JP2008507293A - 生体適合性荷電ポリマーにより形成されたマトリクスへの層流条件下での細胞の固定化 - Google Patents
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Abstract
Description
された高度に組織化された複雑な三次元構造を有する。哺乳動物では、ECMは、細胞とあらゆる面で接触する繊維、管およびチャネルとして、または基底膜と呼ばれる細胞が「着座する」シートとして、細胞を包囲し得る。ECMは機械的支持および生化学的障壁を提供するタンパク質および多糖から通常構成されている。ECMの改変型が例えば骨の形で見られる。ある研究によれば、細胞の機能が細胞外マトリクスにより非常に影響を受けることが示されている。いくつかの細胞は、異なる細胞種の同時培養でのみ、成長し、その生存期間を延長することができる。しかしながら、同時培養は、それらの細胞に適したマトリクスがないために培地中の異なる細胞の相互作用を操作または制御不能であることにより、制限されている。
Wei Tan, M.S. and T.A. Desai, Biomaterials, 2004, Vol.25, P.1355- 1364 Wei Tan, M.S. and T.A. Desai, Tissue Engineering, 2003, Vol. 9, No.2, P.255-267 Liu and Bhatia, Biomedical Devices 2002, Vol.4(4), P. 257-266(発明の開示) 1態様では、本発明は、生体適合性荷電ポリマーにより形成されたマトリクスに少なくとも1つの細胞種を固定化する方法である。方法は、第1の荷電ポリマーおよび第2の荷電ポリマーを提供することであって、少なくとも1つの細胞種は第2の荷電ポリマーに埋め込まれ、第1の荷電ポリマーは第2のポリマーと反対の電荷を有することと、第1の荷電ポリマーと第2の荷電ポリマーを層流条件下で反応させて、少なくとも1つまたは少なくとも2つの細胞種のマトリクスを形成することとから成る。
手段である。さらに本発明の反応は、細胞にとって非毒性の、細胞に優しく水性の条件下で起こる。さらに、本発明の方法を使用して形成されたポリマーマトリクスは、異なるポリマーの組み合わせの使用や、反対に荷電したポリマー反応条件および層流条件により、容易に改変することができる。複合コアセルベーションによる特定の重合反応のため、より大きな機械的安定性が達成される。同じ平面中を横に並んで流れるポリマーの層流および互いに上下に積み重なったポリマーの層流により形成された三次元マトリクス中での細胞培養によって、より複雑なパターニングが可能となり、したがって生組織の細胞に見出される条件の模倣が可能となる。
3Eは、種々の層状ポリマー流が種々の構成で結合されたフロー装置の反応溝2を示す。図3Aに示す反応溝2では、反対に荷電した層状ポリマー流AおよびBが横に並んで流れており、図3Bでは、層状ポリマー流AおよびBが互いに反応溝2で上下に積み重なって流れている。図3Cに示されたさらなる例では、第1(AとZ)および第2(BとC)の荷電ポリマーの異なる種類の層状ポリマー流が互いに上下に積み重ねられている。図3Dでは細胞を含む第2の荷電ポリマーの層状ポリマー流(B)が2つの第1の荷電ポリマーの層状ポリマー流(AとZ)の間に挟まれており、図3Eでは第1の荷電ポリマーの層状ポリマー流(A)が、異なる細胞種を含むいくつかの第2の荷電ポリマーの層状ポリマー流(BからIまで)によって包囲されている。
1節当たりの平均樹状突起長さ;(B)1節当たりの平均樹状突起数[(□)低メチル化コラーゲン、(△)高メチル化コラーゲン]。
図9はHepG2増殖に対するコラーゲンのメチル化の影響を示す(実施例3)。[(斜線)低メチル化コラーゲン(CE指標1.4);(ドット)高メチル化コラーゲン(CE指標1.9)]。
は乳酸菌(Lactococcus lactis)がある。
リン酸緩衝生理食塩液(PBS)、細胞培養培地、または新たに形成されたポリマーマトリクスに埋め込まれた細胞にとって有毒でない任意の他の液体培地であってよい。例えば、実施例1に説明されているようなメタクリル酸ヒドロキシエチル−メタクリル酸−メタクリル酸メチル(HEMA−MAA−MMA)から構成された三量体のメチル化コラーゲンとの重合反応は、リン酸緩衝生理食塩液(PBS、pH7.0)、ダルベッコ(Dulbecco)改変イーグル培地(DMEM)、または改変チー(Chee)培地(Bibco BRL社のHep
