
と２列目のウェルに移す。チップを交換し、希釈
プレートの全希釈試料が移されるまで、このステ
ップを繰り返す。
ｍ．５０μｌ／ウェルの陰性コントロール（１１列目
のウェルＡ−Ｈ）を検査プレートの該当ウェルに
移す。陽性コントロールについても同様にする。
それぞれのコントロールには２つの検査プレート
で使うのに十分な希釈試料が含まれている。
ｎ．検査プレートをプレートシーラーでシールし、３
７℃±２．０℃で１．０時間±１５分間、インキ
ュベートする。
ｏ．プレートを、ダイネックスウルトラウォッシュ
プラスを使い、３５０μｌ／ウェル、ソークタイ
ム０秒の条件で、３回繰り返し、洗浄緩衝液で洗
浄する。プレートをペーパータオルに叩きつけ、
乾燥させる。
ｐ．１：５００あるいは適切な希釈率に希釈した、５
０μｌの酵素標識抗体を検査プレートの全ウェル
に加える。必要な容量は＝プレートの数×プレー
トあたり５ｍｌ、である。
ｑ．検査プレートをプレートシーラーでシールし、３
７℃±２．０℃で１．０時間±１５分間、インキ
ュベートする。
ｒ．プレートを、ダイネックスウルトラウォッシュ
プラスを使い、３５０μｌ／ウェル、ソークタイ
ム０秒の条件で、３回繰り返し、洗浄緩衝液で洗
浄する。プレートをペーパータオルに叩きつけ、
乾燥させる。
ｓ．検査プレートの全ウェルに５０μｌの基質を加え
、室温で５分間±１分間インキュベートする。
ｔ．基質を加えた５分後に、５０μｌの停止液を全ウ
ェルに加え、反応を停止させる。
ｕ．４５０ｎｍの波長フィルタを装備したプレートリ
ーダー上でプレートを読む。

３．結果の解釈
ａ．波長４５０ｎｍにおける吸光度＞０．２００なる
検査試料は、抗ローソニアＬＰＳＩｇＧ抗体に
対して陽性であると考察される。
ｂ．波長４５０ｎｍにおける吸光度＜０．２００なる
検査試料は、抗ローソニアＬＰＳＩｇＧ抗体に
対して陰性であると考察される。

Claims

動物由来試料中のローソニア・イントラセルラリスに対する抗体の存在を検出するためのイムノアッセイ法であり、該試料がローソニア・イントラセルラリスのリポ多糖の少なくとも一部を含む有効量の抗原と接触すること、該抗体と該抗原との間で複合体形成が引き起こされること、及び、該複合体の存在を検出すること、の各ステップを含むイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該試料が、動物由来の血清、初乳、関節液、唾液、組織ホモジェネートおよび糞便からなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該動物が、ブタ、ハムスター、青ギツネ、エミュー、シシカ、イヌ、モルモット、ウマ、アカゲザル、ダチョウ、ウサギおよびラットからなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ抗体からなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該イムノアッセイ法がＥＬＩＳＡテストであるイムノアッセイ法。
請求項５に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原が組換え由来であるイムノアッセイ法。
請求項５に記載のイムノアッセイ法であって、該ＥＬＩＳＡテストが、表面に該抗原を固定すること、該組織が該固定抗原に接触すること、抗体と該抗原の複合体形成が起こることおよび該複合体を検出することの各ステップを含むイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該リポ多糖が約１５〜２５ｋＤａの分子量であるイムノアッセイ法。
請求項８に記載のイムノアッセイ法であって、該分子量が約１８〜２０ｋＤａであるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原が、該動物に有効量の抗原が投与された際に、その動物に免疫応答を誘導することができるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原が、細菌エンドトキシン試験に供した際に約３−７５ＥＵ／ｍｌの内毒性を示すイムノアッセイ法。
請求項１１に記載のイムノアッセイ法であって、該内毒性が約２５−４０ＥＵ／ｍｌであるイムノアッセイ法。
請求項１に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原がＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７株のリポ多糖抽出物を含むイムノアッセイ法。
ローソニア・イントラセルラリスに対する抗体の存在を検出するための抗原であり、該抗原が、単離されたローソニア・イントラセルラリスのリポ多糖の少なくとも一部を含む抗原。
請求項１４に記載の抗原であって、該リポ多糖が約１５−２５ｋＤａの分子量である抗原。
請求項１５に記載の抗原であって、該分子量が約１８−２０ｋＤａである抗原。
請求項１５に記載の抗原であって、該抗原が、該動物に有効量の投与をされた際にその動物に免疫応答を誘導することができる抗原。
請求項１５に記載の抗原であって、該抗原が、細菌エンドトキシン試験で約３−７５ＥＵ／ｍｌの内毒性を示す抗原。
請求項１５に記載の抗原であって、該リポ多糖が組換え由来である抗原。
請求項１８に記載の抗原であって、該内毒性が約２５−４０ＥＵ／ｍｌである抗原。
請求項１４に記載の抗原であって、該抗原がＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７株のリポ多糖抽出物を含む抗原。
動物由来試料中のローソニア・イントラセルラリスに対する抗体の存在を検出するための酵素結合免疫測定法において、ローソニア・イントラセルラリスのリポ多糖を該イムノアッセイ法において抗原として利用することを特徴とするイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該試料が動物由来の血清、初乳、関節液、唾液、組織ホモジェネート、および糞便からなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該動物がブタ、ハムスター、青ギツネ、エミュー、シカ、イヌ、モルモット、ウマ、アカゲザル、ダチョウ、ウサギ、およびラットからなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体からなる群より選ばれるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該ＥＬＩＳＡテストが間接ＥＬＩＳＡテストであるイムノアッセイ法。
請求項２６に記載のイムノアッセイ法であって、該ＥＬＩＳＡテストが、該抗原を表面に固定すること、該試料が該固定抗原に接触すること、該試料中の抗体と該抗原との間で複合体形成が引き起こされること、および該複合体を検出することの各ステップを含むイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該リポ多糖が分子量約１５−２５ｋＤａであるイムノアッセイ法。
請求項２８に記載のイムノアッセイ法であって、該分子量が約１８−２０ｋＤａであるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原が該動物においてその抗原の有効量が投与された際に免疫応答を引き起こすことができるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原が細菌エンドトキシン試験において約３−７５ＥＵ／ｍｌの内毒性を示すイムノアッセイ法。
請求項３１に記載のイムノアッセイ法であって、該内毒性が約２５−４０ＥＵ／ｍｌであるイムノアッセイ法。
請求項２２に記載のイムノアッセイ法であって、該抗原がＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４９２７株のリポ多糖抽出物を含むイムノアッセイ法。