taoZYM無血清培地)を用いて停止することができる。層状ポリマー流のうちの1つを停止溶液に置き替えることに加えて、入口開口部3を通るようフロー装置に層状ポリマ
ー流を送り込むと共に、フロー装置の反対側で出口開口部4を通って反応溝2に入るように停止溶液を送り込むことも可能である(例えば図2B参照)。このように、反応溝2は、半分は平行な層状ポリマー流により満たされ、半分は停止溶液により満たされて、2〜8分後に重合反応は停止される。反対に荷電したポリマー流と検体を含む液体培地との反応で形成されたポリマーマトリクスの有効な潅流が実施例2に示される。実施例2はポリマーマトリクスを収容する反応溝2に送り込まれたポリマーマトリクスに埋め込まれていた肝細胞による7−エトキシレゾルフィンの代謝について説明している。
バイオチップ(この上に細胞を含むゲルストリップが将来の使用のために固定される)への使用のためにポリマー装置から剥がされる場合、有利であり得る。さらに、図2Dのフロー装置では図2Aに示されたフロー装置に比べてより大きな柔軟性およびより良好な制御が可能となる。例えば、出口開口部がより多いと、出口開口部の各々から別々に層状ポリマー流を吸引することが可能となり、これは種々の荷電ポリマーの流量のより良好な制御を可能にする。
クローンC2C12筋管(addressStreetCooper ST. et al., Cell Motil. Cytoskeleton, 2004, Vol.58(3), P.200- 211)が含まれる。胚性幹細胞または他の始原細胞の、他の細胞種との同時培養はそれらの分化を誘導することができる (Wang XY, et al., Surgery, 2003, Vol.134(2), P.189-196; Fair J.H., Brain Res. Dev. Brain. Res., 2002, Vol.137(2),
P.115-125。
キシエチル、約50%のメタクリル酸、および約25%のメタクリル酸メチル(HEMA−MAA−MMA)から成る。本発明の方法に使用可能な他の三量体はShao Wen et alにより記載されており、Shao Wenらは生細胞を埋め込むために種々の組成から成る三量体を使用した(Shao Wen, Yin Xiaonan and W.T.K. Stevenson, Biomaterials, 1991 , Vol.12
May, P.374-384; Shao Wen, H. Alexander et al., Biomaterials, 1995, Vol.16, P.325- 335)。これらの三量体はHEMA−MMA−MAAまたはHEMA−MMA−DMA
EMA(カチオン2−(ジメチルアミノ)メタクリル酸エチル)から成るが、後者の三量体は正に荷電している。
によりカチオンコラーゲンが得られた。Donald G. Wallace および Joel Rosenblatt (Advanced Drug Delivery Reviews 2003, Vol.55, P.1631-1649)に記載された方法によれば
、例えば負荷電コラーゲンを得ることができる。電気的に正味の電荷を有するように改変
可能な非荷電ポリマーの他の例にはポリ(ビニルアルコール)や、デキストランおよび(紅藻から得られた)カラギーナンファミリーの多糖のようなさらなる多糖が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
ル化コラーゲン(CE指標1.9)に埋め込まれているかどうかに依存して影響を受ける。ポリマーマトリクスを形成するために低メチル化コラーゲンが使用された場合には(図8Aおよび8B)、初代肝細胞の解毒活動はより高かった。対照的に、HepG2細胞の増殖は低メチル化コラーゲンよりも高メチル化コラーゲンでの方がより大きかった。
細胞培養物への供給酸素の浸透を促進するため、閉鎖系のマイクロデバイスにおいては重要な特性である。さらに、それらは透明なので、好都合にも細胞の形態の直接観察を観察装置(例えば顕微鏡)で行うことが可能となる。
Re=(流体密度)(平均流体粘度)(特性長さ)/(流体動的粘度)
レイノルズ数が2000未満の値を有する場合、「層流条件」が与えられ、このように容易に決定することができる。生体内条件をシミュレートするための層流条件の使用は(Proc. Natl. Aca. ScL, May 1999, Vol.96, P.5545-5548)によって記述されている。こ
の研究では、液体培地の層流を使用して細胞培養基質のパターニングがシミュレートされた。本発明の方法では、液体の代わりに層状ポリマー流を使用して、三次元マトリクスおよび細胞を同時にパターン化した。
本発明で特徴付けられた溝およびポリマーの寸法を使用すると、そのような溝のレイノルズ数は通常低く、層流を生成するための条件を満たす。表1に記載されたシステムでは、例えばいずれのポリマー流でもReは4未満である。
実施例1は、第2の荷電ポリマーとしてメチル化された(正荷電)コラーゲンと、第1の荷電ポリマーとしてヒドロキシエチルメタクリル酸−メタクリル酸メチル−メチルアクリル酸(HEMA−MMA−MAA)の(負荷電)三量体を層流条件下で層状反応させることによるその場でのポリマーマトリクス形成を示す。
形成されるポリマーマトリクスの構造物の制御を例証するために、2つの異なるポリマーの組み合わせが使用される。2つの組み合わせは、2つの多電解質間の最適の電荷バランスに基づいて選択される。
ア州パロアルト)は、Chiaら(2000年、前掲)によって記述されているようにコラーゲン鎖のカルボキシル基のエステル化によりカチオン化される。HEMA−MMA−MAAの三量体は、Chiaら(2000年、前掲)により、25:50:25のHEMA、MM
AおよびMAAの供給比での溶液重合により合成される。ゲル浸透クロマトグラフィを使用して2つの三量体の分子量(MW)を特徴付ける。これらは低いMWが80.5 kDAで高いMWが849.3 kDaであることが分かった。コラーゲン溶液と三量体溶液はいずれも1×リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)でそれぞれの濃度に再構成される。2つのポリマーの組み合わせは以下のとおりである:
(i)3mg/ml メチル化コラーゲンと3wt% 低MW三量体
(ii)3mg/ml メチル化コラーゲンと0.1wt% 高MW三量体
図1に示したような装置の反応溝を、その迅速な試作品製作が容易であるため、ポリ(ジメチルシロキサン重合体)(PDMS)エラストマーより構成する。溝の設計はコンピュータ支援設計(AutoCAD)プログラムにより行い、これを用いて、ポリカーボネートのコンピュータ数値制御(CNC)機械加工によりPDMS鋳型を構成するためのマスタを製造した。PDMS構造を製作するためのマスタを製造するためには、光硬化エポキシSU−8の使用(Tan W. and Desai T. A., Tissue Engineering 2003, Vol.9(2), P.255-267)を始めとする様々な他の方法を使用することができ、平行に並んだマトリクスポリマーが層流の様式(Reが2000未満)で接触することが可能である限り、ガラスまたはシリコンのエッチング(McDonald et al., Electrophoresis 2000, Vol.21(1), P.27-40)を始めとする溝を形成するための他の技術も使用することができる。小さな溝(
200μm以下)および低い流速(50μl/h−1000μl/hの間)の典型的な微小流体条件下では、Reはほとんど常に低い。この例証的なシステムではReは2未満である。PDMS鋳型を作成するために、液体PDMSプレポリマー(ベースポリマー:硬化剤が1:10の混合物)をマスタの上に注ぎ、60度で1時間硬化させる。穿孔機を使用してPDMSに小孔を開け、入口と出口を作成する。最後に、プラズマ酸化によりガラスカバーストリップ上にPDMSを不可逆的に密封し、溝を形成する。この実験では、長方形の反応溝は、約3.5cmの長さ、約200μmの高さ、および約400μmの幅を有する。
照)で図1Aの入口開口部3Aおよび3Bを介して2つのY字形アームで反応溝2に反応へ伝えられる。合一された層状ポリマー流は、出口開口部4を介して溝5の終端で大気へ出るようにされる(図1B参照)。コラーゲン側にポリマーマトリクスを生成した後、三量体側はPBSで洗浄され、潅流される。光学顕微鏡、60×ウォーターレンズを用いた共焦後方散乱細胞顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM)を含めた種々の方法を使用して、形成されたポリマーマトリクスを特徴づけることができる。
応を停止した後、壁およびポリマーマトリクスが保持され、ポリマーマトリクスを液体で連続的に潅流することが可能となる。
本実施例は、三次元ポリマーマトリクスを、検体を含む液体培地で潅流させることができることを示す。この目的で、(図3Aに略図で示したような)メチル化コラーゲンとメタクリル酸ヒドロキシルエチル−メタクリル酸メチル−アクリル酸メチル(HEMA−MMA−MAA)の三量体との横並びの層状流により形成されたポリマーマトリクスに埋め込まれた肝細胞の解毒機能について調べた。
た。細胞を含有するメチル化コラーゲンと三量体の流れの流速を表3に与える。
本実施例は、第2の荷電ポリマーとしてのメチル化コラーゲンと、第1の荷電ポリマーとしてのHEMA−MMA−MAA三量体との間のポリマー電解質複合コアセルベーション反応を使用して、細胞の挙動と重要な関係を有するコラーゲンマトリクス形成を操作することを例証している。三量体と複合コアセルベート反応させて、ポリマーマトリクスの形態を変更して最適な細胞支持のための微小環境を設計するために、異なるメチル化度のコラーゲンを使用する。2つの肝臓由来のモデル細胞タイプである初代肝細胞およびHepG2細胞系を選択し、細胞機能に対するポリマーマトリクスの形態の影響について検討する。HepG2は、感度が高く、最終的に分化し、生体外での分化された機能の維持には特定の化学的および位相幾何学的な細胞外マトリクス(ECM)の糸口を必要とする初代細胞を表すが、HepG2は接触阻止に遭遇しない限り培地中で比較的容易に増殖することができる形質転換細胞系を表わす肝細胞系である。
られる。キャピラリゾーン電気泳動(CE)法は、コラーゲンメチル化度の定量化に関して開発されたものである。
ル所在)で行なう。使用されるポリビニルアルコール(PVA)でコートされた毛細管(50μm ID x 360μm OD x 70cm長、45cm有効長)も、CE Resources Pte Ltd(シンガポール所在)から得られる。分離は21℃で0.05%ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC) 50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.5)で行う。分離電圧は22kVであり、UV吸光度は200nmで検知される。コラーゲンサンプルを圧力(0.3psix15s)(注:0.3psi=2068.43Pa)により毛細管に導入する。PVAコート毛細管は、最初の使用前に蒸留水で3分間洗浄する。最初の条件設定後は、各分析の間に、コーティングされた毛細管を1分間蒸留水で、3分間0.05% ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC) 50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH2.5)で洗浄する。使用される化学物質はすべて分析的グレードであるかまたは利用可能な最も高い純度のいずれかである。塩酸、リン酸ナトリウム、メタノールおよび水酸化ナトリウムをMerk&Co.(アメリカ合衆国ニュージャージー州)から得る。HPMC(VISC,2wt%水溶液、5CPS)はSigma-Aldrich Co.(アメリカ聖合衆国ミズーリ州セントルイス)から購入した。アセトンはTedla Company Inc(アメリ
カ合衆国フェアフィールド)から購入する。すべての緩衝液および溶液はMillli-Q シス
テム(アメリカ合衆国ウィスコンシン州バーンステッド)で精製した水により調製する。
P.O., Methods Cell Biol. 1976, Vol.13, P.29-83)にいくつかの修正を加えたものに
より、肝細胞を雄Wistarラットから採取する。細胞を、シリンジポンプに取り付けられた
30.G針から三量体に注入して三量体と接触させる前に、5x106/ml(肝細胞)
または8x105/ml(HepG2)の細胞密度でメチル化コラーゲン中に懸濁させる
。ポリマーマトリクスに支持された肝細胞およびHepG2細胞を、37℃、5%CO2
湿り雰囲気中で、ウシ胎児血清(10%)およびHEPES(1g/l)を補足したHepatoZYM−SFM(GIBCO Laboratories)およびDMEMにて培養する。肝細胞の解毒機能を、肝細胞の7−エトキシレゾルフィン−O脱アルキル化(EROD)活性および7−エトキシクマリン−O−デエチラーゼ(ECOD)活性により評価する。簡単に説明すると、これには39.2μM 7−エトキシレゾルフィン 5時間(EROD)および0.26mM 7−エトキシクマリン 3時間(ECOD)の添加ならびにそれらの代謝産物の共焦蛍光顕微鏡(EROD)および高速液体クロマトグラフィ(HPLC)(ECOD)による定量が含まれる。経時的なHepG2細胞の増殖を顕微鏡(Olympus Fluoview 500)により監視する。
以下の実施例は、流量の変化が、メチル化コラーゲンおよびメタクリル酸ヒドロキシエチル−メタクリル酸メチル−アクリル酸メチル(HEMA− MMA−MAA)三量体の横並びの層状流により形成される三次元ナノ線維ポリマーマトリクスの形成をどのように変化させるかを実証する。表5から見られるような2つの流れの構成が使用された。構成
2では、層状コラーゲン流が静止(流速=0)である時間を増加させた。
Claims (18)
- 生体適合性荷電ポリマーにより形成されたマトリクスに少なくとも1つの細胞種を固定化する方法であって、
第1の荷電ポリマーおよび第2の荷電ポリマーを提供することであって、前記少なくとも1つの細胞種は第2の荷電ポリマーに埋め込まれ、第1の荷電ポリマーは第2のポリマーと反対の電荷を有することと;
前記第1の荷電ポリマーと前記第2の荷電ポリマーを層流条件下で反応させて、前記少なくとも1つの細胞種のためのマトリクスを形成することと;
から成る方法。 - 前記少なくとも1つの細胞種として原核生物種または真核細胞種が使用される請求項1に記載の方法。
- 前記真核細胞種は初代肝細胞、HepG2、骨髄間葉細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、ニューロン、骨芽細胞、酵母、両生類細胞、昆虫細胞、および植物細胞から選択される請求項2に記載の方法。
- 前記原核細胞種はエシェリキア属、バチルス属、およびラクトコッカス属から選択される請求項2に記載の方法。
- 前記ポリマーの反応はフロー装置の反応溝で行なわれる請求項1に記載の方法。
- 前記フロー装置の反応溝は、前記層状ポリマー流のための1または複数の出口開口部および少なくとも2つの入口開口部を有する請求項5に記載の方法。
- 液体によって潅流でき、前記少なくとも1つの細胞種の正常な代謝機能を維持するのに必要な物質と、前記少なくとも1つの細胞種により放出された生産物とに対して浸透性のマトリクスを形成する荷電ポリマーが使用される請求項1に記載の方法。
- 前記第2の荷電ポリマーは、キトサン、ポリアニオンアルギン酸、メチル化コラーゲン、負荷電コラーゲン、カルボキシメチルセルロース(CMC)およびポリアニオンアルギン酸から選択される請求項7に記載の方法。
- 前記第1の荷電ポリマーは、正または負に荷電した三量体、Ca2+、コンドロイチン硫酸Aキトサンおよびポリカチオンポリ(L−リジン)から選択される請求項8に記載の方法。
- メチル化コラーゲンと、アクリル酸とメタクリル酸の少なくとも1つおよびメタクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸ヒドロキシプロピルの少なくとも1つを含む負に荷電した三量体とが、第2の荷電ポリマーおよび第1の荷電ポリマーとしてそれぞれ使用される請求項9に記載の方法。
- 25%の2−メタクリル酸ヒドロキシエチル、25%のメタクリル酸ヒドロキシプロピルおよび50%のメタクリル酸メチルから成る三量体(HEMA−MAA−MMA)が第1の荷電ポリマーとして使用される請求項10に記載の方法。
- ポリマーの前記反応においてポリマーが架橋され、架橋度はポリマーの電荷密度を変えることにより変更することができる請求項1に記載の方法。
- 低メチル化ポリマーおよび/または高メチル化ポリマーが使用され、低メチル化ポリマーは0.9〜1.7CEの電荷密度を有し、高メチル化ポリマーは1.7〜2.5CEの電荷密度を有する請求項12に記載の方法。
- ポリマーの前記反応においてポリマーが架橋され、架橋度はポリマー濃度を変えることにより変更することができる請求項1に記載の方法。
- ポリマーの前記反応においてポリマーが架橋され、架橋度はポリマーの反応時間を変えることにより変更することができる請求項1に記載の方法。
- ポリマーの反応時間が約30秒から8分の間である請求項15に記載の方法。
- 生体適合性荷電ポリマーにより形成されたマトリクスに細胞を固定化するための請求項1に記載の方法の使用。
- マイクロメートル寸法の移植組織の生成、生理学的組織のインビトロモデルの生成、生物工学における組換えタンパク質の製造のための細胞培養物潅流用バイオリアクタの生成、組織工学における細胞増殖、および細胞バイオチップから選択された用途のための請求項17に記載の使用。
